Summary
在背根神经节和雪旺细胞的共培养系统中，可以研究周围神经系统的髓鞘形成。该模型为观察和量化外周髓鞘形成以及研究目标化合物对髓鞘的影响提供了实验机会。
Abstract
髓鞘形成过程对于在神经系统中实现快速和充分的信号转导至关重要。在周围神经系统中，神经元和雪旺细胞进行复杂的相互作用以控制轴突的髓鞘形成。这种相互作用的紊乱和髓鞘的分解是炎症性神经病的标志，继发于神经退行性疾病。在这里，我们提出了背根神经节外植体和雪旺细胞的共培养模型，该模型开发了强大的外周轴突髓鞘形成，以研究周围神经系统中的髓鞘形成过程，研究轴突 - 雪旺细胞相互作用，并分别评估治疗剂对每种细胞类型的潜在影响。方法学上，收获胚胎大鼠（E13.5）的背根神经节，从其周围组织中分离，并作为整个外植体培养3天。从3周龄的成年大鼠中分离雪旺细胞，并对坐骨神经进行酶消化。所得雪旺细胞通过磁激活细胞分选纯化，并在神经调节素和毛喉素富集条件下培养。背根神经节外植体培养3天后，在含有抗坏血酸的培养基中将30，000个雪旺细胞加入到一个背根神经节外植体中。在共培养的第10天，通过免疫细胞化学染色中髓鞘碱性蛋白的散射信号检测到髓鞘形成的最初迹象。从第14天开始，髓鞘形成并沿轴突繁殖。髓鞘形成可以通过髓鞘碱性蛋白染色作为髓鞘形成面积和轴突面积的比率来量化，以解释轴突密度的差异。该模型为体外研究 外周髓鞘形成的各个方面提供了实验机会，这对于理解周围神经系统炎症和神经退行性疾病中脱髓鞘和神经变性的病理学和可能的治疗机会至关重要。
Introduction
在周围神经系统（PNS）中，快速信息转导由髓磷脂包裹的轴突介导。轴突的髓鞘形成对于电脉冲的快速传播至关重要，因为神经纤维的传导速度与轴突直径和髓鞘厚度相关1.从外围到中枢神经系统（CNS）的感觉信号依赖于位于背根增大中的一级感觉神经元的激活，称为背根神经节（DRG）。为了形成和维持髓磷脂，轴突和雪旺细胞（PNS中的髓鞘胶质细胞）之间的连续通信是强制性的2。
PNS的许多疾病会干扰原发性轴突或脱髓鞘损伤的信息转导，导致感觉迟钝或感觉迟钝。一级感觉神经元具有在神经元损伤后通过神经元与周围雪旺细胞之间的复杂相互作用再生一定程度的能力3。在这种情况下，雪旺细胞可以进行细胞重编程以清除轴突和髓鞘碎片并促进轴突再生，从而导致髓鞘再生4。了解髓鞘形成在健康和疾病中的机制很重要，以便找到PNS脱髓鞘疾病的可能治疗方案。髓磷脂也可能因急性神经创伤而受损，促进髓鞘形成以促进周围神经损伤后功能恢复的方法正在研究中5。
我们对外周髓鞘形成的了解在很大程度上受益于雪旺细胞和感觉神经元的髓鞘共培养。自从应用第一种方法6，7，8以来，使用不同的共培养系统对髓鞘形成进行了深入研究9，10，11。在这里，我们为背根神经节轴突的稳健体外髓鞘形成提供了一种快速简便的方案。雪旺细胞制备的方案基于Andersen等人12的方案，该方案先前发表在Pitarokoili等人13上。我们使用来自幼年大鼠的雪旺细胞和胚胎DRG外植体培养物进行共培养，其中髓鞘形成发生在第14天左右。该方法的目标是提供一个系统来研究由于直接轴突 - 雪旺细胞相互作用而导致髓磷脂的形成，并研究PNS髓鞘形成的调节剂。与解离的神经元细胞培养物相比，DRG外植体在解剖学上保存得更多，并形成长轴突过程。有髓鞘轴突区域的定量为共培养中的髓鞘形成提供了足够的读数。该方法是筛选治疗性化合物对PNS髓鞘形成的潜在影响的宝贵工具，并且还可以用于动物模型中的体内研究14。
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Protocol
所有程序均按照欧洲共同体理事会关于实验动物护理和使用指令执行。
1. 雪旺细胞培养
- 雪旺细胞培养包衣
- 在无菌条件下涂覆细胞培养皿。将 2 mL 的 0.01% 聚-L-赖氨酸 （PLL） 分别施用到两个 60 mm 组织培养 （TC） 培养皿中，并在 4 °C 下孵育过夜。
- 取出PLL，用蒸馏水清洗TC培养皿2x，并在4°C下用2mL的1μg/ cm2 层粘连蛋白孵育过夜。 用水洗 2 倍 TC 盘子，让盘子风干。
- 雪旺细胞培养基制备
- 在无菌条件下，将 10% 热灭活胎牛血清 （FCS）、2 μM 佛司可林、10 nM 神经调节素和 50 μg/mL 庆大霉素添加到 Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM）/F-12（高葡萄糖）中，制备 50 mL 雪旺细胞培养基。
- 在无菌条件下用 50 μg/mL 庆大霉素制备 70 mL 莱博维茨 L-15 培养基。
- 坐骨神经准备
注意：所有坐骨神经准备步骤均在干净的工作台上进行。- 准备一个 100 mm TC 培养皿，其中含有 5 mL 冰冷的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS），不含Ca 2+ 和 Mg2+，一个 100 mm TC 培养皿，加入 5 mL 冰冷的 Leibovitz L-15 培养基和 50 μg/mL 庆大霉素。
- 通过高压灭菌清洁所有仪器。用70%乙醇喷洒仪器和工作区域。
- 使用CO2 吸入和斩首对五只3周大的雄性Sprague Dawley大鼠实施安乐死。用70%乙醇喷洒大鼠的躯干。
- 用剪刀打开左下肢背侧，小心取出股二头肌。用弯曲的镊子平滑抬高坐骨神经，确保不会瘀伤神经。
- 用弯曲的镊子握住神经的最近端以拉直神经，并用剪刀将神经夹得尽可能高。然后，用剪刀夹住靠近骶丛和爪子的神经。对右侧重复步骤 1.3.4-1.3.5。
注意：打开肢体时，请注意不要瘀伤任何血管。 - 使用镊子，将左右坐骨神经放入带有冰冷DPBS的100 mm TC培养皿中。
- 坐骨神经翻新术
- 使用镊子将所有神经转移到装有冰冷的莱博维茨 L-15 培养基和 50 μg/mL 庆大霉素的 100 mm TC 培养皿中。继续使用体视显微镜，用两对细镊子从神经中去除脂肪、肌肉和血管。用镊子抓住神经，并将它们转移到装有冰冷的莱博维茨 L-15 培养基的 100 毫米 TC 培养皿中。
- 确定坐骨神经的近端和远端。用一对细钳在近端到远端方向取出外神经，同时用第二对细钳固定近端神经末梢。
- 将纯化的神经转移到装有冰冷的莱博维茨 L-15 培养基和 50 μg/mL 庆大霉素的 100 mm TC 培养皿中。挑逗分离的神经束，使用两对细镊子分离和分离单个神经纤维。
- 使用 10 mL 血清移液管将神经纤维转移到 50 mL 管中，并尽可能少地吸收培养基。将 50 mL Leibovitz 的 L-15 培养基和 50 μg/mL 庆大霉素加入神经纤维中，并在 50 mL 管中旋转几次。
- 坐骨神经的酶消化
注意：接下来的步骤（步骤1.5-1.8，2.1和2.2）在无菌条件下进行。- 在 10 mL DMEM（高葡萄糖）中制备含有 0.25% 分散酶 II、0.05% I 型胶原酶和 50 μg/mL 庆大霉素的酶消化溶液。
- 在4°C下以188× g 离心管5分钟，用25mL血清移液管除去上清液，并使用1，000mL移液管将沉淀与剩余的Leibovitz的L-15培养基转移到60mm TC培养皿中。
- 用 10 mL 酶消化溶液冲洗 50 mL 管，并将其添加到含有神经纤维的培养皿中。用移液管的尖端小心地将组织分布在培养皿中，以最大限度地提高消化的可接近表面。
- 在37°C和5%CO2 下孵育18小时，并通过在Hanks的平衡盐溶液中加入10mL的40%FCS停止消化，不含Ca2 和Mg2+ （HBSS）。
- 细胞分离
- 使用血清移液管将消化的神经转移到50mL管中，并在4°C下以188× g 离心10分钟。 弃去上清液并将沉淀重悬于含有 10% FCS 和 50 μg/mL 庆大霉素的 10 mL DMEM 中。随后使用 10 mL、5 mL、2 mL、1 mL 和 200 μL 移液器吸头重悬沉淀 20 次。
- 通过100μm细胞过滤器过滤细胞悬液，并在4°C下以188× g 离心10分钟。 弃去上清液，并用含有 10% FCS 和 50 μg/mL 庆大霉素的 4 mL DMEM 重悬沉淀。
- 将 2 mL 细胞悬液添加到两个 PLL 和层粘连蛋白包被的 60 mm TC 培养皿中，并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育。将板在培养箱中保持原样2天，以保护细胞免受机械应力并支持粘附。
- 雪旺细胞分化
- 2 天后，取出培养基并用 DMEM（高葡萄糖）、10% FCS 和 50 μg/mL 庆大霉素小心冲洗板 2 倍。之后，加入 2 mL 雪旺细胞培养基。每2天更换一次雪旺细胞培养基，并使用显微镜观察细胞外观和汇合度。
注意：雪旺细胞和DRG外植体需要及时，协调地制备共培养。当雪旺细胞接近80%的汇合度时，确保具有E 13.5胚胎的大鼠可用于DRG制备。
- 2 天后，取出培养基并用 DMEM（高葡萄糖）、10% FCS 和 50 μg/mL 庆大霉素小心冲洗板 2 倍。之后，加入 2 mL 雪旺细胞培养基。每2天更换一次雪旺细胞培养基，并使用显微镜观察细胞外观和汇合度。
- 细胞胰蛋白酶消化和磁分离
注意：有关不同雪旺细胞培养阶段的示例图片，请参见 补充图1。- 当细胞达到约80%的汇合度（培养6-12天）时，用3mL DPBS小心地洗涤板2x，并与2mL的0.05%胰蛋白酶/ EDTA（预热至37°C）孵育3分钟。当细胞从板底部分离时，通过加入 2 mL DMEM 和 10% FCS 和 50 μg/mL 庆大霉素来灭活消化。
注意：坚持严格的3分钟胰蛋白酶消化时间，然后快速进行。 - 将细胞沉淀重悬于含有 DPBS 的 2 mL 磁性细胞分离缓冲液中，含 0.5% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 2 nM EDTA。将 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝混合，并使用染色室对细胞进行计数。
- 在4°C下以188× g 离心细胞悬液10分钟，并将细胞沉淀重悬于每1 x 107 细胞的90μL磁性细胞分离缓冲液中。每 1 x 107 个细胞添加 10 μL Thy-1 微珠。重悬溶液几次，并在8°C的黑暗中孵育15分钟。
- 向细胞悬液中加入2mL磁性细胞分离缓冲液，并在4°C下以300× g 离心10分钟。 弃去上清液并将沉淀重悬于500μL磁性细胞分离缓冲液中。
- 用 1 mL 磁性细胞分离缓冲液润湿磁性细胞分离柱。将磁性细胞分离柱放入磁性细胞分离器中。将细胞应用于磁性细胞分离柱。收集流过并在4°C下以300× g 离心10分钟。
注意：成纤维细胞被正选择并保留在色谱柱中，而雪旺细胞通过色谱柱。成纤维细胞可以用印章收集（例如，作为雪旺细胞染色方案的阴性对照）。 - 弃去上清液并将沉淀重悬于1mL共培养基中（参见步骤3.1.1）。用台盼蓝和染色室染色后计数细胞。
- 当细胞达到约80%的汇合度（培养6-12天）时，用3mL DPBS小心地洗涤板2x，并与2mL的0.05%胰蛋白酶/ EDTA（预热至37°C）孵育3分钟。当细胞从板底部分离时，通过加入 2 mL DMEM 和 10% FCS 和 50 μg/mL 庆大霉素来灭活消化。
2. DRG外植体培养
- DRG生长培养基制备
- 通过在神经基础培养基中添加 2% B27、2% 马血清、1% L-谷氨酰胺、0.5% 青霉素/链霉素和 10 ng/mL 神经生长因子 （NGF） 来制备 DRG 生长培养基。将生长培养基储存在4°C。
注意：生长培养基可以使用2天。
- 通过在神经基础培养基中添加 2% B27、2% 马血清、1% L-谷氨酰胺、0.5% 青霉素/链霉素和 10 ng/mL 神经生长因子 （NGF） 来制备 DRG 生长培养基。将生长培养基储存在4°C。
- DRG外植体涂层
- 将盖玻片在70%乙醇中孵育1小时，并使用弯曲的镊子放入4孔培养皿的孔中。乙醇干燥后，每孔施用 300 μL 0.2 mg/mL 聚-D-赖氨酸 （PDL），并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育过夜。
- 连续用DPBS清洗盖玻片3次，每次5分钟。取下DPBS，将300μL的1μg/ mL层粘连蛋白施加到盖玻片上，并在37°C和5%CO2下孵育过夜。
- 用DPBS洗涤步骤3分钟后，用190μLDRG生长培养基替换DPBS。将4孔板放入37°C和5%CO 2的培养箱中。
- DRG 准备
注意：在干净的工作台下收获胚胎大鼠的DRG。- 制备前，用70%乙醇清洁所有仪器。每道培养皿中填充 10 个（每个胚胎两个）35 mm TC 培养皿，每皿中加入 2 mL 冰冷的 HBSS，以及两个 100 mm TC 培养皿，每皿中加入 5 mL 冰冷的 HBSS。
- 通过CO2 吸入和斩首对怀孕的大鼠（成年雌性Sprague Dawley大鼠，E13.5）实施安乐死。
- 用70%乙醇喷洒身体并打开大鼠的腹侧躯干。小心地取出子宫并将其放入带有冰冷HBSS的100 mm TC培养皿中。
- 用弯曲的镊子握住子宫，用细镊子打开子宫壁。取出一个羊膜囊，用细镊子捏一个孔小心地打开。
- 从周围组织中取出胚胎，切断脐带，然后用细镊子将胚胎斩首。使用弯曲的镊子和刮刀将躯干放入装有HBSS的100 mm TC培养皿中。
- 快速从子宫中取出所有胚胎，并将它们转移到一个装有HBSS的100 mm TC培养皿中。如果胚胎超过五个，则根据步骤2.3.1准备一个额外的35 mm TC培养皿和2 mL HBSS。
- 使用刮刀和弯曲的镊子轻轻地将一个胚胎躯干放入装有HBSS的35毫米TC培养皿中。在体视显微镜下，打开躯干的背部，使用细镊子和微型剪刀将胚胎分成两半。将一半转向一侧，识别位于胚胎背侧一条线上的DRG链。
- 用细镊子和微型剪刀将DRG整根线剪掉。将 DRG 放入装有 2 mL HBSS 的新鲜 35 mm TC 培养皿中，并使用细镊子和微型剪刀将单个 DRG 与剩余的组织分离。
- DRG细胞培养
- 将含有 190 μL DRG 生长培养基的 4 孔板从培养箱中取出到要制备 DRG 的洁净工作台。使用细镊子和刮刀小心地将单个DRG转移到4孔培养板的一个孔中。将DRG放置在每个孔的中心，因为中心位置对于DRG的连接很重要。
- 从现在开始在无菌条件下工作。将外植体培养物置于37°C和5%CO2的培养箱中。第二天，使用 100 mL 移液器向每个孔中小心地加入 50 μL DRG 生长培养基。
- 每天使用显微镜观察DRG外植体粘附和轴突生长，并在培养的第3天丢弃已从盖玻片上脱落或未能脱离轴突的DRG外植体。
注意：DRG外植体在培养的第一天非常脆弱，需要小心处理，特别是在更换培养基时将板移入和移出培养箱时，甚至在关闭培养箱门时。每孔 190 μL 培养基的精确体积对于在培养的第一天将 DRG 外植体保持在适当的位置至关重要。在日常控制期间，可以轻松识别松散的DRG外植体，因为它们在培养基中游泳而不是粘附在盖玻片上。
3. 共文化
- 将雪旺细胞转移到DRG外植体培养物中
- 通过在DRG生长培养基中加入0.1%抗坏血酸来制备共培养基。
- 在DRG外植体培养的第3天，小心地用每孔含有30，000个雪旺细胞（来自步骤1.8）的250μL共培养基替换DRG生长培养基。
- 将DRG外植体和雪旺细胞的共培养物保持长达22天。每隔一天仔细更换 250 μL 共培养基，并使用显微镜观察细胞的外观。
注意：有关培养第一天共培养的DRG轴突和雪旺细胞的示例，请参见 图1。
- 免疫细胞化学染色
注意：在染色过程中要非常小心地处理共培养样品，因为它们很容易损坏。- 为了将细胞固定在盖玻片上，缓慢除去培养基，用DPBS小心洗涤3次，并在4%多聚甲醛（PFA）中孵育10分钟。用DPBS替换PFA，并将固定细胞在4°C下储存长达1周。
注意：处理 4% PFA 时，请穿戴推荐的个人防护设备。 - 用DPBS洗涤盖玻片3次5分钟，然后用封闭溶液（10%山羊血清，10%牛血清白蛋白[BSA]，0.1%明胶和0.05%Triton X-100）在DPBS中封闭1小时。在封闭溶液中稀释一抗βIII-微管蛋白（1：7，500）和髓磷脂碱性蛋白（MBP）（1：750），并在4°C孵育过夜。
- 用DPBS洗涤细胞3次5分钟。在封闭溶液中以1：1，000的稀释度使用荧光染料偶联的二抗，并在室温（RT）下孵育2小时。
- 用DPBS洗涤细胞3倍5分钟，并将细胞安装在带有荧光封片介质（包括4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI））的显微镜载玻片上。将载玻片在4°C的黑暗中储存，直到显微镜记录。
注意：处理荧光封片剂时，请穿戴推荐的个人防护设备。
- 为了将细胞固定在盖玻片上，缓慢除去培养基，用DPBS小心洗涤3次，并在4%多聚甲醛（PFA）中孵育10分钟。用DPBS替换PFA，并将固定细胞在4°C下储存长达1周。
- 分析
- 使用倒置显微镜拍摄中心DRG外植体周围的八个定义区域的照片。
- 使用图像分析软件应用程序量化 MBP 染色的 βIII-微管蛋白阳性轴突和髓鞘形成区域。
- 计算髓鞘形成的百分比作为有髓鞘轴突和非髓鞘轴突的比率。
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Representative Results
在第10、12、14、16、18和20天评估共培养中的髓鞘形成。对DRG外植体和雪旺细胞进行MBP、βIII-微管蛋白和DAPI染色。共培养中的轴突网络是密集的，并且在观察的时间过程中没有明显变化。髓磷脂的最初迹象，以小碎片的形式，在第10天可检测到，并在第12天增加（图2）。MBP阳性区域随着时间的推移而增加，直到培养的第20天。将髓鞘化量化为MBP和βIII-微管蛋白阳性区域的比率。与第10天相比，第18天和第20天的髓鞘形成显着增加（图3;**p ≤ 0.01;***p ≤ 0.001）。
图1：共培养中雪旺细胞和轴突的外观。 第 3 天共文化的模范图片。黑色箭头显示细的DRG轴突，白色箭头指向具有细长和纺锤形形态附着在轴突上的雪旺细胞。比例尺：100 μm。 请点击这里查看此图的大图。
图2：DRG外植体和雪旺细胞共培养中的髓鞘形成。 在第10、12、14、16、18和20天进行神经元标志物βIII-微管蛋白和MBP染色，加入两种培养物以研究共培养中髓鞘形成的发展。髓鞘形成的最初迹象在共培养的第10天和第12天可见。从第14天开始，MBP信号更加明显，并检测到髓磷脂包裹的轴突。髓鞘形成随着共培养时间的增加而增加，直到第20天。比例尺：100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：髓鞘形成的定量。 在共培养的第10、12、14、16、18和20天，通过用βIII-微管蛋白染色轴突和用MBP对髓磷脂染色来评估髓鞘形成。通过计算MBP阳性和βIII-微管蛋白染色区域的比率来确定髓鞘轴突的百分比。与共培养的第10天相比，第18天和第20天检测到显着差异。数据表示为平均± SEM;n = 3。单因素方差分析与Kruskal-Wallis和Dunn的多重比较事后检验。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1：雪旺细胞培养的阶段。磁细胞分离前和（B）后培养的雪旺细胞（A）的示例明场图片。在磁性细胞分离之前，培养物包括具有细长和纺锤形形态的雪旺细胞、扁平和扩散的成纤维细胞以及结缔组织的残留物。为了实现更纯的雪旺细胞培养，进行磁性细胞分离。比例尺：200 μm。 请点击这里下载此文件。
补充图2：具有和不具有额外雪旺细胞的DRG外植体的髓鞘形成。 MBP染色区域用于测量第14天共培养中的髓鞘形成。如果将雪旺细胞添加到培养物中，DRG外植体的髓鞘形成显着增加（未配对t检验，**p ≤0.01）。n = 3。 请点击此处下载此文件。
补充图3：共培养中的基因表达分析。 在第22天，通过qPCR（A）分析共培养样品中MBP，PMP22，MAG，Oct6，Egr2和Olig1的相对基因表达水平。MBP和PMP22是共培养中基因表达水平最高的靶标。应用于琼脂糖凝胶的qPCR扩增产物的示例性图片显示了靶标的定性丰度（B）。凝胶上的第一个和最后一个泳道代表一个DNA阶梯（100个碱基对）。n = 5。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
在这里，我们提出了一种快速简便的方案，用于通过合并两种独立的细胞类型培养物，雪旺细胞和背根神经节外植体来产生 体外 髓鞘。
该方案的一个关键步骤是培养DRG外植体，特别是在培养的第一天。DRG在建立强大的轴突网络之前非常脆弱，必须非常小心地处理，例如，当从培养箱中取出或在更换培养基时。从井底分离并被发现在介质中游泳的DRG表明栽培不成功。对于雪旺细胞，由于不同的培养条件和补充剂（例如，培养基中的血清）而导致的增殖速率变化可能对共培养构成挑战。如果培养物被过量的雪旺细胞过度生长，它会从孔底分离并变得无法使用。因此，建议滴定培养物中的雪旺细胞数。在建立雪旺细胞方案期间，应使用SOX10或S100免疫染色进行纯度测试。一般来说，培养物的处理，包括更换培养基以及洗涤和固定步骤，必须小心进行，以确保成功的结果。根据研究兴趣选择观察的时间点很重要;第14天代表第一个致密髓鞘轴突的起点，因此可以选择作为髓鞘形成开始的时间点，而较晚的时间点提供更完整的髓鞘。
由于这种体外髓鞘形成方法仅包括DRG和雪旺细胞，因此它与生物体中的髓鞘形成过程并不完全相似。其他影响因素，如周围组织、微环境、免疫细胞和来自远处结构的信号传导，在该模型中没有表示。然而，该方法提供了一个合适的模型，通过对两种细胞类型9，15，16的单独分析和操作来研究PNS的髓鞘形成。用于共培养的雪旺细胞或DRG可以从患病或处理的动物身上收获，以破译特定细胞类型17，18的贡献。当使用此设置的后期阶段时，强烈建议在不额外添加雪旺细胞的情况下包括对照条件，以排除DRG来源的雪旺细胞的可能影响。根据我们的经验，在没有雪旺细胞的DRG外植体中检测到髓鞘的程度明显低于共培养（补充图2）。
与解离的神经元培养物相比，DRG外植体的使用提供了完整的结构结构的优势。髓磷脂碱性蛋白（MBP）的免疫荧光染色可以量化髓鞘轴突区域，并为共培养中的髓鞘形成提供足够的读数。第22天共培养样品的基因表达分析显示存在MBP、外周髓磷脂蛋白（PMP22）、髓鞘相关糖蛋白（MAG）、八聚体结合因子6（Oct6）、ETS相关基因2（Erg2）和少突胶质细胞转录因子1（Olig1），其中MBP和PMP22的表达水平最高（补充图3）。因此，所描述的方案为共培养中的髓鞘形成标志物提供了一种具有几种靶标选择的方法。
该方法的潜在应用包括关于外围髓鞘形成过程的基础研究方法，以及验证PNS疾病的治疗化合物，包括髓磷脂的损伤。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Ralf Gold教授和PD Dr. Gisa Ellrichmann的建议和支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
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