Summary
Denne protokollen beskriver to metoder for å måle kaspaseaktivitet gjennom et fluorogent substrat ved hjelp av flowcytometri eller et spektrofluorometer.
Abstract
Aktiveringen av cysteinproteaser, kjent som caspaser, forblir en viktig prosess i flere former for celledød. Kaspaser er kritiske initiatorer og bødler av apoptose, den mest studerte formen for programmert celledød. Apoptose oppstår under utviklingsprosesser og er en nødvendig hendelse i vevshomeostase. Pyroptose er en annen form for celledød som benytter caspases og er en kritisk prosess for å aktivere immunsystemet gjennom aktivering av inflammasomet, noe som resulterer i frigjøring av medlemmer av interleukin-1 (IL-1) familien. For å vurdere caspaseaktivitet kan målsubstrater vurderes. Imidlertid kan følsomhet være et problem når man undersøker enkeltceller eller aktivitet på lavt nivå. Vi demonstrerer hvordan et fluorogent substrat kan brukes med en populasjonsbasert analyse eller encelleanalyse ved flowcytometri. Med riktige kontroller kan forskjellige aminosyresekvenser brukes til å identifisere hvilke caspaser som er aktive. Ved hjelp av disse analysene er samtidig tap av inhibitorer av apoptoseproteiner ved tumornekrosefaktor (TNF) stimulering identifisert, noe som primært induserer apoptose i makrofager snarere enn andre former for celledød.
Introduction
Kaspaser er involvert i flere former for programmert celledød. Apoptose er den mest studerte formen for programmert celledød og er assosiert med caspaseaktivitet1. Alle caspaser har en stor og liten katalytisk underenhet. Caspase-1, caspase-4, caspase-5, caspase-9 og caspase-11 har et caspase aktiverings- og rekrutteringsdomene (CARD), og caspase-8 og caspase-10 inneholder dødseffektordomener (DED) 2,3,4,5 (tabell 1). Apoptose kan initieres av to hovedveier: den ekstrinsiske banen og den indre banen. Den ytre apoptotiske banen utløses av dødsreseptorer, som er en del av tumornekrosefaktor-superfamilien (TNFSF). Dødsreseptorer har DED-domener, noe som letter caspase-8-aktivitet6. Den indre apoptotiske banen involverer aktivering av caspase-9 etter dannelsen av apoptosomet, som krever frigjøring av cytokrom c og Apaf-17. Aktiveringen av enten initiator caspase, caspase-8 eller caspase-9, fører til spaltning og påfølgende aktivering av bøddelcaspasene, som er caspase-3, caspase-6 og caspase-7. Identifisering av at bøddelkaspasene er aktive, indikerer at cellene gjennomgår apoptose, og denne aktiveringen anses som en viktig faktor for å definere modusen for celledød.
Kaspaseaktivering er også et kritisk tidspunkt for regulering av betennelse og induksjon av alternative former for programmert celledød. For eksempel fører caspase-1-aktivering til modning av proinflammatoriske cytokiner i interleukin-1-familien8. Frigjøring og aktivering av cytokiner fra denne familien, spesielt IL-1β og IL-18, skyldes gasdermin D-spaltning og poredannelse ved plasmamembranen 9,10. Utilstrekkelig membranreparasjon av gasdermin D-porer kan resultere i en type celledød kjent som pyroptose11. Videre resulterer caspase-8-aktivitet i inhibering av en caspase-uavhengig celledød kjent som nekroptose12. Reseptorinteragerende serin/treoninproteinkinase 1 (RIPK1) er en av de kritiske faktorene ved nekroptose og for å drive betennelse regulert av NF-kB. Modeller har vist at RIPK1 spaltes av caspase-8, noe som resulterer i begrensende NF-kB-signalering, apoptose og nekroptose13,14. Derfor kan identifisering av aktiviteten til forskjellige caspaser hjelpe til med å forstå den resulterende betennelsen og celledødsmodaliteten.
Uavhengig av funksjonen til caspaser i regulering av celledødsmodaliteter, kan caspaseaktivitet også regulere andre cytokinfamilier, som interferon (IFN), som respons på infeksjon15,16. I tillegg er caspaser involvert i ikke-celledødsfunksjoner, inkludert celleskjebnebeslutninger, vevsreparasjon og regenerering, tumorigenese gjennom DNA-reparasjon og neuronal synapsefunksjon. Aktiviteten til caspaser i disse ikke-dødelige rollene antas å være begrenset av den cellulære lokaliseringen og mengden caspaser. Derfor kan kvantifisering av nivået av caspaseaktivitet godt definere om en celle gjennomgår celledød eller om caspasen spiller en rolle i en ikke-celledødsfunksjon 4,17,18.
Kaspaseaktivitet kan vurderes ved flere metoder. Western blotting for spaltet caspases og deres substrater har blitt brukt som en indikator på aktivitet, men disse analysene er i beste fall kvalitative. For å avgjøre om caspaseaktivitet er assosiert med celledød, er en kvantitativ måling ideell. Siden caspaser spalter substrater på et anerkjennelsessted bestående av fire aminosyrer, har kolorimetriske, luminescens eller fluorometriske metoder blitt utviklet. Kaspaser ser imidlertid ut til å ha plastisitet i substratgjenkjenningen 19,20. Gjenkjenningssekvensen er ikke assosiert med proteindomenene (tab 1). Tetrapeptidsekvensen DEVD kan imidlertid brukes til å detektere caspase-3- og caspase-7-aktivitet20,21.
Smac-mimetikk er forbindelser rettet mot inhibitorer av apoptoseproteiner (IAP). Bruken av Smac-mimetikk i en delmengde av kreftceller fører til at cellene blir følsomme for TNF-indusert celledød22. I primære makrofager forårsaker Smac-mimetikk celledød uten eksogen tilsetning av TNF23,24. Tapet av cIAP1 ved Smac mimetisk-indusert nedbrytning resulterer i produksjon av TNF. Hvis caspaseaktivitet oppdages, betyr dette at cellene ikke døde av nekroptose, men på en apoptotisk måte. I denne metoden brukes deteksjon av spaltet DEVD-substrat for å identifisere caspase-3/caspase-7-aktivitet. Videre eksperimenter for å bekrefte apoptotisk celledød er publisert tidligere24.
Protocol
Denne studien ble utført med godkjenning og etter retningslinjene fra dyreetiske komiteen ved Universitetet i Zürich (#ZH149/19). Hannmus C57Bl/6J i alderen 8-16 uker, avlet og plassert i spesifikke patogenfrie (SPF) forhold, ble brukt i denne studien. De intakte beina kan holdes på is i steril Hanks bufrede saltoppløsning (HBSS) med 2% varmeinaktivert føtal bovint serum (FBS). Benmarg ble samlet fra femur og tibia av mus25 på dagen for differensiering. Begge metodene for å vurdere caspaseaktivitet kan brukes for andre celletyper, inkludert både primære og transformerte.
1. Differensiering av benmargsderiverte makrofager (BMDM)
MERK: Utfør alle trinnene i en vevskultur laminær strømningshette, og bruk sterile aseptiske teknikker.
- Klargjør en 1 ml sprøyte med en 21 G kanyle.
- Tilsett 5 ml HBSS + 2% FBS til et 15 ml rør.
- Bruk steril tang, ta et utskåret lårben og sett nålen inn i lårbenets åpning. Hold lårbenet i HBSS + 2% FBS, skyll benmargen ut til beinet er hvitt. Skyll tibia på samme måte. Fortsett å skylle oppløsningen for å oppnå en encellet suspensjon.
- Sentrifuger encellesuspensjonen ved 200 x g i 4 minutter ved romtemperatur (RT).
- Fjern supernatanten ved hjelp av en vakuumaspirator. Knips på røret for å forsiktig resuspendere pelleten. Tilsett 1 ml rød celle lysisbuffer (se materialfortegnelse), og bland forsiktig med en P1000-pipette. Inkuber ved RT i 1 min.
- Tilsett 10 ml HBSS + 2% FBS, og sentrifuge ved 200 x g i 4 minutter ved RT.
- Fjern supernatanten og resuspender i 10 ml benmargsderivert makrofag (BMDM) kulturmedium.
MERK: BMDM-kulturmedium består av DMEM med lav glukose med tilsetning av 10% FBS, 20 ng / ml M-CSF, penicillin (50 U / ml) og streptomycin (50 μg / ml) (se materialtabell). Alternativt kan 20% L929 betinget medium erstattes av M-CSF. - Tilsett 15 ml BMDM-kulturmedium i to 15 cm petriskåler. Tilsett 5 ml av encelleoppløsningen til hver plate.
MERK: Ikke bruk vevskulturbehandlede plater. Vevskulturbehandlede plater begrenser differensieringen. - Sett oppvasken på 37 °C, 5% CO2, i 6 dager.
MERK: BMDM-ene kan høstes etter 5-7 dager. Lengre inkubasjonstider for differensiering fører til økt anti-apoptotisk proteinuttrykk26.
2. Høsting, såing og behandling av celler
MERK: Utfør alle trinnene i en vevskultur laminær strømningshette, og bruk sterile aseptiske teknikker. Fullt differensierte makrofager fester seg til platen, noe som muliggjør enkel separasjon, mens flytende celler kan kastes. Fosfatbufret saltvann (PBS) kan brukes med eller uten Ca 2+ og Mg2+.
- Etter 6 dager med inkubasjon, fjern de flytende cellene og mediet fra platen ved hjelp av en aspirator.
- Tilsett 5 ml PBS til hver 15 cm plate. Fjern PBS fra platen ved hjelp av en aspirator.
- Tilsett 2 ml trypsin (se Materialfortegnelse) på hver plate. Inkuber platen til forsiktig tapping av platen løsner cellene. Ta 5 ml BMDM-kulturmedium, og høst cellene av platen.
- Overfør til den andre 15 cm platen, og høst cellene av platen. Fjern cellesuspensjonen fra platen inn i et 50 ml rør. Ta ytterligere 5 ml BMDM-kulturmedium, og vask begge platene for å sikre at alle cellene er samlet opp. Plasser cellesuspensjonen i det samme 50 ml røret.
- Ta 10 μL av cellesuspensjonen, og tell ved hjelp av et hemacytometer ved hjelp av en 1: 1-fortynning med trypanblått.
MERK: Automatiske celletellere kan også brukes når de kalibreres for størrelsen på makrofagene. - Frø makrofagene med en tetthet på 1 x 106 celler/ml. BMDM sådd ved 2 x 10 6 celler/brønn i en 6-brønns plate gir ca. 2 mg/ml totalt protein. La cellene feste seg til platen i minst 6 timer før behandling.
MERK: For andre celletyper må den optimale konsentrasjonen bestemmes. - Behandle makrofagene med Smac-mimetisk (Forbindelse A, se materialtabell)22 ved 250 nM og 500 nM i 16 timer.
MERK: Inkluder en positiv kontroll for å indusere apoptose og caspase-3-spaltning for å sikre at analysen fungerer. Vanlige apoptoseindusere inkluderer staurosporin og etoposid. For at mange cellelinjer skal gjennomgå apoptose, er 0,1-10 μM for 16 timers stimulering tilstrekkelig.
3. Klargjøring av cellelysater fra behandlede celler
MERK: Dette trinnet må gjøres på is, og reagensene og materialene må være forkjølt.
- Overfør platene som inneholder de behandlede cellene til isen. Samle mediet fra cellekulturen i et 1,5 ml rør, sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C, aspirer mediet og legg røret på is. Dette tillater samling av cellene som har løsnet fra platen.
- Tilsett 1 ml kald PBS til cellekulturplaten for å vaske cellene, og aspirer all PBS. Tilsett 100 μL trypsin til cellene (hvis du arbeider med en 6-brønns tallerken). La trypsinet løfte cellene av platen, og samle dem inn i 1,5 ml røret. Bruk 1 ml kald PBS for å sikre at alle cellene er samlet.
MERK: Hvis du arbeider med suspensjonsceller, overfør forsiktig mediet og cellene til et 1,5 ml rør. - Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og resuspender i 100 μL DISC lysebuffer (150 mM natriumklorid, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glyserol, 20 mM Tris, pH 7,5, se Materialfortegnelse).
- Inkuber prøvene på is i 20 min.
- Sentrifuger lysatene ved ~12 000 x g i 10 minutter ved 4 °C for å pelletere den uløselige fraksjonen.
- Overfør 25 μL lysat til en hvit, flatbunnet 96-brønnsplate for caspase-3/caspase-7 aktivitetsanalysen (trinn 5).
MERK: Ikke forstyrr pelleten. Dette er den uoppløselige fraksjonen av cellelysatet. - Overfør 10 μL av det gjenværende lysatet til en gjennomsiktig flatbunnet 96-brønnsplate for bicinchoninsyreanalysen (BCA) (trinn 4). Dette vil bli brukt til normalisering av prøvene.
- Hold begge platene på is for videre behandling.
MERK: På dette stadiet kan platene forsegles med et klebende deksel og oppbevares ved -20 °C i ca. 4 uker.
4. Proteinkvantifisering ved hjelp av BCA-analysen
MERK: Andre reagenser eller analyser kan brukes til å kvantifisere mengden protein i hver prøve. I den populasjonsbaserte analysen kan prøvene sammenlignes ved å normalisere mengden protein som brukes i analysen.
- Forbered standard proteinkonsentrasjoner mellom 0 μg / ml og 2,000 μg / ml (0 μg / ml, 25 μg / ml, 125 μg / ml, 250 μg / ml, 500 μg / ml, 750 μg / ml, 100 μg / ml, 1,500 μg / ml, 2,000 μg / ml) med bovint serumalbumin (BSA). Forbered emner kun med lysisbuffer.
- Legg til 10 μL av hver standard i den flatbunnede 96-brønnplaten som inneholder prøvene, nevnt i trinn 3.7.
- Bland BCA-reagens 1 med BCA-reagens 2 i forholdet 50:1 (se materialfortegnelse). Tilsett 200 μL blandet BCA-reagens til hver prøve og standard.
- Inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
- Mål absorbansen ved 562 nm på et fluorometrisk instrument, og kvantifiser proteinkonsentrasjonen med standardkurven.
5. Populasjonsbasert analyse for caspase-3/caspase-7 aktivitet
MERK: Ikke la cellelysatene i platen sitte på is i mer enn 3 timer. Hvis kaspaseaktivitet er til stede, øker denne over tid til tross for at prøven er på is. Hvis prøvene ble frosset, tine dem på is, og fortsett umiddelbart når lysatene har tint.
- Start det fluorometriske instrumentet (se Materialfortegnelse) og varm opp maskinen til 37 °C. Forbered manuset som nevnt:
- Utfør individuelle avlesninger hvert minutt i 40 minutter for å bestemme kinetikken til reaksjonen.
- Sett eksitasjonen til 360 nm og utslippet til 465 nm. Ti blink per brønn er tilstrekkelig.
- Forbered den positive kontrollen av rekombinant caspase-3 (se materialfortegnelse). Bland 1 U av det rekombinante caspase-3-enzymet i 50 μL lysisbuffer (rør 1). Tilsett 25 μL lysisbuffer til ytterligere tre rør. Overfør 25 μL fra rør 1 til rør 2. Bland ved pipettering.
- Gjenta for tube 3 og tube 4. Rør 5 inneholder bare 50 μL lysisbuffer. Legg til 25 μL av hver standard i den hvite flatbunnede 96-brønnsplaten for caspase-3-aktivitetsanalysen, nevnt i trinn 3.6.
- Forbered en masterreaksjonsblanding for caspase-aktivitetsanalyse på is. For en reaksjon, bland 50 μL av 2x caspase spaltningsbuffer (0,2M HEPES pH 7,5; 20% sukrose eller PEG; 0,2% CHAPS), 5 μL av 1 mM DEVD-AMC (caspase-3 tetrapeptidsubstrat), 2 μL 500 mM DTT og 18 μL avionisert vann (se materialfortegnelse).
- Tilsett 75 μL av reaksjonsblandingen til hver prøve og standard for å oppnå et totalt reaksjonsvolum på 100 μL.
- Mål fluorescensen umiddelbart ved hjelp av det fluorometriske instrumentet som ble satt opp i trinn 5.1.
- For hver fluorescerende måling, trekk fluorescensavlesningen for emnet (kun lysisbuffer) fra prøvens fluorescens. Normaliser avlesningen ved å dele på proteinkonsentrasjonen i prøven (beregnet i trinn 4.5)27:
- Beregn frekvensen av caspaseaktivitet ved å bestemme hellingen til den normaliserte fluorescensen på y-aksen og tiden på x-aksen.
6. Encelleanalyse (flowcytometrianalyse) for caspase-3/caspase-7 aktivitet
- Frø cellene som beskrevet i avsnitt 2.
- Høst cellene inn i et 5 ml polystyrenrør. Hvis du arbeider med adherente celler, samle mediet inn i 5 ml røret. Tilsett 1 ml kald PBS til cellekulturplaten, og samle PBS inn i 5 ml røret. Legg trypsin til cellene (100 μL hvis du arbeider med 6-brønnsretter). La trypsinet løfte cellene av platen, og samle inn i 5 ml røret. Bruk 1 ml kald PBS for å sikre at alle cellene er samlet.
MERK: Hvis du arbeider med suspensjonsceller, overfør forsiktig mediet og cellene til et 5 ml rør. - Sentrifuger prøvene ved 300 x g i 5 minutter, 4 °C. Fjern supernatanten ved hjelp av en vakuumaspirator.
- Forbered fargeblandingen. Den optimale fargekonsentrasjonen er 1 x 10 6-2 x 106 celler i 50 μL. Fortynn det fluorogene substratet i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialfortegnelse, flowcytometri). Ta 1 μL av stamsubstratet, og fortynn i 150 μL PBS. Tilsett 50 uL per prøve.
- Inkuber prøvene ved 37 °C i 30 minutter beskyttet mot lys, med blanding hvert 15. minutt.
- Med flowcytometeret som brukes i denne studien, bruk den røde laseren ved 640 nm, og oppdag ved bruk av 675/25 nm. Kjør den ufargede kontrollprøven først, og hent minst 10 000 hendelser av ønsket populasjon. Ekskluder rusk ved hjelp av en port (P1) på et FSC-A- og SSC-A-punktplott.
- Bruk et histogram som viser hendelsene i P1-porten og deteksjon for caspase-substratet (y-aksen) for å bestemme median fluorescensintensitet (MFI).
MERK: Caspase-substratet beskrevet i denne metoden krever en eksitasjon ved 590 nm og avgir ved 628 nm.
- Bruk et histogram som viser hendelsene i P1-porten og deteksjon for caspase-substratet (y-aksen) for å bestemme median fluorescensintensitet (MFI).
Representative Results
Primære musemakrofager ble differensiert i 6 dager. Etter 6 dager ble cellene høstet, talt og sådd. Følgende behandlinger ble benyttet: ingen behandling og Smac-mimetikum (forbindelse A)22 ved 250 nM og 500 nM i 16 timer (figur 1). Forsøket ble utført i to eksemplarer slik at caspase-3/caspase-7-aktivering kunne vurderes enten ved populasjonsbasert analyse eller encelleanalyse ved hjelp av flowcytometri.
Proteinkonsentrasjonen i cellelysatene ble kvantifisert ved hjelp av BCA-analysen (tilleggstabell 1). Dette er nødvendig for å sikre at mengden protein som brukes i caspase-3/caspase-7 aktivitetsanalysen er den samme mellom prøvene. I denne populasjonsbaserte analysen kan dataene presenteres på to måter. Den første er å vise kinetikken ved å plotte den justerte fluorescensen (y-aksen) versus tiden (x-aksen) (figur 2A). Alternativt kan helningen beregnes for å sammenligne prøvene direkte (figur 2B). Økningen i helning ved 500 nM Smac mimetisk behandling var ikke signifikant basert på en vanlig enveis ANOVA med multiple sammenlikninger (Dunnetts multiple sammenligningstest28).
For analyse av caspase-3/caspase-7-aktivitet ved bruk av flowcytometri ble cellene og supernatanten høstet. Ufargede celler eller fluorescens minus en ble brukt som en negativ kontroll, så vel som de ubehandlede cellene. Histogram av cellene samlet inn ved flowcytometri viste en forskyvning i fluorescens for cellene behandlet med Smac-mimetikk sammenlignet med de ubehandlede cellene (figur 2C). Dataene kan vises enten som median fluorescensintensitet (figur 2D) eller som foldeendring over de ubehandlede cellene (figur 2E).
Figur 1: Flytdiagram over studien . (A) Lårben og tibias ble skåret ut fra C57Bl/6 mus. Knoklene ble spylt og differensiert i 20 ng/ml m-csf i 6 dager. (B) På dag 6 ble makrofager høstet og sådd på nytt for behandling. Ett sett celler ble høstet for lysater og vurdert ved fluorogen aktivitet, mens det andre settet ble høstet, inkubert med det fluorogene substratet og vurdert ved flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kinetisk analyse for caspase-3/caspase-7-aktivitet og substratspaltning ved flowcytometri. (A,B) Representative data for kinetisk analyse for caspase-3/caspase-7 aktivitet (C-E) og substratspaltning ved flowcytometri. Makrofagene ble behandlet med to konsentrasjoner av Smac-mimetisk (Compound A; 250 nM og 500 nM) i 16 timer. (A) Påvisning av det spaltede DEVD AFC-substratet over tid. Dataene ble normalisert til proteinkonsentrasjonen i prøven. (B) Graden av spaltning (helning) av DEVD AFC for hver prøve ble normalisert til den ubehandlede skråningen og presentert som foldeendringen over de ubehandlede cellene. (C) Flow cytometriske histogrammer av cellene inkubert med caspase-3-substratet. (D,E) MFI sammenligning og fold endring i MFI sammenlignet med den ubehandlede prøven. Hvert datapunkt representerer et uavhengig utvalg; gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittet vises; *p < 0,05 ved hjelp av en enveis ANOVA og flere sammenligningstester (Dunnetts multiple comparison test). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Kaspase | Art | Substrat sekvens | Protein domener | ||
| Caspase-1 | Hs, Mm | (W/L) EHD | CARD, stort domene, lite katalytisk domene | ||
| Caspase-2 | Hs, Mm | DEXD | CARD, stort domene, lite katalytisk domene | ||
| Caspase-4 | Hs | (W/L) EHD | CARD, stort domene, lite katalytisk domene | ||
| Caspase-5 | Hs | (W/L) EHD | CARD, stort domene, lite katalytisk domene | ||
| Caspase-9 | Hs, Mm | (I/V/L) E(H/T)D | CARD, stort domene, lite katalytisk domene | ||
| Caspase-11 | Mm | (W/L) EHD | CARD, stort domene, lite katalytisk domene | ||
| Caspase-12 | Mm | ATAD | CARD, stort domene, lite katalytisk domene | ||
| Caspase-8 | Hs, Mm | (I/V/L) E(H/T)D | DED, stort domene, lite katalytisk domene | ||
| Caspase-10 | Hs | (I/V/L) E(H/T)D | DED, stort domene, lite katalytisk domene | ||
| Caspase-3 | Hs, Mm | DEXD | stort domene, lite katalytisk domene | ||
| Caspase-6 | Hs, Mm | (I/V/L) E(H/T)D | stort domene, lite katalytisk domene | ||
| Caspase-7 | Hs, Mm | DEXD | stort domene, lite katalytisk domene | ||
| Caspase-14 | HS, MM | (W/L) EHD | stort domene, lite katalytisk domene | ||
| KORT | CASPASE Aktivering og rekruttering Domene | ||||
| DED | Death Effector domene | ||||
| Hs | Homo sapien | ||||
| Mm | mus muskulus | ||||
Tabell 1: Substratspesifisitet og proteindomenene til caspasene. Tabellen er tilpasset fra McStay et al.20; Shalini et al.3; og van Opdenbosch og Lamkanfi4.
Tilleggstabell 1: DEVD kinetisk analyse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
I denne metoden brukes et fluorogent substrat i en populasjonsbasert analyse eller enkeltcelleanalyse for å måle caspase-3 / caspase-7-aktivitet. Begge metodene måler caspaseaktiviteten på en kvantitativ måte basert på spaltningen av et substrat. En fordel er muligheten til å bruke disse metodene for mange prøver. Med disse metodene påvises caspase-3/caspase-7-aktivitet i primære makrofager behandlet med Smac-mimetika.
Et kritisk aspekt ved den populasjonsbaserte fluorometriske analysen er tiden fra lysis til avlesning av fluorescensen. Prøvene må holdes på is gjennom hele prosedyren, spesielt før "lesing" av analysen. Dette forhindrer for tidlig spaltning og fluorescens av substratet. Ved bruk av populasjonsbasert analyse kan det være nødvendig med mindre optimalisering. Mengden protein som brukes i analysen er normalisert, slik at prøvene kan sammenlignes direkte. En advarsel er at på et sent stadium av apoptotisk celledød reduseres den totale proteinmengden; Derfor kan det hende at påvisning av caspaseaktivitet ikke er mulig. Ulike kinetikk eller forskjellige behandlingsdoser anbefales for å omgå dette problemet. I tillegg kan annen programvare brukes til å nøyaktig vurdere frekvensen av caspase aktivitet i tillegg til programvaren beskrevet i denne metoden.
For den flowcytometriske analysen kreves det nok hendelser eller celler til å sikre populasjonene trygt. I tillegg kan det være nødvendig med mer optimalisering i den flytbaserte analysen for å oppnå det optimale forholdet mellom substrat og cellenummer. Men med flowcytometri egner denne metoden seg til å måle flere parametere, for eksempel celleoverflatemarkører for celletypeidentifikasjon.
Både populasjons- og encellemetodene kunne brukes til andre caspaser. Det er imidlertid viktig å huske at gjenkjenningssekvensen er mindre diskriminert for andre caspaser. Som sådan må andre metoder for caspaseaktivitet brukes. Dette inkluderer inhibering av caspaseaktivitet, CRISPR eller nedslag av spesifikke caspaser og vestlig blotting for å oppdage spaltning av kjente substrater.
En alternativ metode for å oppdage caspaseaktivitet er time-lapse-avbildning. Det samme permeable caspase-substratet kan brukes sammen med andre markører for levedyktighet, for eksempel vedlegg V, for å gi informasjon om kinetikken til celledød. Avbildning vil også skille caspaseaktiviteten og celleoverlevelsen, noe som muliggjør påvisning av subletale mengder kaspaseaktivitet i en cellepopulasjon. De ikke-dødelige funksjonene til caspase-3/caspase-7 er knyttet til antiviral regulering i medfødte immunceller29, spesielt aktivering av type I IFN via mitokondriell DNA-frigjøring15,16. Dermed er disse analysene for å måle caspaseaktivitet kritiske for å identifisere forskjellige moduser for celledød og kan være nyttige for å vurdere ikke-celledødsfunksjoner.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
W.W.W. støttes av Clöetta Medical Research Fellow grant, S.R. støttes av CanDoc UZH Forschungskredit, og J.T. støttes av Chinese Scholarship Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| 15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
| 37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
| 6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
| 96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
| 96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
| Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
| BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
| b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
| caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
| CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
| DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
| EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
| Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
| FBS | Thermoscientific | 26140 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
| Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
| M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
| M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | |
| PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
| protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
| Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
| sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
| sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
| Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
| sucrose | Sigma | 1.07687 | |
| Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |
References
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
- Nicholson, D. W., Thornberry, N. A.
- Shalini, S., Dorstyn, L., Dawar, S., Kumar, S. Old, new and emerging functions of caspases. Cell Death and Differentiation. 22 (4), 526-539 (2014).
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. -D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Review of Immunology. 38, 567-595 (2020).
- Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Jiang, X., Wang, X. Cytochrome c promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1. Journal of Biological Chemistry. 275 (40), 31199-31203 (2000).
- Christgen, S., Place, D. E., Kanneganti, T. -D. Toward targeting inflammasomes: Insights into their regulation and activation. Cell Research. 30 (4), 315-327 (2020).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
- Rühl, S., et al. ESCRT-dependent membrane repair negatively regulates pyroptosis downstream of GSDMD activation. Science. 362 (6417), 956-960 (2018).
- Declercq, W., Takahashi, N., Vandenabeele, P. Dual face apoptotic machinery: From initiator of apoptosis to guardian of necroptosis. Immunity. 35 (4), 493-495 (2011).
- Newton, K., et al. Cleavage of RIPK1 by caspase-8 is crucial for limiting apoptosis and necroptosis. Nature. 574, 428-431 (2019).
- Fritsch, M., et al. Caspase-8 is the molecular switch for apoptosis, necroptosis and pyroptosis. Nature. 575, 683-687 (2019).
- White, M. J., et al. Apoptotic caspases suppress mtDNA-induced STING-mediated type I IFN production. Cell. 159 (7), 1549-1562 (2014).
- Rongvaux, A., et al. Apoptotic caspases prevent the induction of type I interferons by mitochondrial DNA. Cell. 159 (7), 1563-1577 (2014).
- Nakajima, Y. -I., Kuranaga, E.
- Kumar, S., Dorstyn, L., Lim, Y. The role of caspases as executioners of apoptosis. Biochemical Society Transactions. 50 (1), 33-45 (2022).
- Agniswamy, J., Fang, B., Weber, I. T. Plasticity of S2-S4 specificity pockets of executioner caspase-7 revealed by structural and kinetic analysis. FEBS Journal. 274 (18), 4752-4765 (2007).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death and Differentiation. 15 (2), 322-331 (2008).
- Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 272 (29), 17907-17911 (1997).
- Vince, J. E., et al. IAP antagonists target cIAP1 to induce TNFalpha-dependent apoptosis. Cell. 131 (4), 682-693 (2007).
- McComb, S., et al. cIAP1 and cIAP2 limit macrophage necroptosis by inhibiting Rip1 and Rip3 activation. Cell Death and Differentiation. 19 (11), 1791-1801 (2012).
- Wong, W. W. -L., et al. cIAPs and XIAP regulate myelopoiesis through cytokine production in an RIPK1- and RIPK3-dependent manner. Blood. 123 (16), 2562-2572 (2014).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-Protocol. 5 (20), e1631 (2015).
- Lin, H., Chen, C., Chen, B. D. Resistance of bone marrow-derived macrophages to apoptosis is associated with the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein in primary cultures of bone marrow cells. Biochemical Journal. 353 (Pt 2), 299-306 (2001).
- Mackridge, A., Rowe, P. One-way analysis of variance (ANOVA) - Including Dunnett's and Tukey's follow up tests. Practical Approach to Using Statistics in Health Research: From Planning to Reporting. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 93-103 (2018).
- Chen, H., Ning, X., Jiang, Z. Caspases control antiviral innate immunity. Cellular and Molecular Immunology. 14 (9), 736-747 (2017).
