Summary
본 프로토콜은 쥐의 성공적인 자궁 이식(UTx)을 위한 모든 필수 단계를 설명합니다. 래트 모델은 UTx의 임상적 구현을 촉진하는 데 적합한 것으로 입증되었습니다. 그러나 쥐 UTx는 신중한 지침이 필요한 매우 복잡한 절차입니다.
Abstract
자궁 이식(UTx)은 절대 자궁 인자 불임(AUFI)이 있는 여성을 치료하기 위한 새로운 접근 방식입니다. 여성의 약 3%-5%가 AUFI를 앓고 있습니다. 이 여성들은 UTx가 출현 할 때까지 아이를 가질 수있는 선택권을 박탈 당했습니다. UTx의 임상적 적용은 동물에 대한 실험적 연구에 의해 주도되었으며, 최초의 성공적인 UTx는 쥐에서 달성되었습니다. 생리학적, 면역학적, 유전적, 생식적 특성을 감안할 때 쥐는 이러한 이식에 적합한 모델 시스템입니다. 특히, 실험적 UTx의 일반적인 종점은 출산을 통한 성공적인 임신이기 때문에 짧은 임신 기간은 분명한 이점입니다. 쥐 모델의 가장 큰 과제는 고급 미세 수술 기술과 경험이 필요한 작은 해부학으로 남아 있습니다. UTx가 클리닉에서 임신으로 이어졌지만 절차가 확립되지 않았으며 지속적인 실험 최적화가 필요합니다. 여기에서는 쥐 UTx에 대한 필수 문제 해결을 포함하여 자세한 프로토콜이 제시되며, 이는 이러한 유형의 미세 수술에 대한 경험이 없는 사람들이 전체 절차를 더 쉽게 이해할 수 있도록 할 것으로 기대됩니다.
Introduction
자궁 이식(UTx)은 절대 자궁 인자 불임(AUFI)에 대한 새로운 치료법입니다. AUFI는 자궁의 부재(선천적 또는 후천적) 또는 기형으로 인해 발생하며 전 세계 여성의 3%-5%에 영향을 미칩니다1. 윤리적, 법적 또는 종교적 이유로 모성에 대한 욕구가 있지만 AUFI2로 고통받는 많은 여성의 입양이나 대리모를 배제합니다. 이 여성들에게 UTx는 자신의 가족을 시작할 수 있는 유일한 옵션으로 남아 있습니다. UTx는 엇갈린 성공을 거두었지만 클리닉에 적용되었습니다. 이 절차는 기술적으로 까다롭고 임상 확립을 위해 꾸준한 개선이 필요합니다.
2014년, 살아있는 기증자(LD)로부터 자궁을 이식하여 성공적인 임신을 이룩한 것은 스웨덴의 선구적인 그룹인 Brännström3에 의해 수행되었습니다. 사망한 기증자(DD)의 UTx 이후 첫 번째 출생은 2016년 브라질에서 보고되었습니다4. 2021년까지 전 세계적으로 80개 이상의 UTx가 수행되었지만 성공률은 약 50%이고 대다수는 LD에서 이식편이 나왔습니다1.
생명을 구하는 것은 아니지만 UTx는 자신의 자손에 대한 욕구를 충족시키기 위해 점점 더 인기 있는 절차입니다. 따라서 이식편에 대한 수요가 증가하여 DD 기증이 미래의 초점이 되고 있습니다. 그러나 DD 기증은 상당히 긴 추위(심장사의 경우 따뜻함) 허혈성 노출로 인해 복잡하여 이식편 기능 장애 및 거부 반응의 위험이 높아집니다 5,6. 수술 기술, 까다로운 호환성 일치 및 관련 면역 억제는 UTx 결과와 관련하여 중요한 문제로 남아 있습니다7.
클리닉에서 위의 위험을 관리하기 위해서는 허혈 및 면역 억제 탐색을 위한 적절한 동물 모델이 필요합니다. 동물 모델에 대해 임상적으로 가장 관련성이 높은 종점은 성공적인 출산입니다. 현재까지, 실험적인 UTx에 따른 임신은 생쥐, 쥐, 양, 토끼, 시노몰구스 원숭이8에서 이루어졌다. 더 큰 동물은 수술 기술을 습득하고 최적화하도록 예정되어 있지만 설치류는 짧은 임신 기간이라는 뚜렷한 이점이 있습니다. 따라서 설치류 모델은 실질적, 재정적, 윤리적 고려 사항에서 우수하다9. 그러나 생쥐에서 UTx의 주요 과제는 작은 해부학이며, 매우 까다로운 수술은 쥐 UTx10의 낮은 재현성과 관련이 있습니다. 대조적으로, 쥐는 외과적으로 더 쉽게 접근할 수 있고 짧은 임신 기간의 이점을 유지합니다. 따라서 쥐는 UTx9의 선택 모델이되었습니다. Wranning et al. 2008년에 동소 UTx의 쥐 모델을 도입했으며, 이 모델을 사용하여 UTx 및 자연 교배 후 첫 번째 출생이 보고되었습니다11,12,13. 후속 연구는 인간에서 UTx를 구현하는 데 결정적인 기여를 했습니다9.
그럼에도 불구하고 UTx는 쥐에게 여전히 도전적이며 아직 소수의 그룹만이 이 수술 기술을 마스터했습니다. 연구자들 사이에서 쥐 UTx의 확산에 대한 한 가지 관련 장애물은 개별 미세 수술 단계, 함정 및 문제 해결을 위한 적절한 조치에 대한 정확한 설명이 부족하다는 것입니다14. 이 프로토콜은 이 동물 모델을 향후 연구에 쉽게 구현할 수 있도록 이 매우 복잡한 미세 수술 절차에 대한 자세한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 스위스 연방 동물 규정에 따라 수행되었으며 취리히 수의과(n° 225/2019)의 승인을 받아 인간의 보살핌을 보장합니다. 암컷 처녀 루이스 쥐(체중 170-200g)와 암컷 처녀 브라운 노르웨이 쥐(170-200g)를 자궁 기증자/수혜자로 사용했으며 수컷 루이스 쥐(300-320g)를 짝짓기에 사용했습니다. 쥐는 12-15 개월에서 숙성되었습니다. 동물들은 상업적 출처 ( 재료 표 참조)에서 얻었으며 물과 표준 식품에 자유롭게 접근 할 수있는 통제 된 조건과 풍부한 환경에서 사육되었습니다.
1. 자궁 회수
참고: 절차에 대한 자세한 내용은 이전에 게시된 보고서12,13,15를 참조하십시오.
- 동봉된 플렉시글라스 용기(14cm x 25cm x 13cm) 내에서 이소플루란과 산소로 1-2분 동안 마취를 유도합니다(O2 중 5부피% 이소플루란).
- 수술 30분 전에 계획된 복부 절개 부위에 부프레노르핀(0.05mg/kg)과 부피바카인(0.5%, 8mg/kg)을 피하 투여한다.
- 전기 면도기로 쥐의 모든 복부 피부를 면도하십시오.
- 수술 중 동물을 가열판에 고정시키기 위해 테이프를 사용하십시오. 양쪽 눈에 눈 연고를 바릅니다.
- 작은 코 콘을 통해 지속적으로 투여하여 산소에 2-4 vol % isoflurane으로 시술 중 마취를 유지하십시오.
- 특별한 도구 없이 임상 매개변수로 마취 깊이를 모니터링합니다(호흡수 ~70-120/min-마취 중 50%의 느린 속도 저하가 허용됨, 발가락 꼬집음으로 마취 깊이 확인, 점막의 색상은 파란색이나 회색이 아닌 분홍색이어야 함)16, 그에 따라 이소플루란 농도를 조정합니다.
참고: 선택 사항: 수술 중 빈번한 호흡 모니터링은 보조자의 도움을 받아 가능합니다. - 발가락 꼬집을 수행하여 마취 깊이를 확인하십시오.
- 방부제와 70 % 알코올을 번갈아 가며 3 번 면봉으로 원을 그리며 복부 피부를 청소하십시오. 말리십시오.
- 동물 위에 복부 창이 있는 멸균 드레이프( 재료 표 참조)를 놓습니다.
- 중앙 개복술을 시행하십시오.
- xiphisternum 아래 0.5cm에서 hypogastrium쪽으로 6-8cm 정중선 긴 절개를 통해 복부를 엽니 다. 피부 절개에는 10번 메스를 사용하고 리네아 알바 절개에는 작고 날카로운 가위를 사용하십시오. 간이나 방광을 손상시키지 마십시오.
- 면봉을 사용하여 내장을 복강 밖으로 옮기고 멸균 식염수를 적신 거즈로 부드럽게 덮고 더 나은 단열을 위해 멸균 비닐 봉지로 보호하십시오.
- 왼쪽 및 오른쪽 복벽 폴더에 견인기 또는 클립( 재료 표 참조)을 삽입하여 복막 근육을 옆으로 유지하고 복부를 열어 자궁 및 관련 혈관에 대한 최적의 접근과 가시성을 얻습니다. 테이프로 클립/견인기를 고정합니다.
- 수술 부위와 내장을 촉촉하게 유지하고 내장이 건조하지 않도록 예열 식염수를 바르십시오.
- 일반적인 자궁강과 자궁 경부와 오른쪽 자궁, 내부 및 총 장골 혈관을 포함한 혈관 척추경으로 오른쪽 자궁 뿔을 수확합니다.
- 합자(4/0 polyglactin, 재료 표 참조), 소작 및 공통 자궁강에서 분기에 인접한 왼쪽 자궁 뿔을 절단합니다.
- 자궁과 질을 둘러싼 과도한 지방을 제거하십시오.
알림: 자궁-혈관 시스템 주변의 지방을 유지하십시오. - 자궁 경부에 부착 된 방광을 해부하여 모든 배액 및 수유 방광 혈관을 소작하십시오. 소작하는 동안 자궁 경부와 질 사이에 적절한 거리를 유지하여이 두 구조에 대한 불필요한 소작을 피하십시오. 그렇지 않으면 이식편 괴사의 위험이 증가합니다.
알림: 대부분의 외과적 조작은 방광에 영향을 미칩니다. 혈관 클램프( 재료 표 참조)를 사용하여 방광을 꼬리 쪽으로 집어넣거나 당겨 excavatio vesicouterina를 더 잘 볼 수 있습니다. - 가능한 한 자궁 경부 원위까지 요관 수준에서 하강하는 자궁 혈관을 소작하고 절단하십시오.
참고: 분열하는 동안 질과 자궁경부 주변의 미세 순환을 가능한 한 많이 유지하십시오. - 미래 이식편의 자궁경부/질 부분을 직장 부착물과 질주위 및 경추주위 인대에서 분리합니다.
참고: 이식편 질에 소작을 하지 마십시오. - 자궁 경부의 꼬리 2-3mm 주위에 투열 요법을 통해 질을 조심스럽게 해부합니다.
참고: 질 내강 내부에는 융모(자궁경부)가 보이지 않습니다. - 자궁 동맥과 정맥을 모두 기원 지점에 배치합니다. Ligate(8/0 폴리아미드, 재료 표 참조), 둔부 혈관과 자궁 혈관의 꼬리에 있는 모든 혈관을 소작 및 절단합니다.
참고: 일반적으로 대정맥에 대한 대정맥 꼬리의 직접 결찰이 가능합니다. - 무딘 해부에 의해, 대동맥과 대정맥의 분기점에서 자궁 혈관의 분열에 이르기까지 일반적인 장골 혈관을 서로 분리시킵니다.
참고: 하나 또는 두 개의 인접한 림프절을 제거하여 해당 부위에 대한 더 나은 외과적 접근을 얻을 수 있습니다. - 자궁 - 난소 척추경을 같은 수준으로 소작 한 후 나팔관에서 3mm 떨어진 오른쪽 자궁 뿔을 절제하십시오. 이것은 이식편 자궁 뿔을 수용자 자궁 뿔의 상부에 문합하는 것을 가능하게 합니다.
- 합자(8/0 폴리아미드)를 대동맥 및 기갑 분기점 근위부에 있는 오른쪽 총장골 동맥 및 정맥 주위에 직접 배치합니다. 분기점에 인접한 오른쪽 총 장골 동맥에 작은 절개 (0.5-1 mm)를하고 구부러지고 무딘 30G 바늘 또는 곧고 무딘 25G 바늘을 내강에 삽입합니다 (세척 용). 합자(6/0 폴리아미드)로 고정합니다.
알림: 추가 옵션은 불독 cl로 추가 고정하는 것입니다.amp 바늘 및/또는 용기의 변위를 방지합니다. - 홍조 동안 유출을 가능하게 하기 위해 오른쪽 총장골 정맥에서 합자의 꼬리 부분에 있는 총장골 정맥을 해부합니다.
- 아래 단계에 따라 이식편을 세척하십시오.
- 약 9mL의 차가운 링거 용액(RHX: 50IU/mL 헤파린 및 0.4mg/mL 자일라진이 보충된 링거)과 함께 3mL 주사기를 사용하여 6mL/분의 유속으로 자궁을 수동으로 세척합니다. 헤파린(50IU/mL)과 자일라진(0.4mg/mL)이 보충된 장기 보존 용액 6mL로 다시 씻어냅니다( 재료 표 참조).
알림: 높은 세척 압력을 피하고 바늘을 적절하게 배치하십시오. - 자궁 조직이 창백 해지면 이식을 제거하십시오. 복부 대동맥의 분기점에서 합자의 꼬리 방향으로 총 장골 동맥을 자릅니다.
- 약 9mL의 차가운 링거 용액(RHX: 50IU/mL 헤파린 및 0.4mg/mL 자일라진이 보충된 링거)과 함께 3mL 주사기를 사용하여 6mL/분의 유속으로 자궁을 수동으로 세척합니다. 헤파린(50IU/mL)과 자일라진(0.4mg/mL)이 보충된 장기 보존 용액 6mL로 다시 씻어냅니다( 재료 표 참조).
- 이식 전에 백 테이블 준비 및 보관을 위해 차가운 장기 보존 용액(4°C)에 이식을 놓습니다.
- 이식편을 제거한 후, 먼저 이소플루란 설정을 최대로 돌린 다음 양측 기흉을 유도한 후 방혈을 유발하여 동물을 안락사시킨다17.
2. Syngeneic 자궁 이식
참고: 절차에 대한 자세한 내용은 이전에 게시된 보고서12,13,15를 참조하십시오.
- 마취를 유도하고 단계 1.1에서 언급한 대로 동물을 준비한다.
- 수술 30분 전에 효과적인 진통제(1.1.1단계에 설명된 대로)와 200IU/kg 고분자량 헤파린을 투여합니다.
- 중앙 개복술을 시행하십시오.
- xiphisternum 아래 0.5cm에서 hypogastrium쪽으로 6-8cm 길이의 정중선 절개를 통해 복부를 엽니 다. 피부 절개에는 10번 메스를 사용하고 리네아 알바 절개에는 작고 날카로운 가위를 사용하십시오. 간과 방광을 손상시키지 마십시오.
- 면봉을 사용하여 소장을 복강 밖으로 옮기고 멸균 된 축축한 거즈로 싸서 더 나은 단열을 위해 멸균 비닐 봉지로 덮으십시오.
- 왼쪽 및 오른쪽 복벽 폴더에 견인기 또는 클립을 삽입하여 복막 근육을 옆으로 유지하고 복부를 열어 자궁 및 관련 혈관의 최적 접근과 가시성을 얻습니다. 테이프로 클립/견인기를 고정합니다.
- 수술 부위와 내장을 촉촉하게 유지하고 내장이 건조하지 않도록 예열 식염수를 바르십시오.
- 직장과 방광에서 질의 상부 1/3을 해부하고 동원하여 자궁 적출술을 시행하십시오.
- 자궁, 자궁경부, 질 주위의 미세혈관을 소작합니다. 자궁 불길한 자궁의 미세 순환을 보호하기 위해 장기에 가까운 주변 구조에서 자궁을 자르고 분리하십시오.
- 주변의 지방 조직을 제거하십시오.
- 소작으로 왼쪽 뿔을 절단하십시오. 오른쪽에는 자궁 이식편에 대한 문합을 위해 자궁 상부의 7-8mm 부분을 보존하십시오.
- 자궁 이식을 수행하십시오.
- 자궁 혈관의 기원에서 대동맥/기갑 분기점까지 올바른 공통 장골 혈관을 동원하고 분리합니다.
- 복강에 이식편을 배치하십시오. 차가운 장기 보존 용액에 담근 거즈에 이식편을 싸십시오.
참고: 이식편은 문합 중에 차갑게 유지해야 합니다. - 비외상성 혈관 클램프를 양쪽의 오른쪽 총장골 정맥에 배치하여 미래의 문합 부위를 구성합니다.
참고: 마취를 1-1.5vol% 이소플루란으로 낮추어 심장 예압의 급격한 감소와 그에 따른 저혈압에 적응합니다. - 이식 정맥의 개구부보다 약간 큰 슬릿을 일반적인 장골 정맥으로 자릅니다.
- 이식편 정맥을 배치합니다.
- 하나의 스테이 봉합사(10/0 폴리아미드, 재료 표 참조)를 오른쪽 총장골 정맥의 슬릿 각 모서리에 놓습니다.
알림: 더 나은 조정과 지갑 끈 효과를 방지하기 위해 꼬리 모서리의 봉합사 매듭을 느슨하게 유지하십시오. - 혈전증을 예방하기 위해 시술 중에 냉각 된 RHX로 문합 부위를 정기적으로 세척하십시오.
- 이식 정맥의 한쪽을 6-8개의 연속 봉합 루프로 수혜자의 정맥에 문합합니다(그림 1).
참고: 두개골 스테이 봉합사(10/0 폴리아미드)로 시작하여 먼저 혈관의 인바운드 부분을 문합합니다. - 이번에는 바깥 쪽에서 시작하여 같은 방식으로 선박의 다른 쪽을 문합하십시오.
- 두개골 스테이 봉합사에 매듭을 묶은 다음 꼬리 스테이 봉합사(10/0 폴리아미드)에 매듭을 묶고 양쪽의 문합을 마친 후 매듭을 묶습니다.
알림: 지갑 끈 효과를 방지하기 위해 필요한 만큼만 연속 봉합사를 조입니다. - 비외상성 혈관 클램프를 양쪽의 오른쪽 총장골 동맥에 배치하여 미래의 문합 부위를 구성합니다.
- 중단된 봉합사(10/0 폴리아미드)를 사용하여 8-10 루프를 통해 동맥 문합(오른쪽 총장골동맥[RCIA])을 수행합니다.
참고: 중단된 봉합사는 연속 봉합사보다 제어하기 쉽습니다("물고기 입" 기술에서 선택 사항)18. 시술 중 냉각 된 RHX로 문합 부위를 지속적으로 플러싱하면 혈전증을 예방할 수 있습니다. 연속 봉합사를 사용할 때는 정맥 문합과 유사하게이 단계를 수행하십시오.
- 이식편 재관류를 수행합니다.
- 두 문합 부위가 모두 특허로 나타나고 출혈이 중단되면 이식편 혈관의 혈관 클램프를 풉니다(그림 2).
- 이식편에 붉어짐, 정맥 채우기 또는 이식 동맥의 맥동과 같은 재관류 징후가 있는지 검사합니다.
- 6-7개의 관내(6/0 폴리글락틴) 중단 봉합사를 사용하여 이식의 질 커프를 수혜자의 질 금고에 연결합니다.
알림: 먼저 12시 위치에서 단일 봉합사로 시작하고 다음 봉합사를 10시 및 1시 위치에 놓습니다. 9시와 3시 방향의 두 봉합사는 앞줄19,20의 봉합사 후에 묶어야합니다. - 5-7개의 중단된 봉합사(7/0 폴리아미드)를 사용하여 수용자 자궁의 나머지 두개골 자궁 부분에 이식편 자궁 뿔을 끝에서 끝까지 문합합니다.
알림: 루멘을 꿰매지 마십시오.
- 연속 봉합사로 복부를 닫으십시오. 근육층을 봉합하기 위해 4/0 폴리 글락틴을 사용하고 피부에 6/0 폴리 아미드 또는 수술 상처 클립을 사용하십시오.
- 이식이 완료되면 동물이 따뜻한 케이지에서 회복되도록하십시오. 흉골 누운 능력을 회복 할 때까지 동물과 함께 있고 완전히 회복 될 때까지 단일 주택을 유지하십시오. 부프레노르핀(0.05mg/kg)과 적절한 NSAID를 피하 투여하여 근수술진통 치료를 제공하되, 첫 마취 투여 후 4-8시간 전에는 투여하지 마십시오. 수술 후 3일 동안 식수(1mg/kg, 경구, 160mL 음용수(0.3mg/mL)에 5mL 부프레노르핀)를 통해 부프레노르핀을 지속적으로 제공합니다.
- 피부 봉합사는 보증 후 10-14 일 후에 제거됩니다.
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Representative Results
두 그룹의 쥐의 결과가 제시됩니다. UTx는 수정 전(그룹 1, n = 8) 및 후(그룹 2, n = 8) 프로토콜 조정(표 1)을 수행하여 수정의 효과를 입증했습니다(수정에 대한 설명은 토론 참조)12,15,21.
쥐 UTx의 결과는 세 가지 주요 단계와 관련이 있습니다. 첫 번째 단계는 UTx에서 성공적으로 복구하는 것입니다. 일반적으로 수혜자는 수술 후 처음 2일 이내에 회복되어야 합니다. 두 번째 단계는 수술 후 2 주 후 이식편의 건강 상태와 관련이 있으며, 이는 짝짓기 과정에 포함시키는 것을 결정합니다 (표 2). 세 번째 단계는 자발적인 짝짓기 후 생식력의 증거로 성공적인 출산을 포함합니다.
두 그룹의 모든 동물은 수술에서 순조롭게 회복되었습니다. 두 번째 단계 동안, 4마리의 동물을 그룹 1에서, 2마리의 동물을 그룹 2에서 제외하였다. 배제는 개복술 검사에서 이식편 혈전증 및 농양(그룹 1의 경우 n = 4, 그룹 2의 경우 n = 2) 및 협착/기형 자궁-자궁 문합(n = 1, 그룹 1의 경우 추가)으로 인한 것입니다(표 2). 개복술 (원래 개복술의 흉터를 따라)은 이식 후 2 주 후에 모든 여성에 대해 수행되었는데, 이는 동물의 신체적 외관이 이식편 건강의 지표로서 거의 가치가 없었기 때문입니다. 전체적으로, 2주 이식편 생존율은 그룹 1 및 그룹 2에 대해 각각 50% 및 75%였다(표 3).
3단계에서 그룹 1의 암컷 4마리가 UTx 후 약 9주 후에 루이스 수컷과 짝짓기를 위해 짝짓기를 했습니다. 두 명의 암컷이 임신의 징후를 보였다 (체중 증가, 그림 3, 둥지 행동). 그러나 출생은 관찰되지 않았다. 세 마리의 암컷을 두 번 짝짓기 한 후 한 마리의 암컷 쥐(°1)에서 강아지의 신체 일부(뼈와 조직)가 발견되었습니다. 수의병리학자가 헤마톡실린과 에오신 염색 조직 절편을 조직학적 검사한 결과 이 새끼들은 분만까지 발달한 것으로 나타났습니다(그림 4 및 그림 5).
그룹 2의 6명의 암컷을 루이스 수컷과 교미했습니다(체중 변화는 그림 6 참조). 6마리의 쥐 중 3마리(루이스 2마리와 브라운 노르웨이 쥐 1마리)가 새끼를 낳았고 다른 2마리는 임신 징후를 보였다. 암컷 루이스 쥐의 첫 번째 새끼는 두 마리의 새끼로 구성되었습니다(그림 7). 출생 직후 루이스 여성은 다시 임신했습니다. 그러나 새끼 3마리 중 2마리만이 출생 후 생존했습니다(그림 8). 한 명의 사망에 대한 한 가지 가능한 설명은 산후 스트레스 조건 하에서 건강한 새끼에게도 발생하기 때문에 영아 살해입니다. 마찬가지로, 브라운 노르웨이 암컷은 짝짓기 주기당 4마리의 새끼를 낳을 때마다 두 번 출산했습니다(그림 9). 그룹 2의 가장 큰 새끼 수는 첫 번째 짝짓기 주기 후에 7마리의 새끼와 함께 또 다른 루이스 암컷에 의해 배달되었습니다. 살아남은 모든 새끼는 정상적인 발달을 보였다(그림 10).
전반적으로, 프로토콜의 적응은 2주 이식편 생존율을 50%에서 75%로 증가시켰다. 6 명의 여성 중 5 명이 임신했으며, 1 그룹의 4 명 중 2 명이 임신했습니다. 마찬가지로, 암컷 6 마리 중 3 마리가 살아있는 새끼를 낳은 반면, 그룹 1 암컷 중 4 마리 중 0 마리가 낳았습니다. 결론적으로, 적응된 프로토콜은 직접적인 수술 결과와 UTx 후 성공적인 출생률을 모두 개선했습니다(표 4 및 그림 6).
그림 1 : 이식편과 수혜자의 정맥의 문합. 이식편의 우측 총장골정맥(RCIV)은 종단 간 문합을 통해 수혜자의 RCIV에 연결됩니다(2.4단계). RCIA = 우측 총장골동맥 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이식편과 수용자 동맥의 문합. 우측 총장골동맥(RCIA)은 종단 간 문합을 통해 수혜자의 RCIA에 연결됩니다(2.4단계). 두 혈관 클램프 (2.5)를 모두 연 후 외부 출혈이 없을 때 동맥을 완전히 관류해야합니다. 검은색 화살표: RCIA 이식편; 빨간색 화살표: 이식편 RCIV. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 그룹 1의 암컷 짝짓기 후 체중 변화. 개복술 시 온전한 이식편을 보여준 4명의 그룹 1 여성의 체중 모니터링. 한 마리의 동물(°1)은 자궁을 검사하기 위해 제왕절개 중에 안락사되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 죽은 새끼를 가진 그룹 1 쥐의 자궁에 대한 조직 학적 검사. 새끼의 신체 부위는 rat °1에서 발견되었습니다. 검사 결과 활력이 넘치고 자궁이 확장되어 새끼가 정상적으로 발달했지만 분만할 수 없음을 시사했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 그룹 1 쥐의 자궁 내부 강아지 신체 부위 °1. 뼈의 발달 단계는 만삭 새끼와 일치했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 개복술 시 온전한 이식편을 보여준 6명의 그룹 2 여성의 체중 모니터링. 녹색 별은 개별 출생 사건을 표시합니다. 해시태그 번호는 개별 여성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 수정된 프로토콜에 따른 쥐 UTx 후 첫 번째 출생. 갓 태어난 쥐 두 마리와 어미(오른쪽 머리; 루이스 여성 #1, 그룹 2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 수정된 프로토콜에 따라 두 번째 짝짓기 주기 후 쥐 UTx. 암컷 #1(그룹 2)은 세 마리의 새끼를 낳았고 그 중 두 마리는 살아남았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 수정된 프로토콜에 따른 UTx 후 브라운 노르웨이 쥐의 첫 번째 새끼. 첫 번째 짝짓기 주기 후, 갈색 노르웨이 쥐(#2, 그룹 2)는 4마리의 새끼를 낳았고, 두 번째 짝짓기 주기 후에 또 다른 4마리를 낳았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10 : 새끼의 발달. 살아남은 모든 새끼는 생후 3주에 정상적인 발달을 보였습니다. 한 가지 대표적인 예가 도시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 성공적인 짝짓기 후 질 플러그 형성. 더 이상의 짝짓기를 방지하기 위해 수정 후 질을 덮기 위해 흰색 플러그가 형성되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 그룹 1 | 그룹 2 | 쥐의 Syngeneic UTx | 쥐의 동종 UTx | |
| 수정하기 전에 | 수정 후 | 참조 12 | 참조 15 | |
| 총 동물 수 | 8 | 8 | 27 | 14 |
| 이식 생존 기간 2주 | 4/8 (50%) | 6/8 (75%) | 19/27 (70%) | 9/14 (64%) |
| 짝짓기 한 암컷의 수 | 4/4 (100%) | 6/6 (100%) | 17/19 (89%) | 9/9 (100%) |
| 만삭 임신 | 1/4 (25%) | 5/6 (83%) | 11/17(65%) | 5/9 (56%) |
| 성공적으로 배달 된 쓰레기 | 0 | 5A/TD> | 1 | 5 |
| 살아있는 새끼의 총 수 | 0 | 20ᄂ | 3씨 | 25일 |
| 출생 없이 만삭까지의 임신 | 1 | 1e | 10 | 2 |
표 1: 쥐 UTx에 대한 수정된 프로토콜과 수정되지 않은 프로토콜의 결과 비교. a: 같은 쥐에 의한 두 번의 임신; b: 영아 살해 강아지 포함; c: 중앙값; d: 중앙값/배달의 합계; e: 3주기의 짝짓기 후 흡수 단계에 있는 죽은 새끼.
| 수술 환경 | 그룹 1(n = 8) | 그룹 2(n = 8) |
| 프로젝트 단계 | 초기 단계 | 후기 단계 |
| 냉장 보관 시간 | 2-3 시간 | 2-3 시간 |
| 문합 중 플러싱 용액 | 상대습도 | 증권 시세 표시기 |
| 질 문합 | 6/0 에틸론 | 6/0 비크릴 |
| 자궁 뿔 문합 | 부분 연속 봉합사 | 중단 된 봉합사 |
| 동맥 문합 | 연속 봉합 | 중단 및 연속 |
| 질과 자궁경부 주변의 미세혈관 형성 | 질/자궁경부 조직에 가까운 소작 | 더 멀리 소작 |
표 2: 수술 설정 그룹 1 대 그룹 2.
| 제외 기준# |
| 혈전증의 징후 (특히 문합 주변) |
| 주요 접착 |
| 수축 된 자궁 |
| 감염 징후 |
| 이식편 괴사 |
표 3: 짝짓기에 대한 제외 기준. UTx 후 2주 동안 개복술 시 #Applied.
| N(그룹 1) | N(그룹 2) | |
| 마리 | 8 | 8 |
| 2 주 후 건강한 이식편 | 4 | 6 |
| 성관계 | 4 | 6 |
| 만삭 임신 | 1 | 5 |
| 성공적으로 배달 된 쓰레기 | 0 | 5암페어 |
| 살아있는 새끼의 총 수 | 0 | 20ᄂ |
| 출산이 아닌 만삭까지의 임신 | 1 | 0 |
표 4: 그룹 1 대 그룹 2의 결과. a: 같은 쥐에서 두 번의 연속 임신; b: 영아 살해로 사망한 강아지 포함.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 쥐의 자궁 이식 이면에 있는 외과적 접근에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 UTx 및 후속 짝짓기 후 출생 확률을 높이도록 최적화되었습니다. 원래 프로토콜은 Akouri et al.10의 마우스 작업에서 영감을 받아 Brännström 그룹12,13에서 인수되었으며 지난 몇 년 동안 저자의 경험을 기반으로 수정되었습니다. 따라서 수정은 실패한 이식에서 재현 가능한 결과로의 발전을 반영하는 진정한 학습 곡선에 의해 주도되었습니다.
결정적인 주요 수정은 다음과 같습니다: (1) 장기 회수 및 문합 중에 세척 용액에 자일라진을 첨가하여 혈전 위험을 감소시키는 혈관 확장을 자극했습니다. (2) 동맥 종단 간 문합을 위한 중단 봉합사의 사용. 중단 된 봉합사는 개통에 대한 외과 적 통제를 증가시킬뿐만 아니라 지갑 끈 효과를 피할뿐만 아니라 문합 영역을 넓혀 동맥 자궁을 통한 혈류를 증가시킵니다. (3) 자궁 뿔 문합에 대한 중단 및 비 흡수성 봉합사의 적용은 perimetrium의 층 내에서만 바느질; 이 수정은 자궁벽의 수축을 방지하여 나중에 수정을 방해할 수 있습니다. (4) 질 문합에 흡수성 봉합사를 사용하면 질 협착증의 위험이 줄어들어 출생 가능성이 높아집니다. (5) 질과 자궁 경부에서 가능한 한 멀리 떨어진 외과 적 조작을 수행하는 것은 질 흉터를 피하고 출생 가능성을 높이는 중요한 단계입니다. (6) 대정맥, 복부 대동맥 및 좌측 총장골정맥 동맥을 결찰하는 대신 우측 총장골 정맥과 동맥을 직접 결찰합니다. 자궁 대정맥에 대한 직접 결찰은 대부분의 경우 가능합니다. 직접 결찰은 장기 조달을 단순화하고 이식 결과에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 수술 시간을 단축합니다. (7) 총장골 (2.4.3 단계)을 클램핑 한 직후 이소 플루 란 농도를 1 % -1.5 부피 %로 낮추는 것도 마찬가지로 중요하며, 그렇지 않으면 심장 사망이 발생할 수 있습니다.
위의 요점은 현재 프로토콜을 스웨덴 그룹10,12,13에 의해 설명 된 아마도 가장 널리 사용되는 접근법과 구별하는 주요 요소입니다. 이러한 측정은 그룹 비교(원래 대 수정된 프로토콜, 표 1 참조)에서 입증된 바와 같이 UTx의 궁극적인 종점인 정상 출산에 도움이 되었습니다. 분명히, 시간이 지남에 따라 수술 학습 곡선도 마찬가지로 더 나은 결과를 얻었습니다. 그러나 그 기여도는 추정하기 어렵습니다.
꼼꼼한 수술 기술 외에도 수술 후 수혜자 관리도 최종 결과에 매우 중요합니다. 수술 후 치료는 해당 지역 프로토콜을 따릅니다. 여기의 지침은 수혜자가 마취에서 깨어난 후와 점수 평가에서 정의한 통증을 나타내는 경우 수술 후 첫 번째 날 동안 0.05mg/kg 부프레노르핀을 권장합니다. 점수 기준은 행동(활동, 호흡, 코트, 자세, 상처)과 체중을 기반으로 합니다. 수술 직후, 회복의 긍정적 인 징후는 사지와 귀의 분홍색 색이 돌아오고 눈이 붉어지는 것이 좋습니다. 이식 절차의 길이를 감안할 때 이식 후 처음 3 시간 동안 정기적 인 모니터링이 중요합니다. 이 3 시간 동안 평가 기준이 충족되지 않으면 동물은 더 이상의 고통을 피하기 위해 안락사됩니다. 모니터링은 수술 후 처음 3일 동안 하루에 세 번 계속됩니다. 동물이 처음 2 일 동안 완전히 회복되지 않으면 안락사됩니다. 상태에 따라 동물은 수술 후 2-3 일 동안 단일 주거에 남아 있습니다.
수술 중 무균 상태는 성공적인 결과와 관련된 또 다른 측면입니다. 감염 위험을 최소화하기 위해 엄격한 위생 루틴이 필수입니다. 동물 시설에 들어갈 때는 깨끗한 작업복, 안면 마스크, 장갑 및 모자를 착용하기 전에 손을 철저히 씻어야합니다. 전체 수술 부위는 벤질-C12-18-알킬디메틸암모늄 클로라이드, 디데실디메틸암모늄 클로라이드 및 글루타르알데히드가 포함된 특수 면봉으로 소독합니다. 70 % 에탄올로 추가 소독이 이어집니다. 각 수술 조작 전에 장갑을 70 % 에탄올로 간단히 세척하고 수술 부위 주변을 멸균 드레이프로 덮습니다. 이러한 조치는 감염 위험을 최소화하는 데 크게 도움이 됩니다.
자손 성공의 한 가지 문제는 실제 임신을 모니터링하는 데 어려움이 있다는 것입니다. 체중 증가는 임신을 나타낼 수 있지만 영아 살해로 인한 것일 수도 있으며 일반적으로 여성의 상태를 확실하게 반영하지 않습니다. 예를 들어, 모니터링 중에 그룹 1에 대해 전반적으로 약간의 체중 변화만 나타났습니다. 동물 3과 4는 두 번의 짝짓기 주기에 걸쳐 유사한 체중 증가를 보였지만 개복술 시 동물 4만 임신했습니다(그림 3 및 그림 4). 또한, 출산 부재와 함께 첫 번째 짝짓기 주기 이후의 체중 감소는 임신 흡수를 가리킬 수 있습니다. 조직 흡수가 체중 감소를 초래하는 이유는 아직 명확하지 않지만, 이 현상은 쥐 UTx 수용자에서 반복적으로 관찰되었다12. 성공적인 짝짓기 후 질 플러그 형성(그림 11)도 마찬가지로 종종 없었고 이후의 체중 변화와 상관관계를 나타내지 않았습니다. 임신을 표시하는 데 거의 가치가 없다는 점을 감안할 때 동물 스트레스 노출을 최소화하기 위해 그룹 2의 체중 모니터링 빈도를 줄였습니다. 일관되지 않은 플러그 존재와 무게 변화의 또 다른 결과는 임신 시간에 대한 신뢰할 수 없는 정의였습니다. 따라서 출산 예정일은 남성 노출 후2일을 수 태일로 사용하여 계산되었습니다. 흥미롭게도 그룹 2의 체중 변화는 임신 과정과 비교적 밀접한 상관관계가 있었으며 분만은 체중이 분명히 감소했습니다(그림 6).
동물 1, 2, 3(임신)과 동물 5, 6(임신한 적이 없음)의 체중 변화(그림 6)를 비교하면 임신과 출산 대 실패한 짝짓기의 영향을 잘 보여줍니다. 그룹 2와 그룹 1의 체중 행동이 다른 이유는 아직 명확하지 않습니다. 그러나 체중 변화는 단순히 그룹 2에서 만삭 임신 횟수가 많기 때문에 더 신뢰할 수 있습니다. 그룹 1의 낮은 임신율은 그룹 2에 비해 과대 대표된 질 협착증과 관련이 있을 수 있으며(표 3) 임신 방해의 원인입니다. 그룹 2에서 감소된 협착 발생률은 질 문합을 위해 흡수성 봉합사 대신 비흡수성 봉합사를 사용했기 때문일 수 있으며, 이 그룹에서 질 박리 중 개선된 수술 조작과 함께 발생할 수 있습니다.
스웨덴 접근법10,12와 달리, 여기에 설명된 프로토콜은 링거 또는 다른 솔루션 대신 이식편 저장을 위해 IGL-1(Institute Georges Lopez) 솔루션을 사용합니다. UTx 결과에 대한 IGL-1 용액의 정확한 영향은 알려져 있지 않지만, 다양한 보고서는 이 용액에 대한 실험적 이식의 전반적인 이점을 제안합니다22,23,24,25. 마지막으로, UTx12에 대해 일반적으로 수행되는 몇 가지 프로토콜 단계는 건너뛸 경우 결과에 영향을 미치지 않았습니다. 여기에는 왼쪽 또는 오른쪽 자궁 뿔의 클리핑과 수술 후 헤파린 대체가 포함되며 저자는 이를 선택 사항으로 간주합니다.
실험적 UTx에 내재된 한 가지 제한 사항은 제시된 프로토콜에도 유효합니다. 절차는 시간이 많이 걸리며 장기 적출 후 이식에는 최대 6시간이 소요될 수 있습니다. 따라서 쥐 UTx는 각 단계를 완벽하게 수행하기 위해 몇 시간 동안 완전한 집중이 필요합니다. 후자는 성공의 가장 중요한 측면으로 남아 있습니다. 이러한 관심은 미세 수술 기술이 완전히 개발되고 지속적으로 실행된다면 달성 될 수 있습니다. 마찬가지로 인내심과 체력은 전체 과정에서 실수를 피하기 위한 핵심 특성입니다. 긴 절차의 또 다른 결과는 하루에 한 마리의 동물 만 수술 할 수 있다는 것입니다. 신중한 계획과 주요 질문에 대한 집중은 생산적인 연구 설계를 개발하는 데 도움이 됩니다. 일반적으로 결과가 충분히 견고한지 확인하기 위해 실제 실험 시리즈에 참여하기 전에 이식편 생존율을 70% 이상으로 달성하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 출생을 종점으로 재고할 수 있습니다. 질 협착증과 임신 재흡수의 높은 발생률12 은 의미 있는 결과를 얻기 위해 필요한 UTx의 수를 현저하게 증가시킨다. 실험적 질문에 대한 보류, 이식편 생존과 같은 다른 종점이 더 효과적일 수 있습니다.
응용 프로그램이 증가하고 있음에도 불구하고 UTx는 클리닉에서도 실험적 응용 프로그램으로 남아 있습니다. 개선된 외과적 접근과 면역억제 전략의 필요성 외에도, 특히 사망한 기증자의 이식편을 사용하는 것은 추가 연구가 필요한 영역입니다. 허혈성 손상을 완화하기 위한 전략은 확립되지 않았지만 잠재적인 기증자 풀의 확장에 가장 환영받을 것입니다. 실제로, 허혈이 자궁에 미치는 영향은 연구가 잘 이루어지지 않았으며, 응용 지식은 다른 장기의 발견에 의존합니다26,27. Rat UTx는 클리닉28,29에 맞춤화된 접근 방식을 사용하면서 통제된 환경에서 허혈성 손상을 탐색할 수 있는 수단을 제공합니다. 참고로 라이브 기부는 특정 위험과 관련이 있습니다. 기증자는 요로 및 장 외상과 같은 수술 합병증의 비율이 높습니다. 따라서 죽은 기증과 연구에 대한 수요는 5,30 증가하고 있습니다.
쥐 UTx가 유익할 수 있는 많은 추가 질문이 있습니다. 예를 들어, 쥐 시스템은 클리닉에서 자궁 이식 과정을 비침습적으로 모니터링하는 데 사용할 수 있는 생물학적 마커를 식별 및/또는 검증할 수 있는 기회를 제공합니다. 최근의 사회 발전은 쥐 모델이 사용될 수있는 새로운 질문을 만들 수 있습니다. UTx는 현재 트랜스젠더 개인에게도 옹호되고 있으며, 남성 해부학은 적응된 외과적 접근 방식을 요구하고 있습니다31.
결론적으로, 기존의 설치류 작업을 기반으로 하고 실무 경험에 의해 수정된 쥐 UTx의 새로운 프로토콜이 제시됩니다. 수정된 프로토콜은 쥐 UTx가 충분한 미세 수술 기술 및 실습을 제공하여 정상 출산을 초래할 가능성이 높습니다. UTx는 아마도 주요 이식 절차 중 가장 복잡할 것입니다. 설명된 지침은 현재 부족하지만 연구 커뮤니티 내에서 쥐 UTx의 까다로운 절차를 설정하는 데 필요한 공통 프로토콜에 추가되어야 합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (프로젝트 보조금 번호 310030_192736)의 지원을 받았습니다. 조직병리학적 지원을 해주신 취리히 대학교 수의병리학 연구소의 Frauke Seehusen 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angled to Side Scissor 5 mm | F.S.T | 15008-08 | |
| Big Paper Clip | No specific | Used as retractor | |
| Blunt Bend Needle G30 | Unimed S.A. | ||
| Bupivacain 0.5% | Sintetica | ||
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Temgesic | ||
| Dosiernadel G25 | H.SIGRIST& PARTNER AG | ||
| Dumont #5SF Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Ethilon 10/0 | Ethicon | 2810G | |
| Ethilon 6/0 | Ethicon | 667H | |
| Ethilon 7/0 | Ethicon | EH7446H | |
| Ethilon 8/0 | Ethicon | 2808G | |
| Femal Brown Norway Rats (150-170 g) | Janvier | ||
| Femal Lewis Rats (150-170 g) | Charles River Deutschland | ||
| Fine Scissors - Sharp | F.S.T | 14060-09 | Any other small scissor works too |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | Any other small needholder works too |
| Heparin Natrium 25000 I.E./ 5 mL | B. Braun | ||
| Institute Georges Lopez Perfusion Solution (IGL) | Institute Georges Lopez | Organ preservation solution | |
| Male Lewis Rats (300-320 g) | Charles River Deutschland | ||
| Micro Serrefines 13 mm | F.S.T | 18055-04 | |
| Micro Serrefines 16 mm gebogen | F.S.T | 18055-06 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | |
| Mölnlyncke Op Towel | Mölnlyncke | 800300 | Sterile drape |
| NaCl 0.9% | B.Braun | ||
| Octenisept | Schülke | ||
| Paper Tape | Tesa | For fixing the animal | |
| Philips Avent Schneller Flaschenwärmer SCF358/02 | Philips | 12824216 | |
| Ringerfundin | B.Braun | ||
| Rompun 2% | Bayer | Xylazine | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 45° | F.S.T | 00276-13 | |
| Sacryl Naht | KRUUSE | 152575 | |
| Scapel No 10 | Swann Morton | 201 | |
| Small Histo-Container | Any small histo-container works fine-for coldstorage of the graft | ||
| Small Plastik Bags | Any transparant plastic bags are fine | ||
| Steril Cotton swab | Lohmann-Rauscher | Any steril cotton swab is fine | |
| Sterile Gauze | Lohmann-Rauscher | Any steril gauze is fine | |
| Straight Scissor 8mm | F.S.T | 15024-10 | |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | OLY-SZX9-B | |
| Sutter Non Stick GLISS 0.4 mm | Sutter | 78 01 69 SLS | |
| Suture Tying Forceps | F.S.T | 00272-13 | |
| ThermoLux warming mat | ThermoLux | ||
| Tissue Forceps for Skin | Any tissue forceps are fine | ||
| Vesseldilatator Forceps | F.S.T | 00125-11 | |
| Vicryl plus 4/0 | Ethicon | VCP292H |
References
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