Summary
O presente protocolo descreve todas as etapas essenciais para o sucesso do transplante uterino (TxU) em ratas. O modelo em ratos mostrou-se adequado para promover a implementação clínica de UTx; no entanto, a UTx de ratos é um procedimento altamente complexo que requer instruções cuidadosas.
Abstract
O transplante uterino (UTx) é uma nova abordagem para o tratamento de mulheres com infertilidade absoluta do fator uterino (AUFI). Estima-se que 3%-5% das mulheres sofram de AUFI. Essas mulheres foram privadas da opção de ter filhos até o advento da UTx. A aplicação clínica de UTx foi impulsionada por estudos experimentais em animais, e a primeira UTx bem-sucedida foi alcançada em ratos. Dadas suas características fisiológicas, imunológicas, genéticas e reprodutivas, os ratos são um sistema modelo adequado para tais transplantes. Em particular, seu curto período de gestação é uma clara vantagem, já que o desfecho usual da UTx experimental é a gravidez bem-sucedida com nascido vivo. O maior desafio para modelos de ratos continua sendo a anatomia pequena, que requer habilidades microcirúrgicas avançadas e experiência. Embora a UTx tenha levado à gravidez na clínica, o procedimento não está estabelecido e requer otimização experimental contínua. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado, incluindo a solução de problemas essencial para UTx de ratos, o que deve tornar todo o procedimento mais fácil de entender para aqueles sem experiência neste tipo de microcirurgia.
Introduction
O transplante uterino (UTx) é um novo tratamento para a infertilidade absoluta do fator uterino (AUFI). O IAAU resulta de uma ausência (congênita ou adquirida) ou malformação do útero e afeta 3%-5% das mulheres em todo o mundo1. Razões éticas, legais ou religiosas descartam a adoção ou barriga de aluguel para muitas mulheres que têm o desejo de maternidade, mas sofrem de AUFI2. Para essas mulheres, a UTx continua sendo a única opção para começar sua própria família. A UTx tem sido aplicada na clínica, embora com sucesso misto; O procedimento é tecnicamente desafiador e requer aprimoramento constante para seu estabelecimento clínico.
Em 2014, o primeiro transplante de útero de uma doadora viva (DL) – resultando em gravidez bem-sucedida – foi realizado pelo pioneiro grupo sueco de Brännström3. O primeiro parto após Tx de doador falecido (DD) foi relatado em 2016 no Brasil4. Até 2021, mais de 80 UTxs foram realizadas em todo o mundo, porém com uma taxa de sucesso de cerca de 50% e com enxertos provenientes de DL para a maioria1.
Apesar de não salvar vidas, o UTx é um procedimento cada vez mais popular para satisfazer os desejos da própria progênie. Dessa forma, a demanda por enxertos está aumentando, colocando a doação de DD em um foco futuro. No entanto, a doação DD é complicada devido a exposições isquêmicas consideravelmente mais longas ao frio (e, no caso de morte cardíaca, também quente), elevando os riscos de disfunção e rejeição do enxerto 5,6. A técnica cirúrgica, a compatibilidade exigente e a imunossupressão associada permanecem questões críticas em relação aos resultados daTxU7.
Para gerenciar os riscos acima na clínica, modelos animais apropriados para a exploração de isquemia e imunossupressão são necessários. O desfecho clinicamente mais relevante para modelos animais continua sendo o nascimento bem-sucedido; até o momento, gestações após UTx experimental foram alcançadas em camundongos, ratos, ovelhas, coelhos e macacos cynomolgus8. Enquanto animais maiores são predestinados a adquirir e otimizar técnicas cirúrgicas, os roedores apresentam a nítida vantagem de curtos períodos de gestação. Portanto, os modelos de roedores são superiores em considerações práticas, financeiras e éticas9. No entanto, o principal desafio da UTx em camundongos é a anatomia pequena, com a cirurgia altamente exigente ligada à baixa reprodutibilidade da UTxmurina 10. Por outro lado, as ratas são cirurgicamente mais acessíveis e mantêm as vantagens de tempos de gestação curtos. Como tal, o rato tornou-se o modelo de escolha para UTx9. Wranning e col. introduziram o modelo de UTx ortotópica em ratos em 2008 e, usando esse modelo, o primeiro nascido vivo após UTx e acasalamento natural foi relatado11,12,13. Estudos subsequentes tiveram contribuições críticas para a implementação da TxU em humanos9.
No entanto, a Tx permanece desafiadora em ratos, e apenas alguns grupos ainda dominam essa técnica cirúrgica. Um obstáculo relevante para a disseminação da UTx de ratos entre os pesquisadores é a falta de uma descrição precisa dos passos microcirúrgicos individuais, das armadilhas e das medidas de acordo para a solução deproblemas14. Este protocolo visa fornecer um guia detalhado para este procedimento microcirúrgico de alta complexidade para facilitar a implementação deste modelo animal em pesquisas futuras.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados seguindo os Regulamentos Animais Federais da Suíça e aprovados pelo Escritório Veterinário de Zurique (n° 225/2019), garantindo o cuidado humano. Ratas virgens Lewis (peso corporal de 170-200 g) e ratas virgens Brown Norway (170-200 g) foram utilizadas como doadoras/receptoras de útero, enquanto ratos Lewis machos (300-320 g) foram utilizados para acasalamento. Os ratos tinham idade entre 12 e 15 meses. Os animais foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e alojados em condições controladas e ambiente enriquecido, com livre acesso à água e ração padrão.
1. Recuperação do útero
OBS: Para detalhes sobre o procedimento, favor consultar os relatórios publicados anteriormente12,13,15.
- Induzir anestesia com isoflurano e oxigênio dentro de um recipiente de Plexiglas fechado (14 cm x 25 cm x 13 cm) por 1-2 min (5 vol% de isoflurano em O2).
- Administrar buprenorfina por via subcutânea (0,05 mg/kg) e bupivacaína (0,5%, 8 mg/kg) por via subcutânea na região da incisão abdominal planejada 30 minutos antes da cirurgia.
- Faça a barba de toda a pele abdominal do rato com um barbeador elétrico.
- Use fitas para manter o animal fixado em uma placa de aquecimento durante a cirurgia. Aplique pomada ocular em ambos os olhos.
- Manter a anestesia durante o procedimento com isoflurano 2-4 vol% em oxigênio por administração contínua através de um pequeno cone nasal.
- Monitorar a profundidade anestésica por parâmetros clínicos sem ferramentas especializadas (frequência respiratória de ~70-120/min - uma queda lenta de 50% é aceitável durante a anestesia; verificar a profundidade anestésica com pinça dos dedos; cor das mucosas deve ser rosa, não azul ou cinza)16 e ajustar a concentração de isoflurano de acordo.
NOTA: Opcional: o monitoramento frequente da respiração durante a cirurgia é viável com a ajuda de um assistente. - Confirme a profundidade do anestésico realizando uma pinça do dedo do pé.
- Limpe a pele abdominal em movimento circular com três swabs alternados de uma solução antisséptica e álcool a 70%. Deixe secar.
- Coloque um pano estéril (ver Tabela de Materiais) com uma janela abdominal sobre o animal.
- Realizar laparotomia mediana.
- Abra o abdome através de uma incisão longa de 6-8 cm na linha média, começando 0,5 cm abaixo do xifesterno em direção ao hipogástrio. Use um bisturi nº 10 para a incisão da pele e uma pequena tesoura afiada para a incisão da linha alba. Não danifique o fígado ou a bexiga.
- Mova os intestinos para fora da cavidade abdominal usando cotonetes, cubra-os suavemente com uma gaze umedecida com soro fisiológico estéril e proteja-os com um saco plástico estéril para melhor isolamento.
- Insira afastadores ou clipes (ver Tabela de Materiais) nas pastas da parede abdominal esquerda e direita para manter o músculo peritoneal de lado e o abdome aberto, para obter acesso e visibilidade ideais do útero e vasos associados. Fixe os clipes/afastadores com fitas.
- Aplicar soro fisiológico pré-aquecido para manter a área cirúrgica e os intestinos úmidos e evitar o ressecamento das vísceras.
- Retirar o corno uterino direito com a cavidade uterina comum e o colo do útero, além de pedículos vasculares, incluindo os vasos uterinos direitos, internos e ilíacos comuns.
- Ligate (4/0 poliglactina; ver Tabela de Materiais), cauterizar e cortar o corno uterino esquerdo adjacente à ramificação da cavidade uterina comum.
- Remova o excesso de gordura ao redor do útero e da vagina.
NOTA: Mantenha a gordura ao redor do sistema vascular uterino. - Dissecar a bexiga em sua fixação ao colo do útero com cauterização de todos os vasos vesicais de drenagem e alimentação. Durante a cauterização, mantenha uma distância adequada entre o colo do útero e a vagina para evitar a cauterização desnecessária dessas duas estruturas. Caso contrário, o risco de necrose do enxerto aumenta.
NOTA: A maioria das manipulações cirúrgicas deve afetar a bexiga. Retrair ou puxar a bexiga caudalmente com uma pinça vascular (ver Tabela de Materiais) para obter uma melhor visão da escavação vesicouterina. - Cauterizar e cortar os vasos uterinos descendentes ao nível do ureter o mais distal possível ao colo uterino.
NOTA: Mantenha a microcirculação ao redor da vagina e do colo do útero o máximo possível durante a divisão. - Separe a porção cervical/vaginal do futuro enxerto da fixação retal e dos ligamentos paravaginal e paracervical.
NOTA: Evitar qualquer cauterização na vagina do enxerto. - Dissecar cuidadosamente a vagina através de diatermia em torno de 2-3 mm caudal do colo do útero.
NOTA: Nenhuma vilosidade (colo do útero) é visível dentro do lúmen vaginal. - Localizar a artéria e a veia uterinas em suas origens. Ligate (poliamida 8/0; ver Tabela de Materiais), cauterizar e cortar os vasos glúteos e todos os vasos caudais dos vasos uterinos.
NOTA: A ligadura direta da veia ilíaca comum caudal à veia uterina geralmente é possível. - Por dissecção romba, libere os vasos ilíacos comuns uns dos outros, da bifurcação da aorta e da veia cava até a divisão dos vasos uterinos.
NOTA: Pode-se obter melhor acesso cirúrgico à área removendo um ou dois linfonodos adjacentes. - Excisar o corno uterino direito a 3 mm da tuba uterina após cauterização do pedículo útero-ovariano no mesmo nível. Isso permite a anastomose do corno uterino do enxerto com a parte superior do corno uterino receptor.
- Colocar ligaduras (poliamida 8/0) diretamente ao redor da artéria e veia ilíaca comum direita, proximal às bifurcações aórtica e cava. Faça uma pequena incisão (0,5-1 mm) na artéria ilíaca comum direita adjacente à bifurcação e insira uma agulha 30 G dobrada e embotada ou uma agulha reta 25 G embotada no lúmen (para rubor). Prenda-o com uma ligadura (poliamida 6/0).
NOTA: Uma outra opção é a fixação adicional com uma braçadeira de buldogue para evitar o deslocamento da agulha e/ou vaso. - Dissecar a veia ilíaca comum caudalmente da ligadura na veia ilíaca comum direita para permitir a saída durante o flushing.
- Lave o enxerto seguindo os passos abaixo.
- Lave o útero manualmente usando seringas de 3 mL com aproximadamente 9 mL de solução fria de Ringer (RHX: Ringer suplementado com 50 UI/mL de heparina e 0,4 mg/mL de xilazina) a um fluxo de 6 mL/min. Lavar novamente com 6 ml de solução de preservação de órgãos suplementada com heparina (50 UI/ml) e xilazina (0,4 mg/ml) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Evite alta pressão de lavagem e garanta a colocação adequada da agulha. - Remova o transplante quando o tecido uterino estiver pálido. Cortar a artéria ilíaca comum caudalmente da ligadura na bifurcação da aorta abdominal.
- Lave o útero manualmente usando seringas de 3 mL com aproximadamente 9 mL de solução fria de Ringer (RHX: Ringer suplementado com 50 UI/mL de heparina e 0,4 mg/mL de xilazina) a um fluxo de 6 mL/min. Lavar novamente com 6 ml de solução de preservação de órgãos suplementada com heparina (50 UI/ml) e xilazina (0,4 mg/ml) (ver Tabela de Materiais).
- Colocar o transplante em solução refrigerada de preservação de órgãos (4 °C) para preparação e armazenamento da mesa traseira antes do transplante.
- Após a retirada do enxerto, o animal foi sacrificado, primeiro com o ajuste de isoflurano ao máximo e, em seguida, induzindo-se pneumotórax bilateral seguido de exsanguinação17.
2. Transplante de útero singênico
OBS: Para detalhes sobre o procedimento, favor consultar os relatórios publicados anteriormente12,13,15.
- Induzir a anestesia e preparar o animal conforme mencionado no passo 1.1.
- Administrar analgesia eficaz (conforme descrito no passo 1.1.1) e 200 UI/kg de heparina de alto peso molecular 30 minutos antes da cirurgia.
- Realizar laparotomia mediana.
- Abra o abdome através de uma incisão mediana de 6-8 cm de comprimento começando 0,5 cm abaixo do xifesterno em direção ao hipogástrio. Use um bisturi nº 10 para a incisão da pele e uma pequena tesoura afiada para a incisão da linha alba. Não danifique o fígado e a bexiga.
- Mova os intestinos delgados para fora da cavidade abdominal usando cotonetes, envolva-os com uma gaze estéril umedecida e cubra-os com um saco plástico estéril para melhor isolamento.
- Insira afastadores ou clipes nas pastas da parede abdominal esquerda e direita para manter o músculo peritoneal de lado e o abdome aberto, para obter o acesso e a visibilidade ideais do útero e dos vasos associados. Fixe os clipes/afastadores com fitas.
- Aplicar soro fisiológico pré-aquecido para manter a área cirúrgica e os intestinos úmidos e evitar o ressecamento das vísceras.
- Realizar histerectomia com dissecção e mobilização do terço superior da vagina a partir do reto e da bexiga.
- Cauterizar a microvasculatura ao redor do útero, colo do útero e vagina. Corte e separe o útero das estruturas circundantes próximas ao órgão para proteger a microcirculação do sinistro uterino.
- Remova o tecido adiposo dos arredores.
- Amputar o corno esquerdo por cauterização. Do lado direito, preservar um segmento de 7-8 mm da parte superior do útero para posterior anastomose ao enxerto uterino.
- Realizar transplante de útero.
- Mobilizar e separar os vasos ilíacos comuns direitos, desde a origem dos vasos uterinos até a bifurcação aorto/cava.
- Posicione o enxerto na cavidade abdominal. Embrulhe o enxerto em uma gaze embebida em solução fria de preservação de órgãos.
OBS: O enxerto precisa ser mantido frio durante a anastomose. - Colocar pinças vasculares atraumáticas na veia ilíaca comum direita de cada lado, enquadrando o local da anastomose futura.
NOTA: Abaixe a anestesia para 1-1,5 vol% de isoflurano para se adaptar à diminuição súbita da pré-carga cardíaca e à hipotensão resultante. - Corte uma fenda ligeiramente maior do que a abertura da veia do enxerto na veia ilíaca comum.
- Posicione a veia do enxerto.
- Coloque uma sutura de permanência (poliamida 10/0; ver Tabela de Materiais) em cada canto da fenda na veia ilíaca comum direita.
OBS: Mantenha o nó de sutura no canto caudal solto para melhor ajuste e evitar efeitos de bolsa-corda. - Lave regularmente a área da anastomose com RHX resfriado durante o procedimento para evitar tromboses.
- Anastomosar um lado da veia do enxerto à veia do receptor com seis a oito alças de sutura contínua (Figura 1).
OBS: Iniciar com a sutura de estaca cranial (poliamida 10/0) e anastomosar primeiramente a parte de entrada dos vasos. - Anastomose o outro lado do vaso da mesma maneira, desta vez começando por fora.
- Amarrar um nó na sutura de estaca cranial e, em seguida, um na sutura de suspensão caudal (poliamida 10/0), após terminar as anastomoses em ambos os lados.
NOTA: Aperte as suturas contínuas apenas o quanto necessário para evitar efeitos de corda de bolsa. - Colocar pinças vasculares atraumáticas na artéria ilíaca comum direita de cada lado, enquadrando o local da anastomose futura.
- Realizar a anastomose arterial (artéria ilíaca comum direita [AICD] através de 8-10 alças utilizando pontos interrompidos (poliamida 10/0).
OBS: As suturas interrompidas são mais fáceis de controlar do que as contínuas (opcional com a técnica "boca de peixe")18. A lavagem constante da área da anastomose com RHX resfriado durante o procedimento ajuda a prevenir tromboses. Ao utilizar suturas contínuas, realizar esta etapa análoga à anastomose venosa.
- Realizar reperfusão do enxerto.
- Quando ambos os locais de anastomose parecerem pérvios e qualquer sangramento for interrompido, solte as pinças vasculares nos vasos do enxerto (Figura 2).
- Inspecione o enxerto em busca de sinais de reperfusão, como vermelhidão, enchimento da veia ou pulsação na artéria do enxerto.
- Conectar o manguito vaginal do transplante à abóbada vaginal da receptora usando seis a sete pontos intraluminais (6/0 poliglactina) interrompidos.
OBS: Iniciar com uma única sutura na posição 12 horas primeiro, e colocar as próximas nas posições 10 e 1 hora. As duas suturas nas posições 9 e 3 horas devem ser amarradas após as suturas na primeira fileira19,20. - Anastomosar o enxerto do corno uterino término-a-terminal ao segmento uterino cranial remanescente do útero receptor usando cinco a sete suturas interrompidas (poliamida 7/0).
OBS: Não costurar através do lúmen.
- Fechar o abdome com uma sutura contínua. Utilizar poliglactina 4/0 para sutura da camada muscular e poliamida 6/0 ou clipes da ferida cirúrgica para a pele.
- Deixe o animal se recuperar em uma gaiola aquecida assim que o transplante for concluído. Permanecer com o animal até que ele tenha recuperado a capacidade de decúbito esternal e manter alojamento único até sua recuperação completa. Fornecer tratamento de analgesia psotopertaive administrando buprenorfina (0,05 mg/kg) por via subcutânea e AINE adequado, porém não antes de 4-8 horas após a primeira dose de anestesia. Fornecer continuamente buprenorfina através de água potável (1 mg/kg, via oral, 5 mL de buprenorfina em 160 mL de água potável (0,3 mg/mL)) por três dias após a cirurgia.
- A sutura da pele é removida 10-14 dias após a certeza.
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Representative Results
Resultados de dois grupos de ratos são apresentados. A Tx foi realizada antes (grupo 1, n = 8) e após (grupo 2, n = 8) ajuste do protocolo (Tabela 1) para demonstrar os efeitos de nossas modificações (consulte a Discussão para uma explicação de nossas modificações)12,15,21.
O resultado da UTx de ratos está associado a três fases principais. A primeira fase é a recuperação bem-sucedida do UTx. Normalmente, os receptores devem se recuperar nos primeiros 2 dias de pós-operatório. A segunda fase diz respeito ao estado de saúde do enxerto 2 semanas após a cirurgia, que decide a inclusão no processo de acasalamento (Tabela 2). A terceira fase envolve o acasalamento espontâneo seguido de nascimento bem-sucedido como evidência de fertilidade.
Todos os animais de ambos os grupos tiveram uma recuperação sem intercorrências da cirurgia. Na segunda fase, quatro animais foram excluídos do grupo 1 e dois do grupo 2. A exclusão deveu-se à trombose e abscesso do enxerto (n = 4 para o grupo 1, n = 2 para o grupo 2) e à anastomose útero-uterina estreitada/malformada (adicionalmente para n = 1, grupo 1) ao exame da relaparotomia (Tabela 2). A relaparotomia (ao longo da cicatriz da laparotomia original) foi realizada para todas as fêmeas 2 semanas após o transplante, pois a aparência física dos animais tinha pouco valor como indicador de saúde do enxerto. No geral, a sobrevida do enxerto em 2 semanas foi de 50% e 75% para os grupos 1 e 2, respectivamente (Tabela 3).
Durante a fase 3, quatro fêmeas do grupo 1 foram pareadas para acasalamento com machos Lewis, cerca de 9 semanas após UTx. Duas fêmeas apresentaram sinais de prenhez (aumento de peso corporal, Figura 3; comportamento de nidificação); entretanto, não foram observados nascidos vivos. Após dois ciclos de acasalamento de três fêmeas, partes do corpo dos filhotes (osso e tecido) foram encontradas em uma rata (°1). O exame histológico dos cortes teciduais corados com hematoxilina e eosina por um patologista veterinário revelou que esses filhotes se desenvolveram até o parto (Figuras 4 e Figura 5).
Seis fêmeas do grupo 2 foram acasaladas com machos Lewis (ver Figura 6 para mudanças de peso corporal). Três das seis ratas (duas Lewis e uma Brown Norway) deram à luz filhotes, enquanto outras duas apresentaram sinais de gravidez. A primeira ninhada da rata Lewis consistiu de dois filhotes (Figura 7). Logo após o nascimento, a fêmea Lewis engravidou novamente; no entanto, apenas dois dos três filhotes sobreviveram no pós-natal (Figura 8). Uma provável explicação para a única morte é o infanticídio, que ocorre mesmo com filhotes saudáveis em condições de estresse pós-parto. Da mesma forma, a fêmea marrom norueguesa deu à luz duas vezes, cada vez com quatro filhotes por ciclo de acasalamento (Figura 9). O maior número de ninhadas do grupo 2 foi entregue por outra fêmea Lewis , com sete filhotes após o primeiro ciclo de acasalamento. Todos os filhotes sobreviventes apresentaram desenvolvimento normal (Figura 10).
No geral, a adaptação do protocolo aumentou a sobrevida do enxerto em 2 semanas de 50% para 75%. Cinco das seis fêmeas engravidaram, em comparação com duas das quatro do grupo 1. Da mesma forma, três das seis fêmeas deram à luz filhotes vivos, em comparação com zero de quatro das fêmeas do grupo 1. Em conclusão, o protocolo adaptado melhorou tanto os resultados cirúrgicos diretos quanto a taxa de nascidos vivos bem-sucedidos após TxU (Tabela 4 e Figura 6).
Figura 1: Anastomose do enxerto e veia receptora. A veia ilíaca comum direita (VCIV) do enxerto é conectada ao CDIV do receptor via anastomose término-lateral (passo 2.4). AICD = artéria ilíaca comum direita Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Anastomose do enxerto e da artéria receptora. A artéria ilíaca comum direita (AICD) é conectada à AICD do receptor por meio de anastomose término-lateral (passo 2.4). Após a abertura de ambas as pinças vasculares (2,5), a artéria deve ser totalmente perfundida na ausência de sangramento externo. Seta preta: enxerto RCIA; seta vermelha: enxerto RCIV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Alterações do peso corporal após o acasalamento das fêmeas do grupo 1. Monitorização do peso corporal das quatro fêmeas do grupo 1 que apresentaram enxerto íntegro à relaparotomia. Um animal (°1) foi sacrificado durante cesariana para inspeção do útero. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exame histológico do útero da rata do grupo 1 com filhotes mortos. Partes do corpo dos filhotes foram encontradas em ratos °1. O exame revelou um útero vital e dilatado, sugerindo que os filhotes se desenvolveram normalmente, mas não puderam ser entregues. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Partes do corpo do filhote dentro do útero do grupo 1 rata °1. O estágio de desenvolvimento dos ossos foi consistente com filhotes a termo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Monitorização do peso corporal das seis mulheres do grupo 2 que apresentaram enxerto íntegro à relaparotomia. As estrelas verdes marcam eventos individuais de nascimento. Os números das hashtags referem-se às mulheres individuais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Primeiro nascido vivo após UTx de rato seguindo o protocolo modificado. Dois ratos recém-nascidos e sua mãe (cabeça para a direita; Lewis feminino #1, grupo 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: A segunda ninhada após o segundo ciclo de acasalamento pós-UTx do rato seguindo o protocolo modificado. A fêmea #1 (grupo 2) deu à luz três filhotes, dois dos quais sobreviveram. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Primeira ninhada do rato Noruega marrom após UTx seguindo o protocolo modificado. Após o primeiro ciclo de acasalamento, o rato Noruega marrom (#2, grupo 2) deu à luz quatro filhotes, seguidos por outros quatro após o segundo ciclo de acasalamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Desenvolvimento dos filhotes. Todos os filhotes sobreviventes apresentaram desenvolvimento normal com 3 semanas de idade. Um exemplo representativo é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Formação de tampão vaginal após acasalamento bem-sucedido. Tampões brancos devem se formar para cobrir a vagina após a fertilização para evitar novos acasalamentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Grupo 1 | Grupo 2 | UTx singênica em ratos | UTx alogênica em ratos | |
| antes da modificação | após modificação | ver ref. 12 | ver ref. 15 | |
| Número total de animais | 8 | 8 | 27 | 14 |
| Sobrevida do enxerto em duas semanas | 4/8 (50%) | 6/8 (75%) | 19/27 (70%) | 9/14 (64%) |
| Número de fêmeas acasaladas | 4/4 (100%) | 6/6 (100%) | 17/19 (89%) | 9/9 (100%) |
| Gravidez a termo | 1/4 (25%) | 5/6 (83%) | 11/17(65%) | 5/9 (56%) |
| Lixo entregue com sucesso | 0 | 5A/TD> | 1 | 5 |
| Número total de filhotes vivos | 0 | 20b | 3º-C | 25d |
| Gravidez a termo sem nascido vivo | 1 | 1ºe | 10 | 2 |
Tabela 1: Comparação dos resultados do protocolo modificado e não modificado para UTx de ratos. a: Duas gestações pelo mesmo rato; b: Incluindo o filhote de infanticídio; c: Mediana; d: Soma da mediana/parto; e: Filhotes mortos em fase de reabsorção após três ciclos de acasalamento.
| Cenários cirúrgicos | Grupo 1 (n = 8) | Grupo 2 (n = 8) |
| Fase do projeto | estágio inicial | estágio final |
| Tempo de armazenamento refrigerado | 2-3 h | 2-3 h |
| Solução de lavagem durante a anastomose | RH | RHX |
| Anastomose vaginal | 6/0 Etilo | 6/0 Vicryl |
| Anastomose do corno uterino | sutura parcialmente contínua | sutura interrompida |
| Anastomose de arteria | sutura contínua | Interrompido e contínuo |
| Microvascularização ao redor da vagina e colo do útero | cauterização próxima ao tecido vaginal/cervical | cauterização mais distalmente |
Tabela 2: Ajustes cirúrgicos grupo 1 versus grupo 2.
| Critérios de exclusão# |
| Sinais de trombose (particularmente ao redor de anastomoses) |
| Maior aderência |
| Útero contraído |
| Sinais de infecção |
| Necrose do enxerto |
Tabela 3: Critérios de exclusão para acasalamento. #Applied na relaparotomia 2 semanas após a UTx.
| n (grupo 1) | n (grupo 2) | |
| Animais | 8 | 8 |
| Enxerto saudável após 2 semanas | 4 | 6 |
| Acasalado | 4 | 6 |
| Gravidez a termo | 1 | 5 |
| Lixo entregue com sucesso | 0 | 5a |
| Número total de filhotes vivos | 0 | 20b |
| Gravidez a termo, não nascido vivo | 1 | 0 |
Tabela 4: Resultados do grupo 1 versus grupo 2. a: Duas gestações consecutivas no mesmo rato; b: Incluindo o filhote morto por infanticídio.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado oferece instruções detalhadas para a abordagem cirúrgica por trás do transplante de útero em ratas. O protocolo foi otimizado para aumentar as chances de nascidos vivos após TxU e subsequente acasalamento. O protocolo original foi retomado do grupo de Brännström12,13, inspirado no trabalho em camundongos de Akouri et al.10, e modificado com base nas experiências dos autores nos últimos anos. Como tal, as modificações foram impulsionadas por curvas de aprendizado verdadeiras que refletem o desenvolvimento de transplantes malsucedidos para resultados reprodutíveis.
As principais modificações que provavelmente são decisivas foram: (1) a adição de xilazina à solução de lavagem durante a recuperação do órgão e anastomose, que estimulou a vasodilatação levando à redução dos riscos trombóticos. (2) O uso de suturas interrompidas para anastomose arterial término-lateral. As suturas interrompidas não só aumentam o controle cirúrgico sobre a patência e evitam os efeitos de cinturão em bolsa, mas também permitem o alargamento subsequente da área anastomótica para aumentar o fluxo sanguíneo através da artéria uterina. (3) Aplicação de suturas interrompidas e inabsorvíveis para anastomose do corno uterino com costura apenas na camada do perimétrio; Essa modificação evita a constrição da parede do útero, o que pode dificultar a fecundação posterior. (4) O uso de material de sutura absorvível para anastomose vaginal reduz o risco de estenose vaginal e, consequentemente, aumenta as chances de nascidos vivos. (5) Realizar qualquer manipulação cirúrgica o mais longe possível da vagina e do colo do útero é um passo crucial para evitar cicatrizes vaginais e aumentar as chances de nascidos vivos. (6) A ligadura direta da veia ilíaca comum direita e da artéria em vez da ligadura da veia cava, da aorta abdominal e da artéria ilíaca comum esquerda. A ligadura direta caudal à veia uterina é, na maioria dos casos, factível; A ligadura direta simplifica a captação de órgãos e encurta o tempo cirúrgico sem impactar negativamente os resultados do transplante. (7) A redução da concentração de isoflurano para 1%-1,5 vol% logo após o clampeamento da veia ilíaca comum (passo 2.4.3) também é crucial, pois, caso contrário, pode ocorrer morte cardíaca.
Os pontos acima são os principais elementos que distinguem o presente protocolo da abordagem talvez mais utilizada descrita pelo grupo sueco10,12,13. Essas medidas beneficiaram o desfecho final da UTx, o nascido vivo, como evidenciado pela comparação entre os grupos (protocolo original versus modificado; ver Tabela 1). Claramente, a curva de aprendizado cirúrgico ao longo do tempo também contribuiu para melhores resultados; no entanto, sua contribuição é difícil de estimar.
Além de uma técnica cirúrgica meticulosa, os cuidados pós-operatórios com o receptor também são cruciais para o resultado final. Os tratamentos pós-operatórios seguem o respectivo protocolo local; As instruções aqui recomendadas recomendam 0,05 mg/kg de buprenorfina após o receptor acordar da anestesia e durante o primeiro dia de pós-operatório se apresentar dor, conforme definido por nossa avaliação de pontuação. Os critérios de pontuação são baseados no comportamento (atividade, respiração, jaleco, postura, ferida) e peso corporal. Imediatamente após a cirurgia, os sinais positivos de recuperação são um retorno da coloração rosa das extremidades e orelhas, bem como um retorno da coloração vermelha dos olhos. Dada a duração do procedimento de transplante, o monitoramento regular durante as primeiras 3 horas após o transplante é fundamental. Se os critérios de avaliação não forem atendidos durante essas 3 horas, o animal é sacrificado para evitar mais sofrimento. A monitorização é continuada três vezes ao dia nos primeiros 3 dias de pós-operatório. Se o animal não se recuperar totalmente durante os primeiros 2 dias, ele é sacrificado. Dependendo de sua condição, o animal permanece em um único alojamento por 2-3 dias após a cirurgia.
As condições estéreis durante a cirurgia são outro aspecto relevante para o sucesso dos resultados. Uma rotina rigorosa de higiene é obrigatória para minimizar os riscos de infecção. Ao entrar no biotério, as mãos devem ser cuidadosamente lavadas antes de se vestirem com um macacão limpo, máscara facial, luvas e boné. Toda a área cirúrgica é desinfetada com um swab especial contendo cloreto de benzil-C12-18-alquildimetilamônio, cloreto de didecildimetilamônio e glutaraldeído. Segue-se desinfecção adicional com etanol a 70%. Antes de cada manipulação cirúrgica, as luvas são brevemente limpas com etanol 70% e a área ao redor do sítio cirúrgico é coberta com um campo estéril. Essas medidas ajudam muito a minimizar os riscos de infecção.
Uma questão com o sucesso da progênie é a dificuldade em monitorar a gravidez real. O aumento do peso corporal pode ser indicativo de gravidez, mas também pode ser devido ao infanticídio e geralmente não reflete de forma confiável o estado da mulher. Por exemplo, apenas mudanças modestas de peso em geral foram aparentes para o grupo 1 durante o monitoramento. Os animais 3 e 4 apresentaram aumentos de peso semelhantes ao longo dos dois ciclos de acasalamento, porém apenas o animal 4 estava prenhe à relaparotomia (Figura 3 e Figura 4). Além disso, a perda de peso após o primeiro ciclo de acasalamento com parto ausente pode indicar para a absorção da gravidez. Embora ainda não esteja claro por que a absorção tecidual resulta em perda de peso, esse fenômeno tem sido repetidamente observado em receptores de UTx deratos12. A formação de tampão vaginal após o acasalamento bem-sucedido (Figura 11) também esteve frequentemente ausente e não mostrou correlação com alterações posteriores do peso corporal. Dado o pouco valor na marcação da prenhez, a frequência de monitoramento do peso corporal foi reduzida para o grupo 2 para minimizar a exposição ao estresse dos animais. Outra consequência da presença inconsistente de plug e mudanças de peso foi uma definição não confiável do tempo de concepção. As datas de vencimento dos nascimentos foram, portanto, calculadas usando o2º dia pós-exposição masculina como o dia da concepção. Curiosamente, as mudanças de peso corporal no grupo 2 correlacionaram-se relativamente bem com o curso da gravidez, com o parto sendo marcado por uma clara queda de peso (Figura 6).
A comparação das alterações de peso corporal (Figura 6) dos animais 1, 2 e 3 (prenhes) com os animais 5 e 6 (nunca prenhes) ilustra bem os efeitos da prenhez e do nascimento vivo versus o acasalamento malsucedido. A razão por trás do comportamento diferente do peso corporal no grupo 2 em comparação com o grupo 1 permanece obscura. No entanto, as alterações de peso podem ser mais confiáveis simplesmente devido ao maior número de gestações a termo no grupo 2. A baixa taxa de gravidez no grupo 1 possivelmente pode estar relacionada à estenose vaginal, que foi super-representada em relação ao grupo 2 (Tabela 3) e é uma causa de concepção dificultada. A incidência estenótica reduzida no grupo 2 pode ser devida ao uso de suturas inabsorvíveis em vez de absorvíveis para anastomose vaginal, provavelmente juntamente com a melhora da manipulação cirúrgica durante a dissecção vaginal neste grupo.
Diferentemente da abordagemsueca10,12, o protocolo aqui descrito utiliza a solução IGL-1 (Institute Georges Lopez) para armazenamento do enxerto ao invés de Ringer ou outras soluções. Embora o impacto exato da solução de IGL-1 nos resultados de UTx seja desconhecido, vários relatos sugerem benefícios globais no transplante experimental para essa solução22,23,24,25. Por fim, algumas etapas do protocolo geralmente realizadas para o UTx12 não afetaram os resultados se ignoradas. Estes incluem o clipping no corno uterino esquerdo ou direito e a substituição pós-operatória de heparina, que os autores consideram opcional.
Uma limitação inerente à Tux experimental também é válida para o protocolo apresentado. O procedimento é demorado, e a recuperação de órgãos seguida de transplante pode levar até 6 horas. Portanto, o UTx do rato requer foco total por várias horas, a fim de executar cada etapa sem falhas. Este último continua a ser o aspecto mais importante do sucesso. Tal atenção pode ser realizada desde que as habilidades microcirúrgicas estejam plenamente desenvolvidas e praticadas continuamente. Da mesma forma, paciência e resistência são características fundamentais para evitar erros durante todo o procedimento. Outra consequência do longo procedimento é que apenas um animal pode ser operado por dia. O planejamento cuidadoso e o foco em questões-chave ajudam a desenvolver um projeto de pesquisa produtivo. Em geral, recomenda-se alcançar uma sobrevida do enxerto acima de 70% antes de se comprometer com a série experimental real para garantir que os achados sejam suficientemente robustos. Finalmente, pode-se querer reconsiderar o nascimento vivo como um desfecho. A alta incidência de estenose vaginal e reabsorção gestacional12 aumenta acentuadamente o número de UTxs necessárias para a obtenção de resultados significativos. Na pendência da questão experimental, outros desfechos, como a sobrevida do enxerto, podem ser mais efetivos.
Apesar de sua crescente aplicação, o UTx continua sendo uma aplicação experimental também na clínica. Além da necessidade de melhores abordagens cirúrgicas e estratégias imunossupressoras, o uso de enxertos de doadores falecidos, em particular, é uma área que requer pesquisas adicionais. Estratégias para mitigar a lesão isquêmica não estão estabelecidas, mas seriam muito bem-vindas para a expansão de potenciais pools de doadores. De fato, o impacto da isquemia sobre os úteros é pouco investigado, com o conhecimento aplicado baseado em achados de outros órgãos26,27. A UTx em ratos oferece um meio de explorar a lesão isquêmica em ambientes controlados, utilizando abordagens adaptadas à clínica28,29. Vale ressaltar que a doação em vida está associada a certos riscos; Os doadores apresentam alto índice de complicações cirúrgicas, como trauma urinário e intestinal. Nesse sentido, cresce a demanda por doações de mortos e suas pesquisas 5,30.
Existem muitas perguntas adicionais onde o UTx do rato poderia ser informativo. Por exemplo, o sistema de ratos oferece a oportunidade de identificar e/ou validar marcadores biológicos que poderiam ser usados para monitorar de forma não invasiva o curso de transplantes de útero na clínica. Desenvolvimentos societais recentes podem criar novas questões em que o modelo de rato pode ser útil. A tx está sendo defendida também para indivíduos transgêneros, com a anatomia masculina pedindo abordagens cirúrgicas adaptadas31.
Em conclusão, um novo protocolo de UTx de ratos baseado no trabalho existente com roedores e modificado pela experiência prática é apresentado. O protocolo modificado tem uma alta probabilidade de UTx de ratos resultando em nascidos vivos - fornecido habilidades microcirúrgicas suficientes e prática. A Tx é talvez o mais complexo dos principais procedimentos de transplante. As instruções descritas devem se somar a um protocolo comum, que atualmente está faltando, mas é necessário para estabelecer o procedimento exigente de UTx de ratos dentro da comunidade de pesquisa.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pela Swiss National Science Foundation (bolsa de projeto nº 310030_192736). Gostaríamos de agradecer à Dra. Frauke Seehusen do Instituto de Patologia Veterinária da Universidade de Zurique por seu apoio histopatológico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angled to Side Scissor 5 mm | F.S.T | 15008-08 | |
| Big Paper Clip | No specific | Used as retractor | |
| Blunt Bend Needle G30 | Unimed S.A. | ||
| Bupivacain 0.5% | Sintetica | ||
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Temgesic | ||
| Dosiernadel G25 | H.SIGRIST& PARTNER AG | ||
| Dumont #5SF Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Ethilon 10/0 | Ethicon | 2810G | |
| Ethilon 6/0 | Ethicon | 667H | |
| Ethilon 7/0 | Ethicon | EH7446H | |
| Ethilon 8/0 | Ethicon | 2808G | |
| Femal Brown Norway Rats (150-170 g) | Janvier | ||
| Femal Lewis Rats (150-170 g) | Charles River Deutschland | ||
| Fine Scissors - Sharp | F.S.T | 14060-09 | Any other small scissor works too |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | Any other small needholder works too |
| Heparin Natrium 25000 I.E./ 5 mL | B. Braun | ||
| Institute Georges Lopez Perfusion Solution (IGL) | Institute Georges Lopez | Organ preservation solution | |
| Male Lewis Rats (300-320 g) | Charles River Deutschland | ||
| Micro Serrefines 13 mm | F.S.T | 18055-04 | |
| Micro Serrefines 16 mm gebogen | F.S.T | 18055-06 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | |
| Mölnlyncke Op Towel | Mölnlyncke | 800300 | Sterile drape |
| NaCl 0.9% | B.Braun | ||
| Octenisept | Schülke | ||
| Paper Tape | Tesa | For fixing the animal | |
| Philips Avent Schneller Flaschenwärmer SCF358/02 | Philips | 12824216 | |
| Ringerfundin | B.Braun | ||
| Rompun 2% | Bayer | Xylazine | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 45° | F.S.T | 00276-13 | |
| Sacryl Naht | KRUUSE | 152575 | |
| Scapel No 10 | Swann Morton | 201 | |
| Small Histo-Container | Any small histo-container works fine-for coldstorage of the graft | ||
| Small Plastik Bags | Any transparant plastic bags are fine | ||
| Steril Cotton swab | Lohmann-Rauscher | Any steril cotton swab is fine | |
| Sterile Gauze | Lohmann-Rauscher | Any steril gauze is fine | |
| Straight Scissor 8mm | F.S.T | 15024-10 | |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | OLY-SZX9-B | |
| Sutter Non Stick GLISS 0.4 mm | Sutter | 78 01 69 SLS | |
| Suture Tying Forceps | F.S.T | 00272-13 | |
| ThermoLux warming mat | ThermoLux | ||
| Tissue Forceps for Skin | Any tissue forceps are fine | ||
| Vesseldilatator Forceps | F.S.T | 00125-11 | |
| Vicryl plus 4/0 | Ethicon | VCP292H |
References
- Richards, E. G., et al. Uterus transplantation: state of the art in 2021. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2251-2259 (2021).
- Jones, B. P., et al. Options for acquiring motherhood in absolute uterine factor infertility; adoption, surrogacy and uterine transplantation. The Obstetrician & Gynaecologist. 23 (2), 138-147 (2021).
- Brannstrom, M., et al. The first clinical trial of uterus transplantation: surgical technique and outcome. American Journal of Transplantation. 14, 44 (2014).
- Ejzenberg, D., et al. Livebirth after uterus transplantation from a deceased donor in a recipient with uterine infertility. Lancet. 392 (10165), 2697-2704 (2018).
- Lavoue, V., et al. Which donor for uterus transplants: brain-dead donor or living donor? A systematic review. Transplantation. 101 (2), 267-273 (2017).
- O'Donovan, L., Williams, N. J., Wilkinson, S. Ethical and policy issues raised by uterus transplants. British Medical Bulletin. 131 (1), 19-28 (2019).
- Kisu, I., et al. Long-term outcome and rejection after allogeneic uterus transplantation in cynomolgus macaques. Journal of Clinical Medicine. 8 (10), 1572 (2019).
- Ozkan, O., et al. Uterus transplantation: From animal models through the first heart beating pregnancy to the first human live birth. Womens Health. 12 (4), 442-449 (2016).
- Favre-Inhofer, A., et al. Involving animal models in uterine transplantation. Frontiers in Surgery. 9, 830826 (2022).
- El-Akouri, R. R., Wranning, C. A., Molne, J., Kurlberg, G., Brannstrom, M. Pregnancy in transplanted mouse uterus after long-term cold ischaemic preservation. Human Reproduction. 18 (10), 2024-2030 (2003).
- Sahin, S., Selcuk, S., Eroglu, M., Karateke, A. Uterus transplantation: Experimental animal models and recent experience in humans. Turkish Journal of Obstetrics and Gynecology. 12 (1), 38-42 (2015).
- Wranning, C. A., Akhi, S. N., Diaz-Garcia, C., Brannstrom, M. Pregnancy after syngeneic uterus transplantation and spontaneous mating in the rat. Human Reproduction. 26 (3), 553-558 (2011).
- Wranning, C. A., Akhi, S. N., Kurlberg, G., Brannstrom, M. Uterus transplantation in the rat: Model development, surgical learning and morphological evaluation of healing. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 87 (11), 1239-1247 (2008).
- Brannstrom, M., Wranning, C. A., Altchek, A.
- Diaz-Garcia, C., Akhi, S. N., Wallin, A., Pellicer, A., Brannstrom, M. First report on fertility after allogeneic uterus transplantation. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 89 (11), 1491-1494 (2010).
- R, E., Brown, M. J., Karas, A. Z. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2nd edn. , Elsevier. (2008).
- Donovan, J., Brown, P.
- Rutledge, C., Raper, D. M. S., Abla, A. A. How I do it: superficial temporal artery-middle cerebral artery bypass for flow augmentation and replacement. Acta Neurochirurgica. 162 (8), 1847-1851 (2020).
- Kuo, S. C. -H., et al. The multiple-U technique: a novel microvascular anastomosis technique that guarantees everted anastomosis sites with solid intima-to-intima contact. Plastic and Reconstructive Surgery. 149 (5), 981 (2022).
- Magee, D. J., Manske, R. C. Pathology and Intervention in Musculoskeletal Rehabilitation. 2nd edn. , Elsevier. 25-62 (2016).
- Diaz-Garcia, C., Johannesson, L., Shao, R. J., Bilig, H., Brannstrom, M. Pregnancy after allogeneic uterus transplantation in the rat: perinatal outcome and growth trajectory. Fertility and Sterility. 102 (6), 1545-1552 (2014).
- Canovai, E., et al. IGL-1 as a preservation solution in intestinal transplantation: a multicenter experience. Transplant International. 33 (8), 963-965 (2020).
- Habran, M., De Beule, J., Jochmans, I. IGL-1 preservation solution in kidney and pancreas transplantation: A systematic review. PLoS One. 15 (4), 0231019 (2020).
- Mosbah, I. B., et al. IGL-1 solution reduces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in rat liver transplantation. Cell Death & Disease. 3 (3), 279 (2012).
- Wiederkehr, J. C., et al. Use of IGL-1 preservation solution in liver transplantation. Transplantation Proceedings. 46 (6), 1809-1811 (2014).
- Tilney, N. L., Guttmann, R. D. Effects of initial ischemia/reperfusion injury on the transplanted kidney. Transplantation. 64 (7), 945-947 (1997).
- de Rougemont, O., Dutkowski, P., Clavien, P. A. Biological modulation of liver ischemia-reperfusion injury. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (2), 183-189 (2010).
- Jakubauskiene, L., et al. Relaxin and erythropoietin significantly reduce uterine tissue damage during experimental ischemia-reperfusion injury. International Journal of Molecular Sciences. 23 (13), 7120 (2022).
- Wang, Y., Wu, Y., Peng, S. Resveratrol inhibits the inflammatory response and oxidative stress induced by uterine ischemia reperfusion injury by activating PI3K-AKT pathway. PLoS One. 17 (6), 0266961 (2022).
- Kisu, I., et al. Risks for donors in uterus transplantation. Reproductive Sciences. 20 (12), 1406-1415 (2013).
- Jones, B. P., et al.
