Summary
Il presente protocollo descrive tutti i passaggi essenziali per il successo del trapianto uterino (UTx) nei ratti. Il modello di ratto si è dimostrato adatto a promuovere l'implementazione clinica di UTx; tuttavia, rat UTx è una procedura molto complessa che richiede istruzioni accurate.
Abstract
Il trapianto uterino (UTx) è un nuovo approccio per il trattamento delle donne con infertilità assoluta del fattore uterino (AUFI). Si stima che il 3% -5% delle donne soffra di AUFI. Queste donne sono state private della possibilità di avere figli fino all'avvento di UTx. L'applicazione clinica di UTx è stata guidata da studi sperimentali su animali e il primo UTx di successo è stato raggiunto nei ratti. Date le loro caratteristiche fisiologiche, immunologiche, genetiche e riproduttive, i ratti sono un sistema modello adatto per tali trapianti. In particolare, il loro breve periodo di gestazione è un chiaro vantaggio, poiché l'endpoint abituale dell'UTx sperimentale è la gravidanza di successo con parto vivo. La sfida più grande per i modelli di ratto rimane la piccola anatomia, che richiede competenze microchirurgiche avanzate ed esperienza. Sebbene UTx abbia portato alla gravidanza in clinica, la procedura non è stabilita e richiede una continua ottimizzazione sperimentale. Qui viene presentato un protocollo dettagliato, inclusa la risoluzione dei problemi essenziali per il ratto UTx, che dovrebbe rendere l'intera procedura più facile da comprendere per coloro che non hanno esperienza in questo tipo di microchirurgia.
Introduction
Il trapianto uterino (UTx) è un nuovo trattamento per l'infertilità assoluta del fattore uterino (AUFI). L'AUFI deriva da un'assenza (congenita o acquisita) o da una malformazione dell'utero e colpisce il 3%-5% delle donne in tutto il mondo1. Ragioni etiche, legali o religiose escludono l'adozione o la maternità surrogata per molte donne che hanno un desiderio di maternità ma soffrono di AUFI2. Per queste donne, UTx rimane l'unica opzione per iniziare la propria famiglia. UTx è stato applicato in clinica, anche se con successo misto; La procedura è tecnicamente impegnativa e richiede un miglioramento costante per il suo stabilimento clinico.
Nel 2014, il primo trapianto di utero da un donatore vivente (LD), con conseguente gravidanza di successo, è stato eseguito dal pionieristico gruppo svedese di Brännström3. La prima nascita dopo UTx da un donatore deceduto (DD) è stata segnalata nel 2016 in Brasile4. Entro il 2021, più di 80 UTx sono stati eseguiti in tutto il mondo, tuttavia con un tasso di successo di circa il 50% e con innesti provenienti da LD per la maggior parte1.
Sebbene non salvi la vita, UTx è una procedura sempre più popolare per soddisfare i desideri della propria progenie. Pertanto, la domanda di innesti sta aumentando, ponendo la donazione DD in un focus futuro. Tuttavia, la donazione di DD è complicata a causa di esposizioni ischemiche notevolmente più lunghe al freddo (e nel caso di morte cardiaca, anche a caldo), aumentando i rischi di disfunzione e rigetto del trapianto 5,6. La tecnica chirurgica, la corrispondenza di compatibilità richiesta e l'immunosoppressione associata rimangono problemi critici per quanto riguarda gli esiti UTx7.
Per gestire i rischi di cui sopra nella clinica, sono necessari modelli animali appropriati per l'esplorazione dell'ischemia e dell'immunosoppressione. L'endpoint clinicamente più rilevante per i modelli animali rimane la nascita positiva; ad oggi, gravidanze a seguito di UTx sperimentale sono state raggiunte in topi, ratti, pecore, conigli e scimmie cynomolgus8. Mentre gli animali più grandi sono predestinati all'acquisizione e all'ottimizzazione delle tecniche chirurgiche, i roditori hanno il netto vantaggio di brevi periodi di gestazione. Pertanto, i modelli di roditori sono superiori per quanto riguarda le considerazioni pratiche, finanziarie ed etiche9. Tuttavia, la sfida principale di UTx nei topi è la piccola anatomia, con la chirurgia altamente impegnativa legata alla bassa riproducibilità di UTx10 murino. Al contrario, i ratti sono chirurgicamente più accessibili e conservano i vantaggi di brevi tempi di gestazione. Come tale, il ratto è diventato il modello di scelta per UTx9. Wranning et al. hanno introdotto il modello di ratto di UTx ortotopico nel 2008, e utilizzando questo modello, il primo parto vivo dopo UTx e accoppiamento naturale è stato riportato11,12,13. Studi successivi hanno avuto contributi critici all'implementazione di UTx negli esseri umani9.
Tuttavia, UTx rimane impegnativo nei ratti e solo pochi gruppi hanno ancora padroneggiato questa tecnica chirurgica. Un ostacolo rilevante alla diffusione dell'UTx nel ratto tra i ricercatori è la mancanza di una descrizione precisa delle singole fasi microchirurgiche, delle insidie e delle misure appropriate per la risoluzione dei problemi14. Questo protocollo mira a fornire una guida dettagliata per questa procedura microchirurgica altamente complessa per facilitare l'implementazione di questo modello animale nella ricerca futura.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le prescrizioni federali svizzere sugli animali e approvati dall'Ufficio veterinario di Zurigo (n° 225/2019), garantendo la cura dell'uomo. Le femmine di ratto vergine di Lewis (peso corporeo di 170-200 g) e le femmine di ratto vergine bruno norvegese (170-200 g) sono stati utilizzati come donatori / riceventi dell'utero, mentre i ratti Lewis maschi (300-320 g) sono stati utilizzati per l'accoppiamento. I ratti avevano un'età compresa tra 12 e 15 mesi. Gli animali sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e sono stati alloggiati in condizioni controllate e in un ambiente arricchito con libero accesso all'acqua e al cibo standard.
1. Recupero dell'utero
NOTA: Per i dettagli sulla procedura, consultare le relazioni 12,13,15 pubblicate in precedenza.
- Indurre l'anestesia con isoflurano e ossigeno all'interno di un contenitore di plexiglas chiuso (14 cm x 25 cm x 13 cm) per 1-2 minuti (isoflurano 5 vol% in O2).
- Somministrare buprenorfina per via sottocutanea (0,05 mg/kg) e bupivacaina (0,5%, 8 mg/kg) per via sottocutanea nella regione dell'incisione addominale pianificata 30 minuti prima dell'intervento.
- Rasare tutta la pelle addominale del ratto con un rasoio elettrico.
- Utilizzare nastri per mantenere l'animale fissato su una piastra riscaldante durante l'intervento chirurgico. Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi.
- Mantenere l'anestesia durante la procedura con 2-4 vol% di isoflurano in ossigeno mediante somministrazione continua attraverso un piccolo cono nasale.
- Monitorare la profondità dell'anestetico in base ai parametri clinici senza strumenti specializzati (frequenza respiratoria di ~ 70-120 / min-una caduta lenta del 50% è accettabile durante l'anestesia; controllare la profondità dell'anestetico con pizzicare la punta; il colore delle mucose dovrebbe essere rosa, non blu o grigio)16 e regolare la concentrazione di isoflurano di conseguenza.
NOTA: Opzionale: il monitoraggio frequente della respirazione durante l'intervento chirurgico è fattibile con l'aiuto di un assistente. - Confermare la profondità dell'anestetico eseguendo un pizzico della punta.
- Pulire la pelle addominale con un movimento circolare con tre tamponi alternati di una soluzione antisettica e alcool al 70%. Lasciare asciugare.
- Posizionare un drappo sterile (vedi Tabella dei materiali) con una finestra addominale sopra l'animale.
- Eseguire laparotomia mediana.
- Aprire l'addome attraverso un'incisione lunga 6-8 cm sulla linea mediana, a partire da 0,5 cm sotto lo xiphisternum verso l'ipogastrio. Utilizzare un bisturi n. 10 per l'incisione cutanea e piccole forbici affilate per l'incisione linea alba. Non danneggiare il fegato o la vescica.
- Spostare l'intestino all'esterno della cavità addominale usando tamponi di cotone, coprirli delicatamente con una garza inumidita con soluzione salina sterile e proteggerli con un sacchetto di plastica sterile per un migliore isolamento.
- Inserire divaricatori o clip (vedi Tabella dei materiali) nelle cartelle della parete addominale sinistra e destra per mantenere il muscolo peritoneale da parte e l'addome aperto, per ottenere un accesso e una visibilità ottimali dell'utero e dei vasi associati. Fissare le clip/riavvolgitori con dei nastri.
- Applicare soluzione salina preriscaldata per mantenere umida la zona chirurgica e l'intestino ed evitare l'essiccazione dei visceri.
- Raccogli il corno uterino destro con la cavità uterina comune e la cervice più i peduncoli vascolari, compresi i vasi iliaci interni, interni e comuni.
- Ligate (poliglactina 4/0; vedi Tabella dei materiali), cauterizzare e recidere il corno uterino sinistro adiacente alla ramificazione dalla cavità uterina comune.
- Rimuovere il grasso in eccesso che circonda l'utero e la vagina.
NOTA: Mantenere il grasso intorno al sistema uterino-vascolare. - Sezionare la vescica al suo attaccamento alla cervice con cauterizzazione di tutti i vasi vescicali drenanti e nutrienti. Durante la cauterizzazione, mantenere un'adeguata distanza tra la cervice e la vagina per evitare la cauterizzazione inutile su queste due strutture. Altrimenti, aumenta il rischio di necrosi del trapianto.
NOTA: La maggior parte delle manipolazioni chirurgiche dovrebbe interessare la vescica. Ritrarre o tirare la vescica caudalmente con un morsetto vascolare (vedere la tabella dei materiali) per ottenere una migliore visione dell'excavatio vesicouterina. - Cauterizzare e recidere i vasi uterini discendenti a livello dell'uretere il più distale possibile alla cervice.
NOTA: Mantenere la microcircolazione intorno alla vagina e alla cervice il più possibile durante la divisione. - Separare la porzione cervicale/vaginale del futuro innesto dall'attacco rettale e dai legamenti paravaginali e paracervicali.
NOTA: Evitare qualsiasi cauterizzazione sulla vagina dell'innesto. - Sezionare attentamente la vagina tramite diatermia intorno a 2-3 mm caudale della cervice.
NOTA: Nessun villi (cervice) è visibile all'interno del lume vaginale. - Localizzare sia l'arteria uterina che la vena alle loro origini. Ligate (poliammide 8/0; vedi Tabella dei materiali), cauterizzare e recidere i vasi glutei e tutti i vasi caudali dei vasi uterini.
NOTA: La legatura diretta della vena iliaca caudale comune alla vena uterina è solitamente possibile. - Con la dissezione smussata, liberare i vasi iliaci comuni l'uno dall'altro, dalla biforcazione dell'aorta e della vena cava fino alla divisione dei vasi uterini.
NOTA: Si può ottenere un migliore accesso chirurgico all'area rimuovendo uno o due linfonodi adiacenti. - Asportare il corno uterino destro a 3 mm dalla tuba di Falloppio, dopo aver cauterizzato il peduncolo utero-ovarico allo stesso livello. Ciò consente l'anastomosi del corno uterino innesto nella parte superiore del corno uterino ricevente.
- Posizionare le legature (poliammide 8/0) direttamente attorno all'arteria iliaca e alla vena comune destra, prossimali alle biforcazioni aortica e cavale. Fare una piccola incisione (0,5-1 mm) nell'arteria iliaca comune destra adiacente alla biforcazione e inserire un ago da 30 G piegato e smussato o un ago dritto e smussato da 25 G nel lume (per il lavaggio). Fissarlo con una legatura (poliammide 6/0).
NOTA: Un'ulteriore opzione è il fissaggio aggiuntivo con un morsetto bulldog per evitare lo spostamento dell'ago e/o del vaso. - Sezionare la vena iliaca comune caudalmente della legatura nella vena iliaca comune destra per consentire il deflusso durante il lavaggio.
- Lavare l'innesto seguendo i passaggi seguenti.
- Lavare manualmente l'utero utilizzando siringhe da 3 ml con circa 9 ml di soluzione fredda di Ringer (RHX: Ringer integrato con 50 UI/mL di eparina e 0,4 mg/mL di xilazina) ad una velocità di flusso di 6 ml/min. Sciacquare nuovamente con 6 mL di soluzione per la conservazione degli organi integrata con eparina (50 UI/ml) e xilazina (0,4 mg/ml) (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Evitare un'elevata pressione di lavaggio e garantire il corretto posizionamento dell'ago. - Rimuovere il trapianto quando il tessuto uterino è diventato pallido. Tagliare l'arteria iliaca comune caudalmente della legatura alla biforcazione dell'aorta addominale.
- Lavare manualmente l'utero utilizzando siringhe da 3 ml con circa 9 ml di soluzione fredda di Ringer (RHX: Ringer integrato con 50 UI/mL di eparina e 0,4 mg/mL di xilazina) ad una velocità di flusso di 6 ml/min. Sciacquare nuovamente con 6 mL di soluzione per la conservazione degli organi integrata con eparina (50 UI/ml) e xilazina (0,4 mg/ml) (vedere Tabella dei materiali).
- Posizionare il trapianto in una soluzione refrigerata per la conservazione degli organi (4 °C) per la preparazione e la conservazione della tavola posteriore prima del trapianto.
- Dopo aver rimosso l'innesto, eutanasia l'animale ruotando prima l'impostazione dell'isoflurano al massimo e quindi inducendo il pneumotorace bilaterale seguito dal dissanguamento17.
2. Trapianto di utero singeneico
NOTA: Per i dettagli sulla procedura, consultare le relazioni 12,13,15 pubblicate in precedenza.
- Indurre l'anestesia e preparare l'animale come indicato al punto 1.1.
- Somministrare analgesia efficace (come descritto al punto 1.1.1) e 200 UI/kg di eparina ad alto peso molecolare 30 minuti prima dell'intervento.
- Eseguire laparotomia mediana.
- Aprire l'addome attraverso un'incisione della linea mediana lunga 6-8 cm a partire da 0,5 cm sotto lo xifisno verso l'ipogastrio. Utilizzare un bisturi n. 10 per l'incisione cutanea e piccole forbici affilate per l'incisione linea alba. Non danneggiare il fegato e la vescica.
- Spostare l'intestino tenue all'esterno della cavità addominale usando tamponi di cotone, avvolgerli con una garza inumidita sterile e coprirli con un sacchetto di plastica sterile per un migliore isolamento.
- Inserire divaricatori o clip nelle cartelle della parete addominale sinistra e destra per mantenere il muscolo peritoneale da parte e l'addome aperto, per ottenere un accesso e una visibilità ottimali dell'utero e dei vasi associati. Fissare le clip/riavvolgitori con dei nastri.
- Applicare soluzione salina preriscaldata per mantenere umida la zona chirurgica e l'intestino ed evitare l'essiccazione dei visceri.
- Eseguire un'isterectomia con dissezione e mobilizzazione del terzo superiore della vagina dal retto e dalla vescica.
- Cauterizzare la microvascolarizzazione intorno all'utero, alla cervice e alla vagina. Tagliare e separare l'utero dalle strutture circostanti vicino all'organo per proteggere la microcircolazione del sinistro uterino.
- Rimuovere il tessuto adiposo dall'ambiente circostante.
- Amputare il corno sinistro mediante cauterizzazione. Sul lato destro, conservare un segmento di 7-8 mm della parte superiore dell'utero per la successiva anastomosi all'innesto uterino.
- Eseguire il trapianto di utero.
- Mobilitare e separare i giusti vasi iliaci comuni, dall'origine dei vasi uterini fino alla biforcazione aortica/cavale.
- Posizionare l'innesto nella cavità addominale. Avvolgere l'innesto in una garza imbevuta di soluzione di conservazione dell'organo freddo.
NOTA: L'innesto deve essere mantenuto freddo durante l'anastomosi. - Posizionare morsetti vascolari atraumatici sulla vena iliaca comune destra su ciascun lato, inquadrando il futuro sito di anastomosi.
NOTA: Abbassare l'anestesia a 1-1,5 vol% isoflurano per adattarsi all'improvvisa diminuzione del precarico cardiaco e alla conseguente ipotensione. - Tagliare una fessura leggermente più grande dell'apertura della vena dell'innesto nella vena iliaca comune.
- Posizionare la vena dell'innesto.
- Posizionare una sutura di sospensione (poliammide 10/0; vedi Tabella dei materiali) in ciascun angolo della fessura sulla vena iliaca comune destra.
NOTA: Tenere il nodo di sutura allentato nell'angolo caudale per una migliore regolazione e per evitare effetti di corde della borsa. - Lavare regolarmente l'area di anastomosi con RHX raffreddato durante la procedura per prevenire trombosi.
- Anastomosi un lato della vena dell'innesto nella vena del ricevente con sei-otto anelli di una sutura continua (Figura 1).
NOTA: Iniziare con la sutura cranica (poliammide 10/0) e prima anastomizzare la parte in entrata dei vasi. - Anastomosi l'altro lato della nave allo stesso modo, questa volta partendo dall'esterno.
- Legare un nodo alla sutura cranica, e poi uno alla sutura di soggiorno caudale (poliammide 10/0), dopo aver terminato le anastomosi su entrambi i lati.
NOTA: Stringere le suture continue solo quanto necessario per evitare effetti di corda della borsa. - Posizionare morsetti vascolari atraumatici sull'arteria iliaca comune destra su ciascun lato, inquadrando il futuro sito di anastomosi.
- Eseguire l'anastomosi arteriosa (arteria iliaca comune destra [RCIA] tramite 8-10 anelli utilizzando suture interrotte (poliammide 10/0).
NOTA: Le suture interrotte sono più facili da controllare rispetto a quelle continue (opzionali con la tecnica "bocca di pesce")18. Il lavaggio costante dell'area di anastomosi con RHX raffreddato durante la procedura aiuta a prevenire le trombosi. Quando si utilizzano suture continue, eseguire questo passaggio analogo all'anastomosi venosa.
- Eseguire la riperfusione dell'innesto.
- Quando entrambi i siti di anastomosi appaiono evidenti e qualsiasi sanguinamento viene fermato, rilasciare i morsetti vascolari sui vasi dell'innesto (Figura 2).
- Ispezionare l'innesto per segni di riperfusione, come arrossamento, riempimento della vena o pulsazione nell'arteria dell'innesto.
- Collegare il bracciale vaginale del trapianto alla volta vaginale della ricevente utilizzando da sei a sette suture interrotte intraluminali (poliglactina 6/0).
NOTA: Iniziare con una singola sutura a ore 12 e posizionare prima quelle successive nelle posizioni a ore 10 e 1. Le due suture a ore 9 e 3 dovrebbero essere legate dopo le suture in prima fila19,20. - Anastomosi il corno uterino dell'innesto end-to-end al segmento uterino cranico rimanente dell'utero ricevente utilizzando da cinque a sette suture interrotte (poliammide 7/0).
NOTA: Non cucire attraverso il lume.
- Chiudere l'addome con una sutura continua. Utilizzare poliglactina 4/0 per suturare lo strato muscolare e poliammide 6/0 o clip per ferite chirurgiche per la pelle.
- Lascia che l'animale si riprenda in una gabbia riscaldata una volta completato il trapianto. Rimanere con l'animale fino a quando non ha riacquistato la capacità di sdraiarsi sternale e mantenere un alloggiamento singolo fino al suo completo recupero. Fornire un trattamento di analgesia psotopertativa somministrando per via sottocutanea buprenorfina (0,05 mg/kg) e FANS adatti, tuttavia non prima di 4-8 ore dopo la prima dose di anestesia. Fornire continuamente buprenorfina attraverso l'acqua potabile (1 mg/kg, orale, 5 mL di buprenorfina in 160 mL di acqua potabile (0,3 mg/ml)) per tre giorni dopo l'intervento.
- La sutura della pelle viene rimossa 10-14 giorni dopo la sicurezza.
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Representative Results
Vengono presentati i risultati di due gruppi di ratti. UTx è stato effettuato prima (gruppo 1, n = 8) e dopo (gruppo 2, n = 8) aggiustamento del protocollo (Tabella 1) per dimostrare gli effetti delle nostre modifiche (si veda la Discussione per una spiegazione delle nostre modifiche)12,15,21.
L'esito dell'UTx del ratto è associato a tre fasi chiave. La prima fase è il recupero riuscito da UTx. Di solito, i destinatari dovrebbero recuperare entro i primi 2 giorni postoperatori. La seconda fase riguarda lo stato di salute dell'innesto 2 settimane dopo l'intervento chirurgico, che decide l'inclusione nel processo di accoppiamento (Tabella 2). La terza fase prevede l'accoppiamento spontaneo seguito da una nascita riuscita come prova di fertilità.
Tutti gli animali di entrambi i gruppi hanno avuto un recupero senza incidenti dall'intervento chirurgico. Durante la seconda fase, quattro animali sono stati esclusi dal gruppo 1 e due dal gruppo 2. L'esclusione era dovuta alla trombosi del trapianto e all'ascesso (n = 4 per il gruppo 1, n = 2 per il gruppo 2) e all'anastomosi utero-uterina ristretta/malformata (in aggiunta per n = 1, gruppo 1) all'esame alla relaparotomia (Tabella 2). La relaparotomia (lungo la cicatrice della laparotomia originale) è stata eseguita per tutte le femmine 2 settimane dopo il trapianto, poiché l'aspetto fisico degli animali aveva poco valore come indicatore della salute del trapianto. Complessivamente, il tasso di sopravvivenza del trapianto a 2 settimane è stato del 50% e del 75% per i gruppi 1 e 2, rispettivamente (Tabella 3).
Durante la fase 3, quattro femmine del gruppo 1 sono state abbinate per l'accoppiamento con i maschi di Lewis, circa 9 settimane dopo UTx. Due femmine hanno mostrato segni di gravidanza (aumento del peso corporeo, Figura 3; comportamento di nidificazione); tuttavia, non è stato osservato alcun parto vivo. Dopo due cicli di accoppiamento di tre femmine, parti del corpo del cucciolo (ossa e tessuti) sono state trovate in una femmina di ratto (°1). L'esame istologico delle sezioni di tessuto colorato con ematossilina ed eosina da parte di un patologo veterinario ha rivelato che questi cuccioli si sono sviluppati fino al parto (Figure 4 e Figura 5).
Sei femmine del gruppo 2 sono state accoppiate con maschi di Lewis (vedere la Figura 6 per le variazioni del peso corporeo). Tre dei sei ratti (due Lewis e un ratto norvegese marrone) hanno dato alla luce cuccioli, mentre altri due hanno mostrato segni di gravidanza. La prima cucciolata della femmina di ratto Lewis consisteva di due cuccioli (Figura 7). Poco dopo la nascita, la femmina di Lewis rimase incinta di nuovo; tuttavia, solo due dei tre cuccioli sono sopravvissuti dopo la nascita (Figura 8). Una probabile spiegazione per l'unica morte è l'infanticidio, poiché si verifica anche con cuccioli sani in condizioni di stress postpartum. Allo stesso modo, la femmina di Norvegia bruna ha partorito due volte, ogni volta a quattro cuccioli per ciclo di accoppiamento (Figura 9). Il maggior numero di cucciolate del gruppo 2 è stato partorito da un'altra femmina di Lewis (# 3), con sette cuccioli dopo il primo ciclo di accoppiamento. Tutti i cuccioli sopravvissuti hanno mostrato uno sviluppo normale (Figura 10).
Nel complesso, l'adattamento del protocollo ha aumentato la sopravvivenza del trapianto a 2 settimane dal 50% al 75%. Cinque delle sei femmine sono rimaste incinte, rispetto a due su quattro del gruppo 1. Allo stesso modo, tre su sei delle femmine hanno dato alla luce cuccioli vivi rispetto a zero su quattro delle femmine del gruppo 1. In conclusione, il protocollo adattato ha migliorato sia gli esiti chirurgici diretti che il tasso di nascite vive di successo dopo UTx (Tabella 4 e Figura 6).
Figura 1: Anastomosi dell'innesto e della vena del ricevente. La vena iliaca comune destra (RCIV) dell'innesto è collegata all'RCIV del ricevente tramite anastomosi end-to-side (fase 2.4). RCIA = arteria iliaca comune destra Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Anastomosi dell'innesto e dell'arteria ricevente. L'arteria iliaca comune destra (RCIA) è collegata all'RCIA del ricevente tramite anastomosi end-to-side (fase 2.4). Dopo aver aperto entrambi i morsetti vascolari (2.5), l'arteria deve essere completamente perfusa in assenza di sanguinamento esterno. Freccia nera: innesto RCIA; freccia rossa: innesto RCIV. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Variazioni del peso corporeo dopo l'accoppiamento delle femmine del gruppo 1. Monitoraggio del peso corporeo delle quattro femmine del gruppo 1 che hanno mostrato un innesto intatto dopo relaparotomia. Un animale (°1) è stato sottoposto a eutanasia durante il taglio cesareo per ispezionare l'utero. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Esame istologico dell'utero del ratto del gruppo 1 con cuccioli morti. Parti del corpo dei cuccioli sono state trovate nel ratto °1. L'esame ha rivelato un utero vitale e dilatato, suggerendo che i cuccioli si sviluppavano normalmente ma non potevano essere partoriti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Parti del corpo del cucciolo all'interno dell'utero del ratto del gruppo 1 °1. Lo stadio di sviluppo delle ossa era coerente con i cuccioli a termine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Monitoraggio del peso corporeo delle sei femmine del gruppo 2 che hanno mostrato un innesto intatto dopo relaparotomia. Le stelle verdi segnano gli eventi di nascita individuali. I numeri hashtag si riferiscono alle singole donne. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Il primo parto vivo dopo l'UTx del ratto seguendo il protocollo modificato. Due ratti appena nati e la loro madre (testa a destra; Lewis femmina #1, gruppo 2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: La seconda cucciolata dopo il secondo ciclo di accoppiamento post ratto UTx seguendo il protocollo modificato. La femmina #1 (gruppo 2) ha dato alla luce tre cuccioli, due dei quali sono sopravvissuti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: La prima cucciolata del ratto bruno norvegese dopo UTx seguendo il protocollo modificato. Dopo il primo ciclo di accoppiamento, il ratto norvegese bruno (# 2, gruppo 2) ha dato alla luce quattro cuccioli, seguiti da altri quattro dopo il secondo ciclo di accoppiamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 10: Sviluppo dei cuccioli. Tutti i cuccioli sopravvissuti hanno mostrato uno sviluppo normale a 3 settimane di età. Viene mostrato un esempio rappresentativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 11: Formazione del tappo vaginale dopo l'accoppiamento riuscito. Dovrebbero formarsi tappi bianchi per coprire la vagina dopo la fecondazione per prevenire ulteriori accoppiamenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Gruppo 1 | Gruppo 2 | UTx singeneico nei ratti | UTx allogenico nei ratti | |
| prima della modifica | dopo la modifica | Vedi rif. 12 | Vedi rif. 15 | |
| Numero totale di animali | 8 | 8 | 27 | 14 |
| Sopravvivenza dell'innesto di due settimane | 4/8 (50%) | 6/8 (75%) | 19/27 (70%) | 9/14 (64%) |
| Numero di femmine accoppiate | 4/4 (100%) | 6/6 (100%) | 17/19 (89%) | 9/9 (100%) |
| Gravidanza a termine | 1/4 (25%) | 5/6 (83%) | 11/17(65%) | 5/9 (56%) |
| Lettiera consegnata con successo | 0 | 5a/td> | 1 | 5 |
| Numero totale di cuccioli viventi | 0 | 20b | 3C | 25d |
| Gravidanza a termine senza parto vivo | 1 | 1e | 10 | 2 |
Tabella 1: Confronto dei risultati del protocollo modificato e non modificato per UTx ratto. a: Due gravidanze dello stesso ratto; b: Compreso il cucciolo di infanticidio; c: Mediana; d: Somma della mediana/consegna; e: Cuccioli morti in fase di riassorbimento dopo tre cicli di accoppiamento.
| Impostazioni chirurgiche | Gruppo 1 (n = 8) | Gruppo 2 (n = 8) |
| Fase del progetto | Fase iniziale | Fase avanzata |
| Tempo di conservazione a freddo | 2-3 h | 2-3 h |
| Soluzione di lavaggio durante l'anastomosi | RH | RHX |
| Anastomosi vaginale | 6/0 Ethilon | 6/0 Vicryl |
| Anastomosi del corno dell'utero | sutura parzialmente continua | sutura interrotta |
| Arteria anastomosi | sutura continua | Interrotto e continuo |
| Micro-vascolarizzazione intorno alla vagina e alla cervice | cauterizzazione vicino al tessuto vaginale/cervicale | cauterizzazione più distalmente |
Tabella 2: Impostazioni chirurgiche gruppo 1 rispetto al gruppo 2.
| Criteri di esclusione# |
| Segni di trombosi (in particolare intorno alle anastomosi) |
| Maggiore adesione |
| Utero ristretto |
| Segni di infezione |
| Necrosi da trapianto |
Tabella 3: Criteri di esclusione per l'accoppiamento. #Applied alla relaparotomia 2 settimane dopo UTx.
| n (gruppo 1) | n (gruppo 2) | |
| Animali | 8 | 8 |
| Innesto sano dopo 2 settimane | 4 | 6 |
| Accoppiato | 4 | 6 |
| Gravidanza a termine | 1 | 5 |
| Lettiera consegnata con successo | 0 | 5bis |
| Numero totale di cuccioli viventi | 0 | 20b |
| Gravidanza a termine, non parto vivo | 1 | 0 |
Tabella 4: Risultati del gruppo 1 rispetto al gruppo 2. a: Due gravidanze consecutive nello stesso ratto; b: Compreso il cucciolo ucciso con l'infanticidio.
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Discussion
Il protocollo qui presentato offre istruzioni dettagliate per l'approccio chirurgico alla base del trapianto di utero nei ratti. Il protocollo è stato ottimizzato per aumentare le probabilità di nascite vive dopo UTx e successivo accoppiamento. Il protocollo originale è stato ripreso dal gruppo Brännström 12,13, ispirato al lavoro sui topi di Akouri et al.10, e modificato in base alle esperienze degli autori negli ultimi anni. In quanto tali, le modifiche sono state guidate da vere curve di apprendimento che riflettono lo sviluppo da trapianti falliti a risultati riproducibili.
Le modifiche chiave che sono probabilmente decisive sono state: (1) l'aggiunta di xilazina alla soluzione di lavaggio durante il prelievo e l'anastomosi degli organi, che ha stimolato la vasodilatazione portando a rischi trombotici ridotti. (2) L'uso di punti di sutura interrotti per l'anastomosi arteriosa end-to-side. Le suture interrotte non solo aumentano il controllo chirurgico sulla pervietà ed evitano gli effetti del cordone della borsa, ma consentono anche il successivo allargamento dell'area anastomotica per aumentare il flusso sanguigno attraverso l'arteria uterina. (3) L'applicazione di suture interrotte e non assorbibili per l'anastomosi del corno dell'utero con cuciture solo all'interno dello strato del perimetro; Questa modifica impedisce la costrizione della parete dell'utero, che può ostacolare la successiva fecondazione. (4) L'uso di materiale di sutura assorbibile per l'anastomosi vaginale riduce il rischio di stenosi vaginale e quindi aumenta le possibilità di nati vivi. (5) Eseguire qualsiasi manipolazione chirurgica il più lontano possibile dalla vagina e dalla cervice è un passo cruciale per evitare cicatrici vaginali e aumentare le possibilità di nascite vive. (6) La legatura diretta della vena iliaca comune destra e dell'arteria invece di legare la vena cava, l'aorta addominale e l'arteria della vena iliaca comune sinistra. La legatura diretta caudale alla vena uterina è, nella maggior parte dei casi, fattibile; La legatura diretta semplifica l'approvvigionamento di organi e riduce i tempi chirurgici senza influire negativamente sui risultati del trapianto. (7) Abbassare la concentrazione di isoflurano all'1%-1,5 vol% subito dopo il bloccaggio della vena iliaca comune (fase 2.4.3) è altrettanto cruciale, altrimenti potrebbe verificarsi la morte cardiaca.
I punti precedenti sono gli elementi principali che distinguono il presente protocollo dall'approccio forse più utilizzato descritto dal gruppo svedese10,12,13. Queste misure hanno beneficiato dell'endpoint finale di UTx, la nascita viva, come evidenziato dal confronto di gruppo (protocollo originale vs. modificato; vedi Tabella 1). Chiaramente, la curva di apprendimento chirurgico nel tempo ha anche aggiunto risultati migliori; Tuttavia, il suo contributo è difficile da stimare.
Oltre a una meticolosa tecnica chirurgica, la cura postoperatoria del destinatario è altrettanto cruciale per il risultato finale. I trattamenti postoperatori seguono il rispettivo protocollo locale; Le istruzioni qui raccomandano 0,05 mg / kg di buprenorfina dopo che il ricevente si sveglia dall'anestesia e durante il primo giorno postoperatorio se presenta dolore come definito dalla nostra valutazione del punteggio. I criteri di punteggio si basano sul comportamento (attività, respirazione, pelo, postura, ferita) e sul peso corporeo. Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, i segni positivi di recupero sono un ritorno della colorazione rosa delle estremità e delle orecchie, nonché un ritorno della colorazione rossa degli occhi. Data la lunghezza della procedura di trapianto, è fondamentale un monitoraggio regolare durante le prime 3 ore dopo il trapianto. Se i criteri di valutazione non vengono soddisfatti durante queste 3 ore, l'animale viene sottoposto a eutanasia per evitare ulteriori sofferenze. Il monitoraggio viene continuato tre volte al giorno per i primi 3 giorni postoperatori. Se l'animale non si riprende completamente durante i primi 2 giorni, viene eutanasia. A seconda delle sue condizioni, l'animale rimane in un unico alloggiamento per 2-3 giorni dopo l'intervento.
Le condizioni sterili durante l'intervento chirurgico sono un altro aspetto rilevante per i risultati positivi. Una rigorosa routine igienica è obbligatoria per ridurre al minimo i rischi di infezione. Quando si entra nella struttura per animali, le mani devono essere accuratamente lavate prima di vestirsi con una tuta pulita, una maschera facciale, guanti e un berretto. L'intera area chirurgica viene disinfettata con un tampone speciale contenente benzil-C12-18-alkyldimethylammonium chloride, didecildimethylammonium chloride e glutaraldeide. Segue un'ulteriore disinfezione con etanolo al 70%. Prima di ogni manipolazione chirurgica, i guanti vengono brevemente puliti con etanolo al 70% e l'area circostante il sito chirurgico è coperta da un drappo sterile. Queste misure aiutano notevolmente a ridurre al minimo i rischi di infezione.
Un problema con il successo della progenie è la difficoltà nel monitorare la gravidanza effettiva. Gli aumenti di peso corporeo possono essere indicativi di gravidanza, ma possono anche essere dovuti all'infanticidio e generalmente non riflettono in modo affidabile lo stato della femmina. Ad esempio, solo modeste variazioni di peso complessive erano evidenti per il gruppo 1 durante il monitoraggio. Gli animali 3 e 4 hanno mostrato aumenti di peso simili durante i due cicli di accoppiamento, ma solo l'animale 4 era incinta dopo relaparotomia (Figura 3 e Figura 4). Inoltre, la perdita di peso dopo il primo ciclo di accoppiamento con parto assente può indicare l'assorbimento della gravidanza. Sebbene non sia chiaro il motivo per cui l'assorbimento tissutale provoca la perdita di peso, questo fenomeno è stato ripetutamente osservato nei pazienti trattati con UTx12. Anche la formazione del tappo vaginale dopo l'accoppiamento riuscito (Figura 11) era spesso assente e non mostrava una correlazione con i successivi cambiamenti del peso corporeo. Dato lo scarso valore nella marcatura della gravidanza, la frequenza di monitoraggio del peso corporeo è stata ridotta per il gruppo 2 per ridurre al minimo l'esposizione allo stress degli animali. Un'ulteriore conseguenza della presenza incoerente della spina e delle variazioni di peso era una definizione inaffidabile del tempo di concepimento. Le date di scadenza per le nascite sono state quindi calcolate utilizzando il 2° giorno dopo l'esposizione maschile come giorno del concepimento. È interessante notare che i cambiamenti di peso corporeo nel gruppo 2 sono correlati relativamente bene con il corso della gravidanza, con il parto caratterizzato da un chiaro calo di peso (Figura 6).
Il confronto tra le variazioni di peso corporeo (Figura 6) degli animali 1, 2 e 3 (in gravidanza) con gli animali 5 e 6 (mai in gravidanza) illustra bene gli effetti della gravidanza e della nascita dal vivo rispetto all'accoppiamento non riuscito. La ragione dietro il diverso comportamento del peso corporeo nel gruppo 2 rispetto al gruppo 1 rimane poco chiara. Tuttavia, i cambiamenti di peso possono essere più affidabili semplicemente a causa del maggior numero di gravidanze a termine nel gruppo 2. Il basso tasso di gravidanza nel gruppo 1 può essere correlato alla stenosi vaginale, che è stata sovrarappresentata rispetto al gruppo 2 (Tabella 3) ed è una causa di concepimento ostacolato. La ridotta incidenza stenotica nel gruppo 2 può essere dovuta all'uso di punti di sutura non assorbibili anziché assorbibili per l'anastomosi vaginale, probabilmente insieme a una migliore manipolazione chirurgica durante la dissezione vaginale in questo gruppo.
A differenza dell'approccio svedese10,12, il protocollo qui descritto utilizza la soluzione IGL-1 (Institute Georges Lopez) per la conservazione dell'innesto invece di Ringer o altre soluzioni. Mentre l'esatto impatto della soluzione IGL-1 sugli esiti UTx è sconosciuto, vari rapporti suggeriscono benefici complessivi nel trapianto sperimentale per questa soluzione22,23,24,25. Infine, alcuni passaggi del protocollo solitamente eseguiti per UTx12 non hanno influito sui risultati se saltati. Questi includono il taglio al corno dell'utero sinistro o destro e la sostituzione postoperatoria dell'eparina, che gli autori ritengono facoltativa.
Una limitazione inerente all'UTx sperimentale è valida anche per il protocollo presentato. La procedura richiede molto tempo e il prelievo di organi seguito dal trapianto può richiedere fino a 6 ore. Pertanto, rat UTx richiede la piena concentrazione per diverse ore al fine di eseguire ogni passaggio in modo impeccabile. Quest'ultimo rimane l'aspetto più importante del successo. Tale attenzione può essere realizzata a condizione che le abilità microchirurgiche siano pienamente sviluppate e continuamente praticate. Allo stesso modo, la pazienza e la resistenza sono tratti chiave per evitare errori durante l'intera procedura. Un'altra conseguenza della lunga procedura è che solo un animale può essere operato al giorno. Un'attenta pianificazione e l'attenzione alle domande chiave aiutano a sviluppare un progetto di ricerca produttivo. In generale, si consiglia di raggiungere una sopravvivenza dell'innesto superiore al 70% prima di impegnarsi nella serie sperimentale effettiva per garantire che i risultati siano sufficientemente robusti. Infine, si potrebbe voler riconsiderare la nascita dal vivo come punto finale. L'alta incidenza di stenosi vaginale e riassorbimento della gravidanza12 aumenta notevolmente il numero di UTx necessari per ottenere risultati significativi. In attesa della questione sperimentale, altri endpoint, come la sopravvivenza del trapianto, potrebbero essere più efficaci.
Nonostante la sua crescente applicazione, UTx rimane un'applicazione sperimentale anche in clinica. Oltre alla necessità di migliorare gli approcci chirurgici e le strategie immunosoppressive, l'uso di innesti da donatori deceduti, in particolare, è un'area che richiede ulteriori ricerche. Le strategie per mitigare il danno ischemico non sono stabilite, ma sarebbero più benvenute per l'espansione di potenziali pool di donatori. In effetti, l'impatto dell'ischemia sull'utero è mal studiato, con conoscenze applicate basate sui risultati di altri organi26,27. Rat UTx offre un mezzo per esplorare il danno ischemico in contesti controllati utilizzando approcci su misura per la clinica28,29. Da notare che la donazione di vivi è associata a determinati rischi; I donatori hanno un alto tasso di complicanze chirurgiche, come il tratto urinario e il trauma intestinale. Di conseguenza, la domanda di donazioni morte e la sua ricerca sta crescendo 5,30.
Esistono molte domande aggiuntive in cui rat UTx potrebbe essere informativo. Ad esempio, il sistema di ratto offre l'opportunità di identificare e / o convalidare marcatori biologici che potrebbero essere utilizzati per monitorare in modo non invasivo il corso dei trapianti di utero nella clinica. I recenti sviluppi sociali possono creare nuove domande in cui il modello di ratto può essere utile. UTx viene ora sostenuto anche per gli individui transgender, con l'anatomia maschile che richiede approcci chirurgici adattati31.
In conclusione, viene presentato un nuovo protocollo di ratto UTx basato sul lavoro esistente sui roditori e modificato dall'esperienza pratica. Il protocollo modificato ha un'alta probabilità di UTx nel ratto, con conseguente nascita di nati vivi e sufficiente abilità e pratica microchirurgica. UTx è forse la più complessa delle principali procedure di trapianto. Le istruzioni descritte si aggiungono ad un protocollo comune, che attualmente manca ma è necessario per stabilire l'impegnativa procedura di UTx del ratto all'interno della comunità di ricerca.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (sovvenzione del progetto n. 310030_192736). Ringraziamo la dottoressa Frauke Seehusen dell'Istituto di patologia veterinaria dell'Università di Zurigo per il suo sostegno istopatologico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angled to Side Scissor 5 mm | F.S.T | 15008-08 | |
| Big Paper Clip | No specific | Used as retractor | |
| Blunt Bend Needle G30 | Unimed S.A. | ||
| Bupivacain 0.5% | Sintetica | ||
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Temgesic | ||
| Dosiernadel G25 | H.SIGRIST& PARTNER AG | ||
| Dumont #5SF Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Ethilon 10/0 | Ethicon | 2810G | |
| Ethilon 6/0 | Ethicon | 667H | |
| Ethilon 7/0 | Ethicon | EH7446H | |
| Ethilon 8/0 | Ethicon | 2808G | |
| Femal Brown Norway Rats (150-170 g) | Janvier | ||
| Femal Lewis Rats (150-170 g) | Charles River Deutschland | ||
| Fine Scissors - Sharp | F.S.T | 14060-09 | Any other small scissor works too |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | Any other small needholder works too |
| Heparin Natrium 25000 I.E./ 5 mL | B. Braun | ||
| Institute Georges Lopez Perfusion Solution (IGL) | Institute Georges Lopez | Organ preservation solution | |
| Male Lewis Rats (300-320 g) | Charles River Deutschland | ||
| Micro Serrefines 13 mm | F.S.T | 18055-04 | |
| Micro Serrefines 16 mm gebogen | F.S.T | 18055-06 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | |
| Mölnlyncke Op Towel | Mölnlyncke | 800300 | Sterile drape |
| NaCl 0.9% | B.Braun | ||
| Octenisept | Schülke | ||
| Paper Tape | Tesa | For fixing the animal | |
| Philips Avent Schneller Flaschenwärmer SCF358/02 | Philips | 12824216 | |
| Ringerfundin | B.Braun | ||
| Rompun 2% | Bayer | Xylazine | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 45° | F.S.T | 00276-13 | |
| Sacryl Naht | KRUUSE | 152575 | |
| Scapel No 10 | Swann Morton | 201 | |
| Small Histo-Container | Any small histo-container works fine-for coldstorage of the graft | ||
| Small Plastik Bags | Any transparant plastic bags are fine | ||
| Steril Cotton swab | Lohmann-Rauscher | Any steril cotton swab is fine | |
| Sterile Gauze | Lohmann-Rauscher | Any steril gauze is fine | |
| Straight Scissor 8mm | F.S.T | 15024-10 | |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | OLY-SZX9-B | |
| Sutter Non Stick GLISS 0.4 mm | Sutter | 78 01 69 SLS | |
| Suture Tying Forceps | F.S.T | 00272-13 | |
| ThermoLux warming mat | ThermoLux | ||
| Tissue Forceps for Skin | Any tissue forceps are fine | ||
| Vesseldilatator Forceps | F.S.T | 00125-11 | |
| Vicryl plus 4/0 | Ethicon | VCP292H |
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