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Neuroscience

माउस कोरॉयड प्लेक्सस के माइक्रोडिसेक्शन और पूरे माउंट स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज़ुअलाइज़ेशन

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64733
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB Center for Inflammation Research, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University
* These authors contributed equally

Summary

कोरॉयड प्लेक्सस (सीपी), तंत्रिका विज्ञान में एक अंडरस्टडी ऊतक, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के स्वास्थ्य और बीमारी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह प्रोटोकॉल सीपी को अलग करने के लिए एक माइक्रोविच्छेदन तकनीक का वर्णन करता है और इसकी सेलुलर संरचना का समग्र दृश्य प्राप्त करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है।

Abstract

कोरॉयड प्लेक्सस (सीपी), मस्तिष्क के वेंट्रिकल्स में फैली एक अत्यधिक संवहनी संरचना, तंत्रिका विज्ञान में सबसे कम अध्ययन किए गए ऊतकों में से एक है। जैसा कि यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि यह छोटी संरचना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के स्वास्थ्य और बीमारी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से सीपी को ठीक से विच्छेदित करना अत्यंत महत्वपूर्ण है जो डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण की अनुमति देता है, कार्यात्मक से संरचनात्मक विश्लेषण तक। यहां, विशेष उपकरण या उपकरण की आवश्यकता के बिना पार्श्व और चौथे मस्तिष्क वेंट्रिकल माउस सीपी का अलगाव वर्णित है। यह अलगाव तकनीक सीपी के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता, कार्य और संरचना को संरक्षित करती है। इसके उच्च वैस्कुलराइजेशन के कारण, सीपी को दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मस्तिष्क के वेंट्रिकुलर गुहाओं के अंदर तैरते हुए देखा जा सकता है। हालांकि, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आवश्यक ट्रांसकार्डियल छिड़काव सीपी ऊतक की पहचान को जटिल कर सकता है। आगे के प्रसंस्करण चरणों (जैसे, आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण) के आधार पर, इसे ब्रोमोफेनॉल नीले रंग के साथ ट्रांसकार्डियल छिड़काव के माध्यम से सीपी की कल्पना करके हल किया जा सकता है। अलगाव के बाद, सीपी को इस विशेष मस्तिष्क संरचना के कार्य पर और समझ हासिल करने के लिए आरएनए, प्रोटीन या एकल कोशिका विश्लेषण सहित कई तकनीकों का उपयोग करके संसाधित किया जा सकता है। यहां, संरचना का समग्र दृश्य प्राप्त करने के लिए पूरे माउंट सीपी पर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग किया जाता है।

Introduction

तंग बाधाएं केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को परिधि से अलग करती हैं, जिसमें रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) और रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) बाधा शामिल हैं। ये बाधाएं बाहरी अपमान के खिलाफ सीएनएस की रक्षा करती हैं और एक संतुलित और नियंत्रित माइक्रोएन्वायरमेंट 1,2,3 सुनिश्चित करती हैं। जबकि बीबीबी का समय के साथ बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, कोरॉयड प्लेक्सस (सीपी) में स्थित रक्त-सीएसएफ बाधा ने पिछले दशक के दौरान केवल बढ़ती शोध रुचि प्राप्त की है। यह उत्तरार्द्ध बाधा मस्तिष्क के चार वेंट्रिकल्स (चित्रा 1 ए, बी) में पाई जा सकती है और एक केंद्रीय स्ट्रोमा, लीक केशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट और एक लिम्फोइड और माइलॉयड सेल आबादी (चित्रा 1 सी) 4,5,6 के आसपास कोरॉयड प्लेक्सस एपिथेलियल (सीपीई) कोशिकाओं की एक परत की विशेषता है।. सीपीई कोशिकाएं तंग जंक्शनों द्वारा मजबूती से जुड़ी होती हैं, इस प्रकार सीएसएफ और मस्तिष्क में अंतर्निहित फेनेस्टेड रक्त केशिकाओं से रिसाव को रोकती हैं। इसके अतिरिक्त, सीपीई कोशिकाओं में परिवहन को कई आंतरिक और बाहरी परिवहन प्रणालियों द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो रक्त से सीएसएफ तक लाभकारी यौगिकों (जैसे, पोषक तत्वों और हार्मोन) की आमद और हानिकारक अणुओं (जैसे, चयापचय अपशिष्ट, अतिरिक्त न्यूरोट्रांसमीटर) के प्रवाह कोदूसरी दिशा में प्रबंधित करते हैं। अपने सक्रिय परिवहन कार्य को लागू करने में सक्षम होने के लिए, सीपीई कोशिकाओं में उनके साइटोप्लाज्म7 में कई माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं। इसके अलावा, सीपी सीएसएफ का मुख्य स्रोत है और निवासीभड़काऊ कोशिकाओं की उपस्थिति से मस्तिष्क के द्वारपाल के रूप में कार्य करता है। रक्त और मस्तिष्क के बीच अपने अद्वितीय स्थान के कारण, सीपी भीप्रतिरक्षा निगरानी करने के लिए पूरी तरह से तैनात है।

Figure 1
चित्रा 1: कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी) के स्थान और संरचना का योजनाबद्ध अवलोकन। (ए, बी) सीपी ऊतक (ए) मानव और (बी) माउस दिमाग के दो पार्श्व, तीसरे और चौथे वेंट्रिकल्स के भीतर पाया जाता है। (सी) सीपी ऊतक में कसकर जुड़े क्यूबॉइडल सीपी एपिथेलियम (सीपीई) कोशिकाओं की एक एकल परत होती है, जो फेनेस्टेड केशिकाओं, ढीले संयोजी ऊतक और लिम्फोइड और माइलॉयड कोशिकाओं के आसपास होती है, और रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव अवरोध (संदर्भ23 से अनुकूलित और संशोधित) बनाती है। Biorender.com के साथ बनाई गई आकृति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पिछले एक दशक में, हमारे शोध समूह की कई रिपोर्टों सहित बढ़ते सबूतों से पता चला है कि सीपी स्वास्थ्य और बीमारी 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है।. उदाहरण के लिए, यह ज्ञात है कि उम्र बढ़ने वाले रक्त-सीएसएफ अवरोध दूसरों के बीच, नाभिक, माइक्रोविली और तहखाने झिल्ली 1,19 में रूपात्मक परिवर्तन प्रदर्शित करते हैं। इसके अतिरिक्त, अल्जाइमर रोग के संदर्भ में, समग्र बाधा अखंडता से समझौता किया जाता है और ये सभी उम्र से संबंधित परिवर्तन 1,8,20 और भी अधिक स्पष्ट दिखाई देते हैं। रूपात्मक परिवर्तनों के अलावा, सीपी के प्रतिलेखन, प्रोटिओम और स्राव को रोग 12,21,22,23 के दौरान बदल दिया जाता है। इस प्रकार, न्यूरोलॉजिकल रोगों में इसकी भूमिका को बेहतर ढंग से समझने और संभावित रूप से नई चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए सीपी का उन्नत ज्ञान आवश्यक है।

मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से सीपी के सटीक सूक्ष्मविच्छेदन के लिए एक कुशल तरीका इस छोटे मस्तिष्क संरचना की उचित जांच की अनुमति देने के लिए पहला अमूल्य कदम है। इसकी अत्यधिक संवहनी प्रकृति (चित्रा 2 बी) के कारण, मस्तिष्क के वेंट्रिकुलर गुहाओं के अंदर तैरने वाले सीपी को दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पहचाना जा सकता है। हालांकि, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए अक्सर ट्रांसकार्डियल छिड़काव की आवश्यकता होती है, जो सीपी ऊतक की उचित पहचान और अलगाव को जटिल बनाता है (चित्रा 2 सी)। यदि आगे के प्रसंस्करण चरण अनुमति देते हैं (उदाहरण के लिए, आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के मामले में), सीपी को ब्रोमोफेनॉल ब्लू (चित्रा 2 ए) के साथ ट्रांसकार्डियल छिड़काव के माध्यम से देखा जा सकता है। कई प्रकाशन पहले से ही चूहे24 और माउस प्यूप दिमाग25 से सीपी के अलगाव का वर्णन करते हैं। यहां, वयस्क चूहों से सीपी को अलग करने के लिए एक सूक्ष्मविच्छेदन अलगाव तकनीक का वर्णन किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, यह अलगाव तकनीक सीपी के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता, कार्य और संरचना को संरक्षित करती है। चौथे और पार्श्व वेंट्रिकल्स में तैरने वाले सीपी का अलगाव यहां वर्णित है। संक्षेप में, चूहों को टर्मिनल रूप से एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और, यदि आवश्यक हो, तो ट्रांसकार्डियल रूप से संक्रमित किया जाता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि छिड़काव सीपी के भीतर कोशिकाओं की संरचना को नुकसान पहुंचा सकता है। नतीजतन, यदि नमूने का विश्लेषण ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम), सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम), या केंद्रित आयन बीम एसईएम (एफआईबी-एसईएम) का उपयोग करके किया जाना है, तो छिड़काव नहीं किया जाना चाहिए। इसके बाद, पूरे मस्तिष्क को अलग कर दिया जाता है, और मस्तिष्क को उत्तेजित करने के लिए बल का उपयोग किया जाता है। यहां से, पार्श्व वेंट्रिकल्स में तैरने वाले सीपी को पहचाना और विच्छेदित किया जा सकता है, जबकि चौथे वेंट्रिकल से सीपी को मस्तिष्क के अनुमस्तिष्क पक्ष से अलग किया जा सकता है।

Figure 2
चित्र 2: (ए, डी) ब्रोमोफेनॉल ब्लू छिड़काव के बाद (ए-सी) चौथे और (डी-एफ) पार्श्व वेंट्रिकल कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी) का विज़ुअलाइज़ेशन, (बी, ई) कोई छिड़काव नहीं, और (सी, एफ) पीबीएस / हेपरिन के साथ छिड़काव। छवियों को स्टीरियो माइक्रोस्कोप (8x-32x आवर्धन) के साथ लिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक बार जब सीपी को मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से ठीक से विच्छेदित किया जाता है, तो इस संरचना के कार्य पर आगे की समझ हासिल करने के लिए तकनीकों का एक पूरा प्रदर्शन लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फ्लो साइटोमेट्री या एकल सेल आरएनए अनुक्रमण को कुछ रोग स्थितियों26,27 के तहत घुसपैठ करने वाली भड़काऊ कोशिकाओं को निर्धारित करने और फेनोटाइपिक रूप से विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। सेलुलर संरचना के अलावा, सीपी की आणविक संरचना का विश्लेषण एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा), इम्यूनोब्लॉट, या साइटोकिन बीड सरणी28 का उपयोग करके कई साइटोकिन्स के एक साथ विश्लेषण के माध्यम से साइटोकिन्स और केमोकाइन की उपस्थिति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, ट्रांसक्रिपटम, संवहनी, प्रतिरक्षा कोशिका हिस्टोलॉजी, और स्रावी विश्लेषण माइक्रोविच्छेदित सीपी एक्सप्लेंट29 पर किए जा सकते हैं। यहां, पूरे माउंट सीपी पर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग सीपी संरचना के समग्र दृश्य को प्राप्त करने के लिए किया जाता है। एसईएम सतह पर स्कैन करने और सतह की स्थलाकृति और संरचना की छवि बनाने के लिए केंद्रित इलेक्ट्रॉनों की एक किरण का उपयोग करता है। चूंकि इलेक्ट्रॉनों की तरंग दैर्ध्य प्रकाश की तुलना में बहुत छोटी है, इसलिए एसईएम का रिज़ॉल्यूशन नैनोमीटर रेंज में है और प्रकाश माइक्रोस्कोप से बेहतर है। संक्षेप में, विच्छेदित सीपी को रात भर के निर्धारण के लिए तुरंत ग्लूटाराल्डिहाइड युक्त फिक्सेटिव में स्थानांतरित कर दिया जाता है, इसके बाद ऑस्मिकेशन और यूरिनिल एसीटेट धुंधला हो जाता है। फिर नमूनों को लीड एस्पार्टेट दाग के साथ इलाज किया जाता है, निर्जलित किया जाता है, और अंततः इमेजिंग के लिए एम्बेडेड किया जाता है।

इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से सीपी के कुशल अलगाव की सुविधा प्रदान करता है, जिसे इसकी संरचना और कार्य की जांच के लिए विभिन्न डाउनस्ट्रीम तकनीकों का उपयोग करके आगे विश्लेषण किया जा सकता है।

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Protocol

इस अध्ययन में वर्णित सभी पशु प्रयोग राष्ट्रीय (बेल्जियम कानून 14/08/1986 और 22/12/2003, बेल्जियम रॉयल डिक्री 06/04/2010) और यूरोपीय कानून (यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63/ईयू, 86/609 / ईईसी) के अनुसार आयोजित किए गए थे। चूहों और पशु प्रोटोकॉल पर सभी प्रयोगों को गेंट विश्वविद्यालय की नैतिकता समिति (परमिट संख्या एलए 1400091 और ईसी 2017-026) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. तैयारी

  1. एनेस्थेटिक्स: एक टर्मिनल एनेस्थेटिक तैयार करें। उदाहरण के लिए, फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में एक सोडियम पेंटोबार्बिटल (≥100 मिलीग्राम / किग्रा) समाधान तैयार किया जा सकता है।
  2. ट्रांसकार्डियल छिड़काव समाधान: 0.5% ब्रोमोफेनॉल नीले रंग के साथ पूरक पीबीएस / हेपरिन (0.2% हेपरिन युक्त) समाधान के 10 एमएल (प्रति माउस) तैयार करें।
    नोट: यदि डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण चरण अनुमति देते हैं (उदाहरण के लिए, आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के मामले में), कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी) को ब्रोमोफेनॉल नीले रंग के साथ ट्रांसकार्डियल छिड़काव के माध्यम से देखा जा सकता है। यदि ब्रोमोफेनॉल ब्लू आगे के प्रसंस्करण चरणों (जैसे, इमेजिंग के लिए) के साथ संगत नहीं है, तो पीबीएस / हेपरिन का उपयोग करें।
  3. एसईएम विश्लेषण के लिए आवश्यक समाधान तैयार करें।
    1. 0.1 एम एनए-कैकोडाइलेट बफर (पीएच 7.4) तैयार करें। 0.1 एम एनए-कैकोडाइलेट बफर में 2% पैराफॉर्मलडिहाइड और 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड का घोल तैयार करें। प्रति नमूना इस घोल का 20 एमएल बनाएं।
    2. 0.1 एम एनए-कैकोडाइलेट बफर (प्रति नमूना 5 एमएल) में 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड तैयार करें।
    3. 50%, 70%, 85%, और 100% EtOH समाधान तैयार करें। प्रति नमूना प्रत्येक ईटीओएच समाधान के 5 एमएल तैयार करें।

2. पार्श्व और चौथे वेंट्रिकल से बाहर कोरॉइड प्लेक्सस का सूक्ष्म विच्छेदन।

नोट: इस अध्ययन में महिला, 9 सप्ताह के सी 57बीएल / 6 चूहों का उपयोग किया गया था। हालांकि, वर्णित अलगाव तकनीक वयस्क माउस के तनाव, लिंग और उम्र से स्वतंत्र है।

  1. माउस मस्तिष्क को अलग करें।
    1. इंट्रापरिटोनियल रूप से माउस को एनेस्थेटाइज करने के लिए 26 जी सुई का उपयोग करके एक शॉर्ट-एक्टिंग बार्बिटुरेट (>100 मिलीग्राम / किग्रा, चरण 1.1 में तैयार) की घातक खुराक इंजेक्ट करें। माउस के पैर के रिफ्लेक्स को उसके पिछले पंजे को बल के साथ चुटकी मारकर जांचें।
    2. जब कोई पैर रिफ्लेक्स नहीं होता है, तो टर्मिनल ी एनेस्थेटाइज्ड जानवर को पृष्ठीय डेक्यूबिटस स्थिति में रखें और एक प्लेट पर अंगों को पिन करके माउस को ठीक करें।
      नोट: यदि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण विधि (जैसे, एसईएम इमेजिंग के लिए) के आधार पर चूहों के ट्रांसकार्डियल छिड़काव की आवश्यकता नहीं है, तो चरण 2.1.7 पर आगे बढ़ें। हालांकि, यदि रक्त में रक्त कोशिकाओं या अन्य घटकों को हटाने के लिए छिड़काव की आवश्यकता होती है, तो सीपी को ब्रोमोफेनॉल नीले रंग के साथ छिड़काव के माध्यम से मस्तिष्क वेंट्रिकल्स में तैरने वाली नीली संरचना के रूप में देखा जा सकता है।
    3. 70% इथेनॉल का छिड़काव करके छाती को कीटाणुरहित करें। सर्जिकल क्षेत्र के चारों ओर एक बाँझ ड्रेप रखें। कार्बन स्टील सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके डायाफ्राम के नीचे ~ 4 सेमी का चीरा लगाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. त्वचा खोलें और सर्जिकल कैंची का उपयोग करके छाती को उजागर करें। डायाफ्राम को पूरी तरह से खोलें।
    5. फेफड़ों और धड़कते दिल को उजागर करने के लिए वक्ष को अलग करें।
    6. ट्रांसकार्डियल रूप से छिड़काव पंप का उपयोग करके 4.5 एमएल / मिनट की दर से छिड़काव समाधान के 10 एमएल के साथ चूहों को संक्रमित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। छिड़काव में ~ 2 मिनट लगेंगे। समाधान को प्रणालीगत सर्किट में पंप करने के लिए बाएं वेंट्रिकल में 26 जी सुई डालें। इसके अलावा, दाहिने आलिंद में सर्जिकल कैंची से एक कट बनाएं ताकि रक्त परिसंचरण से बाहर जा सके।
      नोट: एक छिड़काव पंप को तरल पदार्थ के मैनुअल प्रशासन पर प्राथमिकता दी जाती है, क्योंकि यह तरल पदार्थ को एक सटीक प्रोग्राम की गई दर पर वितरित करेगा और यह सुनिश्चित करेगा कि छिड़काव के कारण होने वाले कतरनी बल बहुत मजबूत नहीं हैं। इसके अतिरिक्त, यहां अनुशंसित छिड़काव प्रवाह दर 7 सप्ताह के बाद से वयस्क चूहों को प्रभावित करने के लिए इष्टतम है। यदि छोटे चूहों का उपयोग किया जाता है, तो कम प्रवाह दर का उपयोग किया जाना चाहिए। एक साफ सर्जिकल साइट को संरक्षित करने के लिए दाहिने आलिंद से निकलने वाले रक्त को दूर करना भी महत्वपूर्ण है।
    7. माउस का सिर काट दो।
      नोट: मस्तिष्क संरचना को संरक्षित करने के लिए कंधे तक जितना संभव हो सके सिर को काटने के लिए सावधानी बरतें। यदि कटौती बहुत अधिक है, तो सेरिबैलम क्षतिग्रस्त हो सकता है।
    8. सिर काटने के बाद, कान के बीच से आंखों से बेहतर तक चीरा लगाकर खोपड़ी को काट लें। खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा को पार्श्व में खींचें। फिर, नाक के हिस्से की ओर, स्क्वैमोसल सीवन का पालन करके खोपड़ी को काट लें।
      नोट: मस्तिष्क की अखंडता को बनाए रखने के लिए खोपड़ी को धीरे से हटाना महत्वपूर्ण है।
    9. मस्तिष्क को बर्फ-ठंडे पेट्री डिश में रखें और मस्तिष्क के ऊतकों पर 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस जोड़ें।
      नोट: पकवान की कोटिंग की आवश्यकता नहीं है।
  2. चौथे वेंट्रिकल में तैरने वाले सीपी को अलग करें।
    1. धीरे से सेरेब्रम से सेरिबैलम को स्केलपेल से काट दें। सेरेब्रम मस्तिष्क का सबसे बड़ा हिस्सा है, जबकि सेरिबैलम मस्तिष्क के पीछे बहुत छोटा हिस्सा है। यदि आवश्यक हो, तो सेरिबैलम से शेष मस्तिष्क स्टेम ऊतक भागों को हटा दें।
    2. मस्तिष्क को इस तरह घुमाएं कि काटने की रेखा ऊपर की ओर हो। सुनिश्चित करें कि चौथा वेंट्रिकल गुहा अब अनुभाग के बीच में दिखाई दे रहा है, जिसमें सीपी पृष्ठीय साइट पर तैर रहा है। यदि आवश्यक हो, तो संयोजी ऊतक को तेज बल के साथ खोलकर वेंट्रिकल को थोड़ा खोलें। इस तरह, सीपी अधिक दृश्यमान और पहुंचने में आसान होगा।
    3. छोटे तेज बल का उपयोग करके सीपी को धीरे से वेंट्रिकल की दीवार से बाहर निकालें।
      नोट: आसपास के ऊतक के साथ नमूने को दूषित नहीं करने के लिए इस चरण में केवल सीपी को छूना और बाहर निकालना महत्वपूर्ण है। चरण 2.2.2 में वर्णित के रूप में वेंट्रिकल्स को खोलने से चरण 2.2.3 की सुविधा होगी।
  3. पार्श्व वेंट्रिकल से बाहर निकले सीपी को अलग करें।
    1. मस्तिष्क को दो गोलार्धों में काटने के लिए छोटे तेज बल का उपयोग करें।
    2. मस्तिष्क को इस तरह घुमाएं कि काटने की रेखा ऊपर की ओर हो। पार्श्व वेंट्रिकल को प्रकट करने के लिए, धीरे से थैलेमस से कॉर्टेक्स को दूर खींचें।
    3. हिप्पोकैम्पस को मध्य कटिंग लाइन पर वापस ले जाएं। पार्श्व वेंट्रिकल अब वेंट्रिकल के निचले हिस्से में सीपी के साथ दिखाई दे रहा है। यदि आवश्यक हो, तो संयोजी ऊतक को तेज बल के साथ खोलकर वेंट्रिकल को थोड़ा खोलें। इस तरह, सीपी अधिक दृश्यमान और पहुंचने में आसान होगा।
    4. वेंट्रिकल की दीवार से सीपी को धीरे से फाड़ने के लिए छोटे तेज बल का उपयोग करें।
      नोट: आसपास के ऊतक के साथ नमूने को दूषित नहीं करने के लिए इस चरण में केवल सीपी को छूना और बाहर निकालना महत्वपूर्ण है। चरण 2.3.4 में वर्णित वेंट्रिकल्स को खोलने से चरण 2.3.5 की सुविधा होगी। सीपी की संरचना को यथासंभव संरक्षित करने के लिए इस कदम में आवश्यक सावधानी बरतें। सीपी को रोस्ट्रल से पुच्छल दिशा में खींचना शुरू करना सबसे आसान है।

3. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग करके सीपी ऊतक का रूपात्मक विश्लेषण

सावधानी: निम्नलिखित प्रसंस्करण चरणों में विषाक्त समाधान का उपयोग किया जाता है। फ्यूम हुड में नमूना तैयारी करने की सिफारिश की जाती है।

  1. नीचे वर्णित एसईएम के लिए नमूना तैयारी करें।
    1. ताजा पृथक सीपी को ताजा बनाए गए निर्धारण समाधान में स्थानांतरित करें जिसमें 0.1 एम एनए-कैकोडाइलेट बफर (पीएच 7.4) में 2% पैराफॉर्मलडिहाइड और 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड शामिल हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: चूंकि सीपी ऊतक बहुत नाजुक और पतला है, ऊतक को बफर के बीच स्थानांतरित करने के लिए छोटे नमूना टोकरी ( सामग्री की तालिका देखें) में रखा जाना चाहिए। इस तरह, ऊतक की संरचना बेहतर संरक्षित होगी। एक कैकोडाइलेट-आधारित फिक्सेटिव का उपयोग पीबीएस-आधारित पर किया जाता है, क्योंकि मजबूत कैकोडाइलेट बफर ईएम फिक्सेटिव में ग्लूटाराल्डिहाइड के कम पीएच का मुकाबला कर सकता है।
    2. नमूने को 5 मिनट के लिए 0.1 एम एनए-कैकोडाइलेट बफर (पीएच 7.4) के 3-5 मिलीलीटर के साथ धोएं।
    3. 30 मिनट के लिए 0.1 एम एनए-कैकोडाइलेट बफर में 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड के 3-5 मिलीलीटर में नमूने को ठीक करें। नमूने को 3-5 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी के साथ 5 मिनट के लिए 3x धोएं।
    4. ईटीओएच सांद्रता (50%, 70%, 85%, 100%), प्रति ईटीओएच समाधान 15 मिनट के लिए बर्फ-ठंडे समाधानों की एक श्रृंखला में नमूनों को निर्जलित करें। नमूने को ठीक से सूखने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर का उपयोग करें।
      नोट तरल से गैस चरण में बदलने से सतह तनाव प्रभावित होता है, जिससे सतह संरचना को नुकसान होता है। महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने का कदम सतह संरचना के संरक्षण की अनुमति देता है।
    5. कार्बन स्टिकर के साथ प्रदान किए गए नमूना माउंट पर नमूने को ध्यान से रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. प्लैटिनम की एक पतली परत (2-5 एनएम) के साथ नमूने कोट करें। ऐसा करने के लिए, दो उच्च-वर्तमान विद्युत टर्मिनलों के बीच एक वैक्यूम सिस्टम में एक प्लैटिनम स्रोत माउंट करें और प्लैटिनम को उसके वाष्पीकरण तापमान पर गर्म करें। नमूने पर प्लैटिनम की एक महीन धारा जमा होती है।
      नोट: इस चरण के लिए एक अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल संदर्भ30 में प्रदान किया गया है। प्लैटिनम के अलावा, सोने या सोने / पैलेडियम का भी उपयोग किया जा सकता है।
  2. एसईएम के साथ सीपी नमूने की कल्पना करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एसईएम के माध्यम से सीपी ऊतक की विज़ुअलाइज़ेशन प्रक्रिया अन्य प्रकार के ऊतकों के समान है और उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर और उपकरणों पर निर्भर करती है। एक साथ वीडियो के साथ एक चरण-दर-चरण एसईएम प्रोटोकॉल संदर्भ31 या संदर्भ30 में उपलब्ध है।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क पार्श्व (चित्रा 2 ए-सी) और चौथे (चित्रा 2 डी-एफ) वेंट्रिकल्स से सीपी के कुशल अलगाव की सुविधा प्रदान करता है। पूरे मस्तिष्क को अलग करने के बाद, मस्तिष्क को अलग करने और पार्श्व वेंट्रिकल्स में तैरने वाले सीपी की पहचान करने के लिए बल का उपयोग किया जाता है। चौथे वेंट्रिकल से सीपी को मस्तिष्क के अनुमस्तिष्क पक्ष से अलग किया जा सकता है। ब्रोमोफेनॉल नीले रंग के साथ छिड़काव का उपयोग सीपी (चित्रा 2 ए, डी) की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है; हालांकि, जब आगे के प्रसंस्करण चरणों में ब्रोमोफेनॉल नीले रंग की अनुमति नहीं होती है, तो पीबीएस / हेपरिन (चित्रा 2 सी, एफ) या कोई छिड़काव (चित्रा 2 बी, ई) के साथ छिड़काव नहीं किया जा सकता है। मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से सीपी को अलग करने के बाद, ऊतक पर विश्लेषण का एक पूरा प्रदर्शन किया जा सकता है। इनमें जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग (आरटी-क्यूपीसीआर) 28, सेल प्रकार प्रोफाइलिंग (फ्लो साइटोमेट्री32, सिंगल सेल आरएनए अनुक्रमण 26,27), और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा), इम्यूनोब्लॉट, या मल्टीप्लेक्स इम्यूनोएसे के माध्यम से साइटोकिन्स और केमोकाइन 28 का पता लगाना शामिल है। इसके अलावा, माइक्रोविच्छेदित सीपी को संस्कृति में रखा जा सकता है ताकि सीपी को फ़ंक्शन को और स्पष्ट करने के लिए बनाया जा सके और उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट उत्तेजना23,28,29 के जवाब में इसके स्राव का अध्ययन किया जा सके। इस पांडुलिपि में, हम वर्णन करते हैं कि कोरॉयड प्लेक्सस एपिथेलियल (सीपीई) कोशिकाओं की सतह का रूपात्मक विश्लेषण करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) कैसे करें। चित्रा 3 एसईएम के माध्यम से प्राप्त चौथे वेंट्रिकल (चित्रा 3 ए) से अलग सीपी और पार्श्व वेंट्रिकल (चित्रा 3 बी) से अलग सीपी की अवलोकन छवियां दिखाता है। ये छवियां स्पष्ट रूप से पार्श्व सीपी के विशिष्ट सी-आकार के रूप और चौथे वेंट्रिकल सीपी की दो-हाथ संरचना को दिखाती हैं। 

Figure 3
चित्रा 3: विच्छेदित कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी) ऊतक की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) छवियों का अवलोकन । (ए, बी) सीपी की प्रतिनिधि एसईएम छवि माउस मस्तिष्क के (ए) चौथे और (बी) पार्श्व वेंट्रिकल्स से अलग है। स्केल बार = 100 μm। सेटिंग्स: इलेक्ट्रॉन उच्च तनाव (ईएचटी) = 5.00 केवी; कार्य दूरी (WD) = 4.8 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सीपीई कोशिकाओं पर ज़ूम इन करके, सीपीई कोशिकाओं के एपिकल पक्ष पर अन्य कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है (चित्रा 4 ए)। छवि में कैप्चर की गई कोशिका संभवतः एक एपिप्लेक्सस सेल है, एक मैक्रोफेज जैसी कोशिका जो सीपी की एपिकल सतह पर रहती है। हालांकि, एसईएम के माध्यम से इस सेल की विशिष्ट प्रकृति की पहचान करना संभव नहीं है। एसईएम इमेजिंग के अलावा, लाइव एक्सप्लेंट में कोरॉइड प्लेक्सस एपिथेलियम के दो-फोटॉन इमेजिंग करना संभव है, जैसा कि शिपली एट अल .29 द्वारा दिखाया गया है। जबकि एसईएम सीपी की सतह संरचनाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा प्रदान करता है, दो-फोटॉन इमेजिंग कोशिकाओं और सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम कर सकती है जब तक कि उन्हें फ्लोरोसेंट रूप से निगरानी की जा सकती है। इसमें संवहनी और प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विज़ुअलाइज़ेशन, साथ ही सीपी एक्सप्लेंट29 में स्रावी घटनाएं शामिल हैं।

एक उच्च एसईएम आवर्धन ने सीपीई कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) के साथ-साथ माइक्रोविली (चित्रा 4 सी) के एपिकल पक्ष पर पुटिका जैसी संरचनाओं का खुलासा किया। ये माइक्रोविली मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में फैल जाते हैं और कोशिकाओं और सीएसएफ के बीच सीपीई सेल सतह क्षेत्र को बढ़ाते हैं। इन परिणामों से पता चलता है कि रोग की स्थिति में सीपीई कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तनों की जांच एसईएम का उपयोग करके की जा सकती है।

Figure 4
चित्रा 4: कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी) ऊतक की विस्तृत स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) छवियां । (ए) कोरॉइड प्लेक्सस एपिथेलियल (सीपीई) कोशिकाओं के एपिकल पक्ष पर एक कोशिका। स्केल बार = 2 μm. (B) CPE कोशिकाओं के एपिकल पक्ष पर पुटिका जैसी संरचनाएं। स्केल बार = 10 μm. (C) सीपीई सेल की सतह का उसके माइक्रोविली के साथ विज़ुअलाइज़ेशन। स्केल बार = 1 μm। सेटिंग्स: इलेक्ट्रॉन उच्च तनाव (ईएचटी) = 5.00 केवी; कार्य दूरी (डब्ल्यूडी) = 4.9 मिमी; 3,000x आवर्धन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, पार्श्व वेंट्रिकल और माउस मस्तिष्क के चौथे वेंट्रिकल से कोरॉइड प्लेक्सस (सीपी) को अलग करने की एक विधि का वर्णन किया गया है। सीपी की यह पूरी बढ़ती विधि सीपी आकृति विज्ञान, सेलुलर संरचना, ट्रांसक्रिपटम, प्रोटिओम और सेक्रेटोम का पूरा दृश्य प्राप्त करने के लिए तकनीकों के प्रदर्शनों का उपयोग करके आगे के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करती है। मस्तिष्क के वेंट्रिकल्स से निकली इस उल्लेखनीय संरचना की बेहतर समझ हासिल करने के लिए इस तरह के विश्लेषण महत्वपूर्ण हैं। यह ज्ञान अत्यधिक शोध रुचि का है, क्योंकि यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि सीपी स्वास्थ्य और बीमारी 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

विधि के महत्वपूर्ण चरण, संशोधन और समस्या निवारण
यह सुनिश्चित करने के लिए माउस के पैर रिफ्लेक्स की जांच करना अत्यंत महत्वपूर्ण है कि टर्मिनल संज्ञाहरण अच्छी तरह से किया गया है। नैतिक कारणों के अलावा, यह यह भी आश्वासन देता है कि प्रयोगात्मक प्रक्रिया करते समय माउस को सही जगह पर रखा जाता है। उद्देश्य जानवर को एनेस्थेटाइज करना है ताकि उसे प्रक्रिया के दौरान दर्द का अनुभव न हो, जबकि छिड़काव के समय दिल धड़क रहा हो। यदि ऊतक के आगे के प्रसंस्करण के लिए रक्त को हटाने की आवश्यकता होती है, तो ट्रांसकार्डियल छिड़काव किया जा सकता है। रक्त के थक्के से बचने के लिए यहां हेपरिन युक्त सलाइन का उपयोग किया जाता है। ईडीटीए का उपयोग इस उद्देश्य के लिए भी किया जा सकता है, हालांकि, यदि सेल व्यवहार्यता को संरक्षित करना आवश्यक है, तो हेपरिन ईडीटीए पर एक बेहतर विकल्प है। अत्यधिक एनेस्थीसिया के कारण दिल धड़कना बंद हो जाने पर छिड़काव तुरंत शुरू किया जाना चाहिए। एक छिड़काव पंप तरल पदार्थ के मैनुअल प्रशासन पर बेहतर है, क्योंकि यह एक सटीक क्रमादेशित दर पर द्रव वितरण को सक्षम बनाता है और यह सुनिश्चित करता है कि छिड़काव के कारण होने वाले कतरनी बल बहुत मजबूत नहीं हैं। अत्यधिक कतरनी बल सीपी के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता और संरचना से समझौता करेंगे।

माउस मस्तिष्क वेंट्रिकल्स में तैरते सीपी को देखने में सक्षम होने के लिए एक प्रशिक्षित आंख की आवश्यकता होती है। इस कारण से, बहुत अभ्यास करना अत्यंत महत्वपूर्ण है। ब्रोमोफेनॉल नीले रंग के साथ संक्रमित चूहों पर प्रशिक्षण शुरू करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह सीपी को नीले रंग में दाग देगा और मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से छोटे सीपी ऊतक को अलग करना आसान बना देगा (चित्रा 2 ए, डी)। बाद के परीक्षणों में, सीपी को एक गैर-संक्रमित माउस से अलग किया जा सकता है। यह ब्रोमोफेनॉल ब्लू-परफ्यूज्ड माउस से सीपी अलगाव की तुलना में कठिन है, लेकिन सीपी ऊतक को अभी भी इसकी अत्यधिक संवहनी प्रकृति (चित्रा 2 बी, ई) से पहचाना जा सकता है। केवल व्यापक प्रशिक्षण के बाद मस्तिष्क पैरेन्काइमा (चित्रा 2 सी, एफ) के साथ संदूषण के बिना एक गैर-संक्रमित माउस से मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से सीपी ऊतक को अलग करना संभव है।

सीपी एक बहुत ही नाजुक और पतली संरचना है, जिसका अर्थ है कि इसके भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता, कार्य और संरचना को संरक्षित करने के लिए आवश्यक विवेक के साथ इसका अलगाव किया जाना चाहिए। इस प्रकार, वर्णित प्रोटोकॉल में विभिन्न चरणों को मस्तिष्क की अखंडता को संरक्षित करने के लिए आवश्यक परिशुद्धता और सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। सबसे पहले, माउस को कंधों के करीब हटाना महत्वपूर्ण है। यदि कट बहुत अधिक है, तो सेरिबैलम क्षतिग्रस्त हो सकता है, जिससे चौथे वेंट्रिकल में सीपी का अलगाव जटिल हो सकता है। इसके बाद, मस्तिष्क को नुकसान नहीं पहुंचाने के लिए खोपड़ी को सावधानी से हटाने की आवश्यकता है। एक बार जब मस्तिष्क अलग हो जाता है, तो मस्तिष्क को मटमैला होने से रोकने के लिए इसे ठंडा रखना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह सीपी अलगाव को काफी जटिल करेगा। ऐसा करने के लिए, मस्तिष्क को बर्फ-ठंडे पेट्री डिश पर रखना और मस्तिष्क पर बर्फ ठंडा पीबीएस जोड़ना महत्वपूर्ण है। वर्णित अलगाव तकनीक को करने के लिए एक निश्चित स्तर का प्रशिक्षण आवश्यक है क्योंकि यह माउस के विरूपण और सीपी के अंतिम अलगाव के बीच प्रसंस्करण समय को काफी कम कर देगा। एक छोटी अलगाव प्रक्रिया पृथक ऊतक की व्यवहार्यता और संरचना संरक्षण को बढ़ाएगी। अंत में, अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण, विशेष रूप से बल, को वेंट्रिकल्स से सीपी के तेज और कुशल अलगाव की सुविधा के लिए तेज और इंगित करने की आवश्यकता है। हालांकि, अलगाव के दौरान संरचना की अखंडता को नुकसान न पहुंचाने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए।

एसईएम के लिए नमूना प्रसंस्करण के दौरान ऊतक अखंडता को संरक्षित करने के लिए, सीपी को बफर के बीच स्थानांतरित करते समय छोटे नमूना टोकरी में रखा जा सकता है, ताकि ऊतक के स्पर्श से बचा जा सके। इसके अलावा, ईटीओएच समाधान से ऊतक को बाहर ले जाते समय महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की सिफारिश की जाती है। यह माइक्रोविली सहित सीपी की सतह संरचना के संरक्षण को सुनिश्चित करता है। तरल से गैस चरण में संक्रमण के कारण सतह तनाव, ऐसी संरचनाओं को नुकसान पहुंचा सकता है।

विधि की सीमाएँ
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, सीपी एक छोटी संरचना है, और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (जैसे, फ्लो साइटोमेट्री) के आधार पर, विभिन्न चूहों से सीपी को पूल करना आवश्यक हो सकता है। सीपी अलगाव में एक महत्वपूर्ण बाधा संरचना की पहचान है जब यह अभी भी वेंट्रिकल में तैर रहा है। सीपी की अत्यधिक संवहनी प्रकृति मस्तिष्क के वेंट्रिकुलर गुहाओं के अंदर इसकी सही पहचान (कुछ प्रशिक्षण के बाद) की सुविधा प्रदान करती है। हालांकि, यदि आगे के विश्लेषण के लिए रक्त युक्त घटकों को हटाने की आवश्यकता होती है, तो ट्रांसकार्डियल छिड़काव आवश्यक है। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के आधार पर, ब्रोमोफेनॉल ब्लू के साथ छिड़काव किया जा सकता है, जो सीपी ब्लू को दाग देगा, जिससे ऊतक के अलगाव की सुविधा होगी। दुर्भाग्य से, यह विज़ुअलाइज़ेशन तकनीक हमेशा संभव नहीं होती है (उदाहरण के लिए, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला करने के लिए)। ऐसे मामलों में, सीपी को आंख बंद करके अलग करने की आवश्यकता होती है, जिसके लिए पर्याप्त प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। माइक्रोस्कोप के प्रकाश विवर्तन के साथ खेलने से वेंट्रिकल्स में तैरने वाले सीपी की पहचान करने में मदद मिल सकती है। इसके अलावा, यह पांडुलिपि चौथे और पार्श्व वेंट्रिकल्स में तैरने वाले सीपी के अलगाव का वर्णन करती है, जबकि तीसरे वेंट्रिकल सीपी के अलगाव पर चर्चा नहीं की जाती है।

मौजूदा विधियों के संबंध में महत्व
इस प्रोटोकॉल में, सीपी को पहले मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से बाहर विच्छेदित किया जाता है, इससे पहले कि आगे का विश्लेषण किया जाए। यदि एक धुंधला प्रक्रिया का उपयोग फॉलो-अप रीड-आउट के रूप में किया जाता है, तो सीपी वाले मस्तिष्क वर्गों को दाग देना भी संभव है। इस बाद की तकनीक का अतिरिक्त मूल्य यह है कि वेंट्रिकल्स और मस्तिष्क के भीतर सीपी ऊतक का अभिविन्यास अभी भी दिखाई दे रहा है, जो कि ऐसा नहीं है अगर सीपी को पहले मस्तिष्क वेंट्रिकल्स से बाहर सूक्ष्मविच्छेदित किया जाता है। दूसरी ओर, सीपी युक्त मस्तिष्क अनुभाग को धुंधला करना केवल उस विशिष्ट खंड से जानकारी प्रदान करता है, जबकि पृथक सीपी को धुंधला करने से पूरे सीपी के बारे में जानकारी इकट्ठा करने में मदद मिल सकती है।

वर्णित तकनीक का लाभ यह है कि यह सीपी के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता, कार्य और संरचना को संरक्षित करता है। इसके अलावा, यह विधि वयस्क चूहों में चौथे और पार्श्व मस्तिष्क वेंट्रिकल्स में तैरने वाले सीपी के पूर्ण अलगाव की सुविधा प्रदान करती है। सीपी के अलगाव के तरीके (उदाहरण के लिए, चूहे के दिमाग24 और माउस प्यूप दिमाग25 से) पहले रिपोर्ट किए गए हैं। हालांकि, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि अलगाव तकनीक प्रजातियों से प्रजातियों और युवा और वयस्क उम्र के बीच भिन्न हो सकती है।

तकनीक के अतिरिक्त अनुप्रयोग
सीपी के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता, कार्य और संरचना को संरक्षित करने के अलावा, यह अलगाव तकनीक सीपी फ़ंक्शन की गहरी समझ हासिल करने के लिए डाउनस्ट्रीम तकनीकों के आवेदन की सुविधा प्रदान करती है। उदाहरण के लिए, फ्लो साइटोमेट्री या एकल सेल आरएनए अनुक्रमण को सीपी कोशिकाओं और घुसपैठ करने वाली कोशिकाओं को कुछ रोग स्थितियों26,27 के तहत निर्धारित और फेनोटाइपिक रूप से विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, सीपी की आणविक संरचना की जांच एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा), इम्यूनोब्लॉट, या तथाकथित साइटोकिन बीड सरणी द्वारा कई साइटोकिन्स के एक साथ विश्लेषण के माध्यम से साइटोकिन्स और केमोकाइन की उपस्थिति का आकलन करने के लिए की जा सकती है। इसके अलावा, ट्रांसक्रिपटम, संवहनी, प्रतिरक्षा कोशिका हिस्टोलॉजी, और स्रावी विश्लेषण माइक्रोविच्छेदित सीपी एक्सप्लेंट29 पर किए जा सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को बेल्जियन फाउंडेशन ऑफ अल्जाइमर रिसर्च (एसएओ; परियोजना संख्या: 20200032), रिसर्च फाउंडेशन फ्लैंडर्स (एफडब्ल्यूओ व्लाएंडरेन; परियोजना संख्या: 1268823 एन, 11 डी 0520 एन, 11 9 5021 एन) और बैलेट लैटोर फंड द्वारा समर्थित किया गया था। हम उपकरण पार्क में प्रशिक्षण, समर्थन और पहुंच के लिए वीआईबी बायोइमेजिंग कोर को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G x 1/2 needle Henke Sass Wolf 4710004512
Aluminium specimen mounts EM Sciences 75220
Cacodylate buffer EM Sciences 11652
Carbon steel surgial blades Swann-Morton 0210 size: 0.45 mm x 12 mm
Carbon adhesive tabs -12 mm EM Sciences 77825-12
Critical point dryer  Bal-Tec  CPD030
Crossbeam 540 Zeiss SEM system
Forceps Fine Science Tools GmbH  91197-00
Glutaraldehyde EM Sciences 16220
Heparin Sigma-Aldrich H-3125
Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel Metrohm Belgium N.V CPA-7800160
Osmium Tetroxide  EM Sciences 19170
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate buffered saline (PBS) Lonza BE17-516F
Platinum  Quorum  Q150T ES PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered
Sodium pentobarbital Kela NV 514
Specimen Basket Stainless Steel EM Sciences 70190-01
Stemi DV4 Stereo microscope Zeiss
Surgical scissors Fine Science Tools GmbH  91460-11

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References

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Van Wonterghem, E., Van Hoecke, L., Van Imschoot, G., Verhaege, D., Burgelman, M., Vandenbroucke, R. E. Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus. J. Vis. Exp. (190), e64733, doi:10.3791/64733 (2022).

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