Summary
Denne protokollen beskriver maserasjon og rengjøring av kadaverisk bein med en vakuumforseglet nedsenkingsteknikk for varmtvannsbad. Dette er en billig, sikker og effektiv metode for å produsere anatomiske prøver for kirurgisk planlegging og medisinsk utdanning som et alternativ til tredimensjonale (3D) trykte modeller.
Abstract
Benmodeller tjener mange formål, inkludert forbedring av anatomisk forståelse, preoperativ kirurgisk planlegging og intraoperativ referanse. Flere teknikker for maserasjon av bløtvev er beskrevet, hovedsakelig for rettsmedisinske analyser. For klinisk forskning og medisinsk bruk har disse metodene blitt erstattet av tredimensjonale (3D) trykte modeller, som krever betydelig utstyr og kompetanse, og er kostbare. Her ble kadaveriske sauevirvelbein rengjort ved vakuumforsegling av prøven med kommersielt oppvaskmiddel, nedsenking i et varmtvannsbad og deretter manuelt fjerning av bløtvevet. Dette eliminerte ulempene med de tidligere eksisterende maserasjonsmetodene, for eksempel eksistensen av dårlig lukt, bruk av farlige kjemikalier, betydelig utstyr og høye kostnader. Den beskrevne teknikken produserte rene, tørre prøver samtidig som anatomiske detaljer og struktur ble opprettholdt for nøyaktig modellering av øsestrukturer som kan være nyttige for preoperativ planlegging og intraoperativ referanse. Metoden er enkel, billig og effektiv for benmodellforberedelse for utdanning og kirurgisk planlegging innen veterinær- og humanmedisin.
Introduction
Fjerning av bløtvev og rengjøringsben er nødvendig for rettsmedisin, medisinsk og biologisk forskning, og veterinær og medisinsk utdanning. De fleste teknikker er utviklet for rettsmedisinske formål, og minimerer skade på beinet for å bevare så mange detaljer som mulig. Dette kan gi en nøyaktig, håndgripelig beinmodell for preoperativ kirurgisk planlegging, samt intraoperativ beslutningstaking for å minimere komplikasjoner 1,2,3. Dette er gunstig i kirurgi ved å redusere operasjonstider og blodtap og forbedre kommunikasjonen mellom kirurger, sammenlignet med planlegging med 2D-bilder4. Bruken av disse modellene kan også redusere avhengigheten av intraoperativ bildebehandling, for eksempel fluoroskopi, noe som kan redusere strålingseksponering for personell.
Skjelettbein fra har historisk blitt brukt til disse modellene; Imidlertid har teknologiske fremskritt presset mot bruk av produserte modeller og, mer nylig, tredimensjonale (3D) trykte modeller. Benmodeller er avhengige av tilgjengeligheten av kadaveriske prøver og effektiviteten ved å behandle disse prøvene til brukbare modeller. 3D-utskrift har fordelen av kreativ frihet, noe som muliggjør anatomiske og pasientspesifikke modeller, spesielt når anatomiske abnormiteter eller neoplasmer er til stede, eller hvis maskinvaren må produseres eller utvides for å passe pasienten1. Disse prøvene er også i stand til å bli sterilisert og manipulert av kirurger under en prosedyre. Denne friheten kommer imidlertid med en kostnad, da den krever CT-skanning (computertomografi), materialene og utstyret som kreves kan være dyrt, og ekspertise er avgjørende for å lage modellene i den nødvendige programvaren 1,4. I tillegg kan disse faktorene begrense presisjonen og kvaliteten på modellen, og dermed den kirurgiske planleggingen og suksessen1. 3D-printede modeller er kanskje ikke det beste valget for tilfeller der det ikke er behov for pasientspesifikk anatomi og hvor det er et umiddelbart behov for modellen.
Vanlige metoder for fjerning av bløtvev fra kadaverisk bein inkluderer manuell rengjøring, bakteriell maserasjon, kjemisk maserasjon, matlaging og insektmaserasjon 5,6. Suksessen til disse metodene er generelt basert på kostnad, tid, arbeidskraft, utstyr, sikkerhet og kvalitet på sluttproduktet 5,7. Manuell rengjøring krever mest arbeidskraft og betydelig tid, men innebærer minimalt med utstyr5. Bakteriell maserasjon består i å la prøven stå i et kaldt eller varmt vannbad i lange perioder, ofte opptil 3 uker, slik at bakterier kan bryte ned vevet6. Dette skaper ubehagelig lukt, krever ekstra utstyr for å behandle bakteriene, og skaper en biosikkerhetsfare for brukeren 5,6. Bruken av dermestidbiller er svært effektiv med minimal arbeidskraft, men krever anskaffelse av en koloni og husdyrhold av dyrene, og regnes ikke som en økonomisk investering hvis den brukes sjelden 6,7. Kjemisk maserasjon innebærer vanligvis bruk av enzymer som trypsin, pepsin og papain, eller kommersielle vaskemidler som inneholder stoffer som overflateaktive midler og enzymer 5,8. Selv om denne metoden gir raskere resultater, kan kjemikaliene som brukes, som natriumhydroksid, ammoniakk, blekemiddel og bensin, utgjøre en helse- og sikkerhetsrisiko og produsere skadelig lukt som krever personlig verneutstyr (PPE) og en avtrekkshette 5,7,8,9. Til slutt gir utvidet oppvarming en annen minimalt intensiv metode, men kan gi lukt som krever ventilasjon10.
En enkel, sikker og rimelig metode for fremstilling av anatomiske beinmodeller vil gi et nyttig verktøy for kirurger, studenter, lærere og forskere. Denne artikkelen beskriver en ny metode for å forberede skjelettbenmodeller som unngår ubehagelig lukt og skadelige kjemikalier, og produserer en detaljert kirurgisk modell med minimalt utstyr og arbeidskraft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lumbale pigger ble høstet fra 4 år gamle merino cross adult ewes (Ovis aries) etter de etiske retningslinjene fra Animal Care and Ethics Committee of the Surgical and Orthopedic Research Laboratories. Etter den institusjonelt godkjente metoden for human eutanasi ble spinalryggene høstet med et skarpt disseksjonsverktøy, først snittet gjennom hud og subkutant vev, etterfulgt av fascie og muskulatur før disartikulasjon i thoracolumbal- og lumbosakralovergangene. En høstet prøve er vist i figur 1A.
1. Forberedelse til det første badet
- Fjern bløtvev (muskel, bindevev, fett, etc.) manuelt ved hjelp av et skarpt disseksjonsverktøy (nummer 22 skalpellblad) fra beinprøven før du behandler videre.
MERK: Dette trinnet er valgfritt. Men å fjerne så mye bløtvev som mulig reduserer tiden vannbadet tar å maserere vevet. Prøvestørrelsen (~20 cm x 10 cm x 8 cm) reduseres også; Derfor kan flere prøver monteres i badekaret. - Forsegl prøven i en varmesikker, forseglbar plastpose etter at luften er fjernet. Det anbefales å bruke en vakuumpose ved hjelp av en kommersiell vakuumforseglingsanordning (se materialfortegnelse).
MERK: Ingen tilsetningsstoffer er nødvendig for det første 24-timers badet. Hvis det er betydelig muskel som dekker alle benoverflater, og hvis det allerede er minimalt med bløtvev og de fleste beinoverflatene i prøven er eksponert, fortsett til trinn 3.2 (figur 1B).
2. Prosedyre for det første badet
- Senk den forseglede prøven helt ned i et vannbad på 70 °C i 24 timer.
- Etter 24 timer, fjern posen fra badekaret, åpne posen og la prøven avkjøles til den kan håndteres.
3. Forberedelse for påfølgende bad
- Fjern så mye bløtvev fra beinet som mulig ved hjelp av en skarp skalpell og rennende vann etter behov.
- Disartikulere eventuelle ledd ved hjelp av en skarp skalpell for å avsløre bruskvævet.
- Hold de disartikulerte delene in situ ved hjelp av materiale som ortopedisk ledning eller kabelbånd (se materialfortegnelsen) for å opprettholde den anatomiske posisjonen.
- Forsegl prøven i en vakuumpose sammen med 10 ml oppvaskmiddel (se materialfortegnelse) og 10 ml vann fra springen.
MERK: Volumet av vaskemiddel avhenger av prøvens styrke, konsentrasjon og størrelse.
4. Prosedyre for etterfølgende bad
- Senk den forseglede prøven helt ned i et vannbad på 70 °C i 24 timer.
- Etter 24 timer, fjern posen fra badekaret, åpne posen og la prøven avkjøles til den kan håndteres.
- Unngå å la prøven avkjøles helt, da dette gjør at myknet brusk kan herdes og feste seg til bein, og blir vanskeligere å fjerne.
MERK: Tiden som kreves for prøvebehandling kan variere avhengig av størrelse og type, og gjentatt fjerning av påfølgende bad kan være unødvendig. I tillegg kan prøven forbli i badekaret i lengre perioder, noe som kan hjelpe til med midlertidig fjerning av vev.
- Unngå å la prøven avkjøles helt, da dette gjør at myknet brusk kan herdes og feste seg til bein, og blir vanskeligere å fjerne.
- Fjern så mye bløtvev som mulig ved hjelp av et skarpt disseksjonsverktøy (skalpellblad nummer 22 på et dedikert skalpellhåndtak) og rennende vann.
- Gjenta trinn 4 etter behov til benet er fritt for bløtvevsmateriale. Etter vår erfaring måtte dette bare gjentas én gang.
5. Gjennomføring av prosedyren
- Vask prøven med flytende vaskemiddel og skyll grundig med vann.
MERK: Alkohol kan brukes til hurtigtørking. - La prøven tørke i ca. 48 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter denne protokollen ble rene og tørre sauer lumbale vertebrale kolonnemodeller opprettet for kirurgisk planlegging og referanse. Prøver bestående av syv lumbale ryggvirvler ble behandlet innen 4 dager ved hjelp av denne metoden, med ett innledende bad for å fjerne hoveddelen av muskelen og tre påfølgende bad. Fullføring av badene ble indikert ved hvor enkelt brusk og bindevev ble fjernet fra beinet. Dette varierte ut fra bruskens type og lokalisasjon; Tynne lag ble lett fjernet etter ett eller to bad, men tykt materiale omgitt av annet vev, som mellomvirvelskiver, tok tre eller fire bad. Etter tørking i 48 timer ble beinene forventet å være mye lettere i farge og vekt og føles tørre og ikke-fettete. De produserte beinmodellene gir en nøyaktig representasjon av anatomien, og bevarer de fine osseøse strukturer og konturer av beinet, spesielt leddfasetter, vertebrale endeplater og tverrgående prosesser, sammenlignet med 3D-trykte modeller. Til sammenligning ble en sau lumbal sauerygg CT-skannet ved en 0,5 mm skivetykkelse, importert til 3D-modelleringsprogramvare (se materialtabell), og segmentert for å produsere en modell av en individuell ryggvirvel. Dette ble deretter skrevet ut ved hjelp av akrylnitrilbutadienstyren (ABS) filament i en 3D-printer. Figur 2 viser den 3D-printede modellen av en sau lumbale ryggrad sammenlignet med den anatomiske kadaveriske modellen produsert fra vakuumforseglet varmtvannsbad nedsenking. De komparative bildene viser at den 3D-printede modellen ikke nøyaktig beskriver fine beneous detaljer av kadaveriske prøver, med tap av finere detaljer som konturer av beinet, spesielt på de tverrgående prosessene.
Figur 1: Prøver av lumbalcolumna hos sau på ulike stadier under prosessering. (A) Den nyhøstede lumbale ryggraden krever forberedelse og et innledende bad (trinn 1-2), mens (B) prøven med minimalt bløtvev kan gå videre til påfølgende bad (trinn 3.2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kvalitativ sammenligning mellom 3D-printede og kadaveriske beinmodeller. En sammenligning av (A,B) en 3D-printet modell og (C,D) en kadaverisk beinmodell demonstrerer tap av detaljer på finere punkter, for eksempel endene av tverrgående prosesser og fasettdetaljer i den 3D-printede modellen i forhold til beinet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sauer lumbale spines behandlet ved nedsenking i varmt vannbad. Behandlede sauer lumbale ryggradsmodeller på samme trinn i behandlingen; Prøven på (A) venstre side ble imidlertid behandlet med vaskemiddel, og prøven på (B) høyre side var uten. Forskjellen i farge og tekstur må noteres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette tekniske notatet tar sikte på å beskrive en enkel, sikker og billig metode for å produsere en anatomisk beinmodell til fordel for veterinær og medisinsk utdanning og til bruk i anatomisk utdanning og kirurgisk planlegging.
Pilottesting fant at en badetemperatur på 70 °C ga den raskeste behandlingstiden uten å forårsake skade på prøvene. Høyere temperaturer forårsaket en omfattende nedbrytning av kollagen i beinet, noe som resulterte i sprø prøver med kalkaktig tekstur. Det varme badet i dette eksperimentet var spesielt for behandling av 3D-printede prøver og ble brukt på grunn av dets bekvemmelighet; Imidlertid kan andre rimeligere kommersielle alternativer, for eksempel sakte komfyrer eller sous vide-enheter, være mer tilgjengelige.
Tilsetningen av vaskemiddel var et kritisk skritt i protokollen. Sammenlignet med prøver uten vaskemiddel, reduserte tilsetning av vaskemiddel fullføringstiden fra 168 timer til 96 timer. Prøver uten vaskemiddel tørket ikke helt og virket merkbart mørkere med en fet følelse, begge antagelig på grunn av lipidakkumulering i beinoverflaten. Ferdige prøver som virker mørke eller fete, kan indikere behov for ekstra vaskemiddel (figur 3). Under pilottestingen klarte ikke vaskemiddelet alene å spre seg jevnt gjennom prøvene når de var forseglet, noe som i tillegg nødvendiggjorde bruk av vann. Når vann og vaskemiddel ble tilsatt posene før forsegling, var det tidvis vanskelig å skape en pålitelig vakuumforsegling, som kan unngås ved å fryse væsker på forhånd. Vaskemiddelet som brukes i denne protokollen, et generelt oppvaskmiddel, ble valgt basert på kostnad og tilgjengelighet. Denne metoden kan utføres ved bruk av et hvilket som helst oppvaskmiddel for å oppnå lignende resultater. Andre flerbruksrengjøringsmidler som inneholder 2-butoksyetanol kan hjelpe til med avfetting og nedbrytning av bløtvev mer effektivt, og kan derfor være gunstig for prøver med overdreven eller tøff brusk, for eksempel mellomvirvelskiver7. Enzymatiske vaskemidler som aktivt fordøyer bløtvev kan brukes til å redusere maserasjonstiden sammenlignet med vanlige rengjøringsmidler, men effektene kan være uforutsigbare, spesielt hvis brukeren ikke er kjent med bruken 6,10. Mens enzymatisk maserasjon utgjør en høyere helserisiko, har den potensial til å redusere behandlingstiden fra dager til timer 5,6. Denne metoden har også stor nytte av omrøring for å fremme en enzymatisk reaksjon med bløtvev, noe som kan hindres av mangel på strømning i den vakuumforseglede posen.
Disartikuleringen av ryggvirvlene var spesielt lettere når vaskemiddel ble tilsatt; Videre, etter påfølgende vaskemiddelbad, var mellomvirvelskivene mykere og lettere å fjerne, antagelig på grunn av et høyere overflateareal for vaskemiddelpenetrasjon når de var disartikulert. Derfor ble prøvene ferdigstilt på kortere tid når de ble disartikulert på forhånd. På samme måte, hvis de første prøvene inneholdt tykke områder av brusk, kan manuell fjerning være nødvendig mellom badene for å fremme vaskemiddelpenetrasjon. I tillegg har omrøring av et typisk maserasjonsbad vist seg å redusere tiden som kreves betydelig, men dette er ikke mulig med poseprøver10. Tilsetning av vaskemiddel med små mengder vann i posen og disartikulerende ledd så tidlig som mulig kan redusere virkningen av disse begrensningene.
Et annet kritisk skritt var å unngå å la prøvene avkjøles til romtemperatur etter fjerning fra det varme badet, da restvarme tillot lettere fjerning av myknet brusk fra prøvene. Når den ble avkjølt, dannet denne brusken et tøft, gelatinøst belegg på beinet som var vanskelig å fjerne uten å varme opp prøven. Av samme grunn, hvis rennende vann brukes til å hjelpe fjerning av bløtvev, anbefales det å bruke varmt vann.
I motsetning til 3D-printede modeller, produserer denne metoden beinprøver for å replikere virkelige for kirurgisk planlegging. Bruk av milde vaskemidler i denne metoden kan unngå endringer i benoverflatens integritet, som sett ved bruk av alternative produkter som blekemiddel og hydrogenperoksid6. Med videre utvikling innen 3D-printing for medisinsk forskning, kan modeller skrives ut med tilpassede parametere som kortikal tykkelse, som har vist seg å gi en positiv haptisk simulering av pedicle skrueplassering i ryggkirurgi11. Imidlertid kan disse prøvene være dyre å produsere og krever spesifikk programvare og utstyr, samt grundig planlegging og behandling11,12. I tillegg er kvaliteten på 3D-printede modeller begrenset av utstyret og kan risikere tap av finere detaljer som er bevart i beinprøven13. Pasientspesifikke og 3D-printede modeller har flere praktiske anvendelser, mens anatomiske modeller hentet fra bein kan gi uovertruffen anatomisk detalj med minimal kostnad og utstyr.
Begrensninger av denne metoden inkluderer tilgjengeligheten av kadaveriske prøver som er spesifikke for deres anvendelse. Den beskrevne metoden fjerner helt bløtvev fra bein, og skaper modeller som kun kan brukes til kirurgisk planlegging relatert til bein, og er ikke like praktisk for å visualisere artikulasjon, biomekanikk eller omgivende strukturer. På grunn av dette tapet av artikulasjon kan det være nødvendig med rekonstruksjon av modeller. Rekonstruksjonsmetoden varierer med beintypen, og kan inkludere silikon, ledning, kabelbånd eller lim. Mens de tilnærmer seg de relative plasseringene av beinene, kan disse teknikkene ikke replikere in vivo-mekanikk og redusere oversettelse til kirurgisk praksis. Andre begrensninger inkluderer tiden det tar å fjerne overflødig bløtvev fra store prøver, samt brusk og annet bløtvev, hvis det er tilstede, basert på prøvens anatomiske region.
Evnen til å produsere enkle beinmodeller kan påvirke kirurgisk suksess betydelig. Modeller for kirurgisk planlegging har dokumenterte fordeler, inkludert redusert kirurgisk tid, mer nøyaktig plassering av skruer og implantater, og færre komplikasjoner som blodtap4. Dette er spesielt nyttig når det gjelder veterinærkirurgi, hvor anatomien varierer sterkt etter art. Denne enkle protokollen har potensial til å produsere rene beinmodeller fra uten farlige kjemikalier og konstant lukt og krever minimalt med utstyr og arbeidskraft, spesielt sammenlignet med moderne 3D-utskriftsteknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne må avsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimension Elite 3D printer | Stratasys, Eden Prairie, MN, United States | 3D printer for production of surgical bone models based on reconstructed CT scans | |
| Mimics Innovation Suite | Materialise NV, Leuven, Belgium | Suite 24 | Software to create 3D models from imaging scans |
| Nylon cable ties | 4Cabling, Alexandria, NSW, Australia | 011.060.1042/011.060.1039 | Used to maintain connection between vertebral bodies |
| Orthopaedic wire | B Braun, Bella Vista, NSW, Australia | Used to maintain connection between vertebral bodies | |
| Support Cleaning Apparatus | Phoenix Analysis and Design Technologies, Tempe, AZ, United States | SCA-1200 | Hot water bath for immersion of the sealed sample. |
| Ultra Strength Original Dishwashing Liquid | Colgate-Palmolive, New York, NY, United States | Dishwashing liquid added to sealed bag with sample for cleaning of the bone model. | |
| Vacuum bags | Pacfood PTY LTD | Heat safe, sealable plastic bags | |
| Vacuum Food sealer | Tempoo (Aust) PTY LTD | Vacuum food sealer to seal vacuum bags prior to bath immersion |
References
- Leary, O. P., et al. Three-dimensional printed anatomic modeling for surgical planning and real-time operative guidance in complex primary spinal column tumors: single-center experience and case series. World Neurosurgery. 145, 116-126 (2021).
- Tack, P., Victor, J., Gemmel, P., Annemans, L. 3D-printing techniques in a medical setting: a systematic literature review. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 115 (2016).
- Ventola, C. L. Medical applications for 3D printing: current and projected uses. Pharmacy and Therapeutics. 39 (10), 704-711 (2014).
- Wilcox, B., Mobbs, R. J., Wu, A. M., Phan, K. Systematic review of 3D printing in spinal surgery: the current state of play. Journal of Spinal Surgery. 3 (3), 433-443 (2017).
- Mairs, S., Swift, B., Rutty, G. N. Detergent: an alternative approach to traditional bone cleaning methods for forensic practice. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 25 (4), 276-284 (2004).
- Husch, C., Berner, M., Goldammer, H., Lichtscheidl-Schultz, I. Technical note: A novel method for gentle and non-destructive removal of flesh from bones. Forensic Science International. 323, 110778 (2021).
- Couse, T., Connor, M. A comparison of maceration techniques for use in forensic skeletal preparations. Journal of Forensic Investigation. 3, 1-6 (2015).
- Mahon, T. J., Maboke, N., Myburgh, J. The use of different detergents in skeletal preparations. Forensic Science International. 327, 110967 (2021).
- Hussain, M., Hussain, N., Zainab, H., Qaiser, S. Skeletal preservation techniques to enhance veterinary anatomy teaching. IJAVMS. 1, 21-23 (2007).
- Simonsen, K. P., Rasmussen, A. R., Mathisen, P., Petersen, H., Borup, F. A fast preparation of skeletal materials using enzyme maceration. Journal of Forensic Science. 56 (2), 480-484 (2011).
- Burkhard, M., Furnstahl, P., Farshad, M. Three-dimensionally printed vertebrae with different bone densities for surgical training. European Spine Journal. 28 (4), 798-806 (2019).
- Rose, A. S., et al. Multi-material 3D models for temporal bone surgical simulation. The Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 124 (7), 528-536 (2015).
- Werz, S. M., Zeichner, S. J., Berg, B. I., Zeilhofer, H. F., Thieringer, F. 3D printed surgical simulation models as educational tool by maxillofacial surgeons. European Journal of Dental Education. 22 (3), 500-505 (2018).
