Summary
後根神経節とシュワン細胞の共培養系では、末梢神経系の髄鞘形成を研究することができます。このモデルは、末梢髄鞘形成を観察および定量化し、ミエリン鞘に対する目的の化合物の影響を研究するための実験的機会を提供します。
Abstract
髄鞘形成のプロセスは、神経系における迅速かつ十分なシグナル伝達を可能にするために不可欠です。末梢神経系では、ニューロンとシュワン細胞が複雑な相互作用を起こして軸索の髄鞘形成を制御します。この相互作用の乱れとミエリン鞘の破壊は炎症性神経障害の特徴であり、神経変性疾患で二次的に発生します。.ここでは、末梢神経系における髄鞘形成のプロセスを調査し、軸索-シュワン細胞相互作用を研究し、各細胞タイプに対する治療薬の潜在的な効果を評価するために、末梢軸索の堅牢な髄鞘形成を開発する後根神経節外植片とシュワン細胞の共培養モデルを紹介します。方法論的には、胚性ラット(E13.5)の背根神経節を採取し、それらの周囲組織から解離させ、3日間全外植片として培養した。3週齢の成体ラットからシュワン細胞を単離し、坐骨神経を酵素消化した。得られたシュワン細胞を磁気活性化セルソーティングにより精製し、ニューレグリンおよびフォルスコリン富化条件下で培養した。後根神経節外植片培養の3日後、アスコルビン酸を含む培地中で1つの後根神経節外植片に30,000シュワン細胞を添加した。髄鞘形成の最初の徴候は、共培養の10日目に、免疫細胞化学染色におけるミエリン塩基性タンパク質の散在シグナルを介して検出された。14日目以降、ミエリン鞘が形成され、軸索に沿って伝播した。髄鞘形成は、髄鞘形成面積と軸索面積の比としてミエリン塩基性タンパク質染色によって定量化することができ、軸索密度の違いを説明する。このモデルは、末梢神経系の炎症性および神経変性疾患における脱髄および神経変性の病理および可能な治療機会を理解するために不可欠な、 in vitroでの末梢髄鞘形成のさまざまな側面を研究する実験的機会を提供します。
Introduction
末梢神経系(PNS)では、急速な情報伝達はミエリンに包まれた軸索によって媒介されます。神経線維の伝導速度は軸索径とミエリンの厚さに相関するため、軸索の髄鞘形成は電気インパルスの高速伝播を可能にするために不可欠です1。末梢から中枢神経系(CNS)への感覚シグナル伝達は、後根神経節(DRG)と呼ばれる後根の拡大に存在する一次感覚ニューロンの活性化に依存しています。ミエリンの形成と維持のためには、軸索とPNSの有髄グリア細胞であるシュワン細胞との間の継続的なコミュニケーションが必須です2。
PNSの多くの疾患は、原発性軸索または脱髄損傷のいずれかによる情報の伝達を妨げ、知覚異常または感覚異常をもたらす。一次感覚ニューロンは、ニューロン損傷後、ニューロンと周囲のシュワン細胞との複雑な相互作用によってある程度再生する能力を有する3。この場合、シュワン細胞は細胞のリプログラミングを受けて軸索およびミエリンの破片を取り除き、軸索再生を促進し、髄鞘再形成をもたらすことができる4。PNSの脱髄障害の可能な治療選択肢を見つけるために、健康と病気における髄鞘形成のメカニズムを理解することは重要です。ミエリンは急性神経外傷によっても損傷を受ける可能性があり、末梢神経損傷後の機能回復を促進するために髄鞘形成を促進するアプローチが研究中です5。
末梢髄鞘形成に関する私たちの知識は、シュワン細胞と感覚ニューロンの有髄共培養から主に恩恵を受けています。最初のアプローチが適用されて以来6、7、8、髄鞘形成は、異なる共存系の使用により鋭意研究されてきた9、10、11。ここでは、後根神経節軸索の堅牢なin vitro髄鞘形成のための迅速かつ容易なプロトコルを提供します。シュワン細胞調製のためのプロトコルは、以前にPitarokoiliら13で発表されたAndersenらによるプロトコル12に基づいている。共培養には、幼若ラット由来のシュワン細胞と胚性DRG外植片培養物を使用し、14日目頃に髄鞘形成が起こります。この方法の目的は、直接軸索-シュワン細胞相互作用の結果としてのミエリンの形成を調査し、PNS髄鞘形成のモジュレーターを研究するシステムを提供することです。解離した神経細胞培養と比較して、DRG外植片はより解剖学的に保存され、長い軸索突起を形成します。有髄軸索領域の定量化は、共培養における髄鞘形成のための十分な読み出しを提供する。この方法は、PNS髄鞘形成に対する潜在的な効果について治療用化合物をスクリーニングするための貴重なツールであり、動物モデルでのin vivo研究に加えて利用することもできます14。
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Protocol
すべての手順は、実験動物の世話と使用に関する欧州共同体理事会指令に従って実施されました。
1. シュワン細胞培養
- シュワン細胞培養用コーティング
- 細胞培養皿を無菌条件下でコーティングします。2 mLの0.01%ポリ-L-リジン(PLL)をそれぞれ2つの60 mm組織培養(TC)ディッシュに塗布し、4°Cで一晩インキュベートします。
- PLLを取り出し、TCディッシュを蒸留水で2回洗浄し、2 mLの1 μg/cm2 ラミニンとともに4°Cで一晩インキュベートします。 TC皿をアクアデストで2回洗い、プレートを風乾させます。
- シュワン細胞培養用培地調製
- 無菌条件下でダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/F-12(高グルコース)に10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)、2 μMフォルスコリン、10 nMニューレグリン、および50 μg/mLゲンタマイシンを加えて、50 mLのシュワン細胞培地を調製します。
- 70 mLのリーボビッツL-15培地を50 μg/mLのゲンタマイシンとともに無菌条件下で調製します。
- 坐骨神経の準備
注:すべての坐骨神経の準備ステップは、クリーンベンチの下で実行されます。- Ca2+およびMg2+を含まない氷冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)5 mLを含む100 mm TCディッシュ1枚、氷冷ライボビッツL-15培地5 mLを含む100 mm TCディッシュ1枚、氷冷ライボビッツL-15培地5 mLおよび50 μg/mLゲンタマイシンを含む100 mm TCディッシュ1枚を準備します。
- オートクレーブですべての機器を洗浄します。機器と作業領域に70%エタノールをスプレーします。
- CO2 の吸入と斬首を使用して、5匹の3週齢のオスのSprague Dawleyラットを安楽死させます。ラットの胴体に70%エタノールをスプレーします。
- 左背下肢をハサミで開き、大腿二頭筋を丁寧に取り除きます。湾曲した鉗子で滑らかな隆起によって坐骨神経を緩め、神経を傷つけないようにします。
- 湾曲した鉗子で神経の最も近位部分を持って神経をまっすぐにし、ハサミを使用して神経をできるだけ高くクリップします。次に、仙骨神経叢と足に近い神経をハサミでクリップします。右側に対して手順1.3.4〜1.3.5を繰り返します。
注意: 手足を開くときは、血管を傷つけないように注意してください。 - 鉗子を使用して、左右の坐骨神経を氷のように冷たいDPBSを備えた100mmTC皿に入れます。
- 坐骨神経の改修
- 鉗子を使用して、氷のように冷たいライボビッツのL-15培地と50μg/mLゲンタマイシンを含む100mmTCディッシュにすべての神経を移します。実体顕微鏡を使い続け、2対の細かい鉗子で神経から脂肪、筋肉、血管を取り除きます。鉗子で神経をつかみ、氷のように冷たいリーボヴィッツのL-15培地を入れた100mmのTC皿に移します。
- 坐骨神経の近位端と遠位端を特定します。1対の細かい鉗子で上膜を近位から遠位方向に取り除き、近位神経端を2対目の細かい鉗子で保持します。
- 精製した神経を、氷冷したリーボビッツのL-15培地と50 μg/mLのゲンタマイシンを入れた100 mm TCディッシュに移します。孤立した神経束をいじめ、2対の細い鉗子を使用して単一の神経線維を分離および分離します。
- 10 mLの血清学的ピペットを使用して神経線維を50 mLチューブに移し、できるだけ少ない培地を取ります。50 μg/mLのゲンタマイシンを含む50 mLのリーボビッツL-15培地を神経線維に加え、50 mLチューブで数回スルーします。
- 坐骨神経の酵素消化
注意: 次のステップ(ステップ1.5-1.8、2.1、および2.2)は、無菌条件下で実行されます。- 10 mLのDMEM(高グルコース)中に0.25%ディスパーゼII、0.05%タイプIコラゲナーゼ、および50 μg/mLのゲンタマイシンを含む酵素消化溶液を調製します。
- チューブを188 x g で4°Cで5分間遠心分離し、25 mL血清学的ピペットで上清を除去し、残りのLeibovitzのL-15培地を含むペレットを1,000 mLピペットを使用して60 mm TCディッシュに移します。
- 50 mLチューブを10 mLの酵素消化溶液ですすぎ、神経線維を含む皿に加えます。ピペットの先端で皿の中の組織を注意深く分配し、消化のためにアクセス可能な表面を最大化します。
- 37°C、5%CO2で18時間インキュベートし、Ca2およびMg2+(HBSS)を含まないハンクス平衡塩溶液に10 mLの40%FCSを加えて消化を停止します。
- 細胞分離
- 消化した神経を血清学的ピペットと遠心分離機を使用して50 mLチューブに移し、188 x g で4°Cで10分間行います。 上清を廃棄し、10%FCSと50 μg/mLゲンタマイシンを含む10 mLのDMEMにペレットを再懸濁します。続いて、10 mL、5 mL、2 mL、1 mL、および200 μLのピペットチップを使用して、ペレットを20回再懸濁します。
- 細胞懸濁液を100 μmのセルストレーナーでろ過し、188 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を廃棄し、10%FCSと50 μg/mLのゲンタマイシンを含む4 mLのDMEMでペレットを再懸濁します。
- 2 mLの細胞懸濁液を2つのPLLおよびラミニンコーティングされた60 mm TCディッシュのそれぞれに加え、37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。細胞を機械的ストレスから保護し、接着をサポートするために、プレートをインキュベーター内で2日間そのままにしておきます。
- シュワン細胞分化
- 2日後、培地を取り出し、DMEM(高グルコース)、10%FCS、および50 μg / mLゲンタマイシンでプレートを2回注意深くすすぎます。その後、2 mLのシュワン細胞培地を加えます。2日毎にシュワン細胞培地を交換し、顕微鏡を用いて細胞の外観及びコンフルエンシーを観察した。
注:シュワン細胞とDRG外植片は、共培養のためにタイムリーで調整された方法で準備する必要があります。E 13.5の胚を持つラットが、シュワン細胞が80%のコンフルエンシーに近いときにDRG調製に利用できることを確認してください。
- 2日後、培地を取り出し、DMEM(高グルコース)、10%FCS、および50 μg / mLゲンタマイシンでプレートを2回注意深くすすぎます。その後、2 mLのシュワン細胞培地を加えます。2日毎にシュワン細胞培地を交換し、顕微鏡を用いて細胞の外観及びコンフルエンシーを観察した。
- 細胞トリプシン処理と磁気分離
注:異なるシュワン細胞培養段階の例示的な写真については、 補足図1を参照してください。- 細胞が約80%のコンフルエントに達したら(培養6〜12日)、プレートを3 mLのDPBSで2回注意深く洗浄し、2 mLの0.05%トリプシン/ EDTA(37°Cに予熱)で3分間インキュベートします。細胞がプレート底部から剥離したら、10%FCSおよび50 μg/mLゲンタマイシンを含む2 mLのDMEMを添加して消化を不活性化します。
注意: 厳密に3分のトリプシン処理時間に固執し、その後急速に進めます。 - 細胞ペレットを、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)および2 nM EDTAを含むDPBSを含む2 mLの磁気細胞分離バッファーに再懸濁します。10 μLの細胞懸濁液を10 μLのトリパンブルーと組み合わせ、染色チャンバーを使用して細胞をカウントします。
- 細胞懸濁液を188 x g で4°Cで10分間遠心分離し、細胞ペレットを1 x 107 細胞あたり90 μLの磁気細胞分離バッファーに再懸濁します。1 x 107 細胞あたり10 μLのThy-1マイクロビーズを追加します。溶液を数回再懸濁し、8°Cの暗所で15分間インキュベートします。
- 2 mLの磁気細胞分離バッファーを細胞懸濁液に加え、300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ペレットを500 μLの磁気細胞分離バッファーに再懸濁します。
- 磁性細胞分離カラムを1 mLの磁気細胞分離バッファーで湿らせます。磁気セル分離カラムを磁気セルセパレータに配置します。細胞を磁気セル分離カラムに適用します。フロースルーを収集し、300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
注:線維芽細胞は積極的に選択され、カラムに残りますが、シュワン細胞はカラムを通過します。線維芽細胞は、スタンプを用いて収集することができる(例えば、Schwann細胞染色プロトコルのための陰性対照として)。 - 上清を廃棄し、ペレットを1 mLの共存培地に再懸濁します(ステップ3.1.1を参照)。トリパンブルーおよび染色チャンバーで染色した後の細胞をカウントする。
- 細胞が約80%のコンフルエントに達したら(培養6〜12日)、プレートを3 mLのDPBSで2回注意深く洗浄し、2 mLの0.05%トリプシン/ EDTA(37°Cに予熱)で3分間インキュベートします。細胞がプレート底部から剥離したら、10%FCSおよび50 μg/mLゲンタマイシンを含む2 mLのDMEMを添加して消化を不活性化します。
2. DRG外植片培養
- DRG増殖培地調製
- 2%B27、2%ウマ血清、1%L-グルタミン、0.5%ペニシリン/ストレプトマイシン、および10 ng/mL神経成長因子(NGF)を神経基底培地に添加して、DRG増殖培地を調製します。増殖培地を4°Cで保存する。
注:増殖培地は2日間使用できます。
- 2%B27、2%ウマ血清、1%L-グルタミン、0.5%ペニシリン/ストレプトマイシン、および10 ng/mL神経成長因子(NGF)を神経基底培地に添加して、DRG増殖培地を調製します。増殖培地を4°Cで保存する。
- DRG外植片用コーティング
- カバーガラスを70%エタノール中で1時間インキュベートし、湾曲した鉗子を使用して4ウェル皿のウェルに入れる。エタノールが乾燥したら、ウェルあたり300 μLの0.2 mg/mLポリ-D-リジン(PDL)を塗布し、37°Cおよび5%CO2で一晩インキュベートします。
- カバーガラスをDPBSでそれぞれ3分間5分間連続して洗います。DPBSを取り外し、カバーガラスに300 μLの1 μg/mLラミニンを塗布し、37°Cおよび5%CO2で一晩インキュベートします。
- DPBSで5分間3回の洗浄ステップを行った後、DPBSを190 μLのDRG増殖培地と交換します。4ウェルプレートを37°C、5%CO2のインキュベーターに入れます。
- DRGの準備
注:クリーンベンチの下で胚性ラットのDRGを収穫します。- 準備する前に、すべての器具を70%エタノールで洗浄してください。1皿あたり2 mLの氷冷HBSSを10枚(胚あたり2枚)の35 mm TC皿に、1皿あたり5 mLの氷冷HBSSを2枚の100 mm TC皿に充填します。
- 妊娠中のラット(成体の雌のSprague Dawleyラット、E13.5)をCO2 吸入および断頭によって安楽死させる。
- 体に70%エタノールをスプレーし、ラットの腹側胴体を開きます。子宮を慎重に取り外し、氷冷HBSSを入れた100 mm TC皿に入れます。
- 湾曲した鉗子を使用して子宮を保持し、細かい鉗子で子宮壁を開きます。羊膜嚢を1つ取り除き、細かい鉗子で穴をつまんで慎重に開きます。
- 周囲の組織から胚を取り除き、臍帯を切断し、細かい鉗子を使用して胚を断頭します。湾曲した鉗子とヘラを使用して、HBSSで満たされた100 mm TC皿に胴体を置きます。
- 子宮からすべての胚をすばやく取り除き、HBSSで満たされた1つの100 mm TC皿に移します。5つ以上の胚がある場合は、ステップ2.3.1に従って、2 mLのHBSSを含む追加の35 mm TCディッシュを準備します。
- へらと湾曲した鉗子を使用して、HBSSで満たされた35 mm TC皿に1つの胚胴体をそっと置きます。実体顕微鏡下で、胴体の背側部分を開き、細かい鉗子とマイクロハサミを使用して胚を2つに分割します。半分を横に回して、胚の背側に一列に並んでいるDRGの鎖を特定します。
- 細かい鉗子とマイクロハサミを使用して、DRGをストランド全体として切り取ります。2 mLのHBSSで満たされた新しい35 mm TCディッシュにDRGを置き、細かい鉗子とマイクロハサミを使用して残りの組織から単一のDRGを分離します。
- DRG細胞培養
- 190 μLのDRG増殖培地を含む4ウェルプレートをインキュベーターからDRGを調製するクリーンベンチに運びます。細かい鉗子とヘラを使用して、単一のDRGを4ウェル培養プレートの1ウェルに慎重に移します。DRGの取り付けには中央位置が重要であるため、DRGを各ウェルの中央に配置します。
- これからは無菌状態で作業してください。外植片培養物を37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れる。翌日、100 mLピペットを使用して、50 μLのDRG増殖培地を各ウェルに注意深く加えます。
- 顕微鏡を使用してDRG外植片の付着と軸索の成長を毎日観察し、カバーガラスから外れた、または培養3日目に軸索の成長に失敗したDRG外植体を廃棄します。
注:DRG外植片は培養の最初の数日間は非常に壊れやすいため、特に培地を交換したときにプレートをインキュベーターに出し入れする場合、またはインキュベーターのドアを閉じる場合でも、注意して取り扱う必要があります。ウェルあたり190 μLの培地の正確な量は、培養初日にDRG外植片を所定の位置に保つために重要です。緩いDRG外植片は、カバーガラスに付着する代わりに培地内を泳ぐため、毎日の管理中に簡単に識別できます。
3.コカルチャー
- DRG外植片培養へのシュワン細胞の移植
- DRG増殖培地に0.1%アスコルビン酸を添加して共存培地を調製します。
- DRG外植片培養の3日目に、DRG増殖培地を、ウェルあたり30,000個のシュワン細胞(ステップ1.8から)を含む250 μLの共存培地と慎重に交換します。
- DRG外植片とシュワン細胞の共存培養を最大22日間保持します。250 μLの共存培地を1日おきに丁寧に交換し、顕微鏡を用いて細胞の外観を観察します。
注:培養初日の共培養におけるDRG軸索およびシュワン細胞の例については、 図1を参照してください。
- 免疫細胞化学染色
注:染色手順中は、コカルチャーサンプルが損傷しやすいため、非常に慎重に取り扱ってください。- カバーガラスに細胞を固定するには、培地をゆっくりと取り出し、DPBSで3回注意深く洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で10分間インキュベートします。PFAをDPBSに交換し、固定セルを4°Cで最大1週間保管します。
注意: 4%PFAを取り扱うときは、推奨される個人用保護具を着用してください。 - カバーガラスをDPBSで3回5分間洗浄し、次にブロッキング溶液(10%ヤギ血清、10%ウシ血清アルブミン[BSA]、0.1%ゼラチン、および0.05%トリトンX-100)でDPBSで1時間ブロックします。一次抗体βIII-チューブリン(1:7,500)およびミエリン塩基性タンパク質(MBP)(1:750)をブロッキング溶液で希釈し、4°Cで一晩インキュベートします。
- 細胞をDPBSで3回5分間洗浄します。蛍光色素結合二次抗体をブロッキング溶液中で1:1,000の希釈液で使用し、室温(RT)で2時間インキュベートします。
- 細胞をDPBSで3回5分間洗浄し、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む蛍光封入媒体を使用して細胞を顕微鏡スライドにマウントします。顕微鏡で文書化するまで、スライドを4°Cの暗所で保管してください。
注意: 蛍光封入剤を取り扱うときは、推奨される個人用保護具を着用してください。
- カバーガラスに細胞を固定するには、培地をゆっくりと取り出し、DPBSで3回注意深く洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で10分間インキュベートします。PFAをDPBSに交換し、固定セルを4°Cで最大1週間保管します。
- 解析
- 倒立顕微鏡を使用して、中央のDRG外植片の周囲の8つの定義された領域の写真を撮ります。
- 画像解析ソフトウェアアプリケーションを使用して、MBPによって染色されたβIII-チューブリン陽性軸索および髄鞘形成の領域を定量化します。
- 髄鞘化の割合を有髄軸索と非有髄軸索の比率として計算します。
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Representative Results
共培養における髄鞘形成は、10、12、14、16、18、および20日目に評価されました。DRG外植片およびシュワン細胞をMBP、βIII-チューブリン、およびDAPIについて染色した。共存における軸索網は密集しており、観察の経時的には目に見えて変化しなかった。小さな断片の形のミエリンの最初の兆候は、10日目に検出され、12日目に増加しました(図2)。MBP陽性領域は、培養20日目まで時間とともに増加しました。髄鞘形成は、MBPおよびβIIIチューブリン陽性領域の比率として定量した。髄鞘形成は、10日目と比較して18日目と20日目に有意に増加しました(図3;**p ≤ 0.01; ****p ≤ 0.001)。
図1:共培養におけるシュワン細胞と軸索の出現。 3日目のコカルチャーの模範的な写真。黒い矢印は細いDRG軸索を示し、白い矢印は軸索に細長い紡錘形の形態を持つシュワン細胞を指しています。スケールバー:100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:DRG外植片とシュワン細胞の共培養における髄鞘形成。 神経細胞マーカーβIII-チューブリンとMBPの染色は、共培養における髄鞘形成の進行を調べるために、両方の培養を結合した後、10、12、14、16、18、および20日目に行われました。髄鞘形成の最初の兆候は、共培養の10日目と12日目に見られました。14日目以降、MBPシグナルはより顕著になり、ミエリン包内軸索が検出されました。髄鞘形成は20日目まで共培養の時間とともに増加した。スケールバー:100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:髄鞘形成の定量化。 共培養の10、12、14、16、18、および20日目に、軸索をβIIIチューブリンで染色し、ミエリンをMBPで染色することにより髄鞘形成を評価しました。有髄軸索の割合は、MBP陽性領域とβIIIチューブリン染色領域の比率の計算により決定した。共存培養の10日目と比較して、18日目と20日目に有意差が検出されました。データはSEM±平均値として表されます。n = 3です。クラスカル・ウォリスとダンの多重比較事後検定による一元配置分散分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:シュワン細胞培養の段階。 培養シュワン細胞(A)磁気細胞分離前および(B)後の例示的な明視野写真。磁気細胞分離前の培養物には、細長い紡錘形の形態を持つシュワン細胞、平らで広がりのある線維芽細胞、および結合組織の残骸が含まれます。シュワン細胞のより純粋な培養を達成するために、磁気細胞分離が行われる。スケールバー:200μm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:追加のシュワン細胞の有無にかかわらずDRG外植片の髄鞘形成。 MBP染色領域は、14日目の共存における髄鞘形成を測定するために使用されました。DRG外植体の髄鞘形成は、シュワン細胞を培養物に添加した場合に有意に増加した(対応のないt検定、**p ≤ 0.01)。n = 3です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:共培養における遺伝子発現解析。 MBP、PMP22、MAG、Oct6、Egr2、およびOlig1の相対遺伝子発現レベルを、22日目の共存サンプルにおいてqPCRによって分析した(A)。MBPとPMP22は、共培養で最も高い遺伝子発現レベルを持つターゲットでした。アガロースゲルに適用されたqPCR増幅産物の例示的な写真は、ターゲットの質的存在量を示しています(B)。ゲルの最初と最後のレーンはDNAラダー(100塩基対)を表します。n = 5。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、2つの別々の細胞型培養物、シュワン細胞と後根神経節外植片をマージすることにより、 in vitro 髄鞘形成を生成するための迅速で簡単なプロトコルを提示します。
プロトコルの重要なステップは、特に培養の最初の数日間のDRG外植片の栽培です。DRGは、強力な軸索ネットワークが構築される前は非常に脆弱であり、インキュベーターから取り出したときや培地の交換中など、非常に慎重に取り扱わなければなりません。井戸の底から分離し、培地で泳いでいるのが見つかったDRGは、栽培に失敗したことを示しています。シュワン細胞の場合、異なる培養条件およびサプリメント(例えば、培地中の血清)による増殖速度の変化は、共培養にとって課題となり得る。培養物が過剰な数のシュワン細胞によって生い茂ると、それはウェルの底から剥離し、使用できなくなります。したがって、培養中のシュワン細胞数の滴定が推奨されます。シュワン細胞プロトコルの確立中に、SOX10またはS100免疫染色を使用して純度試験を実施する必要があります。一般に、培地の交換、洗浄および固定ステップを含む培養物の取り扱いは、成功を確実にするために慎重に実行する必要があります。研究対象に応じて観測の時点を選択することが重要です。14日目は、最初の密な有髄軸索の開始点を表すため、髄鞘形成の開始の観察時点として選択でき、後の時点はより完全なミエリン鞘を提供します。
このin vitroの髄鞘形成方法はDRG細胞とシュワン細胞のみを含むため、生物における髄鞘形成のプロセスと正確には似ていません。周囲の組織、微小環境、免疫細胞、遠隔構造からのシグナル伝達などの他の寄与因子は、このモデルでは表されません。しかしながら、この方法は、両方の細胞型の別々の分析および操作によってPNSの髄鞘形成を調査するのに適したモデルを提供する9、15、16。共培養用のシュワン細胞またはDRGは、特定の細胞型の寄与を解読するために罹患動物または処置動物から回収することができる17、18。この設定の後期ステージを使用する場合は、DRG由来のシュワンセルの影響の可能性を排除するために、シュワンセルを追加追加せずにコントロール条件を含めることを強くお勧めします。私たちの経験では、シュワン細胞を含まないDRG外植片の髄鞘形成は、共培養よりも有意に少ない程度で検出されます(補足図2)。
DRG外植片の使用は、解離したニューロン培養と比較して、無傷の構造構造の利点を提供します。ミエリン塩基性タンパク質(MBP)の免疫蛍光染色は、有髄軸索領域の定量を可能にし、共培養における髄鞘形成のための十分な読み出しを提供する。22日目の共存サンプルの遺伝子発現解析では、MBP、末梢ミエリンタンパク質(PMP22)、ミエリン関連糖タンパク質(MAG)、八量体結合因子6(Oct6)、ETS関連遺伝子2(Erg2)、および希突起膠細胞転写因子1(Olig1)の存在が明らかになり、MBPおよびPMP22の発現レベルが最も高かった(補足図3)。したがって、記載されたプロトコルは、共培養における髄鞘形成マーカーのためのいくつかの標的オプションを有する方法を提供する。
この方法の潜在的な用途には、末梢における髄鞘形成の過程に関する基礎研究アプローチ、ならびにミエリンの損傷を含むPNSの疾患に対する治療化合物の検証が含まれる。
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Disclosures
著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
ラルフ・ゴールド教授とジサ・エルリッヒマン博士のアドバイスとサポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
- Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
- Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
- Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
- Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
- Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
- Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
- Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
- Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
- Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
- Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
- Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
- Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
- Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).
