Summary
Denne protokollen beskriver alle viktige trinn for vellykket livmortransplantasjon (UTx) hos rotter. Rottemodellen har vist seg egnet til å fremme den kliniske implementeringen av UTx; Imidlertid er rotte UTx en svært kompleks prosedyre som krever nøye instruksjoner.
Abstract
Livmortransplantasjon (UTx) er en ny tilnærming for behandling av kvinner med absolutt livmorfaktorinfertilitet (AUFI). Anslagsvis 3% -5% av kvinnene lider av AUFI. Disse kvinnene ble fratatt muligheten til å få barn til ankomsten av UTx. Den kliniske anvendelsen av UTx ble drevet av eksperimentelle studier på dyr, og den første vellykkede UTx ble oppnådd hos rotter. Gitt deres fysiologiske, immunologiske, genetiske og reproduktive egenskaper, er rotter et egnet modellsystem for slike transplantasjoner. Spesielt er deres korte drektighetstid en klar fordel, da det vanlige endepunktet for eksperimentell UTx er vellykket graviditet med levende fødsel. Den største utfordringen for rottemodeller er fortsatt den lille anatomien, som krever avanserte mikrokirurgiske ferdigheter og erfaring. Selv om UTx har ført til graviditet i klinikken, er prosedyren ikke etablert og krever kontinuerlig eksperimentell optimalisering. Her presenteres en detaljert protokoll, inkludert viktig feilsøking for rotte UTx, som forventes å gjøre hele prosedyren lettere å forstå for de uten erfaring med denne typen mikrokirurgi.
Introduction
Livmortransplantasjon (UTx) er en ny behandling for absolutt livmorfaktorinfertilitet (AUFI). AUFI skyldes fravær (medfødt eller ervervet) eller misdannelse i livmoren og rammer 3%-5% av kvinner over hele verden1. Etiske, juridiske eller religiøse grunner utelukker adopsjon eller surrogati for mange kvinner som har et ønske om morsrollen, men lider av AUFI2. For disse kvinnene er UTx fortsatt det eneste alternativet for å starte sin egen familie. UTx har blitt brukt i klinikken, om enn med blandet suksess; Prosedyren er teknisk utfordrende og krever jevn forbedring for den kliniske etableringen.
I 2014 ble den første transplantasjonen av en livmor fra en levende donor (LD) - noe som resulterte i vellykket graviditet - utført av den banebrytende svenske gruppen Brännström3. Den første fødselen etter UTx fra en avdød donor (DD) ble rapportert i 2016 i Brasil4. I 2021 har mer enn 80 UTxs blitt utført over hele verden, men med en suksessrate på omtrent 50% og med transplantater som kommer fra LD for flertallet1.
Selv om det ikke er livreddende, er UTx en stadig mer populær prosedyre for å oppfylle ønskene om eget avkom. Som sådan øker etterspørselen etter grafts, og plasserer DD-donasjon i et fremtidig fokus. Imidlertid er DD-donasjon komplisert på grunn av betydelig lengre kalde (og i tilfelle hjertedød, også varm) iskemiske eksponeringer, noe som øker risikoen for transplantatdysfunksjon og avvisning 5,6. Kirurgisk teknikk, krevende kompatibilitetsmatching og tilhørende immunsuppresjon forblir kritiske spørsmål angående UTx-utfall7.
For å håndtere de ovennevnte risikoene i klinikken, er det nødvendig med passende dyremodeller for utforskning av iskemi og immunsuppresjon. Det mest klinisk relevante endepunktet for dyremodeller forblir vellykket fødsel; til dags dato har graviditeter etter eksperimentell UTx blitt oppnådd hos mus, rotter, sauer, kaniner og cynomolgusaper8. Mens større dyr er forutbestemt for å anskaffe og optimalisere kirurgiske teknikker, kommer gnagere med den klare fordelen av korte svangerskapsperioder. Derfor er gnagermodeller overlegne når det gjelder praktiske, økonomiske og etiske hensyn9. Imidlertid er hovedutfordringen med UTx hos mus den lille anatomien, med den svært krevende operasjonen knyttet til den lave reproduserbarheten av murine UTx10. Derimot er rotter kirurgisk mer tilgjengelige og beholder fordelene med korte drektighetstider. Som sådan har rotta blitt den foretrukne modellen for UTx9. Wranning et al. introduserte rottemodellen av ortotopisk UTx i 2008, og ved hjelp av denne modellen har den første levende fødselen etter UTx og naturlig parring blitt rapportert11,12,13. Senere studier har hatt kritiske bidrag til implementeringen av UTx hos mennesker9.
Likevel er UTx fortsatt utfordrende hos rotter, og bare noen få grupper har ennå mestret denne kirurgiske teknikken. Et relevant hinder for spredning av rotte-UTx blant forskere er mangelen på en presis beskrivelse av de enkelte mikrokirurgiske trinnene, fallgruvene og de tilhørende tiltakene for feilsøking14. Denne protokollen tar sikte på å gi en detaljert veiledning for denne svært komplekse mikrokirurgiske prosedyren for å lette implementeringen av denne dyremodellen i fremtidig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til sveitsiske føderale dyreforskrifter og godkjent av veterinærkontoret i Zürich (nr. 225/2019), som sikrer menneskelig omsorg. Hunnrotter fra jomfru Lewis (kroppsvekt 170-200 g) og hunnrotter fra Brown Norway (170-200 g) ble brukt som uterusdonorer/mottakere, mens Lewis-hannrotter (300-320 g) ble brukt til parring. Rottene var i alderen 12-15 måneder. Dyrene ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell) og ble plassert under kontrollerte forhold og et beriket miljø med fri tilgang til vann og standard mat.
1. Uterus henting
MERK: For detaljer om prosedyren, se tidligere publiserte rapporter12,13,15.
- Induser anestesi med isofluran og oksygen i en lukket beholder for pleksiglass (14 cm x 25 cm x 13 cm) i 1-2 minutter (5 vol% isofluran iO2).
- Administrer buprenorfin subkutant (0,05 mg/kg) og bupivakain (0,5 %, 8 mg/kg) subkutant i regionen for det planlagte abdominale snittet 30 minutter før inngrepet.
- Barber hele bukhuden på rotta med en barbermaskin.
- Bruk bånd for å holde dyret festet på en varmeplate under operasjonen. Påfør øyesalve på begge øynene.
- Oppretthold anestesi under prosedyren med 2-4 vol% isofluran i oksygen ved kontinuerlig administrering gjennom en liten nesekjegle.
- Overvåk bedøvelsesdybden ved kliniske parametere uten spesialiserte verktøy (respirasjonsfrekvens på ~ 70-120 / min-et langsomt hastighetsfall på 50% er akseptabelt under anestesi; kontroll av bedøvelsesdybde med tåklype; farge på slimhinner skal være rosa, ikke blå eller grå)16, og juster isofluran konsentrasjonen tilsvarende.
MERK: Valgfritt: hyppig respirasjonsovervåking under operasjonen er mulig ved hjelp av en assistent. - Bekreft bedøvelsesdybden ved å utføre en tåklemme.
- Rengjør bukhuden i en sirkulær bevegelse med tre alternerende vattpinner av en antiseptisk løsning og 70% alkohol. La tørke.
- Plasser en steril drapering (se materialfortegnelse) med et bukvindu over dyret.
- Utfør median laparotomi.
- Åpne abdomen via et 6-8 cm midtlinjelangt snitt, som starter 0,5 cm under xiphisternum mot hypogastrium. Bruk en skalpell nr. 10 til hudsnittet og en liten skarp saks til linea alba-snittet. Ikke skade leveren eller blæren.
- Flytt tarmene utenfor bukhulen ved hjelp av bomullspinne, dekk dem forsiktig med en gasbind fuktet med steril saltvann, og beskytt dem med en steril plastpose for bedre isolasjon.
- Sett inn retractors eller klipp (se Table of Materials) på venstre og høyre bukvegg mapper for å holde bukhinnen muskelen til side og magen åpen, for å få optimal tilgang og synlighet av livmoren og tilhørende kar. Fest klippene / tilbaketrekkerne med bånd.
- Påfør forvarmet saltvann for å holde operasjonsområdet og tarmene fuktige og unngå tørking av innvollen.
- Høst høyre livmorhorn med felles livmorhule og livmorhals pluss vaskulære pedikler, inkludert høyre livmor, indre og vanlige iliac fartøy.
- Ligat (4/0 polyglaktin; se materialfortegnelse), cauterize, og kutt venstre livmorhorn ved siden av forgreningen fra det felles livmorhulen.
- Fjern overflødig fett rundt livmoren og skjeden.
MERK: Hold fettet rundt livmor-vaskulærsystemet. - Dissekere blæren ved vedlegg til livmorhalsen med cauterization av alle drenerings- og fôringsblærekar. Under cauterization, opprettholde en tilstrekkelig avstand mellom livmorhalsen og skjeden for å unngå unødvendig cauterization på disse to strukturer. Ellers øker risikoen for transplantatnekrose.
MERK: De fleste kirurgiske manipulasjoner bør påvirke blæren. Trekk inn eller trekk blæren kaudalt med en vaskulær klemme (se materialfortegnelse) for å få bedre oversikt over excavatio vesicouterina. - Cauterize og kutte de synkende livmorkarrene på nivået av urineren så distalt for livmorhalsen som mulig.
MERK: Oppretthold mikrosirkulasjonen rundt skjeden og livmorhalsen så mye som mulig under delingen. - Separat den cervikale / vaginale delen av det fremtidige transplantatet fra rektalvedlegget og de paravaginale og paracervikale leddbåndene.
MERK: Unngå cauterization på graft vagina. - Forsiktig dissekere skjeden via diatermi rundt 2-3 mm caudal av livmorhalsen.
MERK: Ingen villi (cervix) er synlig inne i vaginal lumen. - Finn både livmorarterien og venen ved opprinnelsen. Ligat (8/0 polyamid; se materialfortegnelse), cauterize og kutte glutealkarene og alle karene caudal av livmorkarrene.
MERK: Direkte ligering av den vanlige iliac vena caudal til livmorvena er vanligvis mulig. - Ved stump disseksjon, frigjør de vanlige iliac-karene fra hverandre, fra bifurkasjonen av aorta og vena cava ned til delingen av livmorkarrene.
MERK: Man kan få bedre kirurgisk tilgang til området ved å fjerne en eller to tilstøtende lymfeknuter. - Excise høyre livmorhorn 3 mm fra egglederen, etter cauterizing utero-ovarie pedicle på samme nivå. Dette muliggjør anastomose av transplantatets livmorhorn til øvre del av mottakerens livmorhorn.
- Plasser ligaturer (8/0 polyamid) rett rundt høyre arteria iliaca communis og vene, proksimalt for aorta- og kavalbifurkasjonene. Lag et lite snitt (0,5-1 mm) i høyre arteria iliaca communis ved siden av bifurkaturen, og sett inn en bøyd, buttet 30 G nål eller en rett, stump 25 G nål inn i lumen (for spyling). Fest den med en ligatur (6/0 polyamid).
MERK: Et annet alternativ er ekstra sikring med en bulldogklemme for å unngå forskyvning av nålen og/eller beholderen. - Dissekere vena iliaca communis kaudalt av ligaturen i høyre vena iliaca communis for å muliggjøre utstrømning under spyling.
- Skyll transplantatet ved å følge trinnene nedenfor.
- Skyll uterusen manuelt med 3 ml sprøyter med ca. 9 ml kald Ringer-oppløsning (RHX: Ringer tilsatt 50 IE/ml heparin og 0,4 mg/ml xylazin) med en strømningsrate på 6 ml/min. Skyll igjen med 6 ml organkonserveringsoppløsning tilsatt heparin (50 IE/ml) og xylazin (0,4 mg/ml) (se materialfortegnelse).
MERK: Unngå høyt spyletrykk og sørg for riktig plassering av nålen. - Fjern transplantasjonen når livmorvevet har blitt blekt. Klipp den vanlige iliac arterien caudalt av ligaturen ved bifurkasjonen av abdominal aorta.
- Skyll uterusen manuelt med 3 ml sprøyter med ca. 9 ml kald Ringer-oppløsning (RHX: Ringer tilsatt 50 IE/ml heparin og 0,4 mg/ml xylazin) med en strømningsrate på 6 ml/min. Skyll igjen med 6 ml organkonserveringsoppløsning tilsatt heparin (50 IE/ml) og xylazin (0,4 mg/ml) (se materialfortegnelse).
- Transplantatet legges i nedkjølt organkonserveringsløsning (4 °C) for tilberedning og oppbevaring av bakbordet før transplantasjon.
- Etter at transplantatet er fjernet, avlives dyret ved først å skru isofluraninnstillingen til maksimum og deretter indusere bilateral pneumothorax etterfulgt av ekssanguinering17.
2. Syngen livmortransplantasjon
MERK: For detaljer om prosedyren, se tidligere publiserte rapporter12,13,15.
- Indusere anestesi og forberede dyret som nevnt i trinn 1.1.
- Gi effektiv analgesi (som beskrevet i trinn 1.1.1) og 200 IE/kg høymolekylært heparin 30 minutter før kirurgi.
- Utfør median laparotomi.
- Åpne abdomen via et 6-8 cm langt midtlinjesnitt som starter 0,5 cm under xiphisternum mot hypogastrium. Bruk en skalpell nr. 10 til hudsnittet og en liten skarp saks til linea alba-snittet. Ikke skade leveren og blæren.
- Flytt tynntarmen utenfor bukhulen ved hjelp av bomullspinne, pakk dem med en steril fuktet gasbind og dekk dem med en steril plastpose for bedre isolasjon.
- Sett inn retractors eller klipp på venstre og høyre bukvegg mapper for å holde peritoneal muskel til side og magen åpen, for å få optimal tilgang og synlighet av livmoren og tilhørende kar. Fest klippene / tilbaketrekkerne med bånd.
- Påfør forvarmet saltvann for å holde operasjonsområdet og tarmene fuktige og unngå tørking av innvollen.
- Utfør en hysterektomi med disseksjon og mobilisering av den øvre tredjedel av skjeden fra endetarmen og blæren.
- Kauterer mikrovaskulaturen rundt livmoren, livmorhalsen og skjeden. Klipp og skille livmoren fra de omkringliggende strukturer nær orgelet for å beskytte mikrosirkulasjonen av livmor uhyggelig.
- Fjern fettvev fra omgivelsene.
- Amputere venstre horn ved cauterization. På høyre side bevares et 7-8 mm segment av øvre del av livmoren for senere anastomose til livmortransplantatet.
- Utfør livmortransplantasjon.
- Mobilisere og separere de rette iliackarene communis, fra livmorkarenes opprinnelse og opp til aorta/kavalbifurkaturen.
- Plasser transplantatet i bukhulen. Pakk graftet i en gasbind gjennomvåt i kald organkonserveringsløsning.
MERK: Transplantatet må holdes kaldt under anastomose. - Plasser atraumatiske vaskulære klemmer på høyre felles iliacvenen på hver side, og rammer det fremtidige anastomosestedet.
MERK: Senk anestesien til 1-1,5 vol% isofluran for å tilpasse seg den plutselige reduksjonen i hjertets forbelastning og den resulterende hypotensjonen. - Skjær en spalt litt større enn åpningen av graftvenen inn i den vanlige iliacvenen.
- Plasser graftvenen.
- Plasser en oppholdsutur (10/0 polyamid; se materialfortegnelse) i hvert hjørne av spalten på høyre alminnelige hofteåre.
NOTAT: Hold suturknuten i det kaudale hjørnet løs for bedre justering og for å forhindre veskestrengeffekter. - Skyll anastomoseområdet regelmessig med avkjølt RHX under prosedyren for å forhindre tromboser.
- Anastomose den ene siden av graftvenen til mottakerens vene med seks til åtte sløyfer kontinuerlig sutur (figur 1).
MERK: Start med kranialoppholdsuturen (10/0 polyamid) og anastomose først den innkommende delen av fartøyene. - Anastomose den andre siden av fartøyet på samme måte, denne gangen fra utsiden.
- Bind en knute ved kranieoppholdsuturen, og deretter en ved kaudaloppholdsuturen (10/0 polyamid), etter å ha fullført anastomosene på begge sider.
MERK: Stram de kontinuerlige suturene bare så mye som nødvendig for å forhindre veskestrengeffekter. - Plasser atraumatiske vaskulære klemmer på høyre arteria iliaca communis på hver side, og innramming av det fremtidige anastomosestedet.
- Utfør arteriell anastomose (høyre arteria iliaca communis [RCIA] via 8-10 sløyfer ved bruk av avbrutte suturer (10/0 polyamid).
MERK: Avbrutte suturer er lettere å kontrollere enn kontinuerlige (valgfritt med "fiskemunn"-teknikken)18. Konstant spyling av anastomoseområdet med avkjølt RHX under prosedyren bidrar til å forhindre tromboser. Når du bruker kontinuerlige suturer, utfør dette trinnet analogt med venøs anastomose.
- Utfør graftreperfusjon.
- Når begge anastomosestedene fremstår som åpne og blødningen stoppes, frigjøres de vaskulære klemmene på transplantatkarene (figur 2).
- Inspiser transplantatet for tegn på reperfusjon, for eksempel rødhet, fylling av venen eller pulsering i graftarterien.
- Koble vaginalmansjetten til transplantasjonen til mottakerens vaginale hvelv ved å bruke seks til syv intraluminale (6/0 polyglaktin) avbrutte suturer.
MERK: Start med en enkelt sutur på klokken 12 posisjon først, og plasser de neste på 10 og 1 o'clock posisjoner. De to suturene på klokka 9 og 3 skal knyttes etter suturene i første rad19,20. - Anastomose transplantatets livmorhorn ende-til-ende til det gjenværende kraniale livmorsegmentet av mottakerens livmor ved å bruke fem til syv avbrutte suturer (7/0 polyamid).
MERK: Ikke sy gjennom lumen.
- Lukk magen med en kontinuerlig sutur. Bruk 4/0 polyglaktin for suturering av muskellaget, og 6/0 polyamid eller kirurgiske sårklemmer for huden.
- La dyret komme seg i et oppvarmet bur når transplantasjonen er fullført. Forbli hos dyret til det har gjenvunnet sternal liggende evne, og oppretthold enkelt bolig til full gjenoppretting. Gi psotopertaiv analgesibehandling ved subkutan administrering av buprenorfin (0,05 mg/kg) og egnet NSAID, men ikke før 4-8 timer etter første anestesidose. Gi buprenorfin kontinuerlig via drikkevann (1 mg/kg, oral, 5 ml buprenorfin i 160 ml drikkevann (0,3 mg/ml)) i tre dager etter operasjonen.
- Hudsuturen fjernes 10-14 dager etter suregery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultater fra to grupper rotter presenteres. UTx ble utført før (gruppe 1, n = 8) og etter (gruppe 2, n = 8) protokolljustering (tabell 1) for å demonstrere effekten av våre modifikasjoner (se diskusjonen for en forklaring på våre modifikasjoner)12,15,21.
Utfallet av rotte UTx er knyttet til tre viktige faser. Den første fasen er vellykket utvinning fra UTx. Vanligvis bør mottakerne komme seg innen de første 2 postoperative dagene. Den andre fasen gjelder transplantatets helsetilstand 2 uker etter operasjonen, som bestemmer inkluderingen i parringsprosessen (tab 2). Den tredje fasen innebærer spontan parring etterfulgt av vellykket fødsel som bevis på fruktbarhet.
Alle dyr fra begge gruppene hadde en begivenhetsløs utvinning fra kirurgi. I andre fase ble fire dyr ekskludert fra gruppe 1 og to fra gruppe 2. Eksklusjonen skyldtes transplantattrombose og abscess (n = 4 for gruppe 1, n = 2 for gruppe 2) og tranmalisert/misformet uterouterin anastomose (i tillegg for n = 1, gruppe 1) ved undersøkelse ved relaparotomi (tab 2). Relaparotomi (langs arret etter den opprinnelige laparotomien) ble utført for alle hunner 2 uker etter transplantasjonen, da dyrenes fysiske utseende hadde liten verdi som indikator på transplantathelse. Totalt var overlevelsesraten for transplantat ved 2 uker 50 % og 75 % for henholdsvis gruppe 1 og 2 (tabell 3).
Under fase 3 ble fire hunner fra gruppe 1 matchet for parring med Lewis-hanner, rundt 9 uker etter UTx. To hunner viste tegn på graviditet (økning i kroppsvekt, figur 3; hekkeatferd); Det ble imidlertid ikke observert noen levende fødsel. Etter to parringssykluser med tre hunner ble det funnet valpens kroppsdeler (bein og vev) hos en hunnrotte (°1). Histologisk undersøkelse av hematoksylin- og eosinfargede vevssnitt utført av veterinærpatolog viste at disse valpene utviklet seg frem til fødsel (figur 4 og figur 5).
Seks hunner fra gruppe 2 ble parret med Lewis-hanner (se figur 6 for endringer i kroppsvekt). Tre av de seks rottene (to Lewis og en brun norgesrotte) fødte unger, mens ytterligere to viste tegn til drektighet. Det første kullet til hunnrotta Lewis (# 1) besto av to valper (figur 7). Kort tid etter fødselen ble Lewis-hunnen gravid igjen; Imidlertid overlevde bare to av tre valper postnatalt (figur 8). En sannsynlig forklaring på det ene dødsfallet er barnedrap, da det forekommer selv med friske valper under forhold med stress etter fødselen. Likeledes fødte den brune norske hunnen to ganger, hver gang til fire valper per paringssyklus (figur 9). Det største kullnummeret i gruppe 2 ble levert av en annen Lewis-hunn (# 3), med syv valper etter den første paringssyklusen. Alle overlevende valper viste normal utvikling (figur 10).
Totalt økte tilpasningen av protokollen 2 ukers graftoverlevelse fra 50 % til 75 %. Fem av seks kvinner ble gravide, mot to av fire fra gruppe 1. På samme måte fødte tre av seks av hunnene levende valper, sammenlignet med null av fire av gruppe 1-hunnene. Avslutningsvis forbedret den tilpassede protokollen både direkte kirurgiske utfall og frekvensen av vellykkede levende fødsler etter UTx (tabell 4 og figur 6).
Figur 1 Anastomose av transplantatet og mottakerens vene. Høyre vena iliaca communis (RCIV) i transplantatet kobles til mottakerens RCIV via ende-til-side-anastomose (trinn 2.4). RCIA = høyre arteria iliaca communis Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Anastomose av transplantat og mottakerarterie. Høyre arteria iliaca communis (RCIA) kobles til mottakerens RCIA via ende-til-side-anastomose (trinn 2.4). Etter åpning av begge vaskulære klemmer (2,5) bør arterien være fullstendig perfundert i fravær av ytre blødning. Svart pil: graft RCIA; rød pil: graft RCIV. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kroppsvektsendringer etter parring av hunner i gruppe 1. Overvåking av kroppsvekt hos de fire gruppe 1-kvinnene som viste intakt transplantat ved relaparotomi. Ett dyr (°1) ble avlivet under keisersnittet for å inspisere livmoren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Histologisk undersøkelse av livmoren til gruppe 1 rotte med døde unger. Kroppsdeler av valper ble funnet i rotte ° 1. Undersøkelse viste en vital og utvidet livmor, noe som tyder på at valpene utviklet seg normalt, men ikke kunne leveres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Valpens kroppsdeler inne i livmoren til rotte i gruppe 1 °1. Utviklingsstadiet av beinene var forenlig med fullbårne valper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kroppsvektovervåking av de seks gruppe 2-kvinnene som viste intakt transplantat ved relaparotomi. Grønne stjerner markerer individuelle fødselshendelser. Hashtag-numre refererer til de enkelte hunnene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Den første levende fødselen etter rotte UTx etter den modifiserte protokollen. To nyfødte rotter og deres mor (hodet til høyre; Lewis kvinne #1, gruppe 2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Det andre kullet etter den andre parringssyklusen post rotte UTx etter den modifiserte protokollen. Hunnen #1 (gruppe 2) fødte tre valper, hvorav to overlevde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Det første kullet med brun norgesrotte etter UTx etter den modifiserte protokollen. Etter den første parringssyklusen fødte den brune norgesrotta (#2, gruppe 2) fire unger, etterfulgt av ytterligere fire etter den andre paringssyklusen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Utvikling av valper. Alle overlevende valper viste normal utvikling ved 3 ukers alder. Ett representativt eksempel er vist. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Dannelse av vaginalplugger etter vellykket parring. Hvite plugger skal dannes for å dekke skjeden etter befruktning for å forhindre ytterligere parring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Gruppe 1 | Gruppe 2 | Syngen UTx hos rotter | Allogen UTx hos rotter | |
| før endring | etter endring | Se ref. 12 | Se ref. 15 | |
| Totalt antall dyr | 8 | 8 | 27 | 14 |
| To ukers graftoverlevelse | 4/8 (50%) | 6/8 (75%) | 19/27 (70%) | 9/14 (64%) |
| Antall parrede kvinner | 4/4 (100%) | 6/6 (100%) | 17/19 (89%) | 9/9 (100%) |
| Full sikt graviditet | 1/4 (25%) | 5/6 (83%) | 11/17(65%) | 5/9 (56%) |
| Vellykket levert søppel | 0 | 5a/td> | 1 | 5 |
| Totalt antall levende valper | 0 | 20b | 3c | 25d |
| Graviditet til termin m / o levende fødsel | 1 | 1e | 10 | 2 |
Tabell 1: Sammenligning av utfall av modifisert og umodifisert protokoll for rotte UTx. a: To graviditeter av samme rotte; b: Inkludert barnedrapsvalpen; c: Median; d: Summen av median/levering; e: Døde valper i resorpsjonsstadium etter tre parringssykluser.
| Kirurgiske innstillinger | Gruppe 1 (n = 8) | Gruppe 2 (n = 8) |
| Prosjektets fase | Innledende fase | sen fase |
| Kald lagringstid | 2-3 timer | 2-3 timer |
| Skylleløsning under anastomose | RH | RHX |
| Vaginal anastomose | 6/0 Ethilon | 6/0 Vicryl |
| Livmor horn anastomose | delvis kontinuerlig sutur | avbrutt sutur |
| Arteria anastomose | kontinuerlig sutur | Avbrutt og kontinuerlig |
| Mikrovaskularisering rundt vagina og livmorhals | cauterization nær vaginal/cervical vev | Cauterization mer distalt |
Tabell 2: Kirurgiske innstillinger gruppe 1 versus gruppe 2.
| Kriterier for eksklusjon# |
| Tegn på trombose (spesielt rundt anastomoser) |
| Stor vedheft |
| Innsnevret livmor |
| Tegn på infeksjon |
| Graft nekrose |
Tabell 3: Eksklusjonskriterier for parring. #Applied ved relaparotomi 2 uker etter UTx.
| n (gruppe 1) | n (gruppe 2) | |
| Dyr | 8 | 8 |
| Sunt transplantat etter 2 uker | 4 | 6 |
| Paret | 4 | 6 |
| Full sikt graviditet | 1 | 5 |
| Vellykket levert søppel | 0 | 5a |
| Totalt antall levende valper | 0 | 20b |
| Graviditet til termin, ikke levende fødsel | 1 | 0 |
Tabell 4: Utfall av gruppe 1 versus gruppe 2. a: To påfølgende graviditeter i samme rotte; b: Inkludert valpen som ble drept av barnedrap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres her gir detaljerte instruksjoner for den kirurgiske tilnærmingen bak livmortransplantasjon hos rotter. Protokollen er optimalisert for å øke oddsen for levende fødsler etter UTx og påfølgende parring. Den opprinnelige protokollen er overtatt fra Brännström-gruppen 12,13, inspirert av musearbeidet til Akouri et al.10, og modifisert basert på forfatternes erfaringer de siste årene. Som sådan ble modifikasjonene drevet av sanne læringskurver som reflekterte utviklingen fra mislykkede transplantasjoner til reproduserbare utfall.
Viktige modifikasjoner som sannsynligvis er avgjørende var: (1) tillegg av xylazin til utskyllingsløsningen under organuthenting og anastomose, noe som stimulerte vasodilatasjon som førte til redusert trombotisk risiko. (2) Bruk av avbrutte suturer for arteriell ende-til-side-anastomose. Avbrutte suturer øker ikke bare kirurgisk kontroll over patency og unngår veskestrengeffekter, men muliggjør også etterfølgende utvidelse av det anastomotiske området for å øke blodstrømmen gjennom arterien uterina. (3) Anvendelse av avbrutte og ikke-absorberbare suturer for livmorhornanastomosen med søm bare innenfor laget av perimetriumet; Denne modifikasjonen forhindrer innsnevring av livmorveggen, noe som kan hindre senere befruktning. (4) Bruk av absorberbart suturmateriale for vaginal anastomose reduserer risikoen for vaginal stenose og øker dermed sjansene for levende fødsler. (5) Å utføre kirurgisk manipulasjon så langt unna skjeden og livmorhalsen som mulig er et viktig skritt for å unngå vaginal arrdannelse og for å øke sjansene for levende fødsler. (6) Direkte ligering av høyre felles iliaca vene og arterie i stedet for å ligere vena cava, abdominal aorta og venstre arteria iliac vene. Direkte ligering caudal til livmorvena er i de fleste tilfeller mulig; Den direkte ligeringen forenkler organinnkjøp og forkorter operasjonstiden uten å påvirke transplantasjonsresultatene negativt. (7) Senking av isofluran konsentrasjonen til 1%-1,5 vol% rett etter klemming av den vanlige iliac vena (trinn 2.4.3) er også avgjørende, da ellers kan hjertedød forekomme.
Punktene ovenfor er hovedelementene som skiller denne protokollen fra den kanskje mest brukte tilnærmingen beskrevet av den svenske gruppen10,12,13. Disse målingene gagnet det ultimate endepunktet for UTx, den levende fødselen, som vist av gruppesammenligningen (original vs. modifisert protokoll; se tabell 1). Det er klart at den kirurgiske læringskurven over tid også har lagt til bedre resultater; Bidraget er imidlertid vanskelig å anslå.
I tillegg til en grundig kirurgisk teknikk, er postoperativ mottakeromsorg også avgjørende for det endelige resultatet. Postoperative behandlinger følger den respektive lokale protokollen; Instruksjonene her anbefaler 0,05 mg/kg buprenorfin etter at mottakeren våkner fra narkose, og i løpet av første postoperative dag ved smertedebut som definert i vår skåringsvurdering. Skåringskriteriene er basert på atferd (aktivitet, respirasjon, pels, holdning, sår) og kroppsvekt. Umiddelbart etter operasjonen er positive tegn på utvinning en retur av rosa farging av ekstremiteter og ører, samt en retur av rød farging av øynene. Gitt lengden på transplantasjonsprosedyren, er regelmessig overvåking i løpet av de første 3 timene etter transplantasjonen kritisk. Hvis vurderingskriteriene ikke er oppfylt i løpet av disse 3 timene, avlives dyret for å unngå ytterligere lidelse. Overvåkingen fortsetter tre ganger daglig de første 3 postoperative dagene. Hvis dyret ikke fullstendig gjenoppretter i løpet av de første 2 dagene, blir det avlivet. Avhengig av tilstanden forblir dyret i et enkelt hus i 2-3 dager etter operasjonen.
Sterile forhold under operasjonen er enda et aspekt som er relevant for vellykkede resultater. En streng hygienerutine er obligatorisk for å minimere infeksjonsrisiko. Når man kommer inn på dyreavdelingen, må hendene vaskes grundig før man kler på seg en ren kjeledress, munnbind, hansker og caps. Hele operasjonsområdet desinfiseres med en spesiell vattpinne som inneholder benzyl-C12-18-alkyldimetylammoniumklorid, didecyldimetylammoniumklorid og glutaraldehyd. Ytterligere desinfeksjon med 70% etanol følger. Før hver kirurgisk manipulasjon rengjøres hanskene kort med 70% etanol, og området rundt operasjonsstedet er dekket med en steril drapering. Disse tiltakene bidrar sterkt til å minimere infeksjonsrisiko.
Et problem med avkomsuksess er vanskeligheten med å overvåke selve graviditeten. Kroppsvektøkninger kan være en indikasjon på graviditet, men kan også skyldes spedbarnsdrap og gjenspeiler generelt ikke pålitelig kvinnens tilstand. For eksempel var det bare beskjedne vektendringer totalt sett for gruppe 1 under overvåkingen. Dyr 3 og 4 viste lignende vektøkninger over de to parringssyklusene, men bare dyr 4 var drektige ved relaparotomi (figur 3 og figur 4). Videre kan vekttap etter den første parringssyklusen med fraværende fødsel peke på graviditetsabsorpsjon. Selv om det fortsatt er uklart hvorfor vevsabsorpsjon resulterer i vekttap, har dette fenomenet blitt gjentatte ganger observert hos rotte UTx-mottakere12. Dannelse av vaginalplugger etter vellykket parring (figur 11) var også ofte fraværende og viste ingen sammenheng med senere endringer i kroppsvekt. Gitt den lille verdien ved å markere graviditet, ble overvåkingsfrekvensen for kroppsvekt redusert for gruppe 2 for å minimere eksponering for dyrestress. En ytterligere konsekvens av inkonsekvent pluggtilstedeværelse og vektendringer var en upålitelig definisjon av unnfangelsestiden. Forfallsdatoer for fødsler er derfor beregnet ved å bruke 2. dag etter mannlig eksponering som unnfangelsesdag. Interessant nok korrelerte kroppsvektendringer i gruppe 2 relativt godt med svangerskapsforløpet, der fødselen var preget av et tydelig vekttap (figur 6).
Sammenligning av kroppsvektendringer (figur 6) hos dyr 1, 2 og 3 (drektige) med dyr 5 og 6 (aldri gravid) illustrerer effekten av graviditet og levende fødsel versus mislykket parring. Årsaken til den forskjellige kroppsvektsatferden i gruppe 2 sammenlignet med gruppe 1 er fortsatt uklar. Vektendringer kan imidlertid være mer pålitelige rett og slett på grunn av høyere antall fullbårne svangerskap i gruppe 2. Den lave svangerskapsraten i gruppe 1 kan muligens relateres til vaginal stenose, som var overrepresentert i forhold til gruppe 2 (tab 3) og er en årsak til hemmet befruktning. Den reduserte stenotiske insidensen i gruppe 2 kan skyldes bruk av ikke-absorberbare i stedet for absorberbare suturer til vaginal anastomose, sannsynligvis sammen med bedret kirurgisk manipulasjon under vaginal disseksjon i denne gruppen.
I motsetning til den svenske tilnærmingen10,12, bruker protokollen beskrevet her IGL-1 (Institute Georges Lopez) løsning for graftlagring i stedet for Ringer eller andre løsninger. Mens den eksakte effekten av IGL-1-løsningen på UTx-utfall er ukjent, foreslår ulike rapporter generelle fordeler ved eksperimentell transplantasjon for denne løsningen22,23,24,25. Til slutt påvirket ikke noen få protokolltrinn som vanligvis utføres for UTx12 utfallet hvis de ble hoppet over. Disse inkluderer klipping på venstre eller høyre livmorhorn og postoperativ heparinsubstitusjon, som forfatterne anser valgfritt.
En begrensning som er iboende for eksperimentell UTx er også gyldig for den presenterte protokollen. Inngrepet er tidkrevende, og organuthenting etterfulgt av transplantasjon kan ta opptil 6 timer. Derfor krever rotte UTx fullt fokus i flere timer for å utføre hvert trinn feilfritt. Sistnevnte er fortsatt det viktigste aspektet ved suksess. Slik oppmerksomhet kan oppnås forutsatt at de mikrokirurgiske ferdighetene er fullt utviklet og kontinuerlig praktisert. På samme måte er tålmodighet og utholdenhet viktige egenskaper for å unngå feil under hele prosedyren. En annen konsekvens av den lange prosedyren er at bare ett dyr kan opereres per dag. Nøye planlegging og fokus på sentrale spørsmål bidrar til å utvikle et produktivt forskningsdesign. Generelt anbefales det å oppnå transplantatoverlevelse over 70 % før man forplikter seg til selve eksperimentelle serien for å sikre at funnene blir tilstrekkelig robuste. Til slutt kan det være lurt å revurdere levende fødsel som et endepunkt. Den høye forekomsten av vaginal stenose og graviditetsresorpsjon12 øker markant antall UTxs som kreves for å oppnå meningsfulle resultater. I påvente av det eksperimentelle spørsmålet kan andre endepunkter, som transplantatoverlevelse, være mer effektive.
Til tross for den økende applikasjonen, forblir UTx en eksperimentell applikasjon også i klinikken. Foruten behovet for forbedrede kirurgiske tilnærminger og immunsuppressive strategier, er spesielt bruk av transplantater fra avdøde givere et område som krever ytterligere forskning. Strategier for å redusere iskemisk skade er ikke etablert, men vil være hjertelig velkommen for utvidelse av potensielle donorpooler. Faktisk er virkningen av iskemi på livmor dårlig undersøkt, med anvendt kunnskap som er avhengig av funn fra andre organer26,27. Rat UTx tilbyr et middel til å utforske iskemisk skade i kontrollerte omgivelser mens du bruker tilnærminger skreddersydd for klinikken28,29. Merk at levende donasjon er forbundet med visse risikoer; Donorer har en høy grad av kirurgiske komplikasjoner, som urinveier og tarm traumer. Følgelig vokser etterspørselen etter døde donasjoner og forskningen 5,30.
Det finnes mange flere spørsmål der rotte UTx kan være informativ. For eksempel tilbyr rottesystemet muligheten til å identifisere og / eller validere biologiske markører som kan brukes til å ikke-invasivt overvåke forløpet av livmortransplantasjoner i klinikken. Den senere tids samfunnsutvikling kan skape nye spørsmål der rottemodellen kan være til nytte. UTx blir nå tatt til orde også for transpersoner, med den mannlige anatomien som ber om tilpassede kirurgiske tilnærminger31.
Avslutningsvis presenteres en ny protokoll for rotte UTx basert på eksisterende gnagerarbeid og modifisert av praktisk erfaring. Den modifiserte protokollen har stor sannsynlighet for rotte UTx som resulterer i levende fødsler - forutsatt tilstrekkelig mikrokirurgisk ferdigheter og praksis. UTx er kanskje den mest komplekse av de store transplantasjonsprosedyrene. Den beskrevne instruksen skal komme i tillegg til en felles protokoll som i dag mangler, men som er nødvendig for å etablere den krevende prosedyren for rotte-UTx i forskningsmiljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Swiss National Science Foundation (prosjektstipend nr. 310030_192736). Vi vil gjerne takke Dr. Frauke Seehusen fra Institutt for veterinærpatologi ved Universitetet i Zürich for hennes histopatologiske støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angled to Side Scissor 5 mm | F.S.T | 15008-08 | |
| Big Paper Clip | No specific | Used as retractor | |
| Blunt Bend Needle G30 | Unimed S.A. | ||
| Bupivacain 0.5% | Sintetica | ||
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Temgesic | ||
| Dosiernadel G25 | H.SIGRIST& PARTNER AG | ||
| Dumont #5SF Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Ethilon 10/0 | Ethicon | 2810G | |
| Ethilon 6/0 | Ethicon | 667H | |
| Ethilon 7/0 | Ethicon | EH7446H | |
| Ethilon 8/0 | Ethicon | 2808G | |
| Femal Brown Norway Rats (150-170 g) | Janvier | ||
| Femal Lewis Rats (150-170 g) | Charles River Deutschland | ||
| Fine Scissors - Sharp | F.S.T | 14060-09 | Any other small scissor works too |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | Any other small needholder works too |
| Heparin Natrium 25000 I.E./ 5 mL | B. Braun | ||
| Institute Georges Lopez Perfusion Solution (IGL) | Institute Georges Lopez | Organ preservation solution | |
| Male Lewis Rats (300-320 g) | Charles River Deutschland | ||
| Micro Serrefines 13 mm | F.S.T | 18055-04 | |
| Micro Serrefines 16 mm gebogen | F.S.T | 18055-06 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | |
| Mölnlyncke Op Towel | Mölnlyncke | 800300 | Sterile drape |
| NaCl 0.9% | B.Braun | ||
| Octenisept | Schülke | ||
| Paper Tape | Tesa | For fixing the animal | |
| Philips Avent Schneller Flaschenwärmer SCF358/02 | Philips | 12824216 | |
| Ringerfundin | B.Braun | ||
| Rompun 2% | Bayer | Xylazine | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| Round Handled Needle Holders | F.S.T | 12075-12 | |
| S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 45° | F.S.T | 00276-13 | |
| Sacryl Naht | KRUUSE | 152575 | |
| Scapel No 10 | Swann Morton | 201 | |
| Small Histo-Container | Any small histo-container works fine-for coldstorage of the graft | ||
| Small Plastik Bags | Any transparant plastic bags are fine | ||
| Steril Cotton swab | Lohmann-Rauscher | Any steril cotton swab is fine | |
| Sterile Gauze | Lohmann-Rauscher | Any steril gauze is fine | |
| Straight Scissor 8mm | F.S.T | 15024-10 | |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | OLY-SZX9-B | |
| Sutter Non Stick GLISS 0.4 mm | Sutter | 78 01 69 SLS | |
| Suture Tying Forceps | F.S.T | 00272-13 | |
| ThermoLux warming mat | ThermoLux | ||
| Tissue Forceps for Skin | Any tissue forceps are fine | ||
| Vesseldilatator Forceps | F.S.T | 00125-11 | |
| Vicryl plus 4/0 | Ethicon | VCP292H |
References
- Richards, E. G., et al. Uterus transplantation: state of the art in 2021. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2251-2259 (2021).
- Jones, B. P., et al. Options for acquiring motherhood in absolute uterine factor infertility; adoption, surrogacy and uterine transplantation. The Obstetrician & Gynaecologist. 23 (2), 138-147 (2021).
- Brannstrom, M., et al. The first clinical trial of uterus transplantation: surgical technique and outcome. American Journal of Transplantation. 14, 44 (2014).
- Ejzenberg, D., et al. Livebirth after uterus transplantation from a deceased donor in a recipient with uterine infertility. Lancet. 392 (10165), 2697-2704 (2018).
- Lavoue, V., et al. Which donor for uterus transplants: brain-dead donor or living donor? A systematic review. Transplantation. 101 (2), 267-273 (2017).
- O'Donovan, L., Williams, N. J., Wilkinson, S. Ethical and policy issues raised by uterus transplants. British Medical Bulletin. 131 (1), 19-28 (2019).
- Kisu, I., et al. Long-term outcome and rejection after allogeneic uterus transplantation in cynomolgus macaques. Journal of Clinical Medicine. 8 (10), 1572 (2019).
- Ozkan, O., et al. Uterus transplantation: From animal models through the first heart beating pregnancy to the first human live birth. Womens Health. 12 (4), 442-449 (2016).
- Favre-Inhofer, A., et al. Involving animal models in uterine transplantation. Frontiers in Surgery. 9, 830826 (2022).
- El-Akouri, R. R., Wranning, C. A., Molne, J., Kurlberg, G., Brannstrom, M. Pregnancy in transplanted mouse uterus after long-term cold ischaemic preservation. Human Reproduction. 18 (10), 2024-2030 (2003).
- Sahin, S., Selcuk, S., Eroglu, M., Karateke, A. Uterus transplantation: Experimental animal models and recent experience in humans. Turkish Journal of Obstetrics and Gynecology. 12 (1), 38-42 (2015).
- Wranning, C. A., Akhi, S. N., Diaz-Garcia, C., Brannstrom, M. Pregnancy after syngeneic uterus transplantation and spontaneous mating in the rat. Human Reproduction. 26 (3), 553-558 (2011).
- Wranning, C. A., Akhi, S. N., Kurlberg, G., Brannstrom, M. Uterus transplantation in the rat: Model development, surgical learning and morphological evaluation of healing. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 87 (11), 1239-1247 (2008).
- Brannstrom, M., Wranning, C. A., Altchek, A.
- Diaz-Garcia, C., Akhi, S. N., Wallin, A., Pellicer, A., Brannstrom, M. First report on fertility after allogeneic uterus transplantation. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 89 (11), 1491-1494 (2010).
- R, E., Brown, M. J., Karas, A. Z. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2nd edn. , Elsevier. (2008).
- Donovan, J., Brown, P.
- Rutledge, C., Raper, D. M. S., Abla, A. A. How I do it: superficial temporal artery-middle cerebral artery bypass for flow augmentation and replacement. Acta Neurochirurgica. 162 (8), 1847-1851 (2020).
- Kuo, S. C. -H., et al. The multiple-U technique: a novel microvascular anastomosis technique that guarantees everted anastomosis sites with solid intima-to-intima contact. Plastic and Reconstructive Surgery. 149 (5), 981 (2022).
- Magee, D. J., Manske, R. C. Pathology and Intervention in Musculoskeletal Rehabilitation. 2nd edn. , Elsevier. 25-62 (2016).
- Diaz-Garcia, C., Johannesson, L., Shao, R. J., Bilig, H., Brannstrom, M. Pregnancy after allogeneic uterus transplantation in the rat: perinatal outcome and growth trajectory. Fertility and Sterility. 102 (6), 1545-1552 (2014).
- Canovai, E., et al. IGL-1 as a preservation solution in intestinal transplantation: a multicenter experience. Transplant International. 33 (8), 963-965 (2020).
- Habran, M., De Beule, J., Jochmans, I. IGL-1 preservation solution in kidney and pancreas transplantation: A systematic review. PLoS One. 15 (4), 0231019 (2020).
- Mosbah, I. B., et al. IGL-1 solution reduces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in rat liver transplantation. Cell Death & Disease. 3 (3), 279 (2012).
- Wiederkehr, J. C., et al. Use of IGL-1 preservation solution in liver transplantation. Transplantation Proceedings. 46 (6), 1809-1811 (2014).
- Tilney, N. L., Guttmann, R. D. Effects of initial ischemia/reperfusion injury on the transplanted kidney. Transplantation. 64 (7), 945-947 (1997).
- de Rougemont, O., Dutkowski, P., Clavien, P. A. Biological modulation of liver ischemia-reperfusion injury. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (2), 183-189 (2010).
- Jakubauskiene, L., et al. Relaxin and erythropoietin significantly reduce uterine tissue damage during experimental ischemia-reperfusion injury. International Journal of Molecular Sciences. 23 (13), 7120 (2022).
- Wang, Y., Wu, Y., Peng, S. Resveratrol inhibits the inflammatory response and oxidative stress induced by uterine ischemia reperfusion injury by activating PI3K-AKT pathway. PLoS One. 17 (6), 0266961 (2022).
- Kisu, I., et al. Risks for donors in uterus transplantation. Reproductive Sciences. 20 (12), 1406-1415 (2013).
- Jones, B. P., et al.
