تلعب الضفيرة المشيمية (CP) ، وهي نسيج غير مدروس في علم الأعصاب ، دورا رئيسيا في صحة ومرض الجهاز العصبي المركزي. يصف هذا البروتوكول تقنية التشريح المجهري لعزل CP واستخدام المجهر الإلكتروني الماسح للحصول على رؤية شاملة لهيكله الخلوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التشريح المجهري والمجهر الإلكتروني الماسح الكامل للجبل تصور الضفيرة المشيمية للفأر
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الضفيرة المشيمية (CP) ، وهي بنية شديدة الأوعية الدموية تبرز في بطينات الدماغ ، هي واحدة من أكثر الأنسجة غير المدروسة في علم الأعصاب. نظرا لأنه أصبح من الواضح بشكل متزايد أن هذا الهيكل الصغير يلعب دورا حاسما في صحة ومرض الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، فمن الأهمية بمكان تشريح الشلل الدماغي بشكل صحيح من البطينين في الدماغ بطريقة تسمح بالمعالجة النهائية ، بدءا من التحليل الوظيفي إلى التحليل الهيكلي. هنا ، يتم وصف عزل فأر البطين الدماغي الجانبي والرابع CP دون الحاجة إلى أدوات أو معدات متخصصة. تحافظ تقنية العزل هذه على صلاحية الخلايا ووظيفتها وهيكلها داخل CP. بسبب الأوعية الدموية العالية ، يمكن تصور CP عائما داخل تجاويف البطين في الدماغ باستخدام مجهر مجهر. ومع ذلك ، فإن التروية عبر القلب المطلوبة لتحليل المصب يمكن أن تعقد تحديد أنسجة CP. اعتمادا على خطوات المعالجة الإضافية (على سبيل المثال ، تحليل الحمض النووي الريبي والبروتين) ، يمكن حل ذلك عن طريق تصور CP عن طريق التروية عبر القلب مع بروموفينول الأزرق. بعد العزلة ، يمكن معالجة CP باستخدام العديد من التقنيات ، بما في ذلك تحليل الحمض النووي الريبي أو البروتين أو الخلية المفردة ، لاكتساب مزيد من الفهم لوظيفة بنية الدماغ الخاصة هذه. هنا ، يتم استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) على CP الكامل للحصول على رؤية شاملة للهيكل.
المقدمة
تفصل الحواجز الضيقة الجهاز العصبي المركزي (CNS) عن المحيط ، بما في ذلك الحاجز الدموي الدماغي (BBB) وحاجز السائل الدموي النخاعي (CSF). تحمي هذه الحواجز الجهاز العصبي المركزي من الإهانات الخارجية وتضمن بيئة دقيقة متوازنة وخاضعة للرقابة1،2،3. في حين تمت دراسة BBB على نطاق واسع بمرور الوقت ، فإن حاجز الدم CSF الموجود في الضفيرة المشيمية (CP) اكتسب اهتماما بحثيا متزايدا خلال العقد الماضي. يمكن العثور على هذا الحاجز الأخير في البطينين الأربعة للدماغ (الشكل 1 أ ، ب) ويتميز بطبقة واحدة من خلايا الضفيرة الظهارية المشيمية (CPE) المحيطة بالسدى المركزي ، وال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة في هذه الدراسة وفقا للتشريعات الوطنية (القانون البلجيكي 14/08/1986 و 22/12/2003 ، المرسوم الملكي البلجيكي 06/04/2010) والتشريعات الأوروبية (توجيهات الاتحاد الأوروبي 2010/63 / EU ، 86/609 / EEC). تمت الموافقة على جميع التجارب على الفئران والبروتوكولات الحيوانية من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة غنت (أرقام التصاريح LA1400091 و EC 2017-026).
1. التحضير
- التخدير: تحضير مخدر نهائي. على سبيل المثال ، يمكن تحضير محلول بنتوباربيتال الصوديوم (≥100 مجم / كجم) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- محلول التروية عبر القلب: تحضير 10 مل (لكل فأر) من محلول PBS / الهيبارين (يحتوي على 0....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يسهل البروتوكول الموصوف العزل الفعال لل CP من البطينين الجانبي لدماغ الفأر (الشكل 2A-C) والرابع (الشكل 2D-F). بعد عزل الدماغ كله ، يتم استخدام الملقط لسهمي الدماغ وتحديد CPs العائمة في البطينين الجانبيين. يمكن عزل CP من البطين الرابع من الجانب المخيخي من الدماغ. يمكن استخدام التروية مع البروموفينول الأزرق لتصور CP (الشكل 2A ، D) ؛ ومع ذلك ، عندما لا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا ، يتم وصف طريقة لعزل الضفيرة المشيمية (CP) من البطين الجانبي والبطين الرابع لدماغ الفأر. تسهل طريقة التركيب الكاملة للإنتاج الأنظف إجراء مزيد من التحليل باستخدام مجموعة من التقنيات للحصول على رؤية كاملة لمورفولوجيا الإنتاج الأنظف والتركيب الخلوي والنسخ والبروتين والإفرازات. مثل هذه التحليلات ضرورية للحصول على فهم أفضل لهذا الهيكل الرائع البارز من البطينين في الدماغ. هذه المعرفة ذات أهمية بحثية كبيرة ، حيث أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الإنتاج الأنظف يلعب دورا حاسما في الصحة والمرض9،10،11،12،13.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة البلجيكية لأبحاث الزهايمر (SAO ؛ رقم المشروع: 20200032) ، ومؤسسة الأبحاث فلاندرز (FWO Vlaanderen ؛ أرقام المشروع: 1268823N ، 11D0520N ، 1195021N) وصندوق Baillet Latour. نشكر VIB BioImaging Core على التدريب والدعم والوصول إلى حديقة الأدوات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 26 جرام × 1/2 إبرة | Henke Sass Wolf | 4710004512 | |
| عينة من الألومنيوم يتصاعد EM | Sciences | 75220 | |
| Cacodylate buffer | EM Sciences | 11652 | |
| شفرات جراحية من الصلب الكربوني | Swann-Morton | 0210 | الحجم: 0.45 مم × 12 مم |
| علامات تبويب لاصقة للكربون -12 مم | EM Sciences | 77825-12 | |
| مجفف النقطة الحرجة | Bal-Tec | CPD030 | |
| Crossbeam 540 | Zeiss | SEM system | |
| ملقط | أدوات العلوم الدقيقة GmbH | 91197-00 | |
| Glutaraldehyde | EM Sciences | 16220 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H-3125 | |
| Ismatec Reglo ICC مضخة التمعجية الرقمية 2-قناة | Metrohm بلجيكا NV | CPA-7800160 | |
| أوزميوم رباعي أكسيد | EM Sciences | 19170 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) Lonza | BE17-516F | ||
| Platinum ؛ | النصاب القانوني | Q150T ES | PBS بدون Ca ++ Mg ++ أو الفينول الأحمر ؛ معقم مفلتر |
| الصوديوم Pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| سلة عينة من الفولاذ المقاوم للصدأ | EM Sciences | 70190-01 | |
| Stemi DV4 مجهر ستيريو | Zeiss | ||
| مقص جراحي | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 |
المراجع
- Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
