Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor het monitoren van de progressie van morfologische veranderingen in de loop van de tijd in de baarmoeder in een induceerbaar muismodel van endometriumkanker met behulp van echografie met correlatie met grove en histologische veranderingen.
Abstract
Baarmoederkanker kan worden bestudeerd bij muizen vanwege het gemak van hantering en genetische manipulatie in deze modellen. Deze studies zijn echter vaak beperkt tot het beoordelen van pathologie post-mortem bij dieren die op meerdere tijdstippen in verschillende cohorten zijn geëuthanaseerd, waardoor het aantal muizen dat nodig is voor een studie toeneemt. Beeldvormende muizen in longitudinale studies kunnen de progressie van de ziekte bij individuele dieren volgen, waardoor het aantal benodigde muizen wordt verminderd. Vooruitgang in ultrasone technologie heeft de detectie van veranderingen op micrometerniveau in weefsels mogelijk gemaakt. Echografie is gebruikt om follikelrijping in eierstokken en xenograftgroei te bestuderen, maar is niet toegepast op morfologische veranderingen in de baarmoeder van de muis. Dit protocol onderzoekt de juxtapositie van pathologie met in vivo beeldvormingsvergelijkingen in een geïnduceerd endometriumkankermuismodel. De kenmerken waargenomen door echografie waren consistent met de mate van verandering waargenomen door grove pathologie en histologie. Echografie bleek zeer voorspellend te zijn voor de waargenomen pathologie en ondersteunde de opname van echografie in longitudinale studies van baarmoederziekten zoals kanker bij muizen.
Introduction
Muizen blijven een van de belangrijkste diermodellen voor voortplantingsstoornissen 1,2,3. Er zijn verschillende genetisch gemodificeerde of geïnduceerde knaagdiermodellen van eierstok- en baarmoederkanker. Deze studies zijn meestal afhankelijk van meerdere cohorten die op verschillende tijdstippen worden geëuthanaseerd om longitudinale trends in morfologische en pathologische veranderingen vast te leggen. Dit voorkomt de mogelijkheid om continue gegevens over de ontwikkeling van kanker in een individuele muis te verkrijgen. Bovendien, zonder de individuele ziekteprogressietoestand van de muis te kennen, zijn interventiestudies gebaseerd op vooraf bepaalde tijdstippen en gemiddelde bevindingen van eerdere cohorten in plaats van individuele drempels voor de detectie van progressie bij een specifiek dier 4,5. Daarom zijn beeldvormingsbenaderingen nodig die longitudinale beoordeling bij levende dieren mogelijk maken om preklinische modellen voor het testen van nieuwe geneesmiddelen of verbindingen te vergemakkelijken en het begrip van pathobiologie te versnellen en tegelijkertijd de striktheid en reproduceerbaarheid te vergroten6.
Echografie (VS) is een aantrekkelijke methode voor de longitudinale monitoring van de progressie van baarmoederkanker bij muizen omdat het relatief gemakkelijk en goedkoop is in vergelijking met andere beeldvormingsmethoden, gemakkelijk uit te voeren is en een opmerkelijke resolutie 6,7 kan hebben. Deze niet-invasieve modaliteit kan kenmerken op micronschaal vastleggen bij wakkere muizen of bij muizen onder korte sedatie met behulp van een examen van 5-10 minuten. Ultrasone microscopie is gevalideerd als een methode om de ontwikkeling van de ovariële follikel bij muizen te meten 8 en de groei van geïmplanteerde of geïnduceerde neoplasie 9,10,11. Hoogfrequente US is ook gebruikt voor percutane intra-uteriene injecties12 en het observeren van de baarmoederverandering van ratten gedurende de oestruscyclus13. Hoogfrequente US kan worden gebruikt met muizen die op gespecialiseerde stationaire platforms worden gehouden met behulp van een railsysteem om de transducer / sonde vast te houden om beelden met een hoge resolutie vast te leggen met gestandaardiseerde positie en druk; Deze apparatuur is echter niet bij alle instellingen beschikbaar. Hand-held transducer scanmethoden kunnen worden toegepast met minder speciale apparatuur en worden gebruikt voor zowel klinische diagnostiek als onderzoekstoepassingen bij muizen.
De vraag blijft of Amerikaanse beeldvorming met handbediende, hoogfrequente sondes kan worden gebruikt om de ontwikkeling van baarmoederkanker gedurende meerdere weken te volgen. Net als de darmen is de baarmoeder van knaagdieren een dunwandige, slanke structuur die zeer mobiel is in de buik en aaneengesloten is door meerdere weefseldiepten, waardoor beeldvorming uitdagender is dan bij relatief onbeweeglijke organen zoals de nieren. Deze studie probeerde de correlatie vast te stellen tussen weefsels waargenomen door echografie en histopathologie, oriëntatiepunten te definiëren voor het lokaliseren van de baarmoeder van de muis en de haalbaarheid van de longitudinale beoordeling van endometriumkanker te bepalen. Deze studie presenteert gegevens die een kwalitatieve overeenkomst laten zien tussen het uiterlijk van uteri in beeld gebracht door de VS en histopathologie, evenals seriële beeldvorming van muizen gedurende meerdere weken. Deze resultaten geven aan dat hand-held US kan worden gebruikt om de ontwikkeling van endometriumkanker bij muizen te volgen, waardoor een mogelijkheid ontstaat voor het verzamelen van individuele longitudinale gegevens van muizen om baarmoederkanker te bestuderen zonder de noodzaak van speciale apparatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures en experimenten met muizen werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. Voor alle procedures werden geschikte PBM's gedragen, inclusief handschoenen en wegwerpisolatiejassen. Er werden voorzorgsmaatregelen genomen bij het hanteren van scherpe voorwerpen, die onmiddellijk na gebruik op de juiste manier werden weggegooid in rode doos scherpe containers. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Inductie van endometriumkanker bij iPAD (induceerbare Pten, Arid1a dubbele deletie) muizen met doxycycline
- Onderhoud 10 Pax8-Cre-Arid1a-Pten double deletion (iPAD) transgene muizen (figuur 1) op een gemengde genetische achtergrond (129S, BALB/C, C57BL/6), zoals eerder beschreven14.
- Verzamel baseline echografie (2D) beelden van de eierstokken, eileider en baarmoeder van elke muis vóór de behandeling met doxycycline.
- Geef uitsluitend doxycycline-bevattende muis chow-diëten (doxycyclinehyclaat bij 625 mg / kg voer) aan de vrouwelijke iPAD-muizen gedurende minimaal 2 weken vanaf de leeftijd van 7-8 weken om gendeletie te induceren.
2. Apparatuur instellen
- Zet het verwarmingskussen aan en dek af met een schoon absorberend kussen (doeltemperatuur: 38 °C).
- Controleer of de isofluraan vaporizer en O2 tank voldoende gevuld zijn. Bijvullen en vervangen als de inhoud laag is.
- Sluit de inductiekamer, neuskegel en het opruimsysteem aan op de vaporizer.
- Stel het echoapparaat in.
- Selecteer een transducer (sonde) met een bereik van 32-56 MHz of tot 70 MHz voor beeldvorming van respectievelijk de baarmoeder of eierstok.
- Sluit de sonde aan en schakel de machine in.
- Gebruik na het opstarten van het systeem het configuratiescherm om in te loggen met de gebruikersreferenties en toegang te krijgen tot het startscherm.
- Ga in het startscherm naar het tabblad Toepassingen en selecteer Muis (kleine) buikmodus.
- Klik op Scannen om terug te keren naar het startscherm en wacht tot een live afbeelding wordt weergegeven.
- Selecteer B-modus in de opties op de linkerwerkbalk.
- Klik op Meer besturingselementen om extra hulpmiddelen voor beeldverfijning weer te geven, zoals beeldversterking en -diepte, of om de instellingen voor clipacquisitie aan te passen, zoals het aantal frames per seconde.
- Zodra de afbeeldingsinstellingen zijn geselecteerd, keert u terug naar het startscherm door op Scannen te klikken.
- Schakel de O2-tank in, leid de stroom naar de inductiekamer en stel het debiet in op 1 l / min.
3. Voorbereiding van muizen voor echografie, inclusief ontharing
- Plaats een muis in de inductiekamer. Stel de isofluraan vaporizer in op 2%-3% vol/vol voor de inductie van anesthesie.
- Bepaal de juiste diepte van de anesthesie door een gebrek aan reactie op teenknijpen en een ademhalingsfrequentie van ongeveer 1-2 ademhalingen / s.
- Breng steriel oftalmisch glijmiddel aan op elk oog. Verwijder de vacht van de dorsum en het ventrum tussen de laatste rib en het bekken met de juiste maat tondeuse.
- Breng een dunne laag ontharingscrème aan op de ventrale en dorsale gebieden die moeten worden afgebeeld (indien nodig).
- Plaats de muis gedurende ongeveer 3-5 minuten terug in de inductiekamer om de juiste diepte van de anesthesie te behouden terwijl de ontharingscrème werkt om het haar te verwijderen. Veeg na ≤4 minuten de crème voorzichtig weg met een schone vochtige papieren handdoek.
OPMERKING: Langere blootstelling aan ontharingscrème is irriterend en kan huidlaesies veroorzaken.
4. Intraperitoneale injectie van vloeistof om het contrast tussen organen te vergroten
- Verwarm een spuit van 3-10 ml gevuld met een steriele isotone vloeistofoplossing (bijv. steriele 0,9% NaCl of lactated ringers solution) tot 35-40 °C door deze gedurende enkele minuten tussen een verwarmingskussen en een absorberende pad te plaatsen. Plaats een fles ultrasone gel op het verwarmingskussen als de machine geen warmer heeft.
- Injecteer voor een muis van 20-25 g 1-2 ml oplossing in de peritoneale holte.
- Zet de muis vast bij het nekvel in één hand, waardoor het ventrum wordt blootgesteld.
- Houd de muis in een hoek van ~ 20 °, met de neus naar de vloer gericht om de organen craniaal te richten vanwege de zwaartekracht.
- Prik met behulp van een kleine naald (25 G, 5/8 in lengte, tuberculinespuit) door de huid en buikwand van het caudale rechterkwadrant van de buik.
- Vóór de injectie van vloeistoffen, om injectie in de vasculatuur of het maagdarmkanaal te voorkomen, trekt u zich terug met minimale druk. Als er bloed of ander materiaal in de spuit komt, verwijder dan de naald. Gebruik een nieuwe naald en spuit en probeer het opnieuw op een iets andere positie.
- Als de muis wakker wordt tijdens de injecties, plaats hem dan terug in de kleine inductiekamer voor anesthesie met 2% -3% vol / vol isofluraan.
5. Echografie vanuit een dorsale benadering
- Plaats de muis in ventrale lighouding op de absorberende pad boven een verwarmingskussen (figuur 2A-C).
- Plaats een neuskegel van knaagdieren stevig over de neus en snuit van de muis. Houd de verdovingsdiepte met isofluraan die door de neuskegel wordt afgegeven op 1% -2% vol / vol in 100% O2. Breng steriel oftalmisch glijmiddel, indien nodig, aan op elk oog.
- Controleer de muis op een regelmatige ademhalingsfrequentie (1-2/s) en een gebrek aan teenknijpreactie om aan te geven of de anesthesie moet worden aangepast.
- Plaats een kleine hoeveelheid (~ 0,5-1 ml) voorverwarmde ultrasone gel abaxiaal (lateraal) aan de wervelkolom aan weerszijden van de verdoofde muis, tussen de laatste rib en het bekken.
- Doe een kleine hoeveelheid gel op de ultrasone sonde.
- Plaats de sonde evenwijdig aan de wervels met de voorkant van de sonde aan de schedelzijde. Op de sondekop is een indicatormarkering aanwezig om de juiste oriëntatie van de sonde aan te geven. Noteer de dag, tijd, dier-ID, sondeoriëntatie en dierzijde (rechts, links, dorsaal, ventraal) voor elke nieuwe set afbeeldingen die wordt verzameld.
- Met een muis in ventrale lighouding (dorsumhuid die de sonde raakt), scant u langzaam het gebied voor het nieroriëntatiepunt (figuur 2B en figuur 3). Met de nier in het zicht, trek de sonde caudaal om de eierstok te vinden - een enigszins hyperechoïsche ovale tot ronde structuur (figuur 4A, B) in een zeer hyperechoïsch ovaal vetkussen dat cranio-ventraal wordt begrensd door de nier en dorso-lateraal door de dorsale buikwand.
OPMERKING: Druk caudaal en lateraal naar de eierstok kan de eierstok dichter bij de buikwand en weg van de lussen van de darm leiden. De eierstok is anatomisch geplaatst tegen de dorsale buikwand, net ventraal en lateraal naar de epaxiale spieren en caudaal naar de nier. - Pas de signaalversterking aan met de schuifregelaar onder aan het bedieningsscherm om het beeldcontrast te verbeteren.
- Om de beeldvorming van de nier te verbeteren, oefent u druk uit met een vinger op de contralaterale buik. Varieer de druk en hoek van direct parallel aan de wervelkolom tot ~ 20 ° ventraal.
- Zodra het orgel van belang in beeld is, verzamelt u een video door te klikken op Clip opslaan of Opname starten en vervolgens Opname stoppen wanneer u klaar bent om afbeeldingen op een vooraf ingesteld aantal frames te behouden.
- Sla afzonderlijke frames op van een live afbeelding of opname met de knop Frame opslaan .
- Om de baarmoeder in beeld te brengen, trekt u de sonde caudaal totdat de eierstok zich in het meest craniale aspect van het gezichtsveld bevindt. Varieer de sondedruk en hoek totdat de baarmoeder in zicht is.
- Herhaal video- en frameverzameling voor elk interessant orgaan.
- Vind de baarmoeder die in de lengterichting langs de dorsale buikwand loopt met de laterale beenmusculatuur ook in beeld (figuur 4B).
OPMERKING: De grootte van de baarmoeder en de lumendiameter kunnen variëren met de fase van oestrus en ziektetoestand. - Controleer het weefsel op peristaltische beweging om de darmlussen te onderscheiden van de stationaire hoorns van de baarmoeder.
6. Verzamel beelden van een ventrale benadering
- Plaats de muis in dorsale lighouding en controleer of de oogbevochtiging voldoende is en de snuit stevig in de neuskegel zit (figuur 2A).
- Breng een kleine hoeveelheid (~ 0,5-1 ml) voorverwarmde ultrasone gel aan op de ventrale buik en breng de sonde aan op de middellijn net craniaal van de schaamstreek om de blaas te lokaliseren als een hypoechoïsch oriëntatiepunt (figuur 5).
OPMERKING: Als de blaas te groot is en de beeldvorming van de baarmoeder verduistert, kan zachte druk op de onderbuik worden uitgeoefend om urine af te drukken. - Trek de sonde lateraal naar de blaas om de baarmoederhoorns te vinden. Oefen lichte digitale druk uit vanaf een of beide zijden van de muis om de hoorns in het gezichtsveld te brengen. Houd de sonde loodrecht op de muis en scan beide zijden van de buik om dwarse weergaven (doorsneden) van beide hoorns vast te leggen. Draai de sonde om sagittale weergaven vast te leggen.
- Na de echografie veegt u de muis schoon van gel met een papieren handdoek en brengt u deze terug naar zijn kooi om te herstellen. Muizen zijn volledig wakker in 2-5 minuten. Zodra het volledig wakker en ambulant is, brengt u de muis terug naar de dierenkamer.
OPMERKING: Een verwarmingskussen op een laag vuur kan onder de kooi worden geplaatst om de kooi te verwarmen voor herstel. - Op het experimentele of humane eindpunt, euthanaseer de muis. Idealiter euthanaseer je de muis in de thuiskooi om stress te verminderen; U kunt de muis ook in een schone kamer plaatsen. Lever CO2 onder druk met een verplaatsingssnelheid van 10% -30% van het kamervolume per minuut. Na ongeveer 5 minuten geen zichtbare ademhaling, controleer de dood door cervicale dislocatie. Ga verder met abdominale obductie voor tumoroogst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pax8-Cre-Arid1a-Pten double deletion (iPAD) transgene muizen werden gehandhaafd op een gemengde genetische achtergrond (129S, BALB/C, C57BL/6), zoals eerder beschreven14. De muizen kregen allemaal een doxycyclinevoer gedurende 2 weken om Cre-recombinase te induceren. In eerder werk van onze groep werd doxycycline gedoseerd door gavage14; In deze huidige studie werkte de doxycycline-voedingsinductiemethode echter efficiënt en verminderde de stress van de maagsonde voor de muizen. Het is belangrijk om te controleren of de toedieningsmethode van doxycycline voldoende is om de Cre-recombinase-expressie te induceren die nodig is om het DNA voor tumoronderdrukkers (Arid1a en Pten) in Pax8-tot expressie brengende cellen, zoals de baarmoeder, te verwijderen. Immunohistochemie met antilichamen gericht tegen ARID1a en pTEN14 werd gebruikt om te controleren of voldoende tumorsuppressorgeiwitverlies werd bereikt in de baarmoederepitheelcellen in vergelijking met het naburige stromale weefsel, zoals te zien is in figuur 6. Het schema van het muismodel en de regulatie van tumorsuppressorgexpressie is weergegeven in figuur 1.
Na 2 weken doxycycline veranderde de baarmoeder niet significant in grootte in vergelijking met controles of dezelfde muis die werd afgebeeld vóór toediening van doxycycline. Toch toonde echografie in de komende 2-6 weken na doxycycline aan dat de muizen een reeks baarmoederpathologieën ontwikkelden, beginnend met hyperplasie en evoluerend naar adenocarcinoom. Figuur 7A,B toont Amerikaanse beelden van een baarmoeder van een muis met vroege pathologieveranderingen gezien na 3 weken behandeling met doxycycline. Figuur 7C,D toont de grove pathologie en histopathologie van dezelfde baarmoeder afgebeeld in figuur 7A,B nadat de muis onmiddellijk na beeldvorming na 3 weken werd geëuthanaseerd. De kleinere (maar verwijde) dunwandige baarmoeder en vroege endometriumhyperplasie met behoud van het afzonderlijke lumen (centrale hyperechoïsche baarmoedervloeistof) kunnen worden waargenomen. Bij muizen die op latere tijdstippen werden geëuthanaseerd, was de baarmoeder veel groter, had een kleiner lumen en had een verdikte wand (figuur 8 en figuur 9). Voorbeelden van verwijde lumen en subtiele veranderingen in het hyperplastische endometrium worden vergeleken met dichte weefsel- en nodulaire kankergroei in de baarmoeder in figuur 8 en figuur 9. De echografie en brutobeelden waren zeer consistent met elkaar voor alle vertegenwoordigde muizen. Figuur 9 toont meerdere baarmoederbeelden van dezelfde muis in een tijdsverloopstudie en toont de morfologische veranderingen die gedurende 6 weken werden waargenomen toen adenocarcinoom zich ontwikkelde. Figuur 5 toont een ventrale benadering met doorsneden van de baarmoederhoorns grenzend aan de hypoechoïsche blaas.
Om het contrast in de buik te verbeteren, verbeterde het injecteren van zoutoplossing in de buikholte direct voor de beeldvorming de visualisatie van de buikorganen, inclusief de baarmoeder en eierstokken. Figuur 3 toont echografische vergelijkingen van dezelfde muis voor en na de injectie van 1 ml zoutoplossing. Met zoutoplossing was er een verhoogde hypoechoïsche ruimte (zwart) tussen de organen waardoor de nier, het vetkussen, de eierstok, de baarmoederhoorns, de darmen en de milt gemakkelijker van elkaar konden worden geïndividualiseerd. In alle andere hier gepresenteerde figuren werden zoutoplossinginjecties gedaan vóór de beeldvorming om de beeldhelderheid te verbeteren.
Alles bij elkaar genomen toont dit protocol aan dat dit induceerbare muismodel adenocarcinoom ontwikkelt gedurende een periode van 6 weken en kan worden gevolgd met echografie om een basislijn vast te stellen en morfologische veranderingen in de baarmoeder te observeren naarmate de kanker zich ontwikkelt. Hier wordt aangetoond dat niet-invasieve echografie het mogelijk maakt om de baarmoederhoorns in een muis gedurende meerdere weken serieel te beoordelen met beelden die voorspellend zijn voor de werkelijke pathologische veranderingen in de baarmoeder.
Figuur 1: Strategie voor de generatie van de Pax8-Cre induceerbare dubbele KO transgene muizen. (A) De constitutieve productie van een reverse tetracycline-controlled transactivator (rtTA) in Pax8-tot expressie brengende uteriene epitheelcellen resulteert in de induceerbare activering van Cre recombinase in aanwezigheid van tetracycline, of zijn analoge doxycycline, door binding aan tetracyclineresponselementen (TRE). Flax-locaties stroomopwaarts en stroomafwaarts van exon 8 (Arid1a) en exon 5 (Pten) zijn het doelwit van Cre-recombinase. Cre-targeted deletie van exon 8 in Arid1a resulteert in een frameshift mutatie en een early stop codon (p.Gly809Hisfs*6). Cre-targeted deletie van exon 5 in Pten resulteert in een frameshift mutatie (p.Val85Glyfs*14). (B) De Pax8-rtTA-muis brengt een omgekeerde tetracycline-gecontroleerde transactivator (rtTA) tot expressie onder controle van de Pax8-promotor. Deze muis wordt gekruist met de TetO-Cre muis die Cre recombinase uitdrukt op een tetracycline-afhankelijke manier. De nakomelingen van deze kruising drukken een tetracycline (of doxycycline)-geactiveerde Cre-recombinase uit die specifiek is voor Pax8-tot expressie brengende baarmoederepitheelcellen (Pax8-Cre transactivator). (C) Arid1a flox/flox muizen op de 129S1 achtergrond werden gekruist met Pten flox/flox op de BALB/C achtergrond (Strain C;129S4-Ptentm1Hwu/J) om de Arid1a flox/flox/Pten flox/flox transresponder muis te genereren. (D) De Pax8-Cre transactivator muis wordt gekruist met een Arid1a flox/flox/Pten flox/flox Transresponder muis. Nageslacht van deze kruising resulteert in een transgeen muizenmodel met een doxycycline induceerbare Arid1a en Pten deletie (iPAD) specifiek voor baarmoederepitheelcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beeldvormingsprocedure . (A) Een verdoofde muis waarbij de buik- en rugvacht wordt verwijderd met een tondeuse en ontharingscrème. De muis wordt via een neuskegel op inhalatie-isofluraananesthesie gehouden en op een warmtekussen geplaatst dat is bedekt met een absorberende pad. (B) Een kleine hoeveelheid voorverwarmde ultrasone gel wordt over het interessegebied op de muis en op de sonde geplaatst. Hier bevindt de muis zich in ventrale lighouding en is de sonde correct geplaatst om de nier te lokaliseren, het anatomische oriëntatiepunt direct craniaal aan de eierstok. (C) Bij dorsale lighouding kan de sonde handmatig worden gemanipuleerd om eerst oriëntatiepunten zoals de blaas te vinden om de geschatte locatie van de baarmoederhoorns te vinden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Verbetering van de zichtbaarheid en orgaandefinitie door injectie van zoutoplossing. (A) Afbeelding van een nier en lussen van het maagdarmkanaal (linksonder) vóór de IP-injectie van 1,5 ml verwarmde, steriele zoutoplossing. De linkerkant van het beeld is craniaal naar de nier. (B) Afbeelding van de nier na de zoutoplossinginjectie, met een verhoogde (hypoechoïsche ruimte, zwart) tussen de organen. Voor beide afbeeldingen, in termen van de oriëntatie, is de muis dorsaal oppervlak omhoog en craniaal tot caudaal is van links naar rechts. (C,D) Het gemarkeerde rode gedeelte toont nieroriëntatiepunten in de 2D-afbeeldingen die in A en B worden gepresenteerd. De beelden zijn gemaakt met een MS550 transducer. Schaalbalken = 2 mm in elke afbeelding. Afkortingen: GI tract = maagdarmkanaal; IP = intraperitoneaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voortplantingskanaal met oriëntatiepunten . (A) De eierstok (pijl) bevindt zich onmiddellijk caudaal tot caudale pool van de nier. (B) De baarmoederhoorn (smalle pijl) is diep en begint craniaal naar de dorsale spieren van de proximale achterpoot (pijlpunt), met de eierstok ook in zicht (grotere pijl). Schaalstaven = 2 mm. Voor alle afbeeldingen, in termen van oriëntatie, is de muis dorsaal oppervlak omhoog en craniaal tot caudaal is van links naar rechts. De beelden zijn gemaakt met een MS550 transducer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Baarmoederhoorns en blaas afgebeeld van dorsale lighouding. Echografiebeelden van twee muizen vóór de inductie van kanker. (A) Het blaaslumen is zichtbaar als een hypoechoïsche, eivormige structuur met een hyperechoïsch slijmvlies. Beide baarmoederhoorns zijn samen zichtbaar, waarbij de grenzen van elk in lichtblauw zijn getraceerd. (B) Hetzelfde beeld bij een andere muis met een veel vollere blaas. Voor beide afbeeldingen, in termen van oriëntatie, is de muis ventraal oppervlak omhoog en de afbeelding links is de muis links. De grenzen van elke baarmoederhoorn zijn getekend in lichtblauw, met gebieden in de aangrenzende tekstvakken (MS550-transducer). Schaalstaven = 3 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voorbeelden van H&E en immunohistochemie van delen van de baarmoeder 6 weken na inductie in een iPAD-muis. (A) Representatieve H&E van iPAD-muizenweefsel. b) Representatieve ARID1a immunohistochemie. De kleuring toont een verlies van Arid1a specifiek voor de kernen van Pax8-tot expressie brengende baarmoederepitheelcellen (zwarte pijl), met het behoud van Arid1a in de kernen van de baarmoederstromale cellen (witte pijl). (C) Representatieve pTEN-immunohistochemie. De kleuring toont een verlies van pTEN in het cytoplasma van Pax 8-tot expressie brengende baarmoederepitheelcellen (zwarte pijl), met het behoud van pTEN in het cytoplasma van de baarmoederstromale cellen (witte pijl). Gedetailleerde IHC-methoden zijn eerder gepubliceerd14. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: iPAD = induceerbare Pten, Arid1a dubbele deletie; H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Voorbeelden van echografiebeelden van muizen met vroege veranderingen in pathologie. (A,B) Antemortem echografie van een baarmoeder gevuld met baarmoedervocht dat van nature hyperechoïsch is De smalle pijlen geven het hypoechoïsche, verwijde lumen van de baarmoeder aan. De pijlpunt geeft het verdikte gebied van de baarmoederwand aan. (C) Bruto beeld van de gehele baarmoeder van de muis afgebeeld in B. Het witte sterretje staat ongeveer op dezelfde locatie als die afgebeeld in A. (D) Bij dezelfde muis werd de baarmoeder bewerkt en gekleurd met H&E. De sectie histologie toont verdikking van de baarmoederwand als gevolg van endometriumhyperplasie; Het voorbeeldgebied wordt aangegeven met een pijlpunt. Voor alle Amerikaanse afbeeldingen, in termen van oriëntatie, is de muis dorsaal oppervlak omhoog en craniaal naar caudaal is van links naar rechts (MS550-transducer). Schaalstaven = (A,B) 3 mm; D) 500 μm. Afkortingen: US = echografie; H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Diversiteit van baarmoederpathologie zichtbaar door echografie . (A) Een baarmoeder met hyperplasie en opgezette vloeistof die luminale dilatatie veroorzaakt tot een diameter van ~ 2,5 mm. (B) Een tweede baarmoeder met hyperplasie die in grotere mate is opgezwollen. (C) Een baarmoeder die zowel verwijd is als gevuld met een zachte weefselmassa. Schaalstaven = 3 mm. Voor alle afbeeldingen zijn de pijlen naar de ventrale kant van de baarmoederhoorn en in termen van de beeldoriëntatie is de muis dorsaal oppervlak omhoog en craniaal naar caudaal is van links naar rechts (MS550-transducer). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Veranderingen in de neoplastische ontwikkeling van de baarmoeder in de loop van de tijd in één muis. (A) Echografiebeeld van een iPAD-muis met de nier (bredere pijl), eierstok (caudaal naar nier) en baarmoeder (smalle pijl), waarbij de beenspier ook zichtbaar is (pijlpunt), vastgelegd op drie tijdstippen: nadat de muis is gestart met een doxycyclinedieet (week 0), en dan weer na 5 weken en 6 weken. Doxycycline geïnduceerde Cre-expressie met tumorsuppressorverlies, wat endometriumkanker in de loop van de tijd bevordert. (B) Dezelfde echografiebeelden als A, maar met de baarmoederhoorn rood gemarkeerd. (C) Brutobeelden van de baarmoeder in situ (smalle pijl) vanaf het tijdstip van 6 weken; Het weefsel wordt bekeken vanaf het ventrale oppervlak. D) dezelfde baarmoeder als in ex vivo ontleedde C; Het weefsel wordt bekeken vanaf het ventrale oppervlak. (E) Histologie van de baarmoedermassa (H&E-kleuring), wat wijst op adenocarcinoom uit dit voorbeeld. Voor A en B is de muis qua oriëntatie dorsaal oppervlak omhoog en craniaal tot caudaal van links naar rechts (MS550-transducer). Schaalbalken = (A,B, eerste twee afbeeldingen in elke rij) 1 mm; (A,B, derde afbeelding) 2 mm; E) 500 μm. Afkortingen: iPAD = induceerbare Pten, Arid1a dubbele deletie; H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol onderzoekt het nut van echografie voor het beoordelen van baarmoedermorfologische veranderingen in de progressie van adenocarcinoom in de baarmoeder bij muizen. In deze studie, door de inductie van endometriumkanker bij muizen longitudinaal te volgen, bleken de anatomische details gedetecteerd door echografie indicatoren te zijn van grove en histologische pathologie. Dit opent de deur voor het gebruik van longitudinale studies met kleinere aantallen muizen die op meerdere tijdstippen door echografie worden gevolgd om de progressie van baarmoederkanker bij muizen te volgen. Deze longitudinale detectie werd bereikt door gebruik te maken van een draagbare sonde en zonder het gebruik van echografieapparatuur van het railsysteem. De gebruikte hoogfrequente sondes (transducers) zijn op grote schaal beschikbaar, waardoor deze aanpak reproduceerbaar is bij meerdere instellingen wereldwijd. Kritieke stappen in het protocol omvatten het gebruik van de juiste sonde voor het resolutieniveau dat vereist is voor het experiment en het voorbereiden van de muis voor beeldvorming voorafgaand aan de echografie.
Kritieke stappen bij het voorbereiden van de muis zijn het verwijderen van al het haar uit de studiegebieden en het injecteren van vloeistof in de peritoneale holte. Bont achtergelaten op de huid kan leiden tot het vangen van bubbels in de ultrasone gel, die artefacten in de afbeeldingen kunnen produceren; Daarom moet ervoor worden gezorgd dat het haar gelijkmatig over het studiegebied wordt verwijderd. Ontharingscrème werd gekozen als de methode voor ontharing omdat het de vacht gelijkmatig over de huid verwijdert. Letsel aan de huid kan optreden als de crème te lang op de huid wordt achtergelaten (>3-4 min). Bij muizen die gevoeliger zijn voor ontharingscrème, mag de crème slechts 1-2 minuten op de huid worden gelaten om het haar te verwijderen. Vervolgens moet de muis worden afgeveegd met een reeks natte papieren handdoeken om de crème volledig te verwijderen. Nadat al het haar uit het studiegebied is verwijderd, worden steriele, warme isotone vloeistoffen in de intraperitoneale holte geïnjecteerd om het contrast te vergroten en te helpen bij het definiëren van de grenzen van de buikorganen. In deze studie was het injecteren van 1-2 ml vloeistof voldoende om de eierstok, eileider en baarmoederhoorns te differentiëren. De vloeistof wordt geleidelijk geabsorbeerd en het is het beste om onmiddellijk voor de beeldvorming te injecteren. Muizen worden snel onderkoeld onder isofluraananesthesie. Dit kan worden voorkomen door warme zoutoplossing te injecteren (opgeslagen in spuiten op een verwarmingspad) en door de muis ook op een verwarmingspad te plaatsen en de ultrasone gel indien mogelijk voor te verwarmen. Beeldvormingssessies met ervaren sonografen lopen op 5-10 min / muis, en met deze korte tijd trad geen significante onderkoeling op. Indien nodig kan tot 2 ml zoutoplossing extra in de buik worden geïnjecteerd voor een grotere scheiding van de organen.
De hier beschreven methoden zijn bedoeld om gemakkelijk reproduceerbaar te zijn zonder gespecialiseerde apparatuur buiten het echoapparaat en de sonde (en). In de gepresenteerde methode wordt de sonde handmatig gemanipuleerd zonder hulp van een railsysteem. Deze handmatige methode is sneller en biedt grote flexibiliteit in de hoeken en druk die wordt uitgeoefend om kleine functies te markeren. Het handmatig richten van de sondes over de buik en het gebruik van transducers met een lagere resolutie zou de kwaliteit van individuele beelden kunnen beperken in vergelijking met beelden van een transducer die op het railsysteem is bevestigd4. Een railsysteem zou nuttig zijn voor injecties in de baarmoeder (in foetussen) of intracardiale injecties wanneer meer stabiliteit nodig is. Er is echter een afweging met betrekking tot minimale manipulatietijd en verhoogde toegankelijkheid voor het brede scala aan instellingen die geen gespecialiseerde echografiefaciliteiten hebben. Het succes van deze vereenvoudigde methode illustreert hoe echografie kan worden gebruikt voor een reeks onderzoeken. De voorgestelde methode is zeer geschikt voor het vastleggen van longitudinale weefselveranderingen in baarmoederkankermodellen zonder de vereiste van speciale apparatuur en kan worden toegepast op andere progressieve ziektemodellen. Handmatige manipulatie van de muizen tijdens beeldvorming kan de variabiliteit in de exacte weefseldiepte en -locatie vergroten, maar voor studies die niet op deze factoren vertrouwen, is de beeldkwaliteit voldoende om pathologische veranderingen te detecteren.
Het is belangrijk om video's op te slaan tijdens het beeldvorming; Later op het werkstation van de gebruiker kunnen de video's worden gestopt bij elk frame dat representatief is voor de anatomie die moet worden vastgelegd en gemeten. Beelden van de organen kunnen worden gemeten (diameter, omtrek of lengte) (figuur 5, baarmoederhoorndoorsnede gemeten) en het tumorgebied kan worden berekend. Video's, meer dan enkele frames, vergemakkelijken de identificatie van organen in een grotere anatomische context. Video's zijn ook nuttig voor het bepalen van de beweging van de dunne en dikke darm, wat kan helpen de darmen van de baarmoeder te onderscheiden. Het verkrijgen van afbeeldingen van hoge kwaliteit hangt ook af van de bekendheid met de anatomie van muizen. Voor het afbeelden van de beweegbare baarmoeder versus het afbeelden van meer stationaire weefsels (bijv. Een geïmplanteerde xenografttumor, eierstokken), heeft het gebruik van de handmatige methode het voordeel dat de baarmoederhoorns van proximaal naar distaal worden gescand en gevolgd. Tijdens het scannen kan een geleidelijke aanpassing van de handhoeken worden gebruikt om de hoorn te volgen. De MS550-sonde werd gebruikt voor alle beeldvorming in deze studie en heeft de voorkeur voor de baarmoeder in vergelijking met de MS700-sonde met een hogere resolutie, wat beter is voor eierstokken. Werk met behulp van de MS700 om de schildklier van de muis in beeld te brengen is onlangs gepubliceerd, met de hoge resolutie die mogelijk is in andere weefsels15. Hand-held probe beeldvorming is nuttig vanwege de verschillende mate van weefseldiepte van de baarmoeder tussen de eierstok en de blaas. In dit werk hielp het bewegen tussen gemakkelijk herkenbare anatomische oriëntatiepunten, zoals de nier en de proximale anatomie van de achterpoten, bij het vastleggen van vergelijkbare beelden over de verschillende tijdspunten bij het afbeelden van de baarmoeder vanuit het dorsale aspect op het lichaam.
Deze ultrasone methode met hoge resolutie om de anatomische veranderingen in de baarmoeder in de loop van de tijd tijdens tumorigenese te volgen, is superieur aan de huidige methoden waarbij dieren uit meerdere cohorten op verschillende tijdstippen worden geëuthanaseerd. Echografie verfijnt het model en vermindert het aantal muizen dat nodig is voor het experiment, waardoor kosten en tijd worden verminderd. Belangrijk is dat deze methode het mogelijk maakt om ziekteprogressie op individueel niveau te volgen, wat kan leiden tot inzichten die worden gemaskeerd in studies die afhankelijk zijn van cohorten die worden opgeofferd door het tijdstip in plaats van het ziektestadium. Vanwege de niet-invasieve aard heeft echografie van muizen veel potentiële toepassingen voor onderzoek bij baarmoeder- of eierstokkanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de financiering van het NCI Ovarian Cancer SPORE Program P50CA228991, postdoctoraal trainingsprogramma 5T32OD011089 en de Richard W. TeLinde Endowment, Johns Hopkins University. Het project werd ook gedeeltelijk gefinancierd door de subsidies voor lopende uitgaven aan particuliere instellingen voor hoger onderwijs van de Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
