Summary
Het huidige protocol beschrijft de maceratie en reiniging van kadaverbot met een vacuümverzegelde, warmwaterbad-onderdompelingstechniek. Dit is een goedkope, veilige en effectieve methode om anatomische monsters te produceren voor chirurgische planning en medisch onderwijs als alternatief voor driedimensionale (3D) geprinte modellen.
Abstract
Botmodellen dienen vele doelen, waaronder het verbeteren van anatomisch begrip, preoperatieve chirurgische planning en intraoperatieve verwijzing. Verschillende technieken voor de maceratie van zachte weefsels zijn beschreven, voornamelijk voor forensische analyse. Voor klinisch onderzoek en medisch gebruik zijn deze methoden vervangen door driedimensionale (3D) geprinte modellen, die aanzienlijke apparatuur en expertise vereisen en kostbaar zijn. Hier werd het kadaverische schapenwervelbot gereinigd door het monster vacuüm te verzegelen met commercieel afwasmiddel, onder te dompelen in een warmwaterbad en vervolgens het zachte weefsel handmatig te verwijderen. Dit elimineerde de nadelen van de eerder bestaande maceratiemethoden, zoals het bestaan van vieze geuren, het gebruik van gevaarlijke chemicaliën, aanzienlijke apparatuur en hoge kosten. De beschreven techniek produceerde schone, droge monsters met behoud van anatomische details en structuur om de botstructuren nauwkeurig te modelleren die nuttig kunnen zijn voor preoperatieve planning en intraoperatieve verwijzing. De methode is eenvoudig, goedkoop en effectief voor botmodelvoorbereiding voor onderwijs en chirurgische planning in de diergeneeskunde en menselijke geneeskunde.
Introduction
Het verwijderen van zacht weefsel en het reinigen van botten zijn vereist voor forensisch onderzoek, medisch en biologisch onderzoek en veterinair en medisch onderwijs. De meeste technieken zijn ontwikkeld voor forensische doeleinden, waarbij schade aan het bot wordt geminimaliseerd om zoveel mogelijk details te behouden. Dit kan een nauwkeurig, tastbaar botmodel bieden voor preoperatieve chirurgische planning, evenals intraoperatieve besluitvorming om complicaties te minimaliseren 1,2,3. Dit is gunstig in de chirurgie door het verminderen van operatietijden en bloedverlies en het verbeteren van de communicatie tussen chirurgen, in vergelijking met planning met 2D-beelden4. Het gebruik van deze modellen kan ook de afhankelijkheid van intraoperatieve beeldvorming, zoals fluoroscopie, verminderen, wat de blootstelling aan straling voor personeel kan verminderen.
Skeletbot van kadavers is van oudsher gebruikt voor deze modellen; technologische vooruitgang heeft echter geleid tot het gebruik van gefabriceerde modellen en, meer recent, driedimensionale (3D) geprinte modellen. Botmodellen vertrouwen op de beschikbaarheid van kadavermonsters en de efficiëntie van het verwerken van deze monsters tot bruikbare modellen. 3D-printen heeft het voordeel van creatieve vrijheid, waardoor anatomische en patiëntspecifieke modellen mogelijk zijn, vooral wanneer anatomische afwijkingen of neoplasmata aanwezig zijn, of als de hardware moet worden vervaardigd of uitgebreid om bij de patiënt te passen1. Deze monsters kunnen ook worden gesteriliseerd en gemanipuleerd door chirurgen tijdens een procedure. Deze vrijheid brengt echter kosten met zich mee, omdat het computertomografie (CT) -scans vereist, de benodigde materialen en apparatuur duur kunnen zijn en expertise essentieel is om de modellen in de vereiste softwarete maken 1,4. Bovendien kunnen deze factoren de precisie en kwaliteit van het model beperken, en dus de chirurgische planning en het succes1. 3D-geprinte modellen zijn mogelijk niet de beste keuze voor gevallen waarin er geen patiëntspecifieke anatomie nodig is en er een onmiddellijke behoefte is aan het model.
Veelgebruikte methoden voor het verwijderen van zacht weefsel uit kadaverbot omvatten handmatige reiniging, bacteriële maceratie, chemische maceratie, koken en insectenmaceratie 5,6. Het succes van deze methoden is over het algemeen gebaseerd op de kosten, tijd, arbeid, apparatuur, veiligheid en kwaliteit van het eindproduct 5,7. Handmatige reiniging vereist de meeste arbeid en een aanzienlijke hoeveelheid tijd, maar omvat minimale apparatuur5. Bacteriële maceratie bestaat uit het achterlaten van het monster in een koud of warm waterbad voor lange tijd, vaak tot 3 weken, waardoor bacteriën het weefsel kunnen ontbinden6. Dit creëert onaangename geuren, vereist extra apparatuur om de bacteriën te behandelen en creëert een bioveiligheidsrisico voor de gebruiker 5,6. Het gebruik van dermestide kevers is zeer effectief met minimale arbeid, maar vereist de verwerving van een kolonie en het houden van de dieren, en wordt niet beschouwd als een economische investering als het niet vaak wordt gebruikt 6,7. Chemische maceratie omvat meestal het gebruik van enzymen zoals trypsine, pepsine en papaïne, of commerciële detergentia die stoffen zoals oppervlakteactieve stoffen en enzymen bevatten 5,8. Hoewel deze methode snellere resultaten oplevert, kunnen de gebruikte chemicaliën, zoals natriumhydroxide, ammoniak, bleekmiddel en benzine, een gezondheids- en veiligheidsrisico vormen en schadelijke geuren produceren die persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) en een zuurkast vereisen 5,7,8,9. Ten slotte biedt uitgebreide verwarming een andere minimaal intensieve methode, maar kan het geuren produceren die ventilatie vereisen10.
Een eenvoudige, veilige en goedkope methode voor de voorbereiding van anatomische botmodellen zou een nuttig hulpmiddel zijn voor chirurgen, studenten, opvoeders en onderzoekers. Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het voorbereiden van skeletbotmodellen die onaangename geuren en schadelijke chemicaliën vermijdt en een gedetailleerd chirurgisch model produceert met minimale apparatuur en arbeid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lumbale stekels werden geoogst van 4-jarige Merino kruising volwassen ooien (Ovis aries) volgens de ethische richtlijnen van de Animal Care and Ethics Committee van de Surgical and Orthopaedic Research Laboratories. Volgens de institutioneel goedgekeurde methode van humane euthanasie werden de lumbale stekels geoogst met behulp van een scherp dissectie-instrument, eerst ingesneden door de huid en onderhuidse weefsels, gevolgd door fascia en musculatuur voorafgaand aan disarticulatie op de thoracolumbale en lumbosacrale juncties. Een geoogst monster is weergegeven in figuur 1A.
1. Voorbereiding voor het eerste bad
- Verwijder handmatig zacht weefsel (spier, bindweefsel, vet, enz.) met behulp van een scherp dissectiegereedschap (nummer 22 scalpelblad) uit het botmonster voordat u verder verwerkt.
OPMERKING: Deze stap is optioneel; Het verwijderen van zoveel mogelijk zacht weefsel vermindert echter de tijd die het waterbad nodig heeft om de weefsels te macereren. De monstergrootte (~ 20 cm x 10 cm x 8 cm) is ook verkleind; Daarom kunnen er meer monsters in het bad worden geplaatst. - Verzegel het monster in een hitteveilige afsluitbare plastic zak na het verwijderen van de lucht. Het wordt aanbevolen om een vacuümzak te gebruiken met behulp van een commercieel vacuümafdichtingsapparaat (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Er zijn geen additieven nodig voor het eerste bad van 24 uur. Als er een significante spier is die alle oppervlakken van het bot bedekt en als er al minimaal zacht weefsel is en de meeste botoppervlakken van het monster zijn blootgesteld, gaat u verder met stap 3.2 (figuur 1B).
2. Procedure voor het eerste bad
- Dompel het verzegelde monster gedurende 24 uur volledig onder in een waterbad van 70 °C.
- Verwijder na 24 uur de zak uit het bad, open de zak en laat het monster afkoelen tot het hanteerbaar is.
3. Voorbereiding op volgende baden
- Verwijder zoveel mogelijk zacht weefsel van het bot met behulp van een scherp scalpel en stromend water als dat nodig is.
- Disarticulate alle gewrichten met behulp van een scherp scalpel om het kraakbeenweefsel bloot te leggen.
- Houd de gedearticuleerde stukken in situ met behulp van materiaal zoals orthopedische draad- of kabelbinders (zie materiaaltabel) om de anatomische positie te behouden.
- Verzegel het monster in een vacuümzak samen met 10 ml afwasmiddel (zie materiaaltabel) en 10 ml leidingwater.
OPMERKING: Het volume van het wasmiddel is afhankelijk van de sterkte, concentratie en grootte van het monster.
4. Procedure voor volgende baden
- Dompel het verzegelde monster gedurende 24 uur volledig onder in een waterbad van 70 °C.
- Verwijder na 24 uur de zak uit het bad, open de zak en laat het monster afkoelen tot het hanteerbaar is.
- Laat het monster niet volledig afkoelen, omdat hierdoor verzacht kraakbeen kan uitharden en zich aan het bot kan hechten, waardoor het moeilijker wordt om het te verwijderen.
OPMERKING: De tijd die nodig is voor monsterverwerking kan variëren op basis van grootte en type, en herhaalde verwijdering van volgende baden kan onnodig zijn. Bovendien kan het monster langere tijd in het bad blijven, wat kan helpen bij de tussentijdse verwijdering van weefsels.
- Laat het monster niet volledig afkoelen, omdat hierdoor verzacht kraakbeen kan uitharden en zich aan het bot kan hechten, waardoor het moeilijker wordt om het te verwijderen.
- Verwijder zoveel mogelijk zacht weefsel met behulp van een scherp dissectiegereedschap (nummer 22 scalpelmesje op een speciaal scalpelhandvat) en stromend water.
- Herhaal stap 4 indien nodig totdat het bot vrij is van zacht weefselmateriaal. In onze ervaring hoefde dit maar één keer herhaald te worden.
5. Afronding van de procedure
- Was het monster met vloeibaar reinigingsmiddel en spoel grondig af met water.
OPMERKING: Alcohol kan worden gebruikt om het drogen te versnellen. - Laat het monster ongeveer 48 uur drogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens dit protocol werden schone en droge lumbale wervelkolommodellen van schapen gemaakt voor chirurgische planning en referentie. Monsters bestaande uit zeven lendenwervels werden binnen 4 dagen verwerkt met behulp van deze methode, met één eerste bad om het grootste deel van de spier te verwijderen en drie daaropvolgende baden. De voltooiing van de baden werd aangegeven door het gemak waarmee kraakbeen en bindweefsel uit het bot werden verwijderd. Dit varieerde op basis van het type en de locatie van kraakbeen; Dunne lagen werden gemakkelijk verwijderd na een of twee baden, maar dik materiaal omgeven door ander weefsel, zoals tussenwervelschijven, nam drie of vier baden. Na 48 uur drogen werd verwacht dat de botten veel lichter van kleur en gewicht zouden zijn en droog en niet-vettig zouden aanvoelen. De geproduceerde botmodellen bieden een nauwkeurige weergave van de anatomie, met behoud van de fijne botstructuren en contouren van het bot, met name articulaire facetten, de werveleindplaat en transversale processen, in vergelijking met 3D-geprinte modellen. Ter vergelijking: een lumbale schapenrug van een schaap werd CT-gescand met een plakdikte van 0,5 mm, geïmporteerd in 3D-modelleringssoftware (zie Materiaaltabel) en gesegmenteerd om een model van een individuele wervel te produceren. Dit werd vervolgens geprint met acrylonitril butadieen styreen (ABS) filament in een 3D-printer. Figuur 2 toont het 3D-geprinte model van een lumbale wervelkolom van schapen in vergelijking met het anatomische kadavermodel dat wordt geproduceerd uit de vacuümverzegelde warmwaterbadonderdompelingen. De vergelijkende beelden laten zien dat het 3D-geprinte model fijne botachtige details van de kadaverspecimens niet nauwkeurig detailleert, met een verlies van fijnere details zoals contouren van het bot, vooral op de transversale processen.
Figuur 1: Monsters van de lumbale wervelkolom van schapen in verschillende stadia van de verwerking. (A) De vers geoogste lumbale wervelkolom vereist voorbereiding en een eerste bad (stappen 1-2), terwijl (B) het monster met minimaal zacht weefsel kan doorgaan naar volgende baden (stap 3.2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwalitatieve vergelijking tussen 3D-geprinte en cadaverische botmodellen. Een vergelijking van (A,B) een 3D-geprint model en (C,D) een kadaverisch botmodel toont detailverlies op fijnere punten, zoals de uiteinden van transversale processen en facetdetails in het 3D-geprinte model ten opzichte van het bot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schapen lumbale stekels verwerkt met behulp van warmwaterbad onderdompeling. Verwerkte schapen lumbale wervelkolommodellen in dezelfde stap van de verwerking; het monster aan de linkerkant (A) werd echter verwerkt met afwasmiddel en het monster aan de (B) rechterkant was zonder. Het verschil in kleur en textuur moet worden opgemerkt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze technische nota is bedoeld om een eenvoudige, veilige en goedkope methode te beschrijven om een anatomisch botmodel te produceren ten behoeve van veterinair en medisch onderwijs en voor gebruik in anatomisch onderwijs en chirurgische planning.
Pilottests toonden aan dat een badtemperatuur van 70 °C de snelste verwerkingstijd bood zonder schade aan de monsters te veroorzaken. Hogere temperaturen veroorzaakten een uitgebreide afbraak van collageen in het bot, wat resulteerde in broze monsters met een krijtachtige textuur. Het hete bad in dit experiment was specifiek voor het verwerken van 3D-geprinte monsters en werd gebruikt vanwege het gemak; Andere goedkopere commerciële opties, zoals slowcookers of sous-vide-apparaten, kunnen echter toegankelijker zijn.
De toevoeging van wasmiddel was een cruciale stap in het protocol. In vergelijking met monsters zonder reinigingsmiddel verkortte het toevoegen van wasmiddel de voltooiingstijd van 168 uur tot 96 uur. Monsters zonder reinigingsmiddel droogden niet volledig en leken merkbaar donkerder met een vettig gevoel, beide vermoedelijk als gevolg van lipideophoping in het botoppervlak. Voltooide monsters die er donker of vettig uitzien, kunnen erop wijzen dat er behoefte is aan extra wasmiddel (figuur 3). Tijdens proeftests kon wasmiddel alleen niet gelijkmatig door de monsters verspreiden nadat het was verzegeld, waardoor bovendien water moest worden gebruikt. Wanneer water en wasmiddel vóór het sealen aan de zakken werden toegevoegd, was het af en toe moeilijk om een betrouwbare vacuümafdichting te creëren, die kan worden vermeden door vloeistoffen vooraf in te vriezen. Het wasmiddel dat in dit protocol wordt gebruikt, een algemeen afwasmiddel, is gekozen op basis van kosten en beschikbaarheid. Deze methode kan worden uitgevoerd met elk vaatwasmiddel om vergelijkbare resultaten te verkrijgen. Andere multifunctionele huishoudelijke reinigingsmiddelen die 2-butoxyethanol bevatten, kunnen helpen bij het effectiever ontvetten en afbreken van zacht weefsel en kunnen daarom gunstig zijn voor monsters met overmatig of taai kraakbeen, zoals tussenwervelschijven7. Enzymatische reinigingsmiddelen die actief zacht weefsel verteren, kunnen worden gebruikt om de maceratietijd te verkorten in vergelijking met gewone reinigingsmiddelen, maar de effecten kunnen onvoorspelbaar zijn, vooral als de gebruiker niet bekend is met het gebruik ervan 6,10. Hoewel enzymatische maceratie een hoger gezondheidsrisico vormt, heeft het het potentieel om de verwerkingstijd te verkorten van dagen tot uren 5,6. Deze methode heeft ook veel baat bij roeren om een enzymatische reactie met zacht weefsel te bevorderen, die kan worden belemmerd door een gebrek aan stroming in de vacuümverzegelde zak.
De disarticulatie van wervels was aanzienlijk gemakkelijker wanneer wasmiddel werd toegevoegd; Verder waren de tussenwervelschijven na daaropvolgende wasmiddelbaden zachter en gemakkelijker te verwijderen, vermoedelijk vanwege een groter oppervlak voor de penetratie van reinigingsmiddelen zodra ze waren gedearticuleerd. Daarom werden de monsters in een kortere tijd voltooid wanneer ze vooraf werden gedearticuleerd. Evenzo, als de eerste monsters dikke delen kraakbeen bevatten, kan handmatige verwijdering tussen de baden nodig zijn om de penetratie van reinigingsmiddelen te bevorderen. Bovendien is aangetoond dat het roeren van een typisch maceratiebad de benodigde tijd aanzienlijk verkort, maar dit is niet mogelijk met monsters in zakken10. Het toevoegen van wasmiddel met kleine hoeveelheden water in de zak en het zo vroeg mogelijk verwijderen van gewrichten kan de impact van deze beperkingen verminderen.
Een andere cruciale stap was om te voorkomen dat monsters na verwijdering uit het hete bad afkoelden tot kamertemperatuur, omdat restwarmte het verzachte kraakbeen gemakkelijker uit de monsters kon verwijderen. Wanneer het kraakbeen werd afgekoeld, vormde het een taaie, gelatineachtige coating op het bot die moeilijk te verwijderen was zonder het monster opnieuw op te warmen. Om dezelfde reden, als stromend water wordt gebruikt om het verwijderen van zacht weefsel te helpen, wordt het aanbevolen om warm water te gebruiken.
In tegenstelling tot 3D-geprinte modellen, produceert deze methode botmonsters om echte onderwerpen te repliceren voor chirurgische planning. Het gebruik van zachte reinigingsmiddelen bij deze methode kan veranderingen in de integriteit van het botoppervlak voorkomen, zoals te zien is bij het gebruik van alternatieve producten zoals bleekmiddel en waterstofperoxide6. Met verdere ontwikkelingen in 3D-printen voor medisch onderzoek, kunnen modellen worden geprint met aangepaste parameters zoals corticale dikte, waarvan is aangetoond dat ze een positieve haptische simulatie bieden van de plaatsing van de pedikelschroef in spinale chirurgie11. Deze monsters kunnen echter duur zijn om te produceren en vereisen specifieke software en apparatuur, evenals een zorgvuldige planning en verwerking11,12. Bovendien wordt de kwaliteit van 3D-geprinte modellen beperkt door de apparatuur en kan het risico lopen dat fijnere details verloren gaan die bewaard blijven in het botmonster13. Patiëntspecifieke en 3D-geprinte modellen hebben verschillende praktische toepassingen, terwijl anatomische modellen afkomstig van bot ongeëvenaarde anatomische details kunnen bieden met minimale kosten en apparatuur.
Beperkingen van deze methode omvatten de beschikbaarheid van kadaverspecimens die specifiek zijn voor hun toepassing. De beschreven methode verwijdert volledig zacht weefsel van bot, waardoor modellen worden gemaakt die alleen kunnen worden gebruikt voor chirurgische planning met betrekking tot bot, en is niet zo praktisch voor het visualiseren van articulatie, biomechanica of omliggende structuren. Vanwege dit verlies van articulatie kan reconstructie van modellen nodig zijn. De reconstructiemethode varieert met het bottype en kan siliconen, draad, kabelbinders of lijm bevatten. Terwijl ze de relatieve locaties van de botten benaderen, kunnen deze technieken de in vivo mechanica niet repliceren en de vertaling naar de chirurgische praktijk verminderen. Andere beperkingen zijn de tijd die nodig is om overtollige zachte weefsels uit grote monsters te verwijderen, evenals kraakbeen en andere zachte weefsels, indien aanwezig, op basis van het anatomische gebied van het monster.
Het vermogen om eenvoudige botmodellen te produceren kan het chirurgische succes aanzienlijk beïnvloeden. Modellen voor chirurgische planning hebben bewezen voordelen, waaronder kortere chirurgische tijd, nauwkeurigere plaatsing van schroeven en implantaten en minder complicaties zoals bloedverlies4. Dit is vooral handig in het geval van veterinaire chirurgie, waar de anatomie sterk varieert per soort. Dit eenvoudige protocol heeft het potentieel om schone botmodellen van kadavers te produceren zonder gevaarlijke chemicaliën en constante geuren en vereist minimale apparatuur en arbeid, vooral in vergelijking met moderne 3D-printtechnieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs moeten openheid van zaken geven.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimension Elite 3D printer | Stratasys, Eden Prairie, MN, United States | 3D printer for production of surgical bone models based on reconstructed CT scans | |
| Mimics Innovation Suite | Materialise NV, Leuven, Belgium | Suite 24 | Software to create 3D models from imaging scans |
| Nylon cable ties | 4Cabling, Alexandria, NSW, Australia | 011.060.1042/011.060.1039 | Used to maintain connection between vertebral bodies |
| Orthopaedic wire | B Braun, Bella Vista, NSW, Australia | Used to maintain connection between vertebral bodies | |
| Support Cleaning Apparatus | Phoenix Analysis and Design Technologies, Tempe, AZ, United States | SCA-1200 | Hot water bath for immersion of the sealed sample. |
| Ultra Strength Original Dishwashing Liquid | Colgate-Palmolive, New York, NY, United States | Dishwashing liquid added to sealed bag with sample for cleaning of the bone model. | |
| Vacuum bags | Pacfood PTY LTD | Heat safe, sealable plastic bags | |
| Vacuum Food sealer | Tempoo (Aust) PTY LTD | Vacuum food sealer to seal vacuum bags prior to bath immersion |
References
- Leary, O. P., et al. Three-dimensional printed anatomic modeling for surgical planning and real-time operative guidance in complex primary spinal column tumors: single-center experience and case series. World Neurosurgery. 145, 116-126 (2021).
- Tack, P., Victor, J., Gemmel, P., Annemans, L. 3D-printing techniques in a medical setting: a systematic literature review. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 115 (2016).
- Ventola, C. L. Medical applications for 3D printing: current and projected uses. Pharmacy and Therapeutics. 39 (10), 704-711 (2014).
- Wilcox, B., Mobbs, R. J., Wu, A. M., Phan, K. Systematic review of 3D printing in spinal surgery: the current state of play. Journal of Spinal Surgery. 3 (3), 433-443 (2017).
- Mairs, S., Swift, B., Rutty, G. N. Detergent: an alternative approach to traditional bone cleaning methods for forensic practice. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 25 (4), 276-284 (2004).
- Husch, C., Berner, M., Goldammer, H., Lichtscheidl-Schultz, I. Technical note: A novel method for gentle and non-destructive removal of flesh from bones. Forensic Science International. 323, 110778 (2021).
- Couse, T., Connor, M. A comparison of maceration techniques for use in forensic skeletal preparations. Journal of Forensic Investigation. 3, 1-6 (2015).
- Mahon, T. J., Maboke, N., Myburgh, J. The use of different detergents in skeletal preparations. Forensic Science International. 327, 110967 (2021).
- Hussain, M., Hussain, N., Zainab, H., Qaiser, S. Skeletal preservation techniques to enhance veterinary anatomy teaching. IJAVMS. 1, 21-23 (2007).
- Simonsen, K. P., Rasmussen, A. R., Mathisen, P., Petersen, H., Borup, F. A fast preparation of skeletal materials using enzyme maceration. Journal of Forensic Science. 56 (2), 480-484 (2011).
- Burkhard, M., Furnstahl, P., Farshad, M. Three-dimensionally printed vertebrae with different bone densities for surgical training. European Spine Journal. 28 (4), 798-806 (2019).
- Rose, A. S., et al. Multi-material 3D models for temporal bone surgical simulation. The Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 124 (7), 528-536 (2015).
- Werz, S. M., Zeichner, S. J., Berg, B. I., Zeilhofer, H. F., Thieringer, F. 3D printed surgical simulation models as educational tool by maxillofacial surgeons. European Journal of Dental Education. 22 (3), 500-505 (2018).
