Summary
В настоящем протоколе описаны все основные этапы успешной трансплантации матки (UTx) у крыс. Модель крысы оказалась подходящей для содействия клиническому внедрению UTx; однако UTx крыс - очень сложная процедура, требующая тщательных инструкций.
Abstract
Трансплантация матки (UTx) - это новый подход к лечению женщин с абсолютным маточным фактором бесплодия (AUFI). По оценкам, 3-5% женщин страдают от AUFI. Эти женщины были лишены возможности иметь детей до появления UTx. Клиническое применение UTx было обусловлено экспериментальными исследованиями на животных, и первый успешный UTx был достигнут на крысах. Учитывая их физиологические, иммунологические, генетические и репродуктивные характеристики, крысы являются подходящей модельной системой для таких трансплантатов. В частности, их короткий срок беременности является явным преимуществом, так как обычной конечной точкой экспериментального UTx является успешная беременность с живорождением. Самой большой проблемой для моделей крыс остается маленькая анатомия, которая требует передовых микрохирургических навыков и опыта. Несмотря на то, что UTx привела к беременности в клинике, процедура не установлена и требует постоянной экспериментальной оптимизации. Здесь представлен подробный протокол, включающий основные способы устранения неполадок при UTx крыс, что, как ожидается, облегчит понимание всей процедуры для тех, кто не имеет опыта в этом типе микрохирургии.
Introduction
Трансплантация матки (UTx) является новым методом лечения абсолютного бесплодия по маточному фактору (AUFI). AUFI возникает в результате отсутствия (врожденного или приобретенного) или порока развития матки и поражает 3-5% женщин во всем мире1. Этические, юридические или религиозные причины исключают усыновление или суррогатное материнство для многих женщин, которые хотят материнства, но страдают от AUFI2. Для этих женщин UTx остается единственным вариантом создать собственную семью. UTx применялся в клинике, хотя и с переменным успехом; Процедура технически сложна и требует постоянного совершенствования для ее клинического становления.
В 2014 году первая трансплантация матки от живого донора (LD), приведшая к успешной беременности, была выполнена новаторской шведской группой Brännström3. Первые роды после UTx от умершего донора (DD) были зарегистрированы в 2016 году в Бразилии4. К 2021 году во всем мире было выполнено более 80 UTx, однако с вероятностью успеха около 50% и с трансплантатами, поступающими из LD для большинства1.
Несмотря на то, что UTx не спасает жизнь, он становится все более популярной процедурой для удовлетворения желаний собственного потомства. Таким образом, спрос на трансплантаты растет, что ставит донорство DD в центр внимания в будущем. Однако донорство DD осложняется значительно более длительным холодным (а в случае сердечной смерти также теплым) ишемическим воздействием, повышающим риск дисфункции трансплантата и отторжения 5,6. Хирургическая техника, требующая соответствия совместимости и связанная с ней иммуносупрессия остаются критическими проблемами в отношении исходов UTx7.
Для управления вышеуказанными рисками в клинике необходимы соответствующие модели на животных для исследования ишемии и иммуносупрессии. Наиболее клинически значимой конечной точкой для животных моделей остаются успешные роды; на сегодняшний день беременность после экспериментального UTx была достигнута у мышей, крыс, овец, кроликов и обезьянCynomolgus 8. В то время как более крупные животные предназначены для приобретения и оптимизации хирургических методов, грызуны имеют явное преимущество в виде коротких периодов беременности. Таким образом, модели грызунов превосходят их по практическим, финансовым и этическим соображениям9. Тем не менее, основной проблемой UTx у мышей является маленькая анатомия, при этом очень сложная операция связана с низкой воспроизводимостью мышиного UTx10. Напротив, крысы хирургически более доступны и сохраняют преимущества коротких сроков беременности. Таким образом, крыса стала моделью выбора для UTx9. Wranning et al. представили крысиную модель ортотопического UTx в 2008 году, и с использованием этой модели сообщалось о первых живорождениях после UTx и естественного спаривания11,12,13. Последующие исследования внесли решающий вклад в реализацию UTx у людей9.
Тем не менее, UTx остается сложной задачей у крыс, и только несколько групп до сих пор освоили эту хирургическую технику. Одним из существенных препятствий для распространения UTx крыс среди исследователей является отсутствие точного описания отдельных микрохирургических этапов, подводных камней и соответствующих мер по устранению неполадок14. Этот протокол направлен на то, чтобы предоставить подробное руководство по этой очень сложной микрохирургической процедуре, чтобы облегчить внедрение этой модели животных в будущие исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Федеральными правилами Швейцарии по животным и одобрены Ветеринарным управлением Цюриха (No 225/2019), обеспечивая заботу о человеке. Самки девственных крыс Льюиса (масса тела 170-200 г) и самки девственных коричневых норвежских крыс (170-200 г) использовались в качестве доноров/реципиентов матки, в то время как самцы крыс Льюиса (300-320 г) использовались для спаривания. Крысы были в возрасте от 12 до 15 месяцев. Животные были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов) и содержались в контролируемых условиях и обогащенной среде со свободным доступом к воде и стандартному корму.
1. Извлечение матки
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре, пожалуйста, ознакомьтесь с ранее опубликованными отчетами12,13,15.
- Индуцируют анестезию изофлураном и кислородом в закрытом контейнере из оргстекла (14 см x 25 см x 13 см) в течение 1-2 мин (5 об.% изофлурана в O2).
- Вводят бупренорфин подкожно (0,05 мг/кг) и бупивакаин (0,5%, 8 мг/кг) подкожно в область планируемого разреза брюшной полости за 30 мин до операции.
- Сбрейте всю кожу живота крысы электробритвой.
- Используйте ленты, чтобы держать животное на нагревательной пластине во время операции. Нанесите глазную мазь на оба глаза.
- Поддерживайте анестезию во время процедуры 2-4% изофлурана в кислороде путем непрерывного введения через небольшой носовой конус.
- Контролируйте глубину анестезии по клиническим параметрам без специальных инструментов (частота дыхания ~ 70-120 / мин - допустимо медленное снижение скорости на 50% во время анестезии; проверка глубины анестезии с помощью защемления пальцев ног; цвет слизистых оболочек должен быть розовым, а не синим или серым)16, и соответствующим образом отрегулируйте концентрацию изофлурана.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно: частый мониторинг дыхания во время операции возможен с помощью ассистента. - Подтвердите глубину анестезии, выполнив защемление пальца ноги.
- Очистите кожу живота круговыми движениями тремя чередующимися тампонами антисептического раствора и 70% спирта. Дайте высохнуть.
- Над животным наложите стерильную драпировку (см. Таблицу материалов) с брюшным окном.
- Выполните срединную лапаротомию.
- Вскрывают брюшную полость через разрез длиной 6-8 см, начиная с 0,5 см ниже мечегрудины по направлению к гипогастрию. Используйте скальпель No 10 для разреза кожи и маленькие острые ножницы для разреза белой линии. Не повреждайте печень или мочевой пузырь.
- Переместите кишечник за пределы брюшной полости с помощью ватных тампонов, аккуратно накройте их марлей, смоченной стерильным физиологическим раствором, и защитите стерильным полиэтиленовым пакетом для лучшей изоляции.
- Вставьте ретракторы или зажимы (см. Таблицу материалов) в левую и правую папки брюшной стенки, чтобы держать брюшную мышцу в стороне, а брюшную полость открытой, чтобы обеспечить оптимальный доступ и видимость матки и связанных с ней сосудов. Закрепите зажимы/втягивающие устройства лентами.
- Нанесите предварительно подогретый физиологический раствор, чтобы сохранить операционную область и кишечник влажными и избежать высыхания внутренних органов.
- Заготавливают правый рог матки с общей маточной полостью и шейкой матки плюс сосудистые ножки, включая правые маточные, внутренние и общие подвздошные сосуды.
- Лигат (полиглактин 4/0; см. Таблицу материалов), прижигают и отделяют левый рог матки, прилегающий к разветвлению, от общей полости матки.
- Удалите лишний жир, окружающий матку и влагалище.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите жир вокруг сосудистой системы матки. - Рассекают мочевой пузырь в месте его прикрепления к шейке матки с прижиганием всех дренирующих и питающих сосудов мочевого пузыря. Во время прижигания поддерживайте достаточное расстояние между шейкой матки и влагалищем, чтобы избежать ненужного прижигания этих двух структур. В противном случае повышается риск некроза трансплантата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство хирургических манипуляций должны воздействовать на мочевой пузырь. Втяните или потяните мочевой пузырь каудально с помощью сосудистого зажима (см. Таблицу материалов), чтобы получить лучший обзор excavatio vesicouterina. - Прижигают и разрывают нисходящие маточные сосуды на уровне мочеточника как можно дальше шейки матки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте микроциркуляцию вокруг влагалища и шейки матки как можно больше во время деления. - Отделите шейную/вагинальную часть будущего трансплантата от крепления прямой кишки и паравагинальной и парацервикальной связок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прижигания влагалища трансплантата. - Осторожно рассеките влагалище с помощью диатермии на расстоянии около 2-3 мм от шейки матки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ворсинки (шейка матки) не видны внутри просвета влагалища. - Найдите как маточную артерию, так и вену в их истоках. Лигат (полиамид 8/0; см. Таблицу материалов) прижигает и разрывает ягодичные сосуды и все сосуды каудально маточных сосудов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно возможна прямая перевязка общей подвздошной вены каудально с полой матки. - Путем тупого рассечения освобождают общие подвздошные сосуды друг от друга, от раздвоения аорты и полой вены вплоть до деления маточных сосудов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно получить лучший хирургический доступ к области, удалив один или два соседних лимфатических узла. - Иссекают правый рог матки на 3 мм от маточной трубы, предварительно прижигая маточно-яичниковую ножку на том же уровне. Это позволяет анастомозировать рог матки трансплантата в верхнюю часть рога матки реципиента.
- Установите лигатуры (полиамид 8/0) непосредственно вокруг правой общей подвздошной артерии и вены, проксимальнее бифуркации аорты и полой кишки. Сделать небольшой разрез (0,5-1 мм) в правой общей подвздошной артерии, прилегающей к бифуркации, и ввести в просвет согнутую, затупленную иглу 30 G или прямую затупленную иглу 25 G (для промывания). Закрепите его лигатурой (полиамид 6/0).
ПРИМЕЧАНИЕ: Еще одним вариантом является дополнительное крепление бульдожьим зажимом, чтобы избежать смещения иглы и/или сосуда. - Рассеките общую подвздошную вену каудально лигатуры в правой общей подвздошной вене, чтобы обеспечить отток во время промывки.
- Промойте трансплантат, выполнив следующие действия.
- Промывание матки вручную с помощью шприцев объемом 3 мл с примерно 9 мл холодного раствора Рингера (RHX: Ringer с добавлением 50 МЕ / мл гепарина и 0,4 мг / мл ксилазина) при скорости потока 6 мл / мин. Снова промойте 6 мл раствора для сохранения органов с добавлением гепарина (50 МЕ / мл) и ксилазина (0,4 мг / мл) (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте высокого давления промывки и обеспечьте правильное размещение иглы. - Удаляют трансплантат, когда ткани матки побледнеют. Разрезают общую подвздошную артерию каудально лигатуры при бифуркации брюшной аорты.
- Промывание матки вручную с помощью шприцев объемом 3 мл с примерно 9 мл холодного раствора Рингера (RHX: Ringer с добавлением 50 МЕ / мл гепарина и 0,4 мг / мл ксилазина) при скорости потока 6 мл / мин. Снова промойте 6 мл раствора для сохранения органов с добавлением гепарина (50 МЕ / мл) и ксилазина (0,4 мг / мл) (см. Таблицу материалов).
- Поместите трансплантат в охлажденный раствор для сохранения органов (4 °C) для подготовки и хранения на заднем столе перед трансплантацией.
- После удаления трансплантата усыпьте животное, сначала увеличив настройку изофлурана до максимума, а затем индуцируя двусторонний пневмоторакс с последующим обескровливанием17.
2. Сингенная трансплантация матки
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре, пожалуйста, ознакомьтесь с ранее опубликованными отчетами12,13,15.
- Индуцируйте анестезию и подготовьте животное, как указано в шаге 1.1.
- За 30 мин до операции вводят эффективную анальгезию (как описано на этапе 1.1.1) и высокомолекулярный гепарин 200 МЕ/кг.
- Выполните срединную лапаротомию.
- Вскрывают брюшную полость через разрез по средней линии длиной 6-8 см, начиная с 0,5 см ниже мечегрудицы по направлению к гипогастрию. Используйте скальпель No 10 для разреза кожи и маленькие острые ножницы для разреза белой линии. Не повреждайте печень и мочевой пузырь.
- Переместите тонкие кишки за пределы брюшной полости с помощью ватных тампонов, оберните их стерильной влажной марлей и накройте стерильным полиэтиленовым пакетом для лучшей изоляции.
- Вставьте ретракторы или зажимы в левую и правую папки брюшной стенки, чтобы держать перитонеальную мышцу в стороне, а брюшную полость открытой, чтобы обеспечить оптимальный доступ и видимость матки и связанных с ней сосудов. Закрепите зажимы/втягивающие устройства лентами.
- Нанесите предварительно подогретый физиологический раствор, чтобы сохранить операционную область и кишечник влажными и избежать высыхания внутренних органов.
- Выполняют гистерэктомию с рассечением и мобилизацией верхней трети влагалища из прямой кишки и мочевого пузыря.
- Прижигайте микроциркуляторное русло вокруг матки, шейки матки и влагалища. Разрежьте и отделите матку от окружающих структур близко к органу, чтобы защитить зловещую микроциркуляцию матки.
- Удалите жировую ткань из окружающей среды.
- Ампутируют левый рог путем прижигания. С правой стороны сохраняют 7-8 мм сегмент верхней части матки для последующего анастомоза к маточному трансплантату.
- Провести пересадку матки.
- Мобилизуйте и разделите правые общие подвздошные сосуды, от начала маточных сосудов до бифуркации аорты / половой кишки.
- Расположите трансплантат в брюшной полости. Заверните трансплантат в марлю, смоченную в холодном органосохраняющем растворе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантат должен храниться в холоде во время анастомоза. - Установите атравматичные сосудистые зажимы на правую общую подвздошную вену с каждой стороны, обрамляя будущее место анастомоза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Понизьте анестезию до 1-1,5 об.% изофлурана, чтобы адаптироваться к внезапному снижению предварительной нагрузки на сердце и возникающей в результате гипотензии. - Разрезают щель размером чуть больше, чем отверстие трансплантатной вены в общую подвздошную вену.
- Расположите вену трансплантата.
- Наложите по одному шву (полиамид 10/0; см. Таблицу материалов) в каждый угол щели на правой общей подвздошной вене.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите шовный узел в каудальном углу свободным для лучшей регулировки и предотвращения эффекта кисетной шнурки. - Регулярно промывайте область анастомоза охлажденным RHX во время процедуры, чтобы предотвратить тромбозы.
- Анастомозируйте одну сторону вены трансплантата к вене реципиента с помощью шести-восьми петель непрерывного шва (рис. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с черепного шва (полиамид 10/0) и сначала анастомозируйте входящую часть сосудов. - Таким же образом анастомозируйте другую сторону сосуда, на этот раз начиная с внешней стороны.
- Завяжите узел на краниальном шве, а затем один на каудальном шве (полиамид 10/0) после завершения анастомозов с обеих сторон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Затягивайте непрерывные швы ровно настолько, насколько это необходимо, чтобы предотвратить эффект кисетной шнурки. - Установите атравматичные сосудистые зажимы на правую общую подвздошную артерию с каждой стороны, обрамляя место будущего анастомоза.
- Выполнить артериальный анастомоз (правая общая подвздошная артерия [RCIA] через 8-10 петель с использованием прерывистых швов (полиамид 10/0).
ПРИМЕЧАНИЕ: Прерывистые швы легче контролировать, чем непрерывные (опционально с техникой «рыбий рот»)18. Постоянное промывание области анастомоза охлажденным RHX во время процедуры способствует предотвращению тромбозов. При использовании сплошных швов выполняют этот этап аналогично венозному анастомозу.
- Выполните реперфузию трансплантата.
- Когда оба участка анастомоза окажутся открытыми и кровотечение остановится, отпустите сосудистые зажимы на сосудах трансплантата (рис. 2).
- Осмотрите трансплантат на наличие признаков реперфузии, таких как покраснение, заполнение вены или пульсация в артерии трансплантата.
- Соедините вагинальную манжету трансплантата со сводом влагалища реципиента с помощью шести-семи внутрипросветных (6/0 полиглактина) прерванных швов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с одного шва в положении «12 часов», а затем наложите следующие швы в положениях «10 часов» и «1 час». Два шва в положениях «9 часов» и «3 часа» должны быть завязаны после швов в первом ряду19,20. - Анастомозируйте рог матки трансплантата встык к оставшемуся черепному сегменту матки-реципиента с помощью пяти-семи прерывистых швов (полиамид 7/0).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прошивайте просвет.
- Закройте живот сплошным швом. Используйте полиглактин 4/0 для наложения швов на мышечный слой и полиамидные или хирургические зажимы для раны 6/0 для кожи.
- Дайте животному восстановиться в прогретой клетке после завершения пересадки. Оставайтесь с животным до тех пор, пока оно не восстановит способность лежа на грудине, и поддерживайте одиночное жилье до его полного выздоровления. Обеспечьте лечение псоопертаивной анальгезией путем подкожного введения бупренорфина (0,05 мг / кг) и подходящего НПВП, но не ранее чем через 4-8 часов после первой дозы анестезии. Обеспечьте непрерывный прием бупренорфина через питьевую воду (1 мг / кг, перорально, 5 мл бупренорфина в 160 мл питьевой воды (0,3 мг / мл)) в течение трех дней после операции.
- Кожный шов снимают через 10-14 дней после операции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представлены результаты двух групп крыс. UTx проводился до (группа 1, n = 8) и после (группа 2, n = 8) корректировки протокола (таблица 1), чтобы продемонстрировать эффекты наших модификаций (см. Обсуждение для объяснения наших модификаций)12,15,21.
Исход UTx у крыс связан с тремя ключевыми фазами. Первая фаза – успешное восстановление после UTx. Обычно реципиенты должны восстановиться в течение первых 2 послеоперационных дней. Вторая фаза связана с состоянием здоровья трансплантата через 2 недели после операции, что решает вопрос о включении в процесс спаривания (таблица 2). Третья фаза включает в себя спонтанное спаривание с последующими успешными родами в качестве доказательства фертильности.
Все животные из обеих групп без осложнений восстановились после операции. Во время второго этапа четыре животных были исключены из группы 1 и два из группы 2. Исключение было обусловлено тромбозом и абсцессом трансплантата (n = 4 для 1-й группы, n = 2 для 2-й группы) и суженным/деформированным маточно-маточным анастомозом (дополнительно для n = 1, 1-й группы) при обследовании при релапаротомии (табл. 2). Релапаротомия (вдоль рубца исходной лапаротомии) была выполнена всем самкам через 2 недели после трансплантации, так как внешний вид животных не имел большого значения как показатель здоровья трансплантата. В целом, 2-недельная выживаемость трансплантата составила 50% и 75% для групп 1 и 2 соответственно (табл. 3).
Во время фазы 3 четыре самки из группы 1 были подобраны для спаривания с самцами Льюиса примерно через 9 недель после UTx. У двух самок наблюдались признаки беременности (увеличение массы тела, рис. 3; гнездовое поведение); Однако живорождения не наблюдалось. После двух брачных циклов трех самок у одной самки крысы были обнаружены части тела детеныша (кости и ткани) (° 1). Гистологическое исследование срезов тканей, окрашенных гематоксилином и эозином, ветеринарным патологоанатомом показало, что эти щенки развивались до родов (рис. 4 и рис. 5).
Шесть самок из группы 2 были спарены с самцами Льюиса (см. Рисунок 6 для изменения массы тела). Три из шести крыс (две крысы Льюиса и одна коричневая норвежская крыса) родили детенышей, а еще у двух были признаки беременности. Первый помет самки крысы Льюиса состоял из двух детенышей (рис. 7). Вскоре после рождения самка Льюиса снова забеременела; однако только два из трех детенышей выжили после родов (рис. 8). Одним из вероятных объяснений одной смерти является детоубийство, так как оно происходит даже со здоровыми щенками в условиях послеродового стресса. Точно так же самка коричневой норвежской рожала дважды, каждый раз по четыре детеныша за брачный цикл (рис. 9). Наибольшее количество пометов группы 2 было доставлено другой самкой Льюиса (# 3) с семью детенышами после первого брачного цикла. Все выжившие детеныши показали нормальное развитие (рис. 10).
В целом, адаптация протокола увеличила 2-недельную выживаемость трансплантата с 50% до 75%. Пять из шести женщин забеременели, по сравнению с двумя из четырех из группы 1. Точно так же три из шести самок родили живых детенышей по сравнению с нолем из четырех самок группы 1. В заключение, адаптированный протокол улучшил как прямые хирургические исходы, так и частоту успешных живорождений после UTx (таблица 4 и рисунок 6).
Рисунок 1: Анастомоз трансплантата и вены реципиента. Правая общая подвздошная вена (RCIV) трансплантата соединяется с RCIV реципиента через анастомоз конец в сторону (этап 2.4). RCIA = правая общая подвздошная артерия Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анастомоз трансплантата и артерии реципиента. Правая общая подвздошная артерия (RCIA) соединяется с RCIA реципиента через анастомоз «конец в сторону» (этап 2.4). После вскрытия обоих сосудистых зажимов (2,5) артерия должна быть полностью перфузирована при отсутствии наружного кровотечения. Черная стрелка: прививка RCIA; красная стрелка: прививка RCIV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Изменение массы тела после спаривания самок 1-й группы. Мониторинг массы тела четырех самок группы 1, у которых был обнаружен интактный трансплантат после релапаротомии. Одно животное (°1) было усыплено во время кесарева сечения для осмотра матки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистологическое исследование матки крысы 1 группы с мертвыми детенышами. Части тела детенышей были обнаружены у крыс °1. Обследование выявило жизненно важную и расширенную матку, что говорит о том, что детеныши развивались нормально, но не могли родиться. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Части тела детеныша внутри матки крысы 1 группы °1. Стадия развития костей соответствовала доношенным детенышам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Мониторинг массы тела шести самок группы 2, у которых был обнаружен неповрежденный трансплантат после релапаротомии. Зелеными звездочками отмечены отдельные события рождения. Номера хэштегов относятся к отдельным женщинам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Первое живорождение после UTx крысы в соответствии с модифицированным протоколом. Две новорожденные крысы и их мать (голова вправо; Льюис женский #1, группа 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Второй помет после второго цикла спаривания после UTx крысы в соответствии с модифицированным протоколом. Самка #1 (группа 2) родила трех детенышей, двое из которых выжили. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Первый помет коричневой норвежской крысы после UTx в соответствии с модифицированным протоколом. После первого брачного цикла коричневая норвежская крыса (#2, группа 2) родила четырех детенышей, а затем еще четырех после второго брачного цикла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Развитие детенышей. Все выжившие щенки показали нормальное развитие в возрасте 3 недель. Приведен один из показательных примеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11: Образование вагинальных пробок после успешного спаривания. Белые пробки должны образоваться, чтобы покрыть влагалище после оплодотворения, чтобы предотвратить дальнейшее спаривание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Группа 1 | Группа 2 | Сингенный UTx у крыс | Аллогенный UTx у крыс | |
| Перед модификацией | После модификации | см. ссылку 12 | см. ссылку 15 | |
| Общее количество животных | 8 | 8 | 27 | 14 |
| Двухнедельная приживаемость трансплантата | 4/8 (50%) | 6/8 (75%) | 19/27 (70%) | 9/14 (64%) |
| Количество спариваемых самок | 4/4 (100%) | 6/6 (100%) | 17/19 (89%) | 9/9 (100%) |
| Доношенная беременность | 1/4 (25%) | 5/6 (83%) | 11/17(65%) | 5/9 (56%) |
| Успешно доставленная подстилка | 0 | 5А/ТД> | 1 | 5 |
| Общее количество живых детенышей | 0 | 20б | 3с | 25д |
| Беременность до срока без живорождения | 1 | 1е | 10 | 2 |
Таблица 1: Сравнение результатов модифицированного и немодифицированного протокола для UTx крыс. a: Две беременности от одной и той же крысы; b: Включая детоубийственного щенка; c: Медиана; d: Сумма медианы/поставки; e: Мертвые детеныши на стадии резорбции после трех циклов спаривания.
| Хирургические настройки | Группа 1 (n = 8) | Группа 2 (n = 8) |
| Стадия проекта | Начальный этап | Поздняя стадия |
| Время хранения в холодильнике | 2-3 ч | 2-3 ч |
| Промывка раствором при анастомозе | Относительная влажность | RHX |
| Вагинальный анастомоз | 6/0 Этилон | 6/0 Викрил |
| Анастомоз рога матки | частично непрерывный шов | прерванный шов |
| Анастомоз артерии | Непрерывный шов | Прерывистые и непрерывные |
| Микроваскуляризация вокруг влагалища и шейки матки | прижигание близко к ткани влагалища/шейки матки | прижигание более дистально |
Таблица 2: Группа хирургических настроек 1 по сравнению с группой 2.
| Критерии исключения# |
| Признаки тромбоза (особенно вокруг анастомозов) |
| Большая адгезия |
| Сужение матки |
| Признаки заражения |
| Некроз трансплантата |
Таблица 3: Критерии исключения для спаривания. #Applied при релапаротомии через 2 недели после UTx.
| N (группа 1) | N (группа 2) | |
| Животные | 8 | 8 |
| Здоровый трансплантат через 2 недели | 4 | 6 |
| Повязана | 4 | 6 |
| Доношенная беременность | 1 | 5 |
| Успешно доставленная подстилка | 0 | 5А |
| Общее количество живых детенышей | 0 | 20б |
| Беременность до срока, а не живорождение | 1 | 0 |
Таблица 4: Исходы группы 1 по сравнению с группой 2. a: Две последовательные беременности у одной и той же крысы; б: Включая щенка, убитого детоубийством.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный здесь протокол предлагает подробные инструкции по хирургическому подходу к трансплантации матки у крыс. Протокол был оптимизирован для увеличения шансов живорождения после UTx и последующего спаривания. Оригинальный протокол был заимствован у группы Brännström 12,13, вдохновленной мышиной работой Akouri et al.10, и изменен на основе опыта авторов за последние годы. Таким образом, модификации были обусловлены истинными кривыми обучения, отражающими развитие от неудачных трансплантаций до воспроизводимых результатов.
Ключевыми модификациями, которые, вероятно, являются решающими, были: (1) добавление ксилазина в раствор для промывки во время забора органов и анастомоза, что стимулировало вазодилатацию, что приводило к снижению тромботического риска. (2) Использование прерывистых швов для артериального анастомоза от края до борта. Прерывистые швы не только усиливают хирургический контроль проходимости и позволяют избежать кисетных эффектов, но и позволяют впоследствии расширить область анастомоза для увеличения кровотока через маточную артерию. (3) Наложение прерывистых и нерассасывающихся швов для анастомоза рога матки с наложением швов только в пределах слоя периметрия; Эта модификация предотвращает сужение стенки матки, что может затруднить последующее оплодотворение. (4) Использование рассасывающегося шовного материала для вагинального анастомоза снижает риск стеноза влагалища и тем самым увеличивает шансы на живорождение. (5) Выполнение любых хирургических манипуляций как можно дальше от влагалища и шейки матки является важным шагом, чтобы избежать рубцевания влагалища и увеличить шансы на живорождение. (6) Прямая перевязка правой общей подвздошной вены и артерии вместо перевязки полой вены, брюшной аорты и левой общей подвздошной вены. Прямая перевязка каудально к вене матки в большинстве случаев возможна; Прямая перевязка упрощает получение органов и сокращает время операции без негативного влияния на результаты трансплантации. (7) Снижение концентрации изофлурана до 1%-1,5 об.% сразу после пережатия общей подвздошной вены (этап 2.4.3) также имеет решающее значение, так как в противном случае может наступить сердечная смерть.
Вышеизложенные моменты являются основными элементами, которые отличают настоящий протокол от, возможно, наиболее широко используемого подхода, описанного шведской группой10,12,13. Эти меры принесли пользу конечной конечной точке UTx, живорождению, о чем свидетельствует сравнение групп (исходный и модифицированный протокол; см. Таблицу 1). Очевидно, что кривая хирургического обучения с течением времени также способствовала лучшим результатам; Однако его вклад трудно оценить.
В дополнение к тщательной хирургической технике, послеоперационный уход за реципиентом также имеет решающее значение для конечного результата. Послеоперационное лечение проводится в соответствии с соответствующим местным протоколом; В приведенных здесь инструкциях рекомендуется 0,05 мг/кг бупренорфина после того, как реципиент просыпается от анестезии, и в течение первого послеоперационного дня при появлении боли, как определено нашей оценкой баллов. Критерии оценки основаны на поведении (активность, дыхание, шерсть, осанка, рана) и массе тела. Сразу после операции положительными признаками выздоровления являются возвращение розовой окраски конечностей и ушей, а также возвращение красной окраски глаз. Учитывая продолжительность процедуры трансплантации, регулярное наблюдение в течение первых 3 часов после трансплантации имеет решающее значение. Если критерии оценки не соблюдаются в течение этих 3 часов, животное усыпляют, чтобы избежать дальнейших страданий. Наблюдение продолжается трижды в сутки в течение первых 3 послеоперационных дней. Если животное не полностью выздоравливает в течение первых 2 дней, его усыпляют. В зависимости от своего состояния, животное остается в одном корпусе в течение 2-3 дней после операции.
Стерильные условия во время операции являются еще одним аспектом, имеющим отношение к успешным результатам. Строгий режим гигиены является обязательным, чтобы свести к минимуму риск заражения. При входе в помещение для животных необходимо тщательно вымыть руки, прежде чем одеться в чистый комбинезон, маску для лица, перчатки и шапочку. Вся хирургическая область дезинфицируется специальным тампоном, содержащим хлорид бензил-C12-18-алкилдиметиламмония, хлорид дидецилдиметиламмония и глутаровый альдегид. Далее следует дополнительная дезинфекция 70% этанолом. Перед каждой хирургической манипуляцией перчатки ненадолго очищают 70% этанолом, а область вокруг места операции накрывают стерильной драпировкой. Эти меры значительно помогают свести к минимуму риски заражения.
Одной из проблем, связанных с успехом потомства, является трудность наблюдения за фактической беременностью. Увеличение массы тела может свидетельствовать о беременности, но также может быть связано с детоубийством и, как правило, не отражает достоверно состояние женщины. Например, во время мониторинга в группе 1 были очевидны лишь незначительные изменения веса в целом. Животные 3 и 4 показали одинаковое увеличение веса в течение двух циклов спаривания, но только животное 4 было беременно после релапаротомии (рис. 3 и рис. 4). Более того, потеря веса после первого брачного цикла при отсутствии родов может указывать на абсорбцию беременности. Хотя остается неясным, почему поглощение тканей приводит к потере веса, это явление неоднократно наблюдалось у реципиентов UTxкрыс 12. Образование вагинальных пробок после успешного спаривания (рис. 11) также часто отсутствовало и не проявляло корреляции с последующими изменениями массы тела. Учитывая малую значимость маркировки беременности, частота мониторинга массы тела была снижена для группы 2, чтобы свести к минимуму воздействие стресса на животных. Еще одним следствием непоследовательного присутствия пробки и изменения веса было ненадежное определение времени зачатия. Таким образом, сроки родов были рассчитаны с использованием2-го дня после воздействия мужского пола в качестве дня зачатия. Интересно, что изменения массы тела в группе 2 относительно хорошо коррелировали с течением беременности, при этом роды отмечались явным снижением веса (рис. 6).
Сравнение изменений массы тела (рис. 6) животных 1, 2 и 3 (беременных) с животными 5 и 6 (никогда не беременных) хорошо иллюстрирует эффекты беременности и живорождения по сравнению с неудачным спариванием. Причина разного поведения массы тела в группе 2 по сравнению с группой 1 остается неясной. Тем не менее, изменения веса могут быть более надежными просто из-за большего числа доношенных беременностей во 2-й группе. Низкая частота беременности в группе 1 может быть связана со стенозом влагалища, который был чрезмерно представлен по сравнению с группой 2 (таблица 3) и является причиной затрудненного зачатия. Снижение заболеваемости стенозом во 2-й группе может быть связано с использованием нерассасывающихся вместо рассасывающихся швов для вагинального анастомоза, вероятно, наряду с улучшением хирургических манипуляций во время диссекции влагалища в этой группе.
В отличие от шведского подхода10,12, описанный здесь протокол использует решение IGL-1 (Институт Жоржа Лопеса) для хранения трансплантата вместо Рингера или других решений. Хотя точное влияние раствора IGL-1 на исходы UTx неизвестно, различные отчеты предполагают общую пользу экспериментальной трансплантации для этого решения 22,23,24,25. Наконец, несколько шагов протокола, обычно выполняемых для UTx12, не влияли на результаты, если их пропустить. К ним относятся клипирование рога левой или правой матки и послеоперационная замена гепарина, которую авторы считают необязательной.
Одно ограничение, присущее экспериментальному UTx, справедливо и для представленного протокола. Процедура занимает много времени, а извлечение органов с последующей трансплантацией может занять до 6 часов. Поэтому крысиный UTx требует полной концентрации в течение нескольких часов, чтобы безупречно выполнить каждый шаг. Последнее остается важнейшим аспектом успеха. Такое внимание может быть достигнуто при условии, что микрохирургические навыки полностью развиты и постоянно практикуются. Точно так же терпение и выносливость являются ключевыми чертами, позволяющими избежать ошибок во время всей процедуры. Еще одним последствием длительной процедуры является то, что в день можно оперировать только одно животное. Тщательное планирование и сосредоточенность на ключевых вопросах помогают разработать продуктивный дизайн исследования. Как правило, рекомендуется достичь выживаемости трансплантата выше 70%, прежде чем приступать к фактической экспериментальной серии, чтобы убедиться, что результаты будут достаточно надежными. Наконец, кто-то может захотеть пересмотреть живорождение как конечную точку. Высокая частота стеноза влагалища и резорбция беременности12 заметно увеличивают количество UTxs, необходимых для получения значимых результатов. В ожидании экспериментального вопроса другие конечные точки, такие как выживаемость трансплантата, могут быть более эффективными.
Несмотря на растущее применение, UTx остается экспериментальным применением и в клинике. Помимо необходимости совершенствования хирургических подходов и иммуносупрессивных стратегий, использование трансплантатов от умерших доноров, в частности, является областью, требующей дополнительных исследований. Стратегии смягчения последствий ишемического повреждения еще не разработаны, но было бы весьма желательно для расширения пулов потенциальных доноров. Действительно, влияние ишемии на матку плохо изучено, а прикладные знания опираются на результаты других органов26,27. Rat UTx предлагает средства для изучения ишемического повреждения в контролируемых условиях с использованием подходов, адаптированных к клинике28,29. Следует отметить, что живое донорство связано с определенными рисками; Доноры имеют высокий уровень хирургических осложнений, таких как травмы мочевыводящих путей и кишечника. Соответственно, спрос на мертвые доноры и их исследования растет 5,30.
Существует много дополнительных вопросов, где крысиный UTx может быть информативным. Например, крысиная система дает возможность идентифицировать и/или проверять биологические маркеры, которые могут быть использованы для неинвазивного мониторинга хода трансплантации матки в клинике. Недавние события в обществе могут создать новые вопросы, в которых может быть полезна крысиная модель. UTx в настоящее время также пропагандируется для трансгендеров, при этом мужская анатомия требует адаптированных хирургических подходов31.
В заключение представлен новый протокол UTx крыс, основанный на существующей работе с грызунами и модифицированный практическим опытом. Модифицированный протокол имеет высокую вероятность того, что UTx у крыс приведет к живорождению при условии достаточных микрохирургических навыков и практики. UTx, пожалуй, самая сложная из основных процедур трансплантации. Описанные инструкции должны дополнить общий протокол, который в настоящее время отсутствует, но необходим для установления сложной процедуры UTx крыс в исследовательском сообществе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Швейцарским национальным научным фондом (грант проекта No 310030_192736). Мы хотели бы поблагодарить доктора Фрауке Зеехузен из Института ветеринарной патологии Цюрихского университета за ее гистопатологическую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angled to Side Scissor 5 mm | F.S.T | 15008-08 | |
| Big Paper Clip | No specific | Used as retractor | |
| Blunt Bend Needle G30 | Unimed S.A. | ||
| Bupivacain 0.5% | Sintetica | ||
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Temgesic | ||
| Dosiernadel G25 | H.SIGRIST& PARTNER AG | ||
| Dumont #5SF Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Ethilon 10/0 | Ethicon | 2810G | |
| Ethilon 6/0 | Ethicon | 667H | |
| Ethilon 7/0 | Ethicon | EH7446H | |
| Ethilon 8/0 | Ethicon | 2808G | |
| Femal Brown Norway Rats (150-170 g) | Janvier | ||
| Femal Lewis Rats (150-170 g) | Charles River Deutschland | ||
| Fine Scissors - Sharp | F.S.T | 14060-09 | Any other small scissor works too |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | Any other small needholder works too |
| Heparin Natrium 25000 I.E./ 5 mL | B. Braun | ||
| Institute Georges Lopez Perfusion Solution (IGL) | Institute Georges Lopez | Organ preservation solution | |
| Male Lewis Rats (300-320 g) | Charles River Deutschland | ||
| Micro Serrefines 13 mm | F.S.T | 18055-04 | |
| Micro Serrefines 16 mm gebogen | F.S.T | 18055-06 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | |
| Mölnlyncke Op Towel | Mölnlyncke | 800300 | Sterile drape |
| NaCl 0.9% | B.Braun | ||
| Octenisept | Schülke | ||
| Paper Tape | Tesa | For fixing the animal | |
| Philips Avent Schneller Flaschenwärmer SCF358/02 | Philips | 12824216 | |
| Ringerfundin | B.Braun | ||
| Rompun 2% | Bayer | Xylazine | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 45° | F.S.T | 00276-13 | |
| Sacryl Naht | KRUUSE | 152575 | |
| Scapel No 10 | Swann Morton | 201 | |
| Small Histo-Container | Any small histo-container works fine-for coldstorage of the graft | ||
| Small Plastik Bags | Any transparant plastic bags are fine | ||
| Steril Cotton swab | Lohmann-Rauscher | Any steril cotton swab is fine | |
| Sterile Gauze | Lohmann-Rauscher | Any steril gauze is fine | |
| Straight Scissor 8mm | F.S.T | 15024-10 | |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | OLY-SZX9-B | |
| Sutter Non Stick GLISS 0.4 mm | Sutter | 78 01 69 SLS | |
| Suture Tying Forceps | F.S.T | 00272-13 | |
| ThermoLux warming mat | ThermoLux | ||
| Tissue Forceps for Skin | Any tissue forceps are fine | ||
| Vesseldilatator Forceps | F.S.T | 00125-11 | |
| Vicryl plus 4/0 | Ethicon | VCP292H |
References
- Richards, E. G., et al. Uterus transplantation: state of the art in 2021. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2251-2259 (2021).
- Jones, B. P., et al. Options for acquiring motherhood in absolute uterine factor infertility; adoption, surrogacy and uterine transplantation. The Obstetrician & Gynaecologist. 23 (2), 138-147 (2021).
- Brannstrom, M., et al. The first clinical trial of uterus transplantation: surgical technique and outcome. American Journal of Transplantation. 14, 44 (2014).
- Ejzenberg, D., et al. Livebirth after uterus transplantation from a deceased donor in a recipient with uterine infertility. Lancet. 392 (10165), 2697-2704 (2018).
- Lavoue, V., et al. Which donor for uterus transplants: brain-dead donor or living donor? A systematic review. Transplantation. 101 (2), 267-273 (2017).
- O'Donovan, L., Williams, N. J., Wilkinson, S. Ethical and policy issues raised by uterus transplants. British Medical Bulletin. 131 (1), 19-28 (2019).
- Kisu, I., et al. Long-term outcome and rejection after allogeneic uterus transplantation in cynomolgus macaques. Journal of Clinical Medicine. 8 (10), 1572 (2019).
- Ozkan, O., et al. Uterus transplantation: From animal models through the first heart beating pregnancy to the first human live birth. Womens Health. 12 (4), 442-449 (2016).
- Favre-Inhofer, A., et al. Involving animal models in uterine transplantation. Frontiers in Surgery. 9, 830826 (2022).
- El-Akouri, R. R., Wranning, C. A., Molne, J., Kurlberg, G., Brannstrom, M. Pregnancy in transplanted mouse uterus after long-term cold ischaemic preservation. Human Reproduction. 18 (10), 2024-2030 (2003).
- Sahin, S., Selcuk, S., Eroglu, M., Karateke, A. Uterus transplantation: Experimental animal models and recent experience in humans. Turkish Journal of Obstetrics and Gynecology. 12 (1), 38-42 (2015).
- Wranning, C. A., Akhi, S. N., Diaz-Garcia, C., Brannstrom, M. Pregnancy after syngeneic uterus transplantation and spontaneous mating in the rat. Human Reproduction. 26 (3), 553-558 (2011).
- Wranning, C. A., Akhi, S. N., Kurlberg, G., Brannstrom, M. Uterus transplantation in the rat: Model development, surgical learning and morphological evaluation of healing. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 87 (11), 1239-1247 (2008).
- Brannstrom, M., Wranning, C. A., Altchek, A.
- Diaz-Garcia, C., Akhi, S. N., Wallin, A., Pellicer, A., Brannstrom, M. First report on fertility after allogeneic uterus transplantation. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 89 (11), 1491-1494 (2010).
- R, E., Brown, M. J., Karas, A. Z. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2nd edn. , Elsevier. (2008).
- Donovan, J., Brown, P.
- Rutledge, C., Raper, D. M. S., Abla, A. A. How I do it: superficial temporal artery-middle cerebral artery bypass for flow augmentation and replacement. Acta Neurochirurgica. 162 (8), 1847-1851 (2020).
- Kuo, S. C. -H., et al. The multiple-U technique: a novel microvascular anastomosis technique that guarantees everted anastomosis sites with solid intima-to-intima contact. Plastic and Reconstructive Surgery. 149 (5), 981 (2022).
- Magee, D. J., Manske, R. C. Pathology and Intervention in Musculoskeletal Rehabilitation. 2nd edn. , Elsevier. 25-62 (2016).
- Diaz-Garcia, C., Johannesson, L., Shao, R. J., Bilig, H., Brannstrom, M. Pregnancy after allogeneic uterus transplantation in the rat: perinatal outcome and growth trajectory. Fertility and Sterility. 102 (6), 1545-1552 (2014).
- Canovai, E., et al. IGL-1 as a preservation solution in intestinal transplantation: a multicenter experience. Transplant International. 33 (8), 963-965 (2020).
- Habran, M., De Beule, J., Jochmans, I. IGL-1 preservation solution in kidney and pancreas transplantation: A systematic review. PLoS One. 15 (4), 0231019 (2020).
- Mosbah, I. B., et al. IGL-1 solution reduces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in rat liver transplantation. Cell Death & Disease. 3 (3), 279 (2012).
- Wiederkehr, J. C., et al. Use of IGL-1 preservation solution in liver transplantation. Transplantation Proceedings. 46 (6), 1809-1811 (2014).
- Tilney, N. L., Guttmann, R. D. Effects of initial ischemia/reperfusion injury on the transplanted kidney. Transplantation. 64 (7), 945-947 (1997).
- de Rougemont, O., Dutkowski, P., Clavien, P. A. Biological modulation of liver ischemia-reperfusion injury. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (2), 183-189 (2010).
- Jakubauskiene, L., et al. Relaxin and erythropoietin significantly reduce uterine tissue damage during experimental ischemia-reperfusion injury. International Journal of Molecular Sciences. 23 (13), 7120 (2022).
- Wang, Y., Wu, Y., Peng, S. Resveratrol inhibits the inflammatory response and oxidative stress induced by uterine ischemia reperfusion injury by activating PI3K-AKT pathway. PLoS One. 17 (6), 0266961 (2022).
- Kisu, I., et al. Risks for donors in uterus transplantation. Reproductive Sciences. 20 (12), 1406-1415 (2013).
- Jones, B. P., et al.
