Summary
Detta protokoll beskriver alla viktiga steg för framgångsrik livmodertransplantation (UTx) hos råttor. Råttmodellen har visat sig lämplig för att främja den kliniska implementeringen av UTx; råtta UTx är dock en mycket komplex procedur som kräver noggranna instruktioner.
Abstract
Livmodertransplantation (UTx) är ett nytt tillvägagångssätt för behandling av kvinnor med absolut livmoderfaktorinfertilitet (AUFI). Uppskattningsvis 3% -5% av kvinnorna lider av AUFI. Dessa kvinnor berövades möjligheten att få barn fram till tillkomsten av UTx. Den kliniska tillämpningen av UTx drevs av experimentella studier på djur, och den första framgångsrika UTx uppnåddes på råtta. Med tanke på deras fysiologiska, immunologiska, genetiska och reproduktiva egenskaper är råttor ett lämpligt modellsystem för sådana transplantationer. I synnerhet är deras korta graviditetsperiod en klar fördel, eftersom det vanliga slutmåttet för experimentell UTx är framgångsrik graviditet med levande födelse. Den största utmaningen för råttmodeller är fortfarande den lilla anatomin, som kräver avancerade mikrokirurgiska färdigheter och erfarenhet. Även om UTx har lett till graviditet på kliniken är proceduren inte etablerad och kräver kontinuerlig experimentell optimering. Här presenteras ett detaljerat protokoll, inklusive nödvändig felsökning för råtta UTx, vilket förväntas göra hela proceduren lättare att förstå för dem utan erfarenhet av denna typ av mikrokirurgi.
Introduction
Livmodertransplantation (UTx) är en ny behandling för absolut livmoderfaktorinfertilitet (AUFI). AUFI är resultatet av frånvaro (medfödd eller förvärvad) eller missbildning av livmodern och drabbar 3% -5% av kvinnorna över hela världen1. Etiska, juridiska eller religiösa skäl utesluter adoption eller surrogatmödraskap för många kvinnor som har en önskan om moderskap men lider av AUFI2. För dessa kvinnor är UTx fortfarande det enda alternativet att starta sin egen familj. UTx har tillämpats i kliniken, om än med blandad framgång; Förfarandet är tekniskt utmanande och kräver stadig förbättring för sin kliniska etablering.
År 2014 utfördes den första transplantationen av en livmoder från en levande donator (LD) - vilket resulterade i framgångsrik graviditet - av den banbrytande svenska gruppen Brännström3. Den första födelsen efter UTx från en avliden donator (DD) rapporterades 2016 i Brasilien4. År 2021 har mer än 80 UTxs utförts över hela världen, dock med en framgångsgrad på cirka 50% och med transplantat som kommer från LD för majoriteten1.
Även om det inte är livräddande, är UTx ett alltmer populärt förfarande för att uppfylla önskningarna om egen avkomma. Som sådan ökar efterfrågan på transplantat, vilket placerar DD-donation i ett framtida fokus. DD-donation är dock komplicerad på grund av betydligt längre kall (och vid hjärtdöd, även varm) ischemisk exponering, vilket ökar risken för transplantatdysfunktion och avstötning 5,6. Kirurgisk teknik, krävande kompatibilitetsmatchning och tillhörande immunsuppression är fortfarande kritiska frågor när det gäller UTx-resultat7.
För att hantera ovanstående risker i kliniken behövs lämpliga djurmodeller för utforskning av ischemi och immunsuppression. Det mest kliniskt relevanta effektmåttet för djurmodeller är fortfarande framgångsrik födelse; hittills har graviditeter efter experimentell UTx uppnåtts hos möss, råttor, får, kaniner och cynomolgusapor8. Medan större djur är förutbestämda för att förvärva och optimera kirurgiska tekniker, kommer gnagare med den tydliga fördelen med korta graviditetsperioder. Därför är gnagarmodeller överlägsna när det gäller praktiska, ekonomiska och etiska överväganden9. Den största utmaningen med UTx hos möss är dock den lilla anatomin, med den mycket krävande operationen knuten till den låga reproducerbarheten av murin UTx10. Däremot är råttor kirurgiskt mer tillgängliga och behåller fördelarna med korta graviditetstider. Som sådan har råttan blivit den valda modellen för UTx9. Wranning et al. introducerade råttmodellen av ortotopisk UTx 2008, och med hjälp av denna modell har den första levande födelsen efter UTx och naturlig parning rapporterats11,12,13. Efterföljande studier har haft kritiska bidrag till implementeringen av UTx hos människor9.
Ändå är UTx fortfarande utmanande hos råttor, och endast ett fåtal grupper har ännu behärskat denna kirurgiska teknik. Ett relevant hinder för spridningen av råtta UTx bland forskare är bristen på en exakt beskrivning av de enskilda mikrokirurgiska stegen, fallgroparna och de relevanta åtgärderna för felsökning14. Detta protokoll syftar till att ge en detaljerad guide för detta mycket komplexa mikrokirurgiska ingrepp för att underlätta implementeringen av denna djurmodell i framtida forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt schweiziska federala djurförordningar och godkändes av veterinärkontoret i Zürich (nr 225/2019), vilket garanterar mänsklig vård. Honråttor av jungfrulig Lewis (kroppsvikt 170-200 g) och honråttor av jungfrulig brunnorsk råtta (170-200 g) användes som livmoderdonatorer/-mottagare, medan hanråttor av Lewis-råttor (300-320 g) användes för parning. Råttorna var i åldrarna 12-15 månader. Djuren erhölls från kommersiella källor (se materialförteckning) och hölls under kontrollerade förhållanden och en berikad miljö med fri tillgång till vatten och standardfoder.
1. Livmoderhämtning
OBS: För detaljer om förfarandet, se de tidigare publicerade rapporterna12,13,15.
- Inducera anestesi med isofluran och syre i en sluten plexiglasbehållare (14 cm x 25 cm x 13 cm) i 1-2 min (5 vol% isofluran i O2).
- Administrera buprenorfin subkutant (0,05 mg/kg) och bupivakain (0,5 %, 8 mg/kg) subkutant i området kring det planerade buksnittet 30 minuter före operation.
- Raka hela råttans bukhud med en elektrisk rakapparat.
- Använd tejp för att hålla djuret fixerat på en värmeplatta under operationen. Applicera ögonsalva på båda ögonen.
- Behåll anestesi under proceduren med 2-4 vol% isofluran i syre genom kontinuerlig administrering genom en liten näskon.
- Övervaka anestesidjupet med kliniska parametrar utan specialverktyg (andningsfrekvens på ~ 70-120 / min - en långsam minskning på 50% är acceptabel under anestesi; kontroll av anestesidjup med tånypa; färg på slemhinnor ska vara rosa, inte blå eller grå)16 och justera isoflurankoncentrationen därefter.
OBS: Valfritt: frekvent andningsövervakning under operationen är möjlig med hjälp av en assistent. - Bekräfta bedövningsdjupet genom att utföra en tåknäpa.
- Rengör bukhuden i en cirkulär rörelse med tre alternerande vattpinnar av en antiseptisk lösning och 70% alkohol. Låt torka.
- Placera ett sterilt draperi (se materialförteckning) med ett bukfönster över djuret.
- Utför median laparotomi.
- Öppna buken via ett 6-8 cm mittlinje långt snitt, med början 0,5 cm under xiphisternum mot hypogastrium. Använd en skalpell nr 10 för hudsnittet och en liten vass sax för linea alba-snittet. Skada inte levern eller urinblåsan.
- Flytta tarmarna utanför bukhålan med bomullspinne, täck dem försiktigt med en gasväv fuktad med steril saltlösning och skydda dem med en steril plastpåse för bättre isolering.
- Sätt in upprullningsdon eller clips (se Materialförteckning) till vänster och höger bukväggsmappar för att hålla bukmuskeln åt sidan och buken öppen, för att få optimal åtkomst och synlighet av livmodern och tillhörande kärl. Fäst klämmorna/upprullningsdonen med tejp.
- Applicera förvärmd saltlösning för att hålla operationsområdet och tarmarna fuktiga och undvika torkning av inälvorna.
- Skörda det högra livmoderhornet med den gemensamma livmoderhålan och livmoderhalsen plus vaskulära pediklar, inklusive de högra livmoder-, inre och vanliga iliackärlen.
- Ligate (4/0 polyglaktin; se Materialtabell), cauterize och skär av det vänstra livmoderhornet intill förgreningen från den gemensamma livmoderhålan.
- Ta bort överflödigt fett som omger livmodern och slidan.
OBS: Håll fettet runt livmoder-kärlsystemet. - Dissekera blåsan vid dess fastsättning i livmoderhalsen med cauterization av alla dränerings- och matningsblåskärl. Under cauterization, upprätthålla ett tillräckligt avstånd mellan livmoderhalsen och slidan för att undvika onödig cauterization på dessa två strukturer. Annars ökar risken för transplantatnekros.
OBS: De flesta kirurgiska manipulationer bör påverka urinblåsan. Dra tillbaka eller dra blåsan kaudalt med en kärlklämma (se Materialförteckning) för att få en bättre bild av excavatio vesicouterina. - Cauterize och skära av de nedåtgående livmoderkärlen på urinledarens nivå så distalt mot livmoderhalsen som möjligt.
OBS: Behåll mikrocirkulationen runt slidan och livmoderhalsen så mycket som möjligt under delningen. - Separera den cervikala / vaginala delen av det framtida transplantatet från rektalfästet och paravaginala och paracervikala ligament.
OBS: Undvik cauterization på transplantatvagina. - Dissekera försiktigt slidan via diatermi runt 2-3 mm kaudal i livmoderhalsen.
OBS: Ingen villi (livmoderhalsen) är synlig inuti vaginal lumen. - Lokalisera både livmoderartären och venen vid deras ursprung. Ligate (8/0 polyamid; se Materialförteckning), cauterize och skära av glutealkärlen och alla kärl caudala i livmoderkärlen.
OBS: Direkt ligering av den gemensamma iliac vena caudal till livmodervena är vanligtvis möjlig. - Genom trubbig dissektion, befria de gemensamma iliackärlen från varandra, från bifurkationen av aorta och vena cava ner till uppdelningen av livmoderkärlen.
OBS: Man kan få bättre kirurgisk tillgång till området genom att ta bort en eller två intilliggande lymfkörtlar. - Accis det högra livmoderhornet 3 mm från äggledaren, efter cauterizing utero-ovariepedikeln på samma nivå. Detta möjliggör anastomos av transplantatets livmoderhorn till den övre delen av mottagarens livmoderhorn.
- Placera ligaturer (8/0 polyamid) direkt runt den högra gemensamma iliacartären och venen, proximalt till aorta- och kavalförgreningarna. Gör ett litet snitt (0,5-1 mm) i den högra gemensamma höftartären intill bifurkationen och sätt in en böjd, trubbig 30 G nål eller en rak, trubbig 25 G nål i lumen (för spolning). Säkra den med en ligatur (6/0 polyamid).
OBS: Ett ytterligare alternativ är ytterligare säkring med en bulldoggklämma för att undvika förskjutning av nålen och / eller kärlet. - Dissekera ligaturens gemensamma iliacvenen vid den högra gemensamma iliacvenen för att möjliggöra utflöde under spolning.
- Spola transplantatet genom att följa stegen nedan.
- Spola livmodern manuellt med 3 ml sprutor med cirka 9 ml kall Ringer-lösning (RHX: Ringer kompletterad med 50 IE/ml heparin och 0,4 mg/ml xylazin) med en flödeshastighet på 6 ml/min. Spola igen med 6 ml organkonserveringslösning kompletterad med heparin (50 IE/ml) och xylazin (0,4 mg/ml) (se materialtabell).
OBS: Undvik högt spoltryck och se till att nålen placeras korrekt. - Ta bort transplantationen när livmodervävnaden har blivit blek. Skär den gemensamma iliacartären kaudalt av ligaturen vid bifurcation av bukaortan.
- Spola livmodern manuellt med 3 ml sprutor med cirka 9 ml kall Ringer-lösning (RHX: Ringer kompletterad med 50 IE/ml heparin och 0,4 mg/ml xylazin) med en flödeshastighet på 6 ml/min. Spola igen med 6 ml organkonserveringslösning kompletterad med heparin (50 IE/ml) och xylazin (0,4 mg/ml) (se materialtabell).
- Placera transplantationen i en lösning för konservering av kylda organ (4 °C) för beredning och förvaring av bordet före transplantation.
- Efter avlägsnande av transplantatet, avliva djuret genom att först vrida isofluraninställningen till maximalt och sedan inducera bilateral pneumotorax följt av exsanguination17.
2. Syngen livmodertransplantation
OBS: För detaljer om förfarandet, se de tidigare publicerade rapporterna12,13,15.
- Inducera anestesi och förbered djuret enligt vad som nämns i steg 1.1.
- Administrera effektiv analgesi (som beskrivs i steg 1.1.1) och 200 IE/kg heparin med hög molekylvikt 30 min före operation.
- Utför median laparotomi.
- Öppna buken via ett 6-8 cm långt snitt i mittlinjen med början 0,5 cm under xiphisternum mot hypogastrium. Använd en skalpell nr 10 för hudsnittet och en liten vass sax för linea alba-snittet. Skada inte levern och urinblåsan.
- Flytta tunntarmen utanför bukhålan med bomullspinne, linda dem med en steril fuktad gasbindning och täck dem med en steril plastpåse för bättre isolering.
- Sätt in upprullningsdon eller klämmor vid vänster och höger bukväggsmappar för att hålla bukmuskeln åt sidan och buken öppen, för att få optimal åtkomst och synlighet av livmodern och tillhörande kärl. Fäst klämmorna/upprullningsdonen med tejp.
- Applicera förvärmd saltlösning för att hålla operationsområdet och tarmarna fuktiga och undvika torkning av inälvorna.
- Utför en hysterektomi med dissektion och mobilisering av den övre tredjedelen av slidan från ändtarmen och urinblåsan.
- Cauterise mikrovaskulaturen runt livmodern, livmoderhalsen och vagina. Klipp och separera livmodern från de omgivande strukturerna nära organet för att skydda mikrocirkulationen av livmodern olycksbådande.
- Ta bort fettvävnad från omgivningen.
- Amputera vänster horn genom cauterization. På höger sida, bevara ett 7-8 mm segment av livmoderns övre del för senare anastomos till livmodertransplantatet.
- Utför livmodertransplantation.
- Mobilisera och separera de rätta gemensamma iliackärlen, från livmoderkärlens ursprung upp till aorta/kavalförgreningen.
- Placera transplantatet i bukhålan. Vik transplantatet i en gasbindning blöt i kall organkonserveringslösning.
OBS: Transplantatet måste hållas kallt under anastomos. - Placera atraumatiska vaskulära klämmor på den högra gemensamma iliacvenen på varje sida, inramning av den framtida anastomosplatsen.
OBS: Sänk anestesin till 1-1,5 vol% isofluran för att anpassa sig till den plötsliga minskningen av hjärtförladdning och den resulterande hypotoni. - Skär en slits något större än öppningen av transplantatvenen i den gemensamma iliacvenen.
- Placera transplantatvenen.
- Placera en stagsutur (10/0 polyamid; se Materialförteckning) i varje hörn av slitsen på höger vanlig iliacven.
OBS: Håll suturknuten vid det kaudala hörnet lös för bättre justering och för att förhindra plånbokssträngeffekter. - Spola regelbundet anastomosområdet med kyld RHX under proceduren för att förhindra tromboser.
- Anastomos ena sidan av transplantatvenen till mottagarens ven med sex till åtta slingor av en kontinuerlig sutur (figur 1).
OBS: Börja med kranialstaget sutur (10/0 polyamid) och anastomos först den inkommande delen av kärlen. - Anastomos den andra sidan av kärlet på samma sätt, den här gången från utsidan.
- Knyt en knut vid kranialstaget sutur, och sedan en vid den kaudala vistelsesuturen (10/0 polyamid), efter avslutad anastomos på båda sidor.
OBS: Dra åt de kontinuerliga suturerna endast så mycket som behövs för att förhindra handväska-strängeffekter. - Placera atraumatiska vaskulära klämmor på den högra gemensamma iliacartären på varje sida, inramning av den framtida anastomosplatsen.
- Utför arteriell anastomos (höger gemensam iliacarteri [RCIA] via 8-10 slingor med avbrutna suturer (10/0 polyamid).
OBS: Avbrutna suturer är lättare att kontrollera än kontinuerliga suturer (valfritt med "fisk-mun"-tekniken)18. Konstant spolning av anastomosområdet med kyld RHX under proceduren hjälper till att förhindra tromboser. När du använder kontinuerliga suturer, utför detta steg analogt med venös anastomos.
- Utför transplantatreperfusion.
- När båda anastomosställena verkar uppenbara och eventuell blödning stoppas, släpp kärlklämmorna på transplantatkärlen (figur 2).
- Inspektera transplantatet för tecken på reperfusion, såsom rodnad, fyllning av venen eller pulsering i transplantatartären.
- Anslut transplantationens vaginala manschett till mottagarens vaginala valv genom att använda sex till sju intraluminala (6/0 polyglaktin) avbrutna suturer.
OBS: Börja med en enda sutur vid klockan 12 först och placera de nästa vid positionerna 10 och 1. De två suturerna vid positionerna 9 och 3 ska vara bundna efter suturerna i främre raden19,20. - Anastomos transplantatet livmoderhorn end-to-end till det återstående kraniala livmodersegmentet av mottagarens livmoder genom att använda fem till sju avbrutna suturer (7/0 polyamid).
OBS: Sy inte genom lumen.
- Stäng buken med en kontinuerlig sutur. Använd 4/0 polyglaktin för suturering av muskelskiktet och 6/0 polyamid eller kirurgiska sårklämmor för huden.
- Låt djuret återhämta sig i en uppvärmd bur när transplantationen är klar. Stanna kvar hos djuret tills det har återfått sternal liggförmåga och behåll ett enda hus tills dess fulla återhämtning. Ge behandling med psoriasisanalgesi genom subkutan administrering av buprenorfin (0,05 mg/kg) och lämpligt NSAID, dock inte före 4-8 timmar efter den första dosen anestesi. Tillhandahåll kontinuerligt med buprenorfin via dricksvatten (1 mg/kg, oralt, 5 ml buprenorfin i 160 ml dricksvatten (0,3 mg/ml)) under tre dagar efter operationen.
- Hudsuturen avlägsnas 10-14 dagar efter säkerhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultat från två grupper av råttor presenteras. UTx utfördes före (grupp 1, n = 8) och efter (grupp 2, n = 8) protokolljustering (tabell 1) för att visa effekterna av våra modifieringar (se diskussionen för en förklaring av våra ändringar)12,15,21.
Utfallet av råtta UTx är förknippat med tre nyckelfaser. Den första fasen är framgångsrik återhämtning från UTx. Vanligtvis bör mottagarna återhämta sig inom de första 2 postoperativa dagarna. Den andra fasen avser transplantatets hälsotillstånd 2 veckor efter operationen, vilket bestämmer inkluderingen i parningsprocessen (tabell 2). Den tredje fasen innebär spontan parning följt av framgångsrik födsel som bevis på fertilitet.
Alla djur från båda grupperna hade en händelselös återhämtning från operationen. Under den andra fasen exkluderades fyra djur från grupp 1 och två från grupp 2. Exkluderingen berodde på transplantattrombos och abscess (n = 4 för grupp 1, n = 2 för grupp 2) och smal/missbildad utero-livmoderanastomos (dessutom för n = 1, grupp 1) vid undersökning vid relaparotomi (tabell 2). Relaparotomi (längs ärret av den ursprungliga laparotomi) utfördes för alla kvinnor 2 veckor efter transplantation, eftersom djurens fysiska utseende hade lite värde som en indikator på transplantathälsa. Totalt sett var 2 veckors transplantatöverlevnad 50 % och 75 % för grupp 1 respektive 2 (tabell 3).
Under fas 3 matchades fyra honor från grupp 1 för parning med Lewis-hanar, cirka 9 veckor efter UTx. Två honor visade tecken på graviditet (ökad kroppsvikt, figur 3; häckningsbeteende); Ingen levande födelse observerades dock. Efter två parningscykler hos tre honor hittades ungarnas kroppsdelar (ben och vävnad) hos en honråtta (°1). Histologisk undersökning av hematoxylin- och eosinfärgade vävnadssnitt av en veterinärpatolog avslöjade att dessa ungar utvecklades fram till förlossningen (figur 4 och figur 5).
Sex honor från grupp 2 parades med Lewis-hanar (se figur 6 för förändringar i kroppsvikt). Tre av de sex råttorna (två Lewis och en Brown Norway råtta) födde ungar, medan ytterligare två visade tecken på dräktighet. Den första kullen av den kvinnliga Lewis rat # 1 bestod av två valpar (figur 7). Strax efter födseln blev Lewis -kvinnan gravid igen; dock överlevde endast två av tre valpar postnatalt (figur 8). En trolig förklaring till den enda döden är barnmord, eftersom det förekommer även med friska valpar under förhållanden med postpartumstress. På samma sätt födde den bruna norska honan (# 2) två gånger, varje gång till fyra valpar per parningscykel (figur 9). Det största kullantalet i grupp 2 levererades av en annan Lewis-hona # 3, med sju valpar efter den första parningscykeln. Alla överlevande ungar uppvisade normal utveckling (figur 10).
Sammantaget ökade anpassningen av protokollet 2 veckors transplantatöverlevnad från 50% till 75%. Fem av sex honor blev dräktiga, jämfört med två av fyra från grupp 1. På samma sätt födde tre av sex kvinnor levande valpar jämfört med noll av fyra av grupp 1-kvinnorna. Sammanfattningsvis förbättrade det anpassade protokollet både direkta kirurgiska resultat och andelen framgångsrika levande födda barn efter UTx (tabell 4 och figur 6).
Figur 1: Anastomos av transplantatet och mottagarens ven. Den högra gemensamma iliacvenen (RCIV) i transplantatet är ansluten till mottagarens RCIV via end-to-side anastomos (steg 2.4). RCIA = höger gemensam iliacartär Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Anastomos av transplantatet och mottagarartären. Den högra gemensamma iliacartären (RCIA) är ansluten till mottagarens RCIA via anastomos från sida till sida (steg 2.4). Efter öppnandet av båda kärlklämmorna (2.5) ska artären perfuseras fullständigt i frånvaro av yttre blödning. Svart pil: transplantat RCIA; röd pil: transplantat RCIV. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kroppsviktsförändringar efter parning av honor i grupp 1. Kroppsviktsövervakning av de fyra grupp 1-honorna som uppvisade ett intakt transplantat vid relaparotomi. Ett djur (°1) avlivades under kejsarsnitt för att inspektera livmodern. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Histologisk undersökning av livmodern hos grupp 1-råtta med döda valpar. Kroppsdelar av valpar hittades hos råtta ° 1. Undersökning avslöjade en vital och dilaterad livmoder, vilket tyder på att valparna utvecklades normalt men inte kunde levereras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Ungarnas kroppsdelar inuti livmodern hos grupp 1 råtta °1. Benens utvecklingsstadium överensstämde med fullgångna valpar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Kroppsviktsövervakning av de sex grupp 2-honorna som uppvisade ett intakt transplantat vid relaparotomi. Gröna stjärnor markerar enskilda födelsehändelser. Hashtag-nummer hänvisar till de enskilda kvinnorna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Den första levande födseln efter råtta UTx enligt det modifierade protokollet. Två nyfödda råttor och deras mamma (huvudet till höger; Lewis kvinna #1, grupp 2). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Den andra kullen efter den andra parningscykeln efter råtta UTx enligt det ändrade protokollet. Kvinna #1 (grupp 2) födde tre valpar, varav två överlevde. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Den första kullen med brunnorsk råtta efter UTx enligt det ändrade protokollet. Efter den första parningscykeln födde den bruna norska råttan (#2, grupp 2) fyra valpar, följt av ytterligare fyra efter den andra parningscykeln. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Utveckling av valpar. Alla överlevande ungar uppvisade normal utveckling vid 3 veckors ålder. Ett representativt exempel visas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Vaginal pluggbildning efter lyckad parning. Vita pluggar bör bildas för att täcka slidan efter befruktning för att förhindra ytterligare parning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Grupp 1 | Grupp 2 | Syngen UTx hos råtta | Allogen UTx hos råtta | |
| Före ändring | Efter ändring | Se ref. 12 | Se ref. 15 | |
| Totalt antal djur | 8 | 8 | 27 | 14 |
| Två veckors transplantatöverlevnad | 4/8 (50%) | 6/8 (75%) | 19/27 (70%) | 9/14 (64%) |
| Antal parade honor | 4/4 (100%) | 6/6 (100%) | 17/19 (89%) | 9/9 (100%) |
| Fullgången graviditet | 1/4 (25%) | 5/6 (83%) | 11/17(65%) | 5/9 (56%) |
| Framgångsrikt levererat skräp | 0 | 5A/TD> | 1 | 5 |
| Totalt antal levande ungar | 0 | 20b | 3c | 25d |
| Graviditet till sikt w / o levande födelse | 1 | 1e | 10 | 2 |
Tabell 1: Utfallsjämförelse av det modifierade och omodifierade protokollet för råtta UTx. a: Två graviditeter av samma råtta; b: Inklusive barnamordsvalpen; c: Median; d: Summan av medianen/leveransen. e: Döda ungar i resorptionsstadiet efter tre parningscykler.
| Kirurgiska inställningar | Grupp 1 (n = 8) | Grupp 2 (n = 8) |
| Projektfas | Inledande skede | sent skede |
| Kall lagringstid | 2-3 timmar | 2-3 timmar |
| Spollösning under anastomos | RH | RHX |
| Vaginal anastomos | 6/0 Ethilon | 6/0 Vicryl |
| Uterus horn anastomos | delvis kontinuerlig sutur | avbruten sutur |
| Artär anastomos | kontinuerlig sutur | Avbruten och kontinuerlig |
| Mikrovaskularisering runt vagina och livmoderhals | cauterization nära vaginal / cervikal vävnad | cauterization mer distalt |
Tabell 2: Kirurgiska inställningar grupp 1 kontra grupp 2.
| Exklusions kriterier# |
| Tecken på trombos (särskilt runt anastomoser) |
| Större vidhäftning |
| Förträngd livmoder |
| Tecken på infektion |
| Transplantatnekros |
Tabell 3: Exklusionskriterier för parning. #Applied vid relaparotomi 2 veckor efter UTx.
| n (grupp 1) | N (grupp 2) | |
| Djur | 8 | 8 |
| Friskt transplantat efter 2 veckor | 4 | 6 |
| Parad | 4 | 6 |
| Fullgången graviditet | 1 | 5 |
| Framgångsrikt levererat skräp | 0 | 5en |
| Totalt antal levande ungar | 0 | 20b |
| Graviditet till sikt, inte levande födelse | 1 | 0 |
Tabell 4: Resultat av grupp 1 kontra grupp 2. a: Två på varandra följande graviditeter hos samma råtta; b: Inklusive valpen som dödats av barnamord.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras här erbjuder detaljerade instruktioner för det kirurgiska tillvägagångssättet bakom livmodertransplantation hos råttor. Protokollet har optimerats för att öka oddsen för levande födda efter UTx och efterföljande parning. Det ursprungliga protokollet har tagits över från Brännströmgruppen 12,13, inspirerat av Akouri et al.10s musarbete, och modifierats utifrån författarnas erfarenheter under de senaste åren. Som sådan drevs modifieringarna av sanna inlärningskurvor som återspeglar utvecklingen från misslyckade transplantationer till reproducerbara resultat.
Viktiga modifieringar som sannolikt är avgörande var: (1) tillsats av xylazin till spollösningen under organhämtning och anastomos, vilket stimulerade vasodilatation vilket ledde till minskade trombotiska risker. (2) Användning av avbrutna suturer för arteriell end-to-side anastomos. Avbrutna suturer ökar inte bara kirurgisk kontroll över patency och undviker handväska-strängeffekter, men möjliggör också efterföljande utvidgning av det anastomotiska området för att öka blodflödet genom arterien livmoder. (3) Applicering av avbrutna och icke-absorberbara suturer för livmoderhornanastomos med sömnad endast inom perimetriumskiktet; Denna modifiering förhindrar förträngning av livmoderväggen, vilket kan hindra senare befruktning. (4) Användning av absorberbart suturmaterial för vaginal anastomos minskar risken för vaginal stenos och ökar därmed risken för levande födda. (5) Att utföra kirurgisk manipulation så långt bort från slidan och livmoderhalsen som möjligt är ett avgörande steg för att undvika vaginal ärrbildning och för att öka risken för levande födda. (6) Den direkta ligeringen av den högra gemensamma iliacvenen och artären istället för att ligera vena cava, bukaorta och vänster gemensam iliacvenartär. Direkt ligering caudal till livmodervena är i de flesta fall genomförbar; Den direkta ligeringen förenklar organanskaffning och förkortar kirurgiska tider utan att påverka transplantationsresultaten negativt. (7) Att sänka isoflurankoncentrationen till 1%-1,5 vol% direkt efter fastspänning av den gemensamma iliac vena (steg 2.4.3) är också avgörande, eftersom hjärtdöd annars kan inträffa.
Ovanstående punkter är de viktigaste delarna som skiljer det nuvarande protokollet från det kanske mest använda tillvägagångssättet som beskrivs av den svenska gruppen10,12,13. Dessa mått gynnade det slutliga effektmåttet UTx, levande födelse, vilket framgår av gruppjämförelsen (ursprungligt kontra modifierat protokoll; se tabell 1). Det är uppenbart att den kirurgiska inlärningskurvan över tid också har bidragit till bättre resultat; Dess bidrag är dock svårt att uppskatta.
Förutom en noggrann kirurgisk teknik är postoperativ mottagarvård också avgörande för slutresultatet. Postoperativa behandlingar följer respektive lokala protokoll; Instruktionerna här rekommenderar 0,05 mg/kg buprenorfin efter att mottagaren vaknat upp från anestesi, och under den första postoperativa dagen om man uppvisar smärta enligt definitionen i vår poängbedömning. Poängkriterierna baseras på beteende (aktivitet, andning, päls, hållning, sår) och kroppsvikt. Omedelbart efter operationen är positiva tecken på återhämtning en återkomst av rosa färgning av extremiteterna och öronen, liksom en återkomst av röd färgning av ögonen. Med tanke på transplantationsprocedurens längd är regelbunden övervakning under de första 3 timmarna efter transplantation kritisk. Om bedömningskriterierna inte uppfylls under dessa 3 timmar avlivas djuret för att undvika ytterligare lidande. Övervakningen fortsätter tre gånger om dagen under de första 3 postoperativa dagarna. Om djuret inte återhämtar sig helt under de första 2 dagarna avlivas det. Beroende på dess tillstånd förblir djuret i ett enda hus i 2-3 dagar efter operationen.
Sterila tillstånd under operationen är ännu en aspekt som är relevant för framgångsrika resultat. En strikt hygienrutin är obligatorisk för att minimera infektionsriskerna. När du går in i djuranläggningen måste händerna tvättas noggrant innan du klär dig i en ren overall, en ansiktsmask, handskar och en keps. Hela operationsområdet desinficeras med en speciell vattpinne innehållande bensyl-C12-18-alkyldimetylammoniumklorid, didecyldimetylammoniumklorid och glutaraldehyd. Ytterligare desinfektion med 70% etanol följer. Före varje kirurgisk manipulation rengörs handskarna kort med 70% etanol, och området kring operationsområdet är täckt med ett sterilt draperi. Dessa åtgärder bidrar i hög grad till att minimera infektionsriskerna.
Ett problem med avkommans framgång är svårigheten att övervaka faktisk graviditet. Kroppsviktsökningar kan vara en indikation på graviditet, men kan också bero på barnmord och återspeglar i allmänhet inte på ett tillförlitligt sätt kvinnans tillstånd. Till exempel var endast blygsamma viktförändringar totalt sett uppenbara för grupp 1 under övervakningen. Djur 3 och 4 uppvisade liknande viktökningar under de två parningscyklerna, men endast djur 4 var dräktigt vid relaparotomi (figur 3 och figur 4). Dessutom kan viktminskning efter den första parningscykeln med frånvarande födsel peka på graviditetsabsorption. Även om det fortfarande är oklart varför vävnadsabsorption resulterar i viktminskning, har detta fenomen upprepade gånger observerats hos råtta UTx-mottagare12. Vaginal pluggbildning efter framgångsrik parning (figur 11) var också ofta frånvarande och visade ingen korrelation med senare kroppsviktsförändringar. Med tanke på det lilla värdet i att markera graviditet reducerades kroppsviktövervakningsfrekvensen för grupp 2 för att minimera exponeringen för djurstress. En ytterligare konsekvens av inkonsekvent pluggnärvaro och viktförändringar var en opålitlig definition av befruktningstiden. Förlossningsdatum har således beräknats med hjälp av den 2:a dagen efter manlig exponering som befruktningsdag. Intressant nog korrelerade kroppsviktförändringar i grupp 2 relativt bra med graviditeten, med leverans markerad av en tydlig viktminskning (figur 6).
Att jämföra kroppsviktsförändringar (figur 6) hos djur 1, 2 och 3 (gravida) med djur 5 och 6 (aldrig dräktiga) illustrerar fint effekterna av graviditet och levande födelse kontra misslyckad parning. Orsaken bakom det annorlunda kroppsviktsbeteendet i grupp 2 jämfört med grupp 1 är fortfarande oklart. Viktförändringar kan dock vara mer tillförlitliga helt enkelt på grund av det högre antalet fullgångna graviditeter i grupp 2. Den låga graviditetsfrekvensen i grupp 1 kan möjligen relatera till vaginal stenos, som var överrepresenterad i förhållande till grupp 2 (tabell 3) och är en orsak till hämmad befruktning. Den minskade stenotiska incidensen i grupp 2 kan bero på användning av icke-absorberbara istället för absorberbara suturer för vaginal anastomos, sannolikt tillsammans med förbättrad kirurgisk manipulation under vaginal dissektion i denna grupp.
Till skillnad från det svenska tillvägagångssättet10,12 använder protokollet som beskrivs här IGL-1 (Institute Georges Lopez) lösning för transplantatlagring istället för Ringer eller andra lösningar. Medan den exakta effekten av IGL-1-lösningen på UTx-resultaten är okänd, tyder olika rapporter på övergripande fördelar vid experimentell transplantation för denna lösning22,23,24,25. Slutligen påverkade några protokollsteg som vanligtvis utfördes för UTx12 inte resultaten om de hoppades över. Dessa inkluderar klippning vid vänster eller höger livmoderhorn och postoperativ heparinsubstitution, som författarna anser vara valfria.
En begränsning som är inneboende i experimentell UTx är också giltig för det presenterade protokollet. Förfarandet är tidskrävande och organhämtning följt av transplantation kan ta upp till 6 timmar. Därför kräver råtta UTx fullt fokus i flera timmar för att utföra varje steg felfritt. Det senare är fortfarande den viktigaste aspekten av framgång. Sådan uppmärksamhet kan uppnås förutsatt att de mikrokirurgiska färdigheterna är fullt utvecklade och kontinuerligt praktiserade. På samma sätt är tålamod och uthållighet viktiga egenskaper för att undvika misstag under hela proceduren. En annan konsekvens av det utdragna förfarandet är att endast ett djur kan opereras per dag. Noggrann planering och fokus på nyckelfrågor bidrar till att utveckla en produktiv forskningsdesign. I allmänhet rekommenderas det att uppnå en transplantatöverlevnad över 70% innan man förbinder sig till den faktiska experimentella serien för att säkerställa att resultaten kommer att vara tillräckligt robusta. Slutligen kanske man vill ompröva levande födelse som slutpunkt. Den höga förekomsten av vaginal stenos och graviditetsresorption12 ökar markant antalet UTxs som krävs för att uppnå meningsfulla resultat. I väntan på den experimentella frågan kan andra slutpunkter, såsom transplantatöverlevnad, vara effektivare.
Trots sin ökande tillämpning förblir UTx en experimentell tillämpning även i kliniken. Förutom behovet av förbättrade kirurgiska metoder och immunsuppressiva strategier är användningen av transplantat från avlidna donatorer i synnerhet ett område som kräver ytterligare forskning. Strategier för att mildra ischemisk skada är inte fastställda, men skulle vara mycket välkomna för utvidgningen av potentiella givarpooler. Faktum är att ischemins inverkan på livmodern är dåligt undersökt, med tillämpad kunskap som bygger på fynd från andra organ26,27. Rat UTx erbjuder ett sätt att utforska ischemisk skada i kontrollerade miljöer samtidigt som man använder metoder skräddarsydda för kliniken28,29. Observera att levande donation är förknippad med vissa risker; Donatorer har en hög grad av kirurgiska komplikationer, såsom urinvägs- och tarmtrauma. Följaktligenväxer efterfrågan på döda donationer och dess forskning 5,30.
Många ytterligare frågor finns där råtta UTx kan vara informativ. Till exempel erbjuder råttsystemet möjligheten att identifiera och / eller validera biologiska markörer som kan användas för att icke-invasivt övervaka förloppet av livmodertransplantationer i kliniken. Den senaste tidens samhällsutveckling kan skapa nya frågor där råttmodellen kan vara till nytta. UTx förespråkas nu även för transpersoner, med den manliga anatomin som ber om anpassade kirurgiska tillvägagångssätt31.
Sammanfattningsvis presenteras ett nytt protokoll av råtta UTx baserat på befintligt gnagararbete och modifierat av praktisk erfarenhet. Det modifierade protokollet har en hög sannolikhet för råtta UTx resulterar i levande födda födda förutsatt tillräckliga mikrokirurgiska färdigheter och praxis. UTx är kanske den mest komplexa av de stora transplantationsprocedurerna. De beskrivna instruktionerna ska komplettera ett gemensamt protokoll, vilket för närvarande saknas men som behövs för att fastställa den krävande proceduren för råtta UTx inom forskarsamhället.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Swiss National Science Foundation (projektbidrag nr 310030_192736). Vi vill tacka Dr. Frauke Seehusen från Institutet för veterinärmedicinsk patologi vid universitetet i Zürich för hennes histopatologiska stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angled to Side Scissor 5 mm | F.S.T | 15008-08 | |
| Big Paper Clip | No specific | Used as retractor | |
| Blunt Bend Needle G30 | Unimed S.A. | ||
| Bupivacain 0.5% | Sintetica | ||
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Temgesic | ||
| Dosiernadel G25 | H.SIGRIST& PARTNER AG | ||
| Dumont #5SF Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Ethilon 10/0 | Ethicon | 2810G | |
| Ethilon 6/0 | Ethicon | 667H | |
| Ethilon 7/0 | Ethicon | EH7446H | |
| Ethilon 8/0 | Ethicon | 2808G | |
| Femal Brown Norway Rats (150-170 g) | Janvier | ||
| Femal Lewis Rats (150-170 g) | Charles River Deutschland | ||
| Fine Scissors - Sharp | F.S.T | 14060-09 | Any other small scissor works too |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | Any other small needholder works too |
| Heparin Natrium 25000 I.E./ 5 mL | B. Braun | ||
| Institute Georges Lopez Perfusion Solution (IGL) | Institute Georges Lopez | Organ preservation solution | |
| Male Lewis Rats (300-320 g) | Charles River Deutschland | ||
| Micro Serrefines 13 mm | F.S.T | 18055-04 | |
| Micro Serrefines 16 mm gebogen | F.S.T | 18055-06 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | |
| Mölnlyncke Op Towel | Mölnlyncke | 800300 | Sterile drape |
| NaCl 0.9% | B.Braun | ||
| Octenisept | Schülke | ||
| Paper Tape | Tesa | For fixing the animal | |
| Philips Avent Schneller Flaschenwärmer SCF358/02 | Philips | 12824216 | |
| Ringerfundin | B.Braun | ||
| Rompun 2% | Bayer | Xylazine | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 45° | F.S.T | 00276-13 | |
| Sacryl Naht | KRUUSE | 152575 | |
| Scapel No 10 | Swann Morton | 201 | |
| Small Histo-Container | Any small histo-container works fine-for coldstorage of the graft | ||
| Small Plastik Bags | Any transparant plastic bags are fine | ||
| Steril Cotton swab | Lohmann-Rauscher | Any steril cotton swab is fine | |
| Sterile Gauze | Lohmann-Rauscher | Any steril gauze is fine | |
| Straight Scissor 8mm | F.S.T | 15024-10 | |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | OLY-SZX9-B | |
| Sutter Non Stick GLISS 0.4 mm | Sutter | 78 01 69 SLS | |
| Suture Tying Forceps | F.S.T | 00272-13 | |
| ThermoLux warming mat | ThermoLux | ||
| Tissue Forceps for Skin | Any tissue forceps are fine | ||
| Vesseldilatator Forceps | F.S.T | 00125-11 | |
| Vicryl plus 4/0 | Ethicon | VCP292H |
References
- Richards, E. G., et al. Uterus transplantation: state of the art in 2021. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2251-2259 (2021).
- Jones, B. P., et al. Options for acquiring motherhood in absolute uterine factor infertility; adoption, surrogacy and uterine transplantation. The Obstetrician & Gynaecologist. 23 (2), 138-147 (2021).
- Brannstrom, M., et al. The first clinical trial of uterus transplantation: surgical technique and outcome. American Journal of Transplantation. 14, 44 (2014).
- Ejzenberg, D., et al. Livebirth after uterus transplantation from a deceased donor in a recipient with uterine infertility. Lancet. 392 (10165), 2697-2704 (2018).
- Lavoue, V., et al. Which donor for uterus transplants: brain-dead donor or living donor? A systematic review. Transplantation. 101 (2), 267-273 (2017).
- O'Donovan, L., Williams, N. J., Wilkinson, S. Ethical and policy issues raised by uterus transplants. British Medical Bulletin. 131 (1), 19-28 (2019).
- Kisu, I., et al. Long-term outcome and rejection after allogeneic uterus transplantation in cynomolgus macaques. Journal of Clinical Medicine. 8 (10), 1572 (2019).
- Ozkan, O., et al. Uterus transplantation: From animal models through the first heart beating pregnancy to the first human live birth. Womens Health. 12 (4), 442-449 (2016).
- Favre-Inhofer, A., et al. Involving animal models in uterine transplantation. Frontiers in Surgery. 9, 830826 (2022).
- El-Akouri, R. R., Wranning, C. A., Molne, J., Kurlberg, G., Brannstrom, M. Pregnancy in transplanted mouse uterus after long-term cold ischaemic preservation. Human Reproduction. 18 (10), 2024-2030 (2003).
- Sahin, S., Selcuk, S., Eroglu, M., Karateke, A. Uterus transplantation: Experimental animal models and recent experience in humans. Turkish Journal of Obstetrics and Gynecology. 12 (1), 38-42 (2015).
- Wranning, C. A., Akhi, S. N., Diaz-Garcia, C., Brannstrom, M. Pregnancy after syngeneic uterus transplantation and spontaneous mating in the rat. Human Reproduction. 26 (3), 553-558 (2011).
- Wranning, C. A., Akhi, S. N., Kurlberg, G., Brannstrom, M. Uterus transplantation in the rat: Model development, surgical learning and morphological evaluation of healing. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 87 (11), 1239-1247 (2008).
- Brannstrom, M., Wranning, C. A., Altchek, A.
- Diaz-Garcia, C., Akhi, S. N., Wallin, A., Pellicer, A., Brannstrom, M. First report on fertility after allogeneic uterus transplantation. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 89 (11), 1491-1494 (2010).
- R, E., Brown, M. J., Karas, A. Z. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2nd edn. , Elsevier. (2008).
- Donovan, J., Brown, P.
- Rutledge, C., Raper, D. M. S., Abla, A. A. How I do it: superficial temporal artery-middle cerebral artery bypass for flow augmentation and replacement. Acta Neurochirurgica. 162 (8), 1847-1851 (2020).
- Kuo, S. C. -H., et al. The multiple-U technique: a novel microvascular anastomosis technique that guarantees everted anastomosis sites with solid intima-to-intima contact. Plastic and Reconstructive Surgery. 149 (5), 981 (2022).
- Magee, D. J., Manske, R. C. Pathology and Intervention in Musculoskeletal Rehabilitation. 2nd edn. , Elsevier. 25-62 (2016).
- Diaz-Garcia, C., Johannesson, L., Shao, R. J., Bilig, H., Brannstrom, M. Pregnancy after allogeneic uterus transplantation in the rat: perinatal outcome and growth trajectory. Fertility and Sterility. 102 (6), 1545-1552 (2014).
- Canovai, E., et al. IGL-1 as a preservation solution in intestinal transplantation: a multicenter experience. Transplant International. 33 (8), 963-965 (2020).
- Habran, M., De Beule, J., Jochmans, I. IGL-1 preservation solution in kidney and pancreas transplantation: A systematic review. PLoS One. 15 (4), 0231019 (2020).
- Mosbah, I. B., et al. IGL-1 solution reduces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in rat liver transplantation. Cell Death & Disease. 3 (3), 279 (2012).
- Wiederkehr, J. C., et al. Use of IGL-1 preservation solution in liver transplantation. Transplantation Proceedings. 46 (6), 1809-1811 (2014).
- Tilney, N. L., Guttmann, R. D. Effects of initial ischemia/reperfusion injury on the transplanted kidney. Transplantation. 64 (7), 945-947 (1997).
- de Rougemont, O., Dutkowski, P., Clavien, P. A. Biological modulation of liver ischemia-reperfusion injury. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (2), 183-189 (2010).
- Jakubauskiene, L., et al. Relaxin and erythropoietin significantly reduce uterine tissue damage during experimental ischemia-reperfusion injury. International Journal of Molecular Sciences. 23 (13), 7120 (2022).
- Wang, Y., Wu, Y., Peng, S. Resveratrol inhibits the inflammatory response and oxidative stress induced by uterine ischemia reperfusion injury by activating PI3K-AKT pathway. PLoS One. 17 (6), 0266961 (2022).
- Kisu, I., et al. Risks for donors in uterus transplantation. Reproductive Sciences. 20 (12), 1406-1415 (2013).
- Jones, B. P., et al.
