Summary
Сосудистое сплетение (ХП), малоизученная ткань в неврологии, играет ключевую роль в здоровье и заболеваниях центральной нервной системы. Этот протокол описывает метод микродиссекции для выделения CP и использование сканирующей электронной микроскопии для получения общего представления о его клеточной структуре.
Abstract
Сосудистое сплетение (ХП), сильно васкуляризированная структура, выступающая в желудочки головного мозга, является одной из наиболее малоизученных тканей в неврологии. Поскольку становится все более очевидным, что эта крошечная структура играет решающую роль в здоровье и заболеваниях центральной нервной системы (ЦНС), крайне важно правильно рассечь ДЦП из желудочков головного мозга таким образом, чтобы обеспечить последующую обработку, начиная от функционального и заканчивая структурным анализом. Здесь описана изоляция ЦП бокового и четвертого желудочков головного мозга мыши без необходимости использования специализированных инструментов или оборудования. Этот метод изоляции сохраняет жизнеспособность, функцию и структуру клеток внутри CP. Из-за высокой васкуляризации CP можно визуализировать плавающим внутри желудочковых полостей мозга с помощью бинокулярного микроскопа. Однако транскардиальная перфузия, необходимая для последующего анализа, может усложнить идентификацию ткани ЦП. В зависимости от дальнейших этапов обработки (например, анализ РНК и белка) это может быть решено путем визуализации CP с помощью транскардиальной перфузии бромфеноловым синим. После выделения CP может быть обработан с использованием нескольких методов, включая анализ РНК, белка или отдельных клеток, чтобы получить более глубокое понимание функции этой особой структуры мозга. Здесь сканирующая электронная микроскопия (SEM) на всей монтировке CP используется для получения общего представления о структуре.
Introduction
Жесткие барьеры отделяют центральную нервную систему (ЦНС) от периферии, включая гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и гемато-спинномозговой жидкость (СМЖ). Эти барьеры защищают ЦНС от внешних воздействий и обеспечивают сбалансированную и контролируемую микросреду 1,2,3. В то время как ГЭБ широко изучался с течением времени, гемато-ликворный барьер, расположенный в сосудистом сплетении (ХП), только приобрел растущий исследовательский интерес в течение последнего десятилетия. Этот последний барьер может быть обнаружен в четырех желудочках головного мозга (рис. 1A, B) и характеризуется одним слоем эпителиальных клеток сосудистого сплетения (CPE), окружающих центральную строму, негерметичные капилляры, фибробласты и популяцию лимфоидных и миелоидных клеток (рис. 1C)4,5,6 . Клетки CPE прочно соединены между собой плотными соединениями, что предотвращает утечку из нижележащих фенестрированных кровеносных капилляров в спинномозговую жидкость и мозг. Кроме того, транспорт через клетки CPE регулируется рядом транспортных систем внутрь и наружу, которые управляют притоком полезных соединений (например, питательных веществ и гормонов) из крови в спинномозговую жидкость и оттоком вредных молекул (например, метаболических отходов, избытка нейротрансмиттеров) в другом направлении 1,6. Чтобы иметь возможность выполнять свою активную транспортную функцию, клетки CPE содержат многочисленные митохондрии в своей цитоплазме7. Кроме того, CP является основным источником спинномозговой жидкости и действует как привратник мозга благодаря присутствию резидентных воспалительных клеток1. Благодаря своему уникальному расположению между кровью и мозгом, CP также идеально подходит для осуществления иммунного надзора8.
Рисунок 1: Схематический обзор расположения и состава сосудистого сплетения (ХП). (A, B) Ткань CP находится в двух боковых, третьем и четвертом желудочках (A) человеческого и (B) мышиного мозга. (C) Ткань CP состоит из одного слоя плотно соединенных кубовидных клеток эпителия CP (CPE), окружающих фенестрированные капилляры, рыхлую соединительную ткань, лимфоидные и миелоидные клетки, и образует гемато-спинномозговой барьер (адаптированный и модифицированный из ссылки23). Рисунок создан с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
За последнее десятилетие все больше доказательств, в том числе несколько отчетов нашей исследовательской группы, показали, что ДЦП играет центральную роль в здоровье и болезнях 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Например, известно, что стареющий барьер кровь-спинномозговая жидкость проявляет морфологические изменения, в частности, в ядрах, микроворсинках и базальной мембране 1,19. Кроме того, в контексте болезни Альцгеймера нарушается общая целостность барьера, и все эти возрастные изменения кажутся еще более выраженными 1,8,20. В дополнение к морфологическим изменениям, транскриптом, протеом и секретом CP изменяются во время болезни 12,21,22,23. Таким образом, передовые знания о ДЦП необходимы для лучшего понимания его роли в неврологических заболеваниях и потенциальной разработки новых терапевтических стратегий.
Эффективный метод точной микродиссекции ЦП из желудочков головного мозга является первым бесценным шагом, позволяющим правильно исследовать эту крошечную структуру мозга. Из-за своей высокой васкуляризированной природы (рис. 2B) CP, плавающий внутри желудочковых полостей мозга, может быть идентифицирован с помощью бинокулярного микроскопа. Тем не менее, транскардиальная перфузия часто требуется для последующего анализа, что усложняет правильную идентификацию и изоляцию ткани CP (рис. 2C). Если позволяют дальнейшие этапы обработки (например, в случае анализа РНК и белка), CP можно визуализировать с помощью транскардиальной перфузии бромфенольным синим (рис. 2A). В нескольких публикациях уже описывается выделение ДЦП из мозгакрысы 24 и мышного детеныша 25. Здесь описан метод изоляции микродиссекции для выделения CP от взрослых мышей. Важно отметить, что этот метод изоляции сохраняет жизнеспособность, функцию и структуру клеток внутри CP. Здесь описана изоляция ЦП, плавающая в четвертом и боковых желудочках. Короче говоря, мышей неизлечимо анестезируют и, при необходимости, транскардиально перфузируют. Однако следует отметить, что перфузия может повредить структуру клеток внутри КП. Следовательно, если образец должен быть проанализирован с использованием просвечивающей электронной микроскопии (TEM), сканирующей электронной микроскопии с последовательным блоком (SBF-SEM) или сфокусированного ионного пучка SEM (FIB-SEM), перфузию не следует проводить. Затем весь мозг изолируется, и щипцы используются для сагиттальной гемисекции мозга. Отсюда ХП, плавающие в боковых желудочках, могут быть идентифицированы и рассечены, в то время как ХП из четвертого желудочка может быть выделен из мозжечковой стороны мозга.
Рисунок 2: Визуализация (A-C) четвертого и (D-F) бокового сосудистого сплетения желудочка (CP) после (A, D) перфузии бромфенольного синего, (B, E) отсутствия перфузии и (C, F) перфузии PBS / гепарином. Снимки сделаны с помощью стереомикроскопа (8-32-кратное увеличение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
После того, как CP правильно рассечен из желудочков мозга, можно применить целый репертуар методов, чтобы получить дальнейшее понимание функции этой структуры. Например, проточная цитометрия или секвенирование одноклеточной РНК могут быть выполнены для количественного определения и фенотипического анализа инфильтрирующих воспалительных клеток при определенных условияхзаболевания 26,27. В дополнение к клеточному составу, молекулярный состав CP может быть проанализирован для оценки присутствия цитокинов и хемокинов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблоттинга или одновременного анализа нескольких цитокинов с использованием массивацитокиновых шариков 28. Кроме того, транскриптомный, сосудистый, иммунно-клеточный гистологический и секретомный анализы могут быть выполнены на микрорассеченных эксплантатахCP 29. Здесь сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) на всей монтировке CP используется для получения общего представления о структуре CP. SEM использует пучок сфокусированных электронов для сканирования поверхности и создания изображения топографии и состава поверхности. Поскольку длина волны электронов намного меньше, чем у света, разрешение СЭМ находится в нанометровом диапазоне и превосходит разрешение светового микроскопа. Следовательно, морфологические исследования на субклеточном уровне могут быть выполнены с помощью SEM. Вкратце, рассеченный CP немедленно переносится в фиксатор, содержащий глутаровый альдегид, для фиксации в течение ночи с последующей осмикацией и окрашиванием уранилацетатом. Затем образцы обрабатывают окраской аспартата свинца, обезвоживают и, в конечном итоге, внедряют для визуализации.
Таким образом, этот протокол способствует эффективному выделению CP из желудочков головного мозга мыши, которые могут быть дополнительно проанализированы с использованием различных последующих методов для исследования его структуры и функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных, описанные в этом исследовании, были проведены в соответствии с национальным (Бельгийский закон 14/08/1986 и 22/12/2003, Бельгийский королевский указ 06/04/2010) и европейским законодательством (Директивы ЕС 2010/63/ЕС, 86/609/ЕЭС). Все эксперименты на мышах и животных были одобрены комитетом по этике Гентского университета (номера разрешений LA1400091 и EC 2017-026).
1. Подготовка
- Анестетики: Приготовьте терминальный анестетик. Например, можно приготовить раствор пентобарбитала натрия (≥100 мг/кг) в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
- Раствор для транскардиальной перфузии: Приготовьте 10 мл (на мышь) раствора PBS / гепарина (содержащего 0,2% гепарина) с добавлением 0,5% бромфенольного синего.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если последующие этапы обработки позволяют (например, в случае анализа РНК и белка), сосудистое сплетение (CP) можно визуализировать с помощью транскардиальной перфузии бромфеноловым синим. Если бромфеноловый синий несовместим с дальнейшими этапами обработки (например, для визуализации), используйте PBS / гепарин для перфузии. - Подготовьте решения, необходимые для SEM-анализа.
- Приготовьте 0,1 М буфер Na-какодилата (рН 7,4). Готовят раствор 2% параформальдегида и 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М Na-какодилатном буфере. Сделайте 20 мл этого раствора на образец.
- Приготовьте 2% тетраоксид осмия в 0,1 М Na-какодилатном буфере (5 мл на образец).
- Приготовьте 50%, 70%, 85% и 100% растворы EtOH. Приготовьте 5 мл каждого раствора EtOH на образец.
2. Микродиссекция сосудистого сплетения из латерального и четвертого желудочка
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались 9-недельные самки мышей C57BL / 6. Однако описанный метод изоляции не зависит от штамма, пола и возраста взрослой мыши.
- Изолируйте мозг мыши.
- Внутрибрюшинно вводят смертельную дозу барбитурата короткого действия (>100 мг / кг, приготовленный на этапе 1.1) с помощью иглы 26G для окончательной анестезии мыши. Проверьте ножной рефлекс мыши, ущипнув щипцами ее заднюю лапу.
- Когда рефлекс стопы отсутствует, поместите неизлечимо анестезированное животное в положение дорсального пролежня и зафиксируйте мышь, прижав конечности к тарелке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если транскардиальная перфузия мышей не требуется, в зависимости от метода последующего анализа (например, для визуализации SEM), перейдите к шагу 2.1.7. Однако, если перфузия необходима для удаления клеток крови или других компонентов в крови, CP можно визуализировать как синюю структуру, плавающую в желудочках головного мозга посредством перфузии бромфеноловым синим. - Продезинфицируйте грудную клетку, распылив 70% этанол. Поместите стерильную драпировку вокруг операционной области. Сделайте надрез ~ 4 см прямо под диафрагмой с помощью хирургического лезвия из углеродистой стали (см. Таблицу материалов).
- Вскрыть кожу и обнажить грудную клетку с помощью хирургических ножниц. Разрежьте диафрагму полностью открытой.
- Отделите грудную клетку, чтобы обнажить легкие и бьющееся сердце.
- Транскардиально перфузируют мышей 10 мл перфузионного раствора со скоростью 4,5 мл / мин с помощью перфузионного насоса (см. Таблицу материалов). Перфузия займет ~2 мин. Вставьте иглу 26G в левый желудочек, чтобы перекачать раствор в системный контур. Кроме того, сделайте разрез хирургическими ножницами в правом предсердии, чтобы кровь могла выйти из кровообращения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионный насос предпочтительнее ручного введения жидкости, так как он будет доставлять жидкости с точно запрограммированной скоростью и гарантировать, что силы сдвига, вызванные перфузией, не будут слишком сильными. Чрезмерные силы сдвига поставят под угрозу жизнеспособность и структуру клеток внутри CP. Кроме того, рекомендуемая здесь скорость перфузионного потока оптимальна для перфузии взрослых мышей с 7 недель. Если используются более молодые мыши, следует использовать более низкую скорость потока. Также важно смыть кровь, выходящую из правого предсердия, чтобы сохранить чистоту в месте операции. - Обезглавить мышь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы отрезать голову как можно ниже плеча, чтобы сохранить структуру мозга. Если разрез будет слишком высоким, мозжечок может быть поврежден. - После обезглавливания разрежьте кожу головы, сделав надрез между ушами до глаз. Потяните кожу вбок, чтобы обнажить череп. Затем разрезайте череп, следуя чешуйчатым швам, по направлению к носовой части.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно аккуратно удалить череп, чтобы сохранить целостность мозга. - Поместите мозг в ледяную чашку Петри и добавьте 1 мл ледяного 1x PBS на ткань мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ:Покрытие блюда не нужно.
- Изолируют ЦП, плавающий в четвертом желудочке.
- Аккуратно отрежьте мозжечок от головного мозга скальпелем. Головной мозг является самой большой частью мозга, в то время как мозжечок является гораздо меньшей частью в задней части мозга. При необходимости удаляют оставшиеся части ткани ствола мозга из мозжечка.
- Поверните мозг так, чтобы линия разреза была обращена вверх. Убедитесь, что полость четвертого желудочка теперь видна в середине разреза, а CP плавает в дорсальном месте. При необходимости немного приоткройте желудочек, растянув соединительную ткань острыми щипцами. Таким образом, КП будет более заметным и легкодоступным.
- Аккуратно вырвите КП из стенки желудочка с помощью крошечных острых щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе важно только трогать и вынимать CP, чтобы не загрязнить образец окружающими тканями. Открытие желудочков, как описано на шаге 2.2.2, облегчит этап 2.2.3.
- Изолируют ЦП, выступающий из бокового желудочка.
- Используйте крошечные острые щипцы, чтобы разрезать мозг на два полушария.
- Поверните мозг так, чтобы линия разреза была обращена вверх. Чтобы раскрыть боковой желудочек, аккуратно оттяните кору от таламуса.
- Втяните гиппокамп к средней сагиттальной линии разреза. Боковой желудочек теперь виден, а CP лежит на дне желудочка. При необходимости немного приоткройте желудочек, растянув соединительную ткань острыми щипцами. Таким образом, КП будет более заметным и легкодоступным.
- Используйте крошечные острые щипцы, чтобы аккуратно вырвать CP из стенки желудочка.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе важно только трогать и вынимать CP, чтобы не загрязнить образец окружающими тканями. Открытие желудочков, как описано на шаге 2.3.4, облегчит этап 2.3.5. Будьте осторожны на этом этапе, чтобы максимально сохранить структуру CP. Проще всего начинать вытягивать КП в ростральном направлении к каудальному.
3. Морфологический анализ ткани ХП с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)
ВНИМАНИЕ: Токсичные растворы используются на следующих этапах обработки. Пробоподготовку рекомендуется проводить в вытяжном шкафу.
- Выполните пробоподготовку для SEM, как описано ниже.
- Переведите свежий выделенный CP в свежеприготовленный фиксирующий раствор, содержащий 2% параформальдегида и 2,5% глутарового альдегида, в 0,1 М Na-какодилатном буфере (рН 7,4). Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ткань CP очень хрупкая и тонкая, ткань следует помещать в небольшие корзины для образцов (см. Таблицу материалов) для переноса между буферами. Таким образом, структура ткани будет лучше сохранена. Фиксатор на основе какодилата используется вместо фиксатора на основе PBS, так как сильный буфер какодилата может противостоять низкому рН глутарового альдегида в ЭМ-фиксаторе. - Промывают образец 3 раза в течение 5 мин каждый 3-5 мл 0,1 М буфера Na-какодилата (рН 7,4).
- После фиксации образцов в 3-5 мл 2% тетраоксида осмия в 0,1 М Na-какодилатном буфере в течение 30 мин. Промойте образцы 3 раза в течение 5 минут каждый 3-5 мл сверхчистой воды.
- Обезвоживают образцы в серии ледяных растворов с возрастающими концентрациями EtOH (50%, 70%, 85%, 100%) в течение 15 мин на раствор EtOH. Используйте сушилку для критических точек, чтобы правильно высушить образец.
ПРИМЕЧАНИЕ Переход из жидкой фазы в газообразную влияет на поверхностное натяжение, вызывая повреждение структуры поверхности. Этап сушки в критической точке позволяет сохранить структуру поверхности. - Аккуратно поместите образец на крепление для образца, снабженное карбоновой наклейкой (см. Таблицу материалов).
- Покройте образцы тонким слоем (2-5 нм) платины. Для этого установите источник платины в вакуумной системе между двумя сильноточными электрическими клеммами и нагрейте платину до температуры испарения. На образец наносится тонкая струя платины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробный протокол для этого шага приведен в ссылке30. Помимо платины, также можно использовать золото или золото/палладий.
- Переведите свежий выделенный CP в свежеприготовленный фиксирующий раствор, содержащий 2% параформальдегида и 2,5% глутарового альдегида, в 0,1 М Na-какодилатном буфере (рН 7,4). Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
- Визуализируйте образцы CP с помощью SEM (см. Таблицу материалов). Процедура визуализации ткани ХП с помощью СЭМ аналогична процедуре визуализации других типов тканей и зависит от используемого программного обеспечения и инструментов. Пошаговый протокол SEM с сопроводительным видео доступен в ссылке31 илиссылке 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный протокол способствует эффективному выделению CP из бокового (рис. 2A-C) и четвертого (рис. 2D-F) желудочков головного мозга мыши. После изоляции всего мозга щипцы используются для сагиттальной гемисекции мозга и идентификации ДЦП, плавающих в боковых желудочках. ДЦП из четвертого желудочка может быть выделен из мозжечковой стороны мозга. Перфузия бромфеноловым синим может быть использована для визуализации CP (рис. 2A, D); однако, когда бромфеноловый синий не допускается на дальнейших стадиях обработки, перфузия PBS/гепарином (рис. 2C, F) или отсутствие перфузии (рис. 2B, E) может быть выполнена. После выделения ХП из желудочков головного мозга можно провести целый репертуар анализов ткани. К ним относятся профилирование экспрессии генов (ОТ-кПЦР)28, профилирование типов клеток (проточная цитометрия32, секвенирование одноклеточной РНК 26,27) и обнаружение цитокинов и хемокинов 28с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблоттинга или мультиплексного иммуноанализа. Кроме того, микрорассеченный CP может быть помещен в культуру для получения эксплантатов CP для дальнейшего выяснения функции и, например, изучения его секретома в ответ на специфический стимул23,28,29. В этой рукописи мы описываем, как выполнить сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) для морфологического анализа поверхности клеток эпителия сосудистого сплетения (CPE). На рисунке 3 показаны обзорные изображения ХП, выделенного из четвертого желудочка (рис. 3А), и ЦП, выделенного из бокового желудочка (рис. 3В), полученные с помощью СЭМ. На этих изображениях отчетливо видна типичная С-образная форма латерального ХП и двухплечевая структура ХП четвертого желудочка.
Рисунок 3: Обзорные изображения рассеченной ткани сосудистого сплетения (ХП) сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). (А, Б) Репрезентативное СЭМ-изображение ЦП, выделенное из (А) четвертого и (Б) боковых желудочков мозга мыши. Масштабная линейка = 100 мкм. Настройки: электронное высокое напряжение (EHT) = 5,00 кВ; рабочее расстояние (WD) = 4,8 мм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Увеличивая масштаб ячеек CPE, можно обнаружить другие клетки на апикальной стороне клеток CPE (рис. 4A). Клетка, запечатленная на изображении, возможно, является клеткой эпиплекса, макрофагоподобной клеткой, которая находится на апикальной поверхности CP. Однако определить специфическую природу этой клетки с помощью SEM невозможно. В дополнение к СЭМ-визуализации можно выполнить двухфотонную визуализацию эпителия сосудистого сплетения в живых эксплантатах, как показано Shipley et al.29. В то время как SEM облегчает визуализацию поверхностных структур CP, двухфотонная визуализация может позволить визуализировать широкий спектр клеток и клеточных процессов, если они могут быть флуоресцентно контролируемыми. Это включает визуализацию сосудистых и иммунных клеток, а также секреторных событий в эксплантеCP 29.
Более высокое увеличение SEM выявило везикулоподобные структуры на апикальной стороне клеток CPE (рис. 4B), а также микроворсинки (рис. 4C). Эти микроворсинки выступают в спинномозговую жидкость (ликвор) и увеличивают площадь поверхности клеток CPE между клетками и спинномозговой жидкостью. Эти результаты показывают, что морфологические изменения клеток CPE в болезненных условиях могут быть исследованы с помощью SEM.
Рисунок 4: Детальные изображения ткани сосудистого сплетения (CP), полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). (A) Клетка на апикальной стороне эпителиальных клеток сосудистого сплетения (CPE). Масштабная линейка = 2 мкм. (B) Везикулоподобные структуры на апикальной стороне клеток CPE. Масштабная линейка = 10 мкм. (C) Визуализация клеточной поверхности CPE с ее микроворсинками. Масштабная линейка = 1 мкм. Настройки: электронное высокое напряжение (EHT) = 5,00 кВ; рабочее расстояние (WD) = 4,9 мм; 3,000-кратное увеличение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь описан способ выделения сосудистого сплетения (ХП) из бокового желудочка и четвертого желудочка мозга мыши. Весь этот метод монтажа CP облегчает дальнейший анализ с использованием репертуара методов, чтобы получить полное представление о морфологии CP, клеточном составе, транскриптоме, протеоме и секретоме. Такие анализы имеют решающее значение для лучшего понимания этой замечательной структуры, выступающей из желудочков мозга. Эти знания представляют огромный исследовательский интерес, поскольку становится все более очевидным, что ДЦП играет решающую роль в здоровье и болезнях 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.
Критические шаги, изменения и устранение неполадок метода
Крайне важно проверить рефлекс ноги мыши, чтобы убедиться, что терминальная анестезия выполнена хорошо. Помимо этических соображений, это также гарантирует, что мышь останется в нужном месте во время выполнения экспериментальной процедуры. Цель состоит в том, чтобы обезболить животное, чтобы оно не испытывало боли во время процедуры, пока сердце бьется во время перфузии. Если дальнейшая обработка ткани требует удаления крови, может быть выполнена транскардиальная перфузия. Здесь используется физиологический раствор, содержащий гепарин, чтобы избежать свертывания крови. ЭДТА также может быть использована для этой цели, однако, если необходимо сохранить жизнеспособность клеток, гепарин является лучшим выбором по сравнению с ЭДТА. Перфузию следует начинать немедленно, когда сердце перестает биться из-за чрезмерной анестезии. Перфузионный насос предпочтительнее ручного введения жидкости, так как он обеспечивает подачу жидкости с точно запрограммированной скоростью и гарантирует, что силы сдвига, вызванные перфузией, не будут слишком сильными. Чрезмерные силы сдвига поставят под угрозу жизнеспособность и структуру клеток внутри CP.
Требуется натренированный глаз, чтобы увидеть ДЦП, плавающий в желудочках мозга мыши. По этой причине крайне важно много практиковаться. Рекомендуется начинать обучение на мышах, перфузированных бромфеноловым синим, так как это окрасит ХП в синий цвет и облегчит различение крошечной ткани ХП от остальной части мозга (рис. 2A, D). В более поздних испытаниях CP может быть выделен из неперфузированной мыши. Это сложнее по сравнению с выделением CP у мыши, прошедшей бромфенол синий перфуз, но ткань CP все еще может быть идентифицирована по ее сильно васкуляризированной природе (рис. 2B, E). Только после обширной тренировки можно выделить ткань ЦП из желудочков головного мозга у неперфузированной мыши без загрязнения паренхимой мозга (рис. 2C, F).
КП является очень хрупкой и тонкой структурой, что означает, что его выделение должно выполняться с необходимой осторожностью, чтобы сохранить жизнеспособность, функцию и структуру клеток внутри него. Таким образом, различные шаги в описанном протоколе должны выполняться с необходимой точностью и осторожностью для сохранения целостности мозга. Во-первых, важно обезглавить мышь близко к плечам. Если разрез слишком высок, мозжечок может быть поврежден, что осложнит изоляцию ДЦП в четвертом желудочке. Далее череп нужно удалить аккуратно, чтобы не повредить мозг. После того, как мозг изолирован, крайне важно держать его холодным, чтобы мозг не стал мягким, так как это значительно усложнит изоляцию ДЦП. Для этого важно поместить мозг в ледяную чашку Петри и добавить ледяной PBS поверх мозга. Для выполнения описанной техники изоляции необходим определенный уровень подготовки, так как это значительно сократит время обработки между обезглавливанием мыши и окончательным выделением ДЦП. Короткий процесс изоляции повысит жизнеспособность и сохранение структуры изолированной ткани. Наконец, инструменты, используемые для изоляции, особенно щипцы, должны быть острыми и заостренными, чтобы облегчить быструю и эффективную изоляцию ДЦП из желудочков. Однако следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить целостность конструкции во время изоляции.
Чтобы сохранить целостность ткани во время обработки образца для SEM, CP можно помещать в небольшие корзины для образцов при переносе между буферами, чтобы избежать прикосновения к самой ткани. Кроме того, рекомендуется выполнять сушку в критических точках при удалении ткани из растворов EtOH. Это обеспечивает сохранение структуры поверхности КП, в том числе микроворсинок. Поверхностное натяжение, вызванное переходом из жидкой фазы в газообразную, может повредить такие структуры.
Ограничения метода
Как упоминалось ранее, CP представляет собой крошечную структуру, и в зависимости от последующих анализов (например, проточной цитометрии) может потребоваться объединение CP от разных мышей. Существенным препятствием в изоляции ДЦП является идентификация структуры, когда она все еще плавает в желудочке. Сильно васкуляризированная природа ЦП облегчает его правильную идентификацию (после некоторой тренировки) внутри желудочковых полостей головного мозга. Однако, если необходимо удалить кровосодержащие компоненты для дальнейшего анализа, необходима транскардиальная перфузия. В зависимости от последующего анализа может быть выполнена перфузия бромфенольным синим, который окрашивает CP синим, тем самым облегчая изоляцию ткани. К сожалению, этот метод визуализации не всегда возможен (например, для иммуногистохимического окрашивания). В таких случаях ДЦП необходимо изолировать вслепую, что требует соответствующей подготовки. Игра с дифракцией света микроскопа может помочь идентифицировать ДЦП, плавающий в желудочках. Кроме того, в данной рукописи описывается выделение ДЦП, плавающего в четвертом и боковом желудочках, в то время как выделение ЦП третьего желудочка не обсуждается.
Значимость по отношению к существующим методам
В этом протоколе CP сначала рассекают желудочки головного мозга, прежде чем проводить дальнейший анализ. Если процедура окрашивания используется в качестве последующего считывания, также возможно окрашивание участков мозга, содержащих ДЦП. Дополнительная ценность этого последнего метода заключается в том, что ориентация ткани CP в желудочках и головном мозге все еще видна, чего не происходит, если CP сначала микрорассекается из желудочков мозга. С другой стороны, окрашивание участка мозга, содержащего CP, дает информацию только из этого конкретного участка, тогда как окрашивание изолированного CP может помочь собрать информацию обо всем CP.
Преимущество описанного метода заключается в том, что он сохраняет жизнеспособность, функцию и структуру клеток внутри ЦП. Кроме того, этот метод способствует полной изоляции ЦП, плавающего в четвертом и боковых желудочках мозга у взрослых мышей. Ранее сообщалось о методах выделения CP (например, из мозга24 крысы имозга 25 детенышей мыши). Однако важно учитывать, что метод изоляции может отличаться от вида к виду и между молодым и взрослым возрастом.
Дополнительные применения методики
Помимо сохранения жизнеспособности, функции и структуры клеток в ХП, этот метод изоляции облегчает применение последующих методов для более глубокого понимания функции ХП. Например, проточная цитометрия или секвенирование одноклеточной РНК могут быть выполнены для количественного определения и фенотипического анализа CP-клеток и инфильтрирующих клеток при определенных условияхзаболевания 26,27. Кроме того, молекулярный состав CP может быть исследован для оценки присутствия цитокинов и хемокинов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблоттинга или одновременного анализа нескольких цитокинов с помощью так называемого массива цитокиновых шариков. Кроме того, транскриптомный, сосудистый, иммунно-клеточный гистологический и секретомный анализы могут быть выполнены на микрорассеченных эксплантатахCP 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Бельгийским фондом исследований болезни Альцгеймера (SAO; номер проекта: 20200032), Исследовательским фондом Фландрии (FWO Vlaanderen; номера проектов: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) и Фондом Байе Латура. Мы благодарим VIB BioImaging Core за обучение, поддержку и доступ к инструментальному парку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G x 1/2 needle | Henke Sass Wolf | 4710004512 | |
| Aluminium specimen mounts | EM Sciences | 75220 | |
| Cacodylate buffer | EM Sciences | 11652 | |
| Carbon steel surgial blades | Swann-Morton | 0210 | size: 0.45 mm x 12 mm |
| Carbon adhesive tabs -12 mm | EM Sciences | 77825-12 | |
| Critical point dryer | Bal-Tec | CPD030 | |
| Crossbeam 540 | Zeiss | SEM system | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Glutaraldehyde | EM Sciences | 16220 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H-3125 | |
| Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel | Metrohm Belgium N.V | CPA-7800160 | |
| Osmium Tetroxide | EM Sciences | 19170 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| Platinum | Quorum | Q150T ES | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
| Sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| Specimen Basket Stainless Steel | EM Sciences | 70190-01 | |
| Stemi DV4 Stereo microscope | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 |
References
- Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), Springer-Verlag. 497-511 (2009).
- Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation. Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).
- Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).
- Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders. Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).
- Brkic, M., et al. Amyloid βoligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases. Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).
- Vandenbroucke, R. E., et al. Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases. Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).
- Marques, F., et al. The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus. BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans. Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).
- Lehtinen, M. K., et al. The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy. Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).
- Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier. Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).
- Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders. Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).
- Marques, F., et al. Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation. Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).
- Thouvenot, E., et al. The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells. Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).
- Vandendriessche, C., et al. Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).
- Bowyer, J. F., et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).
- Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
- Van Hoecke, L., et al. Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type. C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).
- JoVE.
- Pauwels, M., et al. Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics). Biomaterials. 290, 121830 (2022).
