Summary
De choroïde plexus (CP), een onderbelicht weefsel in de neurowetenschappen, speelt een sleutelrol in de gezondheid en ziekte van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft een microdissectietechniek voor het isoleren van de CP en het gebruik van scanning elektronenmicroscopie om een algemeen beeld te krijgen van de cellulaire structuur.
Abstract
De choroïde plexus (CP), een sterk gevasculariseerde structuur die uitsteekt in de ventrikels van de hersenen, is een van de meest onderbelichte weefsels in de neurowetenschappen. Omdat het steeds duidelijker wordt dat deze kleine structuur een cruciale rol speelt in de gezondheid en ziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS), is het van het grootste belang om de CP uit de hersenventrikels goed te ontleden op een manier die downstream-verwerking mogelijk maakt, variërend van functionele tot structurele analyse. Hier wordt isolatie van de laterale en vierde hersenventrikel muis CP beschreven zonder de noodzaak van gespecialiseerde gereedschappen of apparatuur. Deze isolatietechniek behoudt de levensvatbaarheid, functie en structuur van cellen binnen de CP. Vanwege de hoge vascularisatie kan de CP worden gevisualiseerd zwevend in de ventriculaire holtes van de hersenen met behulp van een binoculaire microscoop. Transcardiale perfusie die nodig is voor downstream-analyse kan de identificatie van het CP-weefsel echter bemoeilijken. Afhankelijk van de verdere verwerkingsstappen (bijv. RNA- en eiwitanalyse) kan dit worden opgelost door de CP te visualiseren via transcardiale perfusie met broomfenolblauw. Na isolatie kan de CP worden verwerkt met behulp van verschillende technieken, waaronder RNA, eiwit of eencellige analyse, om meer inzicht te krijgen in de functie van deze speciale hersenstructuur. Hier wordt scanning elektronenmicroscopie (SEM) op whole mount CP gebruikt om een totaalbeeld van de structuur te krijgen.
Introduction
Strakke barrières scheiden het centrale zenuwstelsel (CZS) van de periferie, inclusief de bloed-hersenbarrière (BBB) en de bloed-hersenvocht (CSF) barrière. Deze barrières beschermen het CZS tegen externe beledigingen en zorgen voor een evenwichtige en gecontroleerde micro-omgeving 1,2,3. Hoewel de BBB in de loop van de tijd uitgebreid is bestudeerd, heeft de bloed-CSF-barrière bij de choroïde plexus (CP) het afgelopen decennium alleen maar meer onderzoeksinteresse gekregen. Deze laatste barrière is te vinden in de vier ventrikels van de hersenen (figuur 1A, B) en wordt gekenmerkt door een enkele laag vaatvliesplexusepitheelcellen (CPE) rond een centraal stroma, lekkende haarvaten, fibroblasten en een lymfoïde en myeloïde celpopulatie (figuur 1C)4,5,6. De CPE-cellen zijn stevig met elkaar verbonden door tight junctions, waardoor lekkage van de onderliggende fenestrated bloedcapillairen naar de liquor en de hersenen wordt voorkomen. Bovendien wordt het transport over de CPE-cellen gereguleerd door een aantal in- en uitgaande transportsystemen die de instroom van nuttige verbindingen (bijv. Voedingsstoffen en hormonen) van het bloed naar de liquor en de efflux van schadelijke moleculen (bijv. Metabolisch afval, overtollige neurotransmitters) in de andere richting beheren 1,6. Om hun actieve transportfunctie te kunnen uitoefenen, bevatten de CPE-cellen talrijke mitochondriën in hun cytoplasma7. Bovendien is de CP de belangrijkste bron van CSF en fungeert als de poortwachter van de hersenen door de aanwezigheid van residente ontstekingscellen1. Door zijn unieke locatie tussen het bloed en de hersenen is de CP ook perfect gepositioneerd om immuunsurveillance uit te voeren8.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de locatie en samenstelling van de plexus choroideus (CP). (A,B) CP-weefsel wordt gevonden in de twee laterale, de derde en de vierde ventrikels van (A) menselijke en (B) muizenhersenen. (C) Het CP-weefsel bestaat uit een enkele laag nauw verbonden kubusvormige CP-epitheel (CPE) -cellen rond fenestratieve haarvaten, los bindweefsel en lymfoïde en myeloïde cellen, en vormt de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière (aangepast en gewijzigd op basis van referentie23). Figuur gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In het afgelopen decennium hebben toenemende bewijzen, waaronder verschillende rapporten van onze onderzoeksgroep, aangetoond dat de CP een centrale rol speelt in gezondheid en ziekte 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Zo is bekend dat de verouderende bloed-CSF-barrière morfologische veranderingen vertoont in onder andere de kernen, microvilli en het keldermembraan 1,19. Bovendien is in de context van de ziekte van Alzheimer de algehele barrière-integriteit aangetast en al deze leeftijdsgerelateerde veranderingen lijken nog meer uitgesproken te zijn 1,8,20. Naast morfologische veranderingen zijn het transcriptoom, proteoom en secretoom van de CP veranderd tijdens ziekte 12,21,22,23. Geavanceerde kennis van de CP is dus essentieel om de rol ervan bij neurologische ziekten beter te begrijpen en mogelijk nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen.
Een efficiënte methode voor nauwkeurige microdissectie van de CP uit de hersenventrikels is de eerste onschatbare stap om goed onderzoek van deze kleine hersenstructuur mogelijk te maken. Vanwege zijn sterk gevasculariseerde aard (figuur 2B) kan de CP die in de ventriculaire holtes van de hersenen zweeft, worden geïdentificeerd met behulp van een binoculaire microscoop. Transcardiale perfusie is echter vaak vereist voor downstream-analyse, wat de juiste identificatie en isolatie van het CP-weefsel bemoeilijkt (figuur 2C). Als de verdere verwerkingsstappen het toelaten (bijvoorbeeld in het geval van RNA- en eiwitanalyse), kan de CP worden gevisualiseerd via transcardiale perfusie met broomfenolblauw (figuur 2A). Verschillende publicaties beschrijven al de isolatie van de CP van rat24 en muizenpuphersenen25. Hier wordt een microdissectie-isolatietechniek beschreven om de CP te isoleren van volwassen muizen. Belangrijk is dat deze isolatietechniek de levensvatbaarheid, functie en structuur van de cellen binnen de CP behoudt. De isolatie van de CP zwevend in de vierde en laterale ventrikels wordt hier beschreven. Kortom, de muizen worden terminaal verdoofd en indien nodig transcardiaal geperfuseerd. Er moet echter worden opgemerkt dat perfusie de structuur van de cellen in de CP kan beschadigen. Als het monster moet worden geanalyseerd met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), seriële blokgezichtscanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM) of gefocusseerde ionenbundel SEM (FIB-SEM), mag perfusie dus niet worden uitgevoerd. Vervolgens worden de hele hersenen geïsoleerd en wordt een tang gebruikt om de hersenen sagittaal te hemisecteren. Vanaf hier kunnen de CP's die in de laterale ventrikels zweven worden geïdentificeerd en ontleed, terwijl de CP van de vierde ventrikel kan worden geïsoleerd van de cerebellaire kant van de hersenen.
Figuur 2: Visualisatie van de (A-C) vierde en (D-F) laterale ventrikel choroïde plexus (CP) na (A,D) broomfenolblauwe perfusie, (B,E) geen perfusie en (C,F) perfusie met PBS/heparine. De beelden zijn gemaakt met een stereomicroscoop (8x-32x vergroting). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zodra de CP goed is ontleed uit de hersenventrikels, kan een heel repertoire aan technieken worden toegepast om meer inzicht te krijgen in de functie van deze structuur. Flowcytometrie of eencellige RNA-sequencing kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd om de infiltrerende ontstekingscellen onder bepaalde ziekteomstandigheden te kwantificeren en fenotypisch te analyseren26,27. Naast de cellulaire samenstelling kan de moleculaire samenstelling van de CP worden geanalyseerd om de aanwezigheid van cytokines en chemokines te beoordelen via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblot of door gelijktijdige analyse van meerdere cytokines met behulp van de cytokine bead array28. Bovendien kunnen transcriptoom-, vasculaire, immuuncelhistologie en secretoomanalyses worden uitgevoerd op de microdissected CP-explantaten29. Hier wordt scanning elektronenmicroscopie (SEM) op whole mount CP gebruikt om een totaalbeeld van de CP-structuur te verkrijgen. SEM gebruikt een bundel van gefocuste elektronen om over het oppervlak te scannen en een beeld te creëren van de topografie en samenstelling van het oppervlak. Omdat de golflengte van elektronen veel kleiner is dan die van licht, ligt de resolutie van SEM in het nanometerbereik en superieur aan die van een lichtmicroscoop. Bijgevolg kunnen morfologische studies op subcellulair niveau worden uitgevoerd via SEM. Kortom, de ontleedde CP wordt onmiddellijk overgebracht in een glutaaraldehyde-bevattend fixatief voor een nachtelijke fixatie, gevolgd door osmicatie en uranylacetaatkleuring. De monsters worden vervolgens behandeld met loodaspartaatvlek, gedehydrateerd en uiteindelijk ingebed voor beeldvorming.
Dit protocol vergemakkelijkt dus de efficiënte isolatie van de CP van de hersenventrikels van de muis, die verder kunnen worden geanalyseerd met behulp van een verscheidenheid aan downstream-technieken om de structuur en functie ervan te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven beschreven in deze studie werden uitgevoerd volgens de nationale (Belgische wet 14/08/1986 en 22/12/2003, Belgisch Koninklijk Besluit 06/04/2010) en Europese wetgeving (EU-richtlijnen 2010/63/EU, 86/609/EEG). Alle experimenten op muizen en dierprotocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit Gent (vergunningsnummers LA1400091 en EC 2017-026).
1. Voorbereiding
- Anesthetica: Bereid een terminale verdoving voor. Zo kan bijvoorbeeld een natriumpentobarbital (≥100 mg/kg) oplossing in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) worden bereid.
- Transcardiale perfusieoplossing: Bereid 10 ml (per muis) PBS/heparine (met 0,2% heparine) oplossing aangevuld met 0,5% broomfenolblauw.
OPMERKING: Als de stroomafwaartse verwerkingsstappen het toelaten (bijvoorbeeld in het geval van RNA- en eiwitanalyse), kan de plexus choroideus (CP) worden gevisualiseerd via transcardiale perfusie met broomfenolblauw. Als broomfenolblauw niet compatibel is met de verdere verwerkingsstappen (bijvoorbeeld voor beeldvorming), gebruik dan PBS / heparine om te perfuseren. - Bereid de oplossingen voor die nodig zijn voor SEM-analyse.
- Bereid 0,1 M Na-cacodylaatbuffer (pH 7,4) voor. Bereid een oplossing van 2% paraformaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M Na-cacodylaatbuffer. Maak 20 ml van deze oplossing per monster.
- Bereid 2% osmiumtetroxide in 0,1 M Na-cacodylaatbuffer (5 ml per monster).
- Bereid 50%, 70%, 85% en 100% EtOH-oplossingen voor. Bereid 5 ml van elke EtOH-oplossing per monster.
2. Microdissectie van de plexus choroïde uit de laterale en vierde ventrikel
OPMERKING: Vrouwelijke, 9 weken oude C57BL / 6-muizen werden gebruikt in deze studie. De beschreven isolatietechniek is echter onafhankelijk van de stam, het geslacht en de leeftijd van de volwassen muis.
- Isoleer het muizenbrein.
- Injecteer intraperitoneaal een dodelijke dosis van een kortwerkend barbituraat (>100 mg/kg, bereid in stap 1.1) met behulp van een naald van 26 G om de muis terminaal te verdoven. Controleer de voetreflex van de muis door met een tang in de achterpoot te knijpen.
- Wanneer er geen voetreflex is, plaatst u het terminaal verdoofde dier in de dorsale decubituspositie en fixeert u de muis door de ledematen op een plaat vast te pinnen.
OPMERKING: Als transcardiale perfusie van de muizen niet nodig is, afhankelijk van de downstream-analysemethode (bijvoorbeeld voor SEM-beeldvorming), gaat u verder met stap 2.1.7. Als perfusie echter nodig is om bloedcellen of andere componenten in het bloed te verwijderen, kan de CP worden gevisualiseerd als een blauwe structuur die in de hersenventrikels zweeft via perfusie met broomfenolblauw. - Desinfecteer de borstkas door 70% ethanol te spuiten. Plaats een steriel gordijn rond het operatiegebied. Maak een incisie van ~4 cm net onder het diafragma met behulp van een koolstofstalen chirurgisch mes (zie tabel met materialen).
- Open de huid en stel de borstkas bloot met een chirurgische schaar. Snijd het diafragma volledig open.
- Scheid de thorax om de longen en het kloppende hart bloot te leggen.
- Transcardiaal perfuseren van de muizen met 10 ml van de perfusieoplossing met een snelheid van 4,5 ml / min, met behulp van een perfusiepomp (zie tabel met materialen). De perfusie duurt ~ 2 minuten. Steek een naald van 26 G in de linker ventrikel om de oplossing in het systemische circuit te pompen. Maak daarnaast een knip met een chirurgische schaar in het rechter atrium zodat bloed uit de bloedsomloop kan gaan.
OPMERKING: Een perfusiepomp heeft de voorkeur boven handmatige toediening van de vloeistof, omdat deze de vloeistoffen met een nauwkeurig geprogrammeerde snelheid zal leveren en ervoor zal zorgen dat de schuifkrachten veroorzaakt door de perfusie niet te sterk zijn. Overmatige schuifkrachten zullen de levensvatbaarheid en structuur van cellen binnen de CP in gevaar brengen. Bovendien is de hier aanbevolen perfusiestroomsnelheid optimaal om volwassen muizen vanaf 7 weken te perfuseren. Als jongere muizen worden gebruikt, moet een lager debiet worden gebruikt. Het is ook belangrijk om het bloed dat uit het rechter atrium komt weg te deppen om een schone chirurgische plaats te behouden. - Onthoofd de muis.
OPMERKING: Wees voorzichtig om het hoofd zo laag mogelijk bij de schouder af te snijden om de hersenstructuur te behouden. Als de snee te hoog is, kan het cerebellum beschadigd raken. - Snijd na onthoofding de hoofdhuid open door een incisie te maken van tussen de oren tot superieur aan de ogen. Trek de huid zijdelings om de schedel bloot te leggen. Snijd vervolgens de schedel open door de plaiselachtige hechtingen te volgen, in de richting van het neusgedeelte.
OPMERKING: Het is belangrijk om de schedel voorzichtig te verwijderen om de integriteit van de hersenen te behouden. - Plaats de hersenen in een ijskoude petrischaaltje en voeg 1 ml ijskoude 1x PBS toe aan het hersenweefsel.
OPMERKING: Coating van het gerecht is niet nodig.
- Isoleer de CP die in de vierde ventrikel drijft.
- Snijd het cerebellum voorzichtig af van het cerebrum met een scalpel. Het cerebrum is het grootste deel van de hersenen, terwijl het cerebellum een veel kleiner deel is aan de achterkant van de hersenen. Verwijder indien nodig resterende hersenstamweefseldelen uit het cerebellum.
- Draai de hersenen zodat de snijlijn naar boven is gericht. Zorg ervoor dat de vierde ventrikelholte nu zichtbaar is in het midden van de sectie, met de CP zwevend op de dorsale plaats. Open indien nodig de ventrikel een beetje door het bindweefsel met een scherpe tang open te trekken. Op deze manier wordt de CP beter zichtbaar en beter bereikbaar.
- Scheur de CP voorzichtig uit de ventrikelwand met behulp van een kleine scherpe tang.
OPMERKING: Het is belangrijk om de CP in deze stap alleen aan te raken en eruit te halen om het monster niet te besmetten met het omliggende weefsel. Het openen van de ventrikels zoals beschreven in stap 2.2.2 zal stap 2.2.3 vergemakkelijken.
- Isoleer de CP die uit de laterale ventrikel steekt.
- Gebruik kleine scherpe tangen om de hersenen in twee hersenhelften te snijden.
- Draai de hersenen zodat de snijlijn naar boven is gericht. Om de laterale ventrikel te onthullen, trekt u de cortex voorzichtig weg van de thalamus.
- Trek de hippocampus terug tot de midsagittale snijlijn. De laterale ventrikel is nu zichtbaar met de CP die aan de onderkant van de ventrikel ligt. Open indien nodig de ventrikel een beetje door het bindweefsel met een scherpe tang open te trekken. Op deze manier wordt de CP beter zichtbaar en beter bereikbaar.
- Gebruik een kleine scherpe tang om de CP voorzichtig uit de ventrikelwand te scheuren.
OPMERKING: Het is belangrijk om de CP in deze stap alleen aan te raken en eruit te halen om het monster niet te besmetten met het omliggende weefsel. Het openen van de ventrikels zoals beschreven in stap 2.3.4 zal stap 2.3.5 vergemakkelijken. Wees voorzichtig in deze stap om de structuur van de CP zoveel mogelijk te behouden. Het is het gemakkelijkst om de CP in de rostrale naar caudale richting te trekken.
3. Morfologische analyse van CP-weefsel met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM)
LET OP: Toxische oplossingen worden gebruikt in de volgende verwerkingsstappen. Het wordt aanbevolen om de monstervoorbereiding in een zuurkast uit te voeren.
- Voer de monstervoorbereiding voor SEM uit zoals hieronder beschreven.
- Breng de verse geïsoleerde CP over in een vers gemaakte fixatieoplossing met 2% paraformaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M Na-cacodylaatbuffer (pH 7,4). Incubeer een nacht bij 4 °C.
OPMERKING: Omdat het CP-weefsel erg fragiel en dun is, moet het weefsel in kleine monstermanden worden geplaatst (zie tabel met materialen) om het tussen buffers over te brengen. Op deze manier blijft de structuur van het weefsel beter behouden. Een op cacodylaat gebaseerd fixatief wordt gebruikt boven een op PBS gebaseerd fixatief, omdat de sterke cacodylaatbuffer de lage pH van glutaaraldehyde in het EM-fixatief kan tegengaan. - Was het monster 3x gedurende 5 minuten elk met 3-5 ml 0,1 M Na-cacodylaatbuffer (pH 7,4).
- Befixeer de monsters in 3-5 ml 2% osmiumtetroxide in 0,1 M Na-cacodylaatbuffer gedurende 30 minuten. Was de monsters 3x gedurende 5 minuten elk met 3-5 ml ultrapuur water.
- Droog de monsters uit in een reeks ijskoude oplossingen met toenemende EtOH-concentraties (50%, 70%, 85%, 100%), gedurende 15 minuten per EtOH-oplossing. Gebruik een kritische puntdroger om het monster goed te drogen.
OPMERKING: Het overschakelen van vloeibare naar gasfase beïnvloedt de oppervlaktespanning en veroorzaakt schade aan de oppervlaktestructuur. De kritische puntdroogstap zorgt voor het behoud van de oppervlaktestructuur. - Plaats het monster voorzichtig op een monsterbevestiging die is voorzien van een koolstofsticker (zie materiaaltabel).
- Bedek de monsters met een dunne laag (2-5 nm) platina. Monteer hiervoor een platinabron in een vacuümsysteem tussen twee hoogstroomelektrische aansluitingen en verwarm het platina tot de verdampingstemperatuur. Een fijne stroom platina wordt op het monster afgezet.
OPMERKING: Een meer gedetailleerd protocol voor deze stap vindt u in referentie30. Naast platina kan ook goud of goud/palladium gebruikt worden.
- Breng de verse geïsoleerde CP over in een vers gemaakte fixatieoplossing met 2% paraformaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M Na-cacodylaatbuffer (pH 7,4). Incubeer een nacht bij 4 °C.
- Visualiseer de CP-monsters met SEM (zie Materiaaltabel). De visualisatieprocedure van CP-weefsel via SEM is vergelijkbaar met die van andere soorten weefsels en is afhankelijk van de gebruikte software en instrumenten. Een stap voor stap SEM-protocol met een bijbehorende video is beschikbaar in referentie31 of referentie30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het beschreven protocol vergemakkelijkt de efficiënte isolatie van de CP van de laterale (figuur 2A-C) en vierde (figuur 2D-F) ventrikels van de muizenhersenen. Na het isoleren van de hele hersenen, wordt een tang gebruikt om de hersenen sagittaal te hemisecteren en de CP's te identificeren die in de laterale ventrikels zweven. De CP van de vierde ventrikel kan worden geïsoleerd van de cerebellaire kant van de hersenen. Perfusie met broomfenolblauw kan worden gebruikt om de CP te visualiseren (figuur 2A,D); wanneer broomfenolblauw echter niet is toegestaan in de verdere verwerkingsstappen, kan perfusie met PBS/heparine (figuur 2C,F) of geen perfusie (figuur 2B,E) worden uitgevoerd. Na het isoleren van de CP uit de hersenventrikels kan een heel repertoire aan analyses op het weefsel worden uitgevoerd. Deze omvatten genexpressieprofilering (RT-qPCR)28, celtypeprofilering (flowcytometrie32, single cell RNA sequencing 26,27) en de detectie van cytokines en chemokines 28via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblot of multiplex immunoassays. Bovendien kan de microdissected CP in cultuur worden gebracht om CP-explantaten te maken om de functie verder op te helderen en bijvoorbeeld het secretoom ervan te bestuderen als reactie op een specifieke stimulus23,28,29. In dit manuscript beschrijven we hoe we scanning elektronenmicroscopie (SEM) kunnen uitvoeren om het oppervlak van choroïde plexus epitheliale (CPE) cellen morfologisch te analyseren. Figuur 3 toont overzichtsbeelden van de CP geïsoleerd uit de vierde ventrikel (figuur 3A) en de CP geïsoleerd uit de laterale ventrikel (figuur 3B), verkregen via SEM. Deze afbeeldingen tonen duidelijk de typische C-vormige vorm van de laterale CP en de tweearmige structuur van de vierde ventrikel CP.
Figuur 3: Overzicht scanning elektronenmicroscopie (SEM) beelden van het ontleedde choroïde plexus (CP) weefsel. (A,B) Representatief SEM-beeld van de CP geïsoleerd uit de (A) vierde en (B) laterale ventrikels van de muizenhersenen. Schaalbalk = 100 μm. Instellingen: elektronenhoogspanning (EHT) = 5,00 kV; werkafstand (WD) = 4,8 mm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Door in te zoomen op de CPE-cellen kunnen andere cellen aan de apicale kant van de CPE-cellen worden gedetecteerd (figuur 4A). De cel die in de afbeelding is vastgelegd, is mogelijk een epiplexuscel, een macrofaagachtige cel die zich op het apicale oppervlak van de CP bevindt. Het is echter niet mogelijk om de specifieke aard van deze cel via SEM te identificeren. Naast SEM-beeldvorming is het mogelijk om twee-fotonenbeeldvorming van het plexusepitheel van het choroidepitheel in levende explantaten uit te voeren, zoals aangetoond door Shipley et al.29. Terwijl SEM de visualisatie van oppervlaktestructuren van de CP vergemakkelijkt, kan beeldvorming met twee fotonen de visualisatie van een breed scala aan cellen en cellulaire processen mogelijk maken, zolang ze fluorescerend kunnen worden bewaakt. Dit omvat visualisatie van vasculaire en immuuncellen, evenals de secretoire gebeurtenissen in de CP-explant29.
Een hogere SEM-vergroting onthulde vesikelachtige structuren aan de apicale kant van CPE-cellen (figuur 4B) en microvilli (figuur 4C). Deze microvilli steken uit in het hersenvocht (CSF) en vergroten het CPE-celoppervlak tussen de cellen en de liquör. Deze resultaten tonen aan dat de morfologische veranderingen van de CPE-cellen in ziekteomstandigheden kunnen worden onderzocht met behulp van SEM.
Figuur 4: Gedetailleerde scanning elektronenmicroscopie (SEM) beelden van choroid plexus (CP) weefsel. (A) Een cel aan de apicale zijde van choroid plexus epithelial (CPE) cellen. Schaalbalk = 2 μm. (B) Vesicle-achtige structuren aan de apicale zijde van CPE-cellen. Schaalbalk = 10 μm. (C) Visualisatie van een CPE-celoppervlak met zijn microvilli. Schaalbalk = 1 μm. Instellingen: elektronenhoogspanning (EHT) = 5,00 kV; werkafstand (WD) = 4,9 mm; 3.000x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een methode beschreven om de plexus choroideus (CP) uit de laterale ventrikel en de vierde ventrikel van een muizenbrein te isoleren. Deze hele montagemethode van de CP vergemakkelijkt verdere analyse met behulp van een repertoire van technieken om een volledig beeld te krijgen van de CP-morfologie, cellulaire samenstelling, transcriptoom, proteoom en secretoom. Dergelijke analyses zijn cruciaal om een beter begrip te krijgen van deze opmerkelijke structuur die uit de ventrikels van de hersenen steekt. Deze kennis is van immens onderzoeksbelang, omdat het steeds duidelijker wordt dat de CP een cruciale rol speelt in gezondheid en ziekte 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.
Kritieke stappen, wijzigingen en probleemoplossing van de methode
Het is van het grootste belang om de voetreflex van de muis te controleren om er zeker van te zijn dat de terminale anesthesie goed wordt uitgevoerd. Naast ethische redenen zorgt dit er ook voor dat de muis op de juiste plaats wordt gehouden tijdens het uitvoeren van de experimentele procedure. Het doel is om het dier te verdoven, zodat het geen pijn ervaart tijdens de procedure terwijl het hart klopt op het moment van perfusie. Als verdere verwerking van het weefsel de verwijdering van bloed vereist, kan transcardiale perfusie worden uitgevoerd. Zoutoplossing met heparine wordt hier gebruikt om bloedstolling te voorkomen. EDTA kan ook voor dit doel worden gebruikt, maar als het nodig is om de levensvatbaarheid van de cel te behouden, is heparine een betere keuze dan EDTA. Perfusie moet onmiddellijk worden gestart wanneer het hart stopt met kloppen als gevolg van overmatige anesthesie. Een perfusiepomp heeft de voorkeur boven handmatige toediening van de vloeistof, omdat dit vloeistofafgifte met een nauwkeurig geprogrammeerde snelheid mogelijk maakt en ervoor zorgt dat de schuifkrachten veroorzaakt door de perfusie niet te sterk zijn. Overmatige schuifkrachten zullen de levensvatbaarheid en structuur van cellen binnen de CP in gevaar brengen.
Er is een getraind oog voor nodig om de CP te kunnen zien zweven in de hersenventrikels van de muis. Om deze reden is het van het grootste belang om veel te oefenen. Het wordt aanbevolen om de training te starten op muizen doordrenkt met broomfenolblauw, omdat dit de CP blauw kleurt en het gemakkelijker maakt om het kleine CP-weefsel van de rest van de hersenen te onderscheiden (figuur 2A, D). In latere proeven kan de CP worden geïsoleerd van een niet-doordrenkte muis. Dit is moeilijker in vergelijking met CP-isolatie van een broomfenolblauw-geperfuseerde muis, maar het CP-weefsel kan nog steeds worden geïdentificeerd aan de hand van zijn sterk gevasculariseerde aard (figuur 2B, E). Pas na uitgebreide training is het mogelijk om het CP-weefsel uit de hersenventrikels te isoleren van een niet-doordrenkte muis zonder besmetting met hersenparenchym (figuur 2C,F).
De CP is een zeer fragiele en dunne structuur, wat impliceert dat de isolatie ervan met de nodige voorzichtigheid moet worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid, functie en structuur van cellen erin te behouden. Daarom moeten verschillende stappen in het beschreven protocol met de nodige precisie en voorzichtigheid worden uitgevoerd om de integriteit van de hersenen te behouden. Ten eerste is het belangrijk om de muis dicht bij de schouders te onthoofden. Als de snee te hoog is, kan het cerebellum worden beschadigd, waardoor de isolatie van de CP in de vierde ventrikel wordt bemoeilijkt. Vervolgens moet de schedel voorzichtig worden verwijderd om de hersenen niet te beschadigen. Zodra de hersenen geïsoleerd zijn, is het cruciaal om het koud te houden om te voorkomen dat de hersenen papperig worden, omdat dit de CP-isolatie aanzienlijk zal bemoeilijken. Om dit te doen, is het belangrijk om de hersenen op een ijskoude petrischaal te plaatsen en ijskoude PBS over de hersenen toe te voegen. Een bepaald niveau van training is nodig om de beschreven isolatietechniek uit te voeren, omdat dit de verwerkingstijd tussen de onthoofding van de muis en de uiteindelijke isolatie van de CP aanzienlijk zal verkorten. Een kort isolatieproces zal de levensvatbaarheid en het structuurbehoud van het geïsoleerde weefsel verbeteren. Ten slotte moeten de hulpmiddelen die worden gebruikt voor isolatie, met name de tang, scherp en gericht zijn om de snelle en efficiënte isolatie van de CP uit de ventrikels te vergemakkelijken. Er moet echter voor worden gezorgd dat de integriteit van de structuur tijdens de isolatie niet wordt beschadigd.
Om de weefselintegriteit tijdens de monsterverwerking voor SEM te behouden, kan de CP in kleine monstermanden worden geplaatst bij overdracht tussen buffers, zodat aanraking van het weefsel zelf kan worden vermeden. Bovendien wordt aanbevolen om kritieke puntdroging uit te voeren bij het verplaatsen van het weefsel uit de EtOH-oplossingen. Dit zorgt voor het behoud van de oppervlaktestructuur van de CP, inclusief microvilli. Oppervlaktespanning, veroorzaakt door de overgang van vloeibare naar gasfase, kan dergelijke structuren beschadigen.
Beperkingen van de methode
Zoals eerder vermeld, is de CP een kleine structuur en afhankelijk van de downstream-analyses (bijv. Flowcytometrie), kan het nodig zijn om de CP van verschillende muizen te poolen. Een belangrijke hindernis bij CP-isolatie is de identificatie van de structuur wanneer deze nog steeds in de ventrikel zweeft. De sterk gevasculariseerde aard van de CP vergemakkelijkt de juiste identificatie (na enige training) in de ventriculaire holtes van de hersenen. Als bloedbevattende componenten echter moeten worden verwijderd voor verdere analyse, is transcardiale perfusie essentieel. Afhankelijk van de stroomafwaartse analyse kan perfusie met broomfenolblauw worden uitgevoerd, waardoor het CP-blauw kleurt, waardoor de isolatie van het weefsel wordt vergemakkelijkt. Helaas is deze visualisatietechniek niet altijd mogelijk (bijvoorbeeld voor immunohistochemische kleuring). In dergelijke gevallen moet de CP blindelings worden geïsoleerd, wat een adequate training vereist. Spelen met de lichtdiffractie van de microscoop kan helpen om de CP te identificeren die in de ventrikels zweeft. Bovendien beschrijft dit manuscript de isolatie van de CP zwevend in de vierde en laterale ventrikels, terwijl isolatie van de derde ventrikel CP niet wordt besproken.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden
In dit protocol wordt de CP eerst uit de hersenventrikels ontleed voordat verdere analyse wordt uitgevoerd. Als een kleuringsprocedure wordt gebruikt als vervolguitlezing, is het ook mogelijk om hersensecties te kleuren die de CP bevatten. De meerwaarde van deze laatste techniek is dat de oriëntatie van het CP-weefsel binnen de ventrikels en de hersenen nog steeds zichtbaar is, wat niet het geval is als de CP eerst uit de hersenventrikels wordt gemicrodissecteerd. Aan de andere kant biedt het kleuren van een hersensectie met CP alleen informatie uit die specifieke sectie, terwijl het kleuren van de geïsoleerde CP kan helpen bij het verzamelen van informatie over de hele CP.
Het voordeel van de beschreven techniek is dat het de levensvatbaarheid, functie en structuur van de cellen binnen de CP behoudt. Bovendien vergemakkelijkt deze methode de volledige isolatie van de CP die zweeft in de vierde en laterale hersenventrikels bij volwassen muizen. Methoden voor isolatie van de CP (bijvoorbeeld van rattenhersenen24 en muizenpuphersenen25) zijn eerder gemeld. Het is echter belangrijk om te bedenken dat de isolatietechniek kan verschillen van soort tot soort en tussen jonge en volwassen leeftijden.
Aanvullende toepassingen van de techniek
Naast het behoud van de levensvatbaarheid, functie en structuur van cellen binnen de CP, vergemakkelijkt deze isolatietechniek de toepassing van downstream-technieken om een dieper inzicht te krijgen in de CP-functie. Flowcytometrie of single cell RNA sequencing kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd om CP-cellen en infiltrerende cellen onder bepaalde ziekteomstandigheden te kwantificeren en fenotypisch te analyseren26,27. Daarnaast kan de moleculaire samenstelling van de CP worden onderzocht om de aanwezigheid van cytokines en chemokines te beoordelen via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblot of gelijktijdige analyses van meerdere cytokines door een zogenaamde cytokine bead array. Bovendien kunnen transcriptoom-, vasculaire, immuuncelhistologie en secretoomanalyses worden uitgevoerd op de microdissected CP-explantaten29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Belgische Stichting voor Alzheimeronderzoek (NRK; projectnummer: 20200032), het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO Vlaanderen; projectnummers: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) en het Fonds Baillet Latour. We danken de VIB BioImaging Core voor training, ondersteuning en toegang tot het instrumentenpark.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G x 1/2 needle | Henke Sass Wolf | 4710004512 | |
| Aluminium specimen mounts | EM Sciences | 75220 | |
| Cacodylate buffer | EM Sciences | 11652 | |
| Carbon steel surgial blades | Swann-Morton | 0210 | size: 0.45 mm x 12 mm |
| Carbon adhesive tabs -12 mm | EM Sciences | 77825-12 | |
| Critical point dryer | Bal-Tec | CPD030 | |
| Crossbeam 540 | Zeiss | SEM system | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Glutaraldehyde | EM Sciences | 16220 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H-3125 | |
| Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel | Metrohm Belgium N.V | CPA-7800160 | |
| Osmium Tetroxide | EM Sciences | 19170 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| Platinum | Quorum | Q150T ES | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
| Sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| Specimen Basket Stainless Steel | EM Sciences | 70190-01 | |
| Stemi DV4 Stereo microscope | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 |
References
- Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), Springer-Verlag. 497-511 (2009).
- Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation. Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).
- Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).
- Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders. Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).
- Brkic, M., et al. Amyloid βoligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases. Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).
- Vandenbroucke, R. E., et al. Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases. Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).
- Marques, F., et al. The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus. BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans. Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).
- Lehtinen, M. K., et al. The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy. Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).
- Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier. Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).
- Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders. Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).
- Marques, F., et al. Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation. Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).
- Thouvenot, E., et al. The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells. Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).
- Vandendriessche, C., et al. Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).
- Bowyer, J. F., et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).
- Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
- Van Hoecke, L., et al. Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type. C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).
- JoVE.
- Pauwels, M., et al. Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics). Biomaterials. 290, 121830 (2022).
