Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Mikrodisseksjon og helmontert skanning elektronmikroskopi visualisering av mus choroid plexus

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64733
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB Center for Inflammation Research, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University
* These authors contributed equally

Summary

Choroid plexus (CP), et understudert vev i nevrovitenskap, spiller en nøkkelrolle i helse og sykdom i sentralnervesystemet. Denne protokollen beskriver en mikrodisseksjonsteknikk for å isolere CP og bruk av skanningelektronmikroskopi for å få en samlet oversikt over dens cellulære struktur.

Abstract

Choroid plexus (CP), en svært vaskularisert struktur som stikker ut i hjernens ventrikler, er et av de mest understuderte vevene i nevrovitenskap. Ettersom det blir stadig tydeligere at denne lille strukturen spiller en avgjørende rolle i helse og sykdom i sentralnervesystemet (CNS), er det av største betydning å dissekere CP riktig ut av hjerneventriklene på en måte som tillater nedstrøms behandling, alt fra funksjonell til strukturell analyse. Her beskrives isolering av lateral og fjerde hjerneventrikkelmus CP uten behov for spesialiserte verktøy eller utstyr. Denne isolasjonsteknikken bevarer levedyktigheten, funksjonen og strukturen til celler i CP. På grunn av sin høye vaskularisering kan CP visualiseres flytende inne i hjernens ventrikulære hulrom ved hjelp av et kikkertmikroskop. Imidlertid kan transkardial perfusjon som kreves for nedstrøms analyse komplisere identifiseringen av CP-vevet. Avhengig av de videre behandlingstrinnene (f.eks. RNA og proteinanalyse), kan dette løses ved å visualisere CP via transkardial perfusjon med bromfenolblått. Etter isolasjon kan CP behandles ved hjelp av flere teknikker, inkludert RNA, protein eller enkeltcelleanalyse, for å få ytterligere forståelse av funksjonen til denne spesielle hjernestrukturen. Her brukes skanning elektronmikroskopi (SEM) på hele mount CP for å få en samlet oversikt over strukturen.

Introduction

Tette barrierer skiller sentralnervesystemet (CNS) fra periferien, inkludert blod-hjernebarrieren (BBB) og blod-cerebrospinalvæsken (CSF) barrieren. Disse barrierene beskytter CNS mot eksterne fornærmelser og sikrer et balansert og kontrollert mikromiljø 1,2,3. Mens BBB har blitt grundig studert over tid, har blod-CSF-barrieren som ligger ved choroid plexus (CP) bare fått økende forskningsinteresse i løpet av det siste tiåret. Denne sistnevnte barrieren finnes i hjernens fire ventrikler (figur 1A, B) og er preget av et enkelt lag av choroid plexus epitelceller (CPE) som omgir en sentral stroma, lekkende kapillærer, fibroblaster og en lymfoid og myeloid cellepopulasjon (figur 1C) 4,5,6. CPE-cellene er godt forbundet med stramme kryss, og forhindrer dermed lekkasje fra de underliggende fenestrerte blodkapillærene inn i CSF og hjernen. I tillegg reguleres transport over CPE-cellene av en rekke transportsystemer innover og utover som styrer tilstrømningen av gunstige forbindelser (f.eks. næringsstoffer og hormoner) fra blodet til CSF og utstrømningen av skadelige molekyler (f.eks. metabolsk avfall, overflødige nevrotransmittere) i den andre retningen 1,6. For å kunne utøve sin aktive transportfunksjon inneholder CPE-cellene mange mitokondrier i deres cytoplasma7. Videre er CP den viktigste kilden til CSF og fungerer som gatekeeper av hjernen ved tilstedeværelse av bosatt inflammatoriske celler1. På grunn av sin unike beliggenhet mellom blodet og hjernen, er CP også perfekt posisjonert for å utføre immunovervåking8.

Figure 1
Figur 1 Skjematisk oversikt over lokalisasjon og sammensetning av choroid plexus (CP). (A,B) CP-vev finnes i de to laterale, tredje og fjerde ventriklene til (A) menneskelige og (B) musehjerner. (C) CP-vevet består av et enkelt lag av tett koblede kuboidale CP-epitelceller (CPE) som omgir fenestrerte kapillærer, løst bindevev og lymfoide og myeloide celler, og danner blod-cerebrospinalvæskebarrieren (tilpasset og modifisert fra referanse23). Figur opprettet med Biorender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I løpet av det siste tiåret har økende bevis, inkludert flere rapporter fra vår forskningsgruppe, avslørt at CP spiller en sentral rolle i helse og sykdom 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . For eksempel er det kjent at den aldrende blod-CSF-barrieren viser morfologiske endringer i blant annet kjernene, mikrovilli og kjellermembranen 1,19. I tillegg, i sammenheng med Alzheimers sykdom, er den generelle barriereintegriteten kompromittert, og alle disse aldersrelaterte endringene ser ut til å være enda mer uttalt 1,8,20. I tillegg til morfologiske endringer endres transkriptomet, proteomet og sekretomet til CP under sykdom 12,21,22,23. Dermed er avansert kunnskap om CP avgjørende for å bedre forstå sin rolle i nevrologiske sykdommer og potensielt utvikle nye terapeutiske strategier.

En effektiv metode for nøyaktig mikrodisseksjon av CP ut av hjerneventriklene er det første uvurderlige skrittet for å tillate riktig undersøkelse av denne lille hjernestrukturen. På grunn av sin sterkt vaskulariserte natur (figur 2B) kan CP som flyter inne i hjernens ventrikulære hulrom identifiseres ved hjelp av et kikkertmikroskop. Imidlertid er transkardial perfusjon ofte nødvendig for nedstrømsanalyse, noe som kompliserer riktig identifisering og isolering av CP-vevet (figur 2C). Hvis de videre behandlingstrinnene tillater det (f.eks. ved RNA- og proteinanalyse), kan CP visualiseres via transkardial perfusjon med bromfenolblått (figur 2A). Flere publikasjoner beskriver allerede isoleringen av CP fra rotte24 og musevalpehjerner25. Her beskrives en mikrodisseksjonsisolasjonsteknikk for å isolere CP fra voksne mus. Det er viktig at denne isolasjonsteknikken bevarer levedyktigheten, funksjonen og strukturen til cellene i CP. Isoleringen av CP flytende i fjerde og laterale ventrikler er beskrevet her. Kort sagt, musene er terminalt bedøvet og om nødvendig transkardialt perfusert. Det skal imidlertid bemerkes at perfusjon kan skade strukturen til cellene i CP. Følgelig, hvis prøven skal analyseres ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM), seriell blokk ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM), eller fokusert ionstråle SEM (FIB-SEM), bør perfusjon ikke utføres. Deretter isoleres hele hjernen, og tang brukes til å sagittalt hemisect hjernen. Herfra kan CP-ene som flyter i laterale ventrikler identifiseres og dissekeres, mens CP fra fjerde ventrikkel kan isoleres fra hjernesiden.

Figure 2
Figur 2 Visualisering av (A-C) fjerde og (D-F) laterale ventrikkel choroid plexus (CP) etter (A,D) bromfenolblå perfusjon, (B,E) ingen perfusjon og (C,F) perfusjon med PBS/heparin. Bildene er tatt med stereomikroskop (8x-32x forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Når CP er riktig dissekert ut av hjerneventriklene, kan et helt repertoar av teknikker brukes for å få ytterligere forståelse av funksjonen til denne strukturen. For eksempel kan flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekvensering utføres for å kvantifisere og fenotypisk analysere de infiltrerende inflammatoriske cellene under visse sykdomstilstander26,27. I tillegg til den cellulære sammensetningen kan den molekylære sammensetningen av CP analyseres for å vurdere tilstedeværelsen av cytokiner og kjemokiner via enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA), immunoblot, eller gjennom samtidig analyse av flere cytokiner ved bruk av cytokinperlematrisen28. Videre kan transkriptom-, vaskulær-, immuncellehistologi- og sekretomanalyser utføres på de mikrodissekerte CP-eksplantene29. Her brukes skanning elektronmikroskopi (SEM) på hele mount CP for å få en samlet oversikt over CP-strukturen. SEM bruker en stråle av fokuserte elektroner til å skanne over overflaten og skape et bilde av overflatens topografi og sammensetning. Siden bølgelengden til elektroner er mye mindre enn lyset, er oppløsningen av SEM i nanometerområdet og overlegen til et lysmikroskop. Følgelig kan morfologiske studier på subcellulært nivå utføres via SEM. Kort fortalt overføres den dissekerte CP umiddelbart til et glutaraldehydholdig fikseringsmiddel for en fiksering over natten, etterfulgt av osmikyring og uranylacetatfarging. Prøvene blir deretter behandlet med bly aspartat flekk, dehydrert, og til slutt innebygd for avbildning.

Dermed letter denne protokollen effektiv isolering av CP fra musens hjerneventrikler, som kan analyseres videre ved hjelp av en rekke nedstrøms teknikker for å undersøke dens struktur og funksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk beskrevet i denne studien ble utført i henhold til nasjonal (belgisk lov 14/08/1986 og 22/12/2003, belgisk kongelig dekret 06/04/2010) og europeisk lovgivning (EU-direktiver 2010/63 / EU, 86/609 / EØF). Alle eksperimenter på mus og dyreprotokoller ble godkjent av etikkomiteen ved Ghent University (tillatelsesnummer LA1400091 og EC 2017-026).

1. Forberedelse

  1. Bedøvelse: Forbered en terminal bedøvelse. For eksempel kan en natriumpentobarbital (≥100 mg / kg) oppløsning i fosfatbufret saltvann (PBS) fremstilles.
  2. Transkardial perfusjonsoppløsning: Klargjør 10 ml (per mus) PBS/heparin (inneholdende 0,2 % heparin) oppløsning tilsatt 0,5 % bromfenolblått.
    MERK: Hvis nedstrømsbehandlingstrinnene tillater det (f.eks. Ved RNA- og proteinanalyse) kan choroid plexus (CP) visualiseres via transkardial perfusjon med bromfenolblått. Hvis bromfenolblått ikke er kompatibelt med de videre behandlingstrinnene (f.eks. for avbildning), bruk PBS / heparin til perfus.
  3. Forbered løsningene som kreves for SEM-analyse.
    1. Forbered 0,1 M Na-kakodylatbuffer (pH 7,4). Forbered en løsning av 2% paraformaldehyd og 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M Na-kakodylatbuffer. Lag 20 ml av denne løsningen per prøve.
    2. Klargjør 2% osmiumtetroxid i 0,1 M Na-kakodylatbuffer (5 ml per prøve).
    3. Forbered 50%, 70%, 85% og 100% EtOH-løsninger. Klargjør 5 ml av hver EtOH-oppløsning per prøve.

2. Mikrodisseksjon av choroid plexus ut av lateral og fjerde ventrikkel

MERK: Hunn, 9 uker gamle C57BL/6 mus ble brukt i denne studien. Imidlertid er den beskrevne isolasjonsteknikken uavhengig av belastningen, kjønn og alder av den voksne musen.

  1. Isoler musehjernen.
    1. Intraperitonealt injiser en dødelig dose av et korttidsvirkende barbiturat (>100 mg/kg, tilberedt i trinn 1.1) ved hjelp av en 26G kanyle for terminalt bedøvelse av musen. Sjekk musens fotrefleks ved å klemme bakpoten med tang.
    2. Når det ikke er fotrefleks, plasser det terminalt bedøvede dyret i dorsaldecubitusposisjonen og fest musen ved å feste lemmer på en tallerken.
      MERK: Hvis transkardial perfusjon av musene ikke er nødvendig, avhengig av nedstrøms analysemetode (f.eks. for SEM-avbildning), fortsett til trinn 2.1.7. Men hvis perfusjon er nødvendig for å fjerne blodceller eller andre komponenter i blodet, kan CP visualiseres som en blå struktur som flyter i hjerneventriklene via perfusjon med bromfenolblått.
    3. Desinfiser brystet ved å sprøyte 70% etanol. Plasser en steril drapering rundt operasjonsområdet. Lag et snitt på ~ 4 cm like under membranen ved hjelp av et kirurgisk blad av karbonstål (se materialtabell).
    4. Åpne huden og utsett brystet ved hjelp av kirurgisk saks. Klipp membranen helt åpen.
    5. Separer brystkassen for å eksponere lungene og det bankende hjertet.
    6. Transkardialt perfusere musene med 10 ml perfusjonsoppløsning med en hastighet på 4,5 ml/min, ved bruk av en perfusjonspumpe (se materialfortegnelse). Perfusjonen vil ta ~2 min. Sett inn en 26G nål i venstre ventrikkel for å pumpe oppløsningen inn i den systemiske kretsen. I tillegg gjør du et kutt med kirurgisk saks i høyre atrium slik at blod kan gå ut av sirkulasjonen.
      MERK: En perfusjonspumpe foretrekkes fremfor manuell administrering av væsken, da den vil levere væskene med en nøyaktig programmert hastighet og sikre at skjærkreftene forårsaket av perfusjonen ikke er for sterke. Overdreven skjærekrefter vil kompromittere levedyktigheten og strukturen til celler i CP. I tillegg er perfusjonsstrømningshastigheten som anbefales her optimal for å perfusere voksne mus fra 7 uker og fremover. Hvis yngre mus brukes, bør en lavere strømningshastighet brukes. Det er også viktig å tørke bort blodet som kommer ut av høyre atrium for å bevare et rent kirurgisk sted.
    7. Halshugg musen.
      MERK: Vær forsiktig med å kutte av hodet så lavt som mulig til skulderen for å bevare hjernestrukturen. Hvis kuttet er for høyt, kan cerebellum bli skadet.
    8. Etter halshugging, kutt opp hodebunnen ved å gjøre et snitt fra mellom ørene til overlegen øynene. Trekk huden sideveis for å avsløre skallen. Deretter kutter du opp skallen ved å følge squamosal suturer, mot nesedelen.
      MERK: Det er viktig å forsiktig fjerne skallen for å opprettholde hjernens integritet.
    9. Legg hjernen i en iskald petriskål og tilsett 1 ml iskald 1x PBS på hjernevevet.
      MERK:Belegg av parabolen er ikke nødvendig.
  2. Isoler CP som flyter i fjerde ventrikkel.
    1. Klipp forsiktig av cerebellum fra storhjernen med en skalpell. Storhjernen er den største delen av hjernen, mens lillehjernen er en mye mindre del på baksiden av hjernen. Fjern om nødvendig gjenværende hjernestamvevsdeler fra lillehjernen.
    2. Roter hjernen slik at skjærelinjen vender oppover. Sørg for at det fjerde ventrikkelhulrommet nå er synlig midt i snittet, med CP flytende på dorsalstedet. Om nødvendig, åpne ventrikkelen litt ved å trekke opp bindevevet med skarpe tang. På denne måten vil CP være mer synlig og lettere å nå.
    3. Riv CP forsiktig ut av ventrikkelveggen med små skarpe tang.
      MERK: Det er viktig å bare berøre og ta ut CP i dette trinnet for ikke å forurense prøven med det omkringliggende vevet. Åpning av ventriklene som beskrevet i trinn 2.2.2 vil lette trinn 2.2.3.
  3. Isoler CP som stikker ut av lateral ventrikkel.
    1. Bruk små skarpe tang for å sagittalt kutte hjernen i to halvkuler.
    2. Roter hjernen slik at skjærelinjen vender oppover. For å avsløre lateral ventrikkel, trekk forsiktig cortex fra thalamus.
    3. Trekk hippocampus tilbake til midtsagittale skjærelinjen. Den laterale ventrikkelen er nå synlig med CP liggende i bunnen av ventrikkelen. Om nødvendig, åpne ventrikkelen litt ved å trekke opp bindevevet med skarpe tang. På denne måten vil CP være mer synlig og lettere å nå.
    4. Bruk små skarpe tang for å forsiktig rive CP ut av ventrikkelveggen.
      MERK: Det er viktig å bare berøre og ta ut CP i dette trinnet for ikke å forurense prøven med det omkringliggende vevet. Åpning av ventriklene som beskrevet i trinn 2.3.4 vil lette trinn 2.3.5. Vær nødvendig forsiktighet i dette trinnet for å bevare strukturen til CP så mye som mulig. Det er lettest å begynne å trekke CP i rostral til kaudal retning.

3. Morfologisk analyse av CP-vev ved hjelp av skanning elektronmikroskopi (SEM)

FORSIKTIG: Giftige løsninger brukes i følgende behandlingstrinn. Det anbefales å utføre prøvepreparatet i en avtrekkshette.

  1. Utfør prøveklargjøring for SEM som beskrevet nedenfor.
    1. Overfør den ferske isolerte CP til nylaget fikseringsløsning inneholdende 2% paraformaldehyd og 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M Na-kakodylatbuffer (pH 7,4). Inkuber over natten ved 4 °C.
      MERK: Siden CP-vevet er svært skjørt og tynt, bør vevet legges i små prøvekurver (se materialtabellen) for å overføre det mellom buffere. På denne måten vil vevets struktur bli bedre bevart. Et kakodylatbasert fikseringsmiddel brukes over en PBS-basert, da den sterke kakodylatbufferen kan motvirke den lave pH av glutaraldehyd i EM-fikseringsmiddelet.
    2. Vask prøven 3x i 5 min hver med 3-5 ml 0,1 M Na-kakodylatbuffer (pH 7,4).
    3. Etterfiks prøvene i 3-5 ml 2% osmiumtetroxid i 0,1 M Na-kakodylatbuffer i 30 minutter. Vask prøvene 3x i 5 min hver med 3-5 ml ultrarent vann.
    4. Dehydrer prøvene i en serie iskalde løsninger med økende EtOH-konsentrasjoner (50%, 70%, 85%, 100%), i 15 minutter per EtOH-løsning. Bruk en tørketrommel med kritisk punkt for å tørke prøven riktig.
      MERK Endring fra væske- til gassfase påvirker overflatespenningen og forårsaker skade på overflatestrukturen. Tørketrinnet med kritisk punkt gjør det mulig å bevare overflatestrukturen.
    5. Plasser prøven forsiktig på et prøvefeste som er utstyrt med et karbonklistremerke (se materialfortegnelse).
    6. Belegg prøvene med et tynt lag (2-5 nm) platina. For å gjøre dette, monter en platinakilde i et vakuumsystem mellom to elektriske terminaler med høy strøm og varm platina til fordampningstemperaturen. En fin strøm av platina blir avsatt på prøven.
      MERK: En mer detaljert protokoll for dette trinnet er gitt i referanse30. Foruten platina kan gull eller gull/palladium også brukes.
  2. Visualiser CP-prøvene med SEM (se Materialfortegnelse). Visualiseringsprosedyren for CP-vev via SEM ligner på andre typer vev og avhenger av brukt programvare og instrumenter. En trinnvis SEM-protokoll med tilhørende video er tilgjengelig i referanse31 eller referanse30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den beskrevne protokollen letter effektiv isolering av CP fra musehjernens laterale (figur 2A-C) og fjerde (figur 2D-F) ventrikler. Etter å ha isolert hele hjernen, brukes tang til å sagittalt hemisect hjernen og identifisere CPene som flyter i laterale ventrikler. CP fra fjerde ventrikkel kan isoleres fra lillehjernen side. Perfusjon med bromfenolblått kan brukes til å visualisere CP (figur 2A, D); Når bromfenolblått ikke er tillatt i de videre behandlingstrinnene, kan det imidlertid utføres perfusjon med PBS/heparin (figur 2C,F) eller ingen perfusjon (figur 2B,E). Etter å ha isolert CP ut av hjerneventriklene, kan et helt repertoar av analyser utføres på vevet. Disse inkluderer genuttrykksprofilering (RT-qPCR) 28, celletypeprofilering (flowcytometri32, enkeltcelle RNA-sekvensering 26,27), og påvisning av cytokiner og kjemokiner 28via enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA), immunoblot eller multiplex immunoassays. Videre kan mikrodissekert CP plasseres i kultur for å lage CP-eksplanter for ytterligere å belyse funksjonen og for eksempel studere dens sekretom som svar på en spesifikk stimulus23,28,29. I dette manuskriptet beskriver vi hvordan man utfører skanning elektronmikroskopi (SEM) for å morfologisk analysere overflaten av choroid plexus epitelceller (CPE). Figur 3 viser oversiktsbilder av CP isolert fra fjerde ventrikkel (figur 3A) og CP isolert fra lateral ventrikkel (figur 3B), målt via SEM. Disse bildene viser tydelig den typiske C-formede formen av lateral CP og toarmstrukturen til fjerde ventrikkel CP. 

Figure 3
Figur 3 Oversikt over elektronmikroskopi (SEM)-bilder av dissekert choroid plexus (CP) vev. (A,B) Representativt SEM-bilde av CP isolert fra (A) fjerde og (B) laterale ventrikler i musehjernen. Skala bar = 100 μm. Innstillinger: elektron høyspenning (EHT) = 5,00 kV; arbeidsavstand (WD) = 4,8 mm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ved å zoome inn på CPE-cellene kan andre celler på den apikale siden av CPE-cellene detekteres (figur 4A). Cellen fanget i bildet er muligens en epiplexuscelle, en makrofaglignende celle som ligger på den apikale overflaten av CP. Det er imidlertid ikke mulig å identifisere den spesifikke naturen til denne cellen via SEM. I tillegg til SEM-avbildning er det mulig å utføre to-foton avbildning av choroid plexus epitel i levende eksplanter, som vist av Shipley et al.29. Mens SEM letter visualiseringen av overflatestrukturer av CP, kan to-foton avbildning muliggjøre visualisering av et bredt spekter av celler og cellulære prosesser så lenge de kan overvåkes fluorescerende. Dette inkluderer visualisering av vaskulære og immunceller, samt sekretoriske hendelser i CP explant29.

Høyere SEM-forstørrelse viste vesikkellignende strukturer på apikalsiden av CPE-cellene (figur 4B) samt mikrovilli (figur 4C). Disse mikrovilli stikker ut i cerebrospinalvæsken (CSF) og øker CPE-celleoverflaten mellom cellene og CSF. Disse resultatene viser at de morfologiske endringene av CPE-cellene ved sykdomstilstander kan undersøkes ved hjelp av SEM.

Figure 4
Figur 4 Detaljert skanning elektronmikroskopi (SEM) bilder av choroid plexus (CP) vev. (A) En celle på den apikale siden av choroid plexus epitelceller (CPE). Skala bar = 2 μm. (B) Vesikkellignende strukturer på den apikale siden av CPE-celler. Skala bar = 10 μm. (C) Visualisering av en CPE-celleoverflate med mikrovilli. Skala bar = 1 μm. Innstillinger: elektron høyspenning (EHT) = 5,00 kV; arbeidsavstand (WD) = 4,9 mm; 3,000x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrives en metode for å isolere choroid plexus (CP) ut av lateral ventrikkel og fjerde ventrikkel i en musehjerne. Hele denne monteringsmetoden til CP muliggjør videre analyse ved hjelp av et repertoar av teknikker for å få en fullstendig oversikt over CP-morfologi, cellulær sammensetning, transkriptom, proteom og sekretom. Slike analyser er avgjørende for å få en bedre forståelse av denne bemerkelsesverdige strukturen som stikker ut fra hjernens ventrikler. Denne kunnskapen er av enorm forskningsinteresse, da det blir stadig tydeligere at CP spiller en avgjørende rolle for helse og sykdom 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

Kritiske trinn, modifikasjoner og feilsøking av metoden
Det er av største betydning å sjekke musens fotrefleks for å sikre at terminalbedøvelsen er godt utført. Foruten etiske grunner, sikrer dette også at musen holdes på rett sted mens du utfører eksperimentell prosedyre. Målet er å bedøve dyret slik at det ikke opplever smerte under prosedyren mens hjertet slår på perfusjonstidspunktet. Hvis ytterligere behandling av vevet krever fjerning av blod, kan transkardial perfusjon utføres. Saltvann som inneholder heparin brukes her for å unngå blodpropp. EDTA kan også brukes til dette formålet, men hvis det er nødvendig å bevare cellens levedyktighet, er heparin et bedre valg over EDTA. Perfusjon bør startes umiddelbart når hjertet slutter å slå på grunn av overdreven anestesi. En perfusjonspumpe er å foretrekke fremfor manuell administrering av væsken, da dette muliggjør væsketilførsel med en nøyaktig programmert hastighet og sikrer at skjærekreftene forårsaket av perfusjonen ikke er for sterke. Overdreven skjærkraft vil kompromittere levedyktigheten og strukturen til celler i CP.

Det krever et trent øye for å kunne se CP flyte i musens hjerneventrikler. Av denne grunn er det av største betydning å øve mye. Det anbefales å starte treningen på mus som er perfusert med bromfenolblått, da dette vil farge CP i blått og gjøre det lettere å skille det lille CP-vevet fra resten av hjernen (figur 2A,D). I senere forsøk kan CP isoleres fra en ikke-perfusert mus. Dette er vanskeligere sammenlignet med CP-isolasjon fra en bromfenolblåperfusert mus, men CP-vevet kan fortsatt identifiseres fra sin svært vaskulariserte natur (figur 2B,E). Først etter omfattende trening er det mulig å isolere CP-vevet ut av hjerneventriklene fra en ikke-perfundert mus uten forurensning med hjerneparenkym (figur 2C,F).

CP er en svært skjøre og tynn struktur, noe som innebærer at isolasjonen skal utføres med nødvendig forsiktighet for å bevare levedyktigheten, funksjonen og strukturen til celler i den. Dermed må forskjellige trinn i den beskrevne protokollen utføres med nødvendig presisjon og forsiktighet for å bevare hjernens integritet. Først er det viktig å halshugge musen nær skuldrene. Hvis kuttet er for høyt, kan cerebellum bli skadet, noe som kompliserer isoleringen av CP i fjerde ventrikkel. Deretter må skallen fjernes forsiktig for ikke å skade hjernen. Når hjernen er isolert, er det avgjørende å holde den kald for å forhindre at hjernen blir grøtaktig, da dette vil komplisere CP-isolasjon betydelig. For å gjøre det, er det viktig å plassere hjernen på en iskald petriskål og legge iskald PBS over hjernen. Et visst treningsnivå er nødvendig for å utføre den beskrevne isolasjonsteknikken, da dette vil forkorte behandlingstiden betydelig mellom musens halshugging og den endelige isolasjonen av CP. En kort isolasjonsprosess vil forbedre levedyktigheten og strukturbevaringen av det isolerte vevet. Til slutt må verktøyene som brukes til isolasjon, spesielt tangen, være skarpe og spisse for å lette rask og effektiv isolering av CP ut av ventriklene. Imidlertid bør det tas hensyn til ikke å skade strukturens integritet under isolasjon.

For å bevare vevets integritet under prøvebehandling for SEM, kan CP settes i små prøvekurver ved overføring mellom buffere, slik at berøring av vevet selv kan unngås. Videre anbefales det å utføre kritisk punkttørking når vevet flyttes ut av EtOH-løsningene. Dette sikrer bevaring av overflatestrukturen til CP, inkludert mikrovilli. Overflatespenning, forårsaket av overgangen fra væske- til gassfase, kan skade slike strukturer.

Begrensninger av metoden
Som nevnt tidligere er CP en liten struktur, og avhengig av nedstrømsanalysene (f.eks. flowcytometri), kan det være nødvendig å samle CP fra forskjellige mus. En betydelig hindring i CP-isolasjon er identifiseringen av strukturen når den fortsatt flyter i ventrikkelen. Den svært vaskulariserte naturen til CP letter korrekt identifikasjon (etter litt trening) inne i hjernens ventrikulære hulrom. Imidlertid, hvis blodholdige komponenter må fjernes for videre analyse, er transkardial perfusjon avgjørende. Avhengig av nedstrømsanalysen kan perfusjon med bromfenolblått utføres, noe som vil flekke CP-blått, og dermed lette isoleringen av vevet. Dessverre er denne visualiseringsteknikken ikke alltid mulig (f.eks. for immunhistokjemifarging). I slike tilfeller må CP isoleres blindt, noe som krever tilstrekkelig trening. Å leke med lysdiffraksjonen av mikroskopet kan bidra til å identifisere CP som flyter i ventriklene. I tillegg beskriver dette manuskriptet isoleringen av CP flytende i fjerde og laterale ventrikler, mens isolering av tredje ventrikkel CP ikke er omtalt.

Betydning i forhold til eksisterende metoder
I denne protokollen blir CP først dissekert ut av hjerneventriklene før videre analyse utføres. Hvis en fargeprosedyre brukes som oppfølgingsavlesning, er det også mulig å flekke hjerneseksjoner som inneholder CP. Merverdien av denne sistnevnte teknikken er at orienteringen av CP-vevet i ventriklene og hjernen fortsatt er synlig, noe som ikke er tilfelle hvis CP først mikrodissekeres ut av hjerneventriklene. På den annen side gir farging av en hjerneseksjon som inneholder CP bare informasjon fra den spesifikke delen, mens farging av den isolerte CP kan bidra til å samle informasjon om hele CP.

Fordelen med den beskrevne teknikken er at den bevarer levedyktigheten, funksjonen og strukturen til cellene i CP. Videre letter denne metoden fullstendig isolasjon av CP som flyter i fjerde og laterale hjerneventrikler hos voksne mus. Metoder for isolering av CP (f.eks. fra rottehjerner24 og musevalpehjerner25) er tidligere rapportert. Det er imidlertid viktig å tenke på at isolasjonsteknikken kan variere fra art til art og mellom ung og voksen alder.

Ytterligere anvendelser av teknikken
I tillegg til å bevare levedyktigheten, funksjonen og strukturen til celler i CP, letter denne isolasjonsteknikken anvendelsen av nedstrøms teknikker for å få en dypere forståelse av CP-funksjonen. For eksempel kan flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekvensering utføres for å kvantifisere og fenotypisk analysere CP-celler og infiltrerende celler under visse sykdomstilstander26,27. I tillegg kan den molekylære sammensetningen av CP undersøkes for å vurdere tilstedeværelsen av cytokiner og kjemokiner via enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA), immunoblot eller samtidige analyser av flere cytokiner ved en såkalt cytokinperlematrise. Videre kan transkriptom-, vaskulær-, immuncellehistologi- og sekretomanalyser utføres på de mikrodissekerte CP-eksplantene29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Belgian Foundation of Alzheimer's Research (SAO; prosjektnummer: 20200032), Research Foundation Flanders (FWO Vlaanderen; prosjektnummer: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) og Baillet Latour Fund. Vi takker VIB BioImaging Core for opplæring, support og tilgang til instrumentparken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G x 1/2 needle Henke Sass Wolf 4710004512
Aluminium specimen mounts EM Sciences 75220
Cacodylate buffer EM Sciences 11652
Carbon steel surgial blades Swann-Morton 0210 size: 0.45 mm x 12 mm
Carbon adhesive tabs -12 mm EM Sciences 77825-12
Critical point dryer  Bal-Tec  CPD030
Crossbeam 540 Zeiss SEM system
Forceps Fine Science Tools GmbH  91197-00
Glutaraldehyde EM Sciences 16220
Heparin Sigma-Aldrich H-3125
Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel Metrohm Belgium N.V CPA-7800160
Osmium Tetroxide  EM Sciences 19170
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate buffered saline (PBS) Lonza BE17-516F
Platinum  Quorum  Q150T ES PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered
Sodium pentobarbital Kela NV 514
Specimen Basket Stainless Steel EM Sciences 70190-01
Stemi DV4 Stereo microscope Zeiss
Surgical scissors Fine Science Tools GmbH  91460-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
  2. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), Springer-Verlag. 497-511 (2009).
  3. Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation. Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
  6. Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).
  7. Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
  8. Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).
  9. Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders. Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).
  10. Brkic, M., et al. Amyloid βoligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases. Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).
  11. Vandenbroucke, R. E., et al. Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases. Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).
  12. Marques, F., et al. The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus. BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).
  13. Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
  14. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
  15. Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans. Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).
  16. Lehtinen, M. K., et al. The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy. Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).
  17. Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier. Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).
  18. Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders. Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).
  19. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).
  20. Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).
  21. Marques, F., et al. Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation. Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).
  22. Thouvenot, E., et al. The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells. Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).
  23. Vandendriessche, C., et al. Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).
  24. Bowyer, J. F., et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).
  25. Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).
  26. Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
  27. Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
  28. Van Hoecke, L., et al. Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type. C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).
  29. Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
  30. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).
  31. JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM). JoVE Science Education Database. , https://www.jove.com/v/5656/scanning-electron-microscopy-sem (2022).
  32. Pauwels, M., et al. Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics). Biomaterials. 290, 121830 (2022).

Tags

Nevrovitenskap utgave 190 choroid plexus nevrodegenerative sykdommer scanning elektronmikroskopi (SEM) sentralnervesystemet hjernen
Mikrodisseksjon og helmontert skanning elektronmikroskopi visualisering av mus choroid plexus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van Wonterghem, E., Van Hoecke, L.,… More

Van Wonterghem, E., Van Hoecke, L., Van Imschoot, G., Verhaege, D., Burgelman, M., Vandenbroucke, R. E. Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus. J. Vis. Exp. (190), e64733, doi:10.3791/64733 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter