Summary
Dorsal kök gangliyonları ve Schwann hücrelerinin kokültür sisteminde, periferik sinir sisteminin miyelinasyonu incelenebilir. Bu model, periferik miyelinasyonu gözlemlemek ve ölçmek ve ilgilenilen bileşiklerin miyelin kılıfı üzerindeki etkilerini incelemek için deneysel fırsatlar sunmaktadır.
Abstract
Miyelinasyon süreci, sinir sisteminde hızlı ve yeterli sinyal iletimini sağlamak için gereklidir. Periferik sinir sisteminde, nöronlar ve Schwann hücreleri, aksonların miyelinasyonunu kontrol etmek için karmaşık bir etkileşime girer. Bu etkileşimin bozuklukları ve miyelin kılıfının parçalanması, enflamatuar nöropatilerin ayırt edici özellikleridir ve nörodejeneratif bozukluklarda ikincil olarak ortaya çıkar. Burada, periferik sinir sistemindeki miyelinasyon sürecini araştırmak, akson-Schwann hücre etkileşimlerini incelemek ve terapötik ajanların her hücre tipi üzerindeki potansiyel etkilerini ayrı ayrı değerlendirmek için periferik aksonların sağlam bir miyelinasyonunu geliştiren dorsal kök gangliyon eksplantları ve Schwann hücrelerinin bir kokültür modelini sunuyoruz. Metodolojik olarak, embriyonik sıçanların (E13.5) dorsal kök ganglionları toplandı, çevre dokularından ayrıştırıldı ve 3 gün boyunca bütün eksplantlar olarak kültürlendi. Schwann hücreleri 3 haftalık yetişkin sıçanlardan izole edildi ve siyatik sinirler enzimatik olarak sindirildi. Elde edilen Schwann hücreleri, manyetik aktive edilmiş hücre sıralama ile saflaştırıldı ve neuregulin ve forskolin ile zenginleştirilmiş koşullar altında kültürlendi. 3 günlük dorsal kök ganglion eksplant kültüründen sonra, askorbik asit içeren bir ortamda bir dorsal kök ganglion eksplantına 30.000 Schwann hücresi eklendi. Miyelinasyonun ilk belirtileri, immünositokimyasal boyamada miyelin bazik proteini için dağınık sinyaller yoluyla kokültürün 10. gününde tespit edildi. 14. günden itibaren, miyelin kılıfları oluşturuldu ve aksonlar boyunca yayıldı. Miyelinasyon, aksonal yoğunluktaki farklılıkları hesaba katmak için miyelinasyon alanı ve akson alanının bir oranı olarak miyelin bazik protein boyaması ile ölçülebilir. Bu model, periferik sinir sisteminin enflamatuar ve nörodejeneratif hastalıklarında demiyelinasyon ve nörodejenerasyon patolojisini ve olası tedavi fırsatlarını anlamak için çok önemli olan in vitro periferik miyelinasyonun çeşitli yönlerini incelemek için deneysel fırsatlar sunmaktadır.
Introduction
Periferik sinir sisteminde (PNS), hızlı bilgi iletimine miyelin sarılı aksonlar aracılık eder. Aksonların miyelinasyonu, elektrik uyarılarının hızlı yayılmasını sağlamak için gereklidir, çünkü sinir liflerinin iletim hızı akson çapı ve miyelin kalınlığı1 ile ilişkilidir. Periferden merkezi sinir sistemine (CNS) duyusal sinyalleme, dorsal kök gangliyonu (DRG) olarak adlandırılan dorsal kökün genişlemesinde bulunan birinci dereceden duyusal nöronların aktivasyonuna dayanır. Miyelin oluşumu ve bakımı için, PNS'deki miyelinleştirici Glia hücreleri olan aksonlar ve Schwann hücreleri arasında sürekli iletişim zorunludur2.
PNS'nin birçok hastalığı, primer aksonal veya demiyelinizan hasar ile bilginin iletimini bozar, bu da hipestezi veya disestezi ile sonuçlanır. Birinci dereceden duyusal nöronlar, nöron ve çevresindeki Schwann hücreleri arasındaki karmaşık bir etkileşim ile nöronal hasardan sonra bir dereceye kadar yenilenme yeteneğine sahiptir3. Bu durumda, Schwann hücreleri aksonal ve miyelin kalıntılarını temizlemek ve aksonal rejenerasyonu teşvik etmek için hücresel yeniden programlamaya tabi tutulabilir ve bu da remiyelinasyon4 ile sonuçlanır. Sağlık ve hastalıkta miyelinasyon mekanizmalarını anlamak, PNS'nin demiyelinizan bozuklukları için olası tedavi seçeneklerini bulmak için önemlidir. Miyelin ayrıca akut nörotravma ile de zarar görebilir ve periferik sinir hasarından sonra fonksiyonel iyileşmeyi ilerletmek için miyelinasyonu teşvik eden yaklaşımlar araştırılmaktadır5.
Periferik miyelinasyon konusundaki bilgimiz büyük ölçüde Schwann hücrelerinin ve duyusal nöronların miyelinasyon kokültürlerinden yararlanmıştır. İlk yaklaşımların 6,7,8 uygulanmasından bu yana, miyelinasyon farklı kokültür sistemlerinin kullanımı ile yoğun bir şekilde çalışılmıştır 9,10,11. Burada, dorsal kök ganglion aksonlarının sağlam in vitro miyelinasyonu için hızlı ve kolay bir protokol sunuyoruz. Schwann hücre hazırlığı protokolü, daha önce Pitarokoili ve ark.13'te yayınlanan Andersen ve ark.12'nin protokolüne dayanmaktadır. Miyelinasyonun yaklaşık 14. günde gerçekleştiği kokültür için genç sıçanlardan ve embriyonik DRG eksplant kültürlerinden türetilen Schwann hücrelerini kullanıyoruz. Yöntemin amacı, doğrudan akson-Schwann hücre etkileşiminin bir sonucu olarak miyelin oluşumunu araştırmak ve PNS miyelinasyonunun modülatörlerini incelemek için bir sistem sağlamaktır. Ayrışmış nöronal hücre kültürlerine kıyasla, DRG eksplantları anatomik olarak daha korunur ve uzun aksonal süreçler oluşturur. Miyelinli akson alanının miktarının belirlenmesi, kokültürde miyelinasyon için yeterli bir okuma sağlar. Yöntem, terapötik bileşikleri PNS miyelinasyonu üzerindeki potansiyel etkileri açısından taramak için değerli bir araçtır ve hayvan modellerinde in vivo çalışmalara ek olarak da kullanılabilir14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Schwann hücre kültürü
- Schwann hücre kültürü için kaplama
- Hücre kültürü bulaşıklarını steril koşullar altında kaplayın. Her biri iki adet 60 mm doku kültürü (TC) kabına 2 mL% 0.01 poli-L-lizin (PLL) uygulayın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- PLL'yi çıkarın, TC bulaşıklarını damıtılmış suyla 2 kat yıkayın ve 4 ° C'de gece boyunca 2 mL 1 μg /cm2 laminin ile inkübe edin. TC bulaşıkları aqua dest ile 2 kat yıkayın ve tabakların hava kurumasını bekleyin.
- Schwann hücre kültürü için orta hazırlık
- Steril koşullar altında Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (DMEM)/F-12'ye (yüksek glikoz) %10 ısı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 2 μM forskolin, 10 nM neuregulin ve 50 μg/mL gentamisin ekleyerek 50 mL Schwann hücre ortamı hazırlayın.
- Leibovitz'in L-15 besiyerinin 70 mL'sini steril koşullar altında 50 μg/mL gentamisin ile hazırlayın.
- Siyatik sinir hazırlığı
NOT: Tüm siyatik sinir hazırlama adımları temiz bir tezgah altında gerçekleştirilir.- Ca2 + ve Mg2+ içermeyen 5 mL buz gibi soğuk Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) içeren bir adet 100 mm TC kabı, 5 mL buz gibi soğuk Leibovitz'in L-15 ortamına sahip bir adet 100 mm TC kabı ve 5 mL buz gibi soğuk Leibovitz'in L-15 ortamı ve 50 μg/mL gentamisin içeren bir adet 100 mm TC kabı hazırlayın.
- Tüm aletleri otoklavlama ile temizleyin. Aletleri ve çalışma alanını %70 etanol ile püskürtün.
- Beş adet 3 haftalık erkek Sprague Dawley sıçanını CO2 inhalasyonu ve dekapitasyonu kullanarak ötenazi yapın. Sıçanın gövdesine% 70 etanol püskürtün.
- Dorsal sol alt ekstremiteyi makasla açın ve biseps femoris kasını dikkatlice çıkarın. Siyatik siniri kavisli forsepslerle düzgün bir şekilde yükselterek gevşetin ve sinirin çürümemesini sağlayın.
- Siniri düzeltmek için sinirin en proksimal kısmını kavisli forseps ile tutun ve makas kullanarak siniri mümkün olduğunca yükseğe klipsleyin. Ardından, siniri sakral pleksusa ve pençeye makasla yakın bir yere kırpın. Sağ taraf için 1.3.4-1.3.5 adımlarını yineleyin.
NOT: Uzuv açılırken, herhangi bir kan damarını çürütmemeye dikkat edin. - Forseps kullanarak, sol ve sağ siyatik sinirleri buz gibi soğuk DPBS ile 100 mm'lik bir TC kabına koyun.
- Siyatik sinir yenileme
- Forseps kullanarak tüm sinirleri buz gibi soğuk Leibovitz'in L-15 ortamı ve 50 μg/mL gentamisin ile 100 mm'lik bir TC kabına aktarın. Bir stereomikroskop kullanmaya devam edin ve iki çift ince forseps ile sinirlerden yağ, kas ve kan damarlarını çıkarın. Forseps ile sinirleri tutun ve buz gibi soğuk Leibovitz'in L-15 ortamı ile 100 mm'lik bir TC kabına aktarın.
- Siyatik sinirin proksimal ve distal uçlarını tanımlayın. Proksimal sinir ucunu ikinci çift ince forseps ile tutarken, epineurium'u proksimal ila distal yönde bir çift ince forseps ile çıkarın.
- Saflaştırılmış sinirleri buz gibi soğuk Leibovitz'in L-15 ortamı ve 50 μg / mL gentamisin ile 100 mm'lik bir TC kabına aktarın. İki çift ince forseps kullanarak tek sinir liflerini ayırmak ve izole etmek için izole sinir fasiküllerini kızdırın.
- Sinir liflerini 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve mümkün olduğunca az ortam alın. Sinir liflerine 50 μg / mL gentamisin içeren 50 mL Leibovitz'in L-15 ortamını ekleyin ve 50 mL tüpte birkaç kez katledin.
- Siyatik sinirin enzimatik sindirimi
NOT: Sonraki adımlar (adım 1.5-1.8, 2.1 ve 2.2) steril koşullar altında gerçekleştirilir.- 10 mL DMEM (yüksek glikoz) içinde% 0.25 dispaz II,% 0.05 tip I kollajenaz ve 50 μg / mL gentamisin içeren enzimatik sindirim çözeltisini hazırlayın.
- Tüpü 188 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı 25 mL'lik bir serolojik pipetle çıkarın ve peleti kalan Leibovitz'in L-15 ortamıyla birlikte 1.000 mL'lik bir pipet kullanarak 60 mm'lik bir TC kabına aktarın.
- 50 mL'lik tüpü 10 mL'lik enzimatik sindirim çözeltisi ile durulayın ve sinir liflerini içeren kaba ekleyin. Sindirim için erişilebilir yüzeyi en üst düzeye çıkarmak için dokuyu bir pipetin ucuyla dikkatlice dağıtın.
- 18 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO 2'de inkübe edin ve Hanks'in dengeli tuz çözeltisineCa2 ve Mg2 + (HBSS) olmadan 10 mL% 40 FCS ekleyerek sindirimi durdurun.
- Hücre ayrımı
- Serolojik bir pipet kullanarak sindirilen sinirleri 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 188 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti %10 FCS ve 50 μg/mL gentamisin içeren 10 mL DMEM içinde yeniden askıya alın. Daha sonra 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL ve 200 μL pipet ucu kullanarak pelet 20 kez askıya alın.
- Hücre süspansiyonunu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 188 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve peleti% 10 FCS ve 50 μg / mL gentamisin içeren 4 mL DMEM ile yeniden askıya alın.
- İki PLL ve laminin kaplı 60 mm TC kabının her birine 2 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin. Hücreleri mekanik stresten korumak ve yapışmayı desteklemek için plakaları inkübatörde 2 gün boyunca el değmeden bırakın.
- Schwann hücre farklılaşması
- 2 gün sonra, ortamı çıkarın ve plakaları DMEM (yüksek glikoz),% 10 FCS ve 50 μg / mL gentamisin ile 2 kat dikkatlice durulayın. Daha sonra, 2 mL Schwann hücre ortamı ekleyin. Schwann hücre ortamını her 2. günde bir değiştirin ve mikroskop kullanarak hücre görünümünü ve akıcılığını gözlemleyin.
NOT: Schwann hücreleri ve DRG eksplantları, kokültür için zamanında, koordineli bir şekilde hazırlanmalıdır. Schwann hücreleri% 80'lik bir akıcılığa yakın olduğunda, DRG preparatı için E 13.5'te embriyoları olan bir sıçanın mevcut olduğundan emin olun.
- 2 gün sonra, ortamı çıkarın ve plakaları DMEM (yüksek glikoz),% 10 FCS ve 50 μg / mL gentamisin ile 2 kat dikkatlice durulayın. Daha sonra, 2 mL Schwann hücre ortamı ekleyin. Schwann hücre ortamını her 2. günde bir değiştirin ve mikroskop kullanarak hücre görünümünü ve akıcılığını gözlemleyin.
- Hücre tripsinizasyonu ve manyetik ayırma
NOT: Farklı Schwann hücre kültürü aşamalarının örnek resimleri için, Ek Şekil 1'e bakınız.- Hücreler yaklaşık% 80'lik bir akıcılığa ulaştığında (6-12 günlük kültür), plakaları 3 mL DPBS ile 2x dikkatlice yıkayın ve 3 dakika boyunca 2 mL% 0.05 Tripsin / EDTA (37 ° C'ye ısıtılmış) ile inkübe edin. Hücreler plaka tabanından ayrıldığında,% 10 FCS ve 50 μg / mL gentamisin ile 2 mL DMEM ilavesiyle sindirimi etkisiz hale getirin.
NOT: Kesinlikle 3 dakikalık bir tripsinizasyon süresine sadık kalın ve daha sonra hızla ilerleyin. - Hücre peletini, %0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 nM EDTA ile DPBS içeren 2 mL manyetik hücre ayırma tamponunda yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini 10 μL tripan mavisi ile birleştirin ve bir boyama odası kullanarak hücreleri sayın.
- Hücre süspansiyonunu 188 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve hücre peletini 1 x 107 hücre başına 90 μL manyetik hücre ayırma tamponunda yeniden askıya alın. 1 x 107 hücre başına 10 μL Thy-1 mikroboncuk ekleyin. Çözeltiyi birkaç kez tekrar askıya alın ve karanlıkta 8 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
- Hücre süspansiyonuna 2 mL manyetik hücre ayırma tamponu ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve pelet 500 μL manyetik hücre ayırma tamponunda yeniden askıya alın.
- Manyetik hücre ayırma kolonunu 1 mL manyetik hücre ayırma tamponu ile nemlendirin. Manyetik hücre ayırma sütununu manyetik hücre ayırıcıya yerleştirin. Hücreleri manyetik hücre ayırma sütununa uygulayın. Akışı toplayın ve 10 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'de santrifüj yapın.
NOT: Schwann hücreleri sütunu geçerken fibroblastlar pozitif olarak seçilir ve sütunda kalır. Fibroblastlar bir damga ile toplanabilir (örneğin, Schwann hücre boyama protokolleri için negatif bir kontrol olarak). - Süpernatantı atın ve peleti kokültür ortamının 1 mL'sinde yeniden askıya alın (bkz. adım 3.1.1). Tripan mavisi ve bir boyama odası ile boyandıktan sonra hücreleri sayın.
- Hücreler yaklaşık% 80'lik bir akıcılığa ulaştığında (6-12 günlük kültür), plakaları 3 mL DPBS ile 2x dikkatlice yıkayın ve 3 dakika boyunca 2 mL% 0.05 Tripsin / EDTA (37 ° C'ye ısıtılmış) ile inkübe edin. Hücreler plaka tabanından ayrıldığında,% 10 FCS ve 50 μg / mL gentamisin ile 2 mL DMEM ilavesiyle sindirimi etkisiz hale getirin.
2. DRG eksplant kültürü
- DRG büyüme ortamı hazırlığı
- Nörobazal ortama% 2 B27,% 2 at serumu,% 1 L-glutamin,% 0.5 penisilin / streptomisin ve 10 ng / mL sinir büyüme faktörü (NGF) ekleyerek DRG büyüme ortamını hazırlayın. Büyüme ortamını 4 ° C'de saklayın.
NOT: Büyüme ortamı 2 gün boyunca kullanılabilir.
- Nörobazal ortama% 2 B27,% 2 at serumu,% 1 L-glutamin,% 0.5 penisilin / streptomisin ve 10 ng / mL sinir büyüme faktörü (NGF) ekleyerek DRG büyüme ortamını hazırlayın. Büyüme ortamını 4 ° C'de saklayın.
- DRG eksplantları için kaplama
- Kapakları 1 saat boyunca% 70 etanol içinde inkübe edin ve kavisli forseps kullanarak 4 kuyucuklu tabakların kuyucuklarına yerleştirin. Etanol kuruduktan sonra, kuyucuk başına 300 μL 0.2 mg / mL poli-D-lizin (PDL) uygulayın ve gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Kapak fişlerini art arda DPBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. DPBS'yi çıkarın, kapaklara 300 μL 1 μg / mL laminin uygulayın ve gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- DPBS ile 5 dakika boyunca üç yıkama adımından sonra, DPBS'yi 190 μL DRG büyüme ortamı ile değiştirin. 4 delikli plakaları inkübatöre 37 °C ve %5 CO2'de yerleştirin.
- DRG hazırlığı
NOT: Embriyonik sıçanların DRG'sini temiz bir tezgah altında toplayın.- Hazırlamadan önce, tüm aletleri% 70 etanol ile temizleyin. 10 (embriyo başına iki) 35 mm TC kabını, çanak başına 2 mL buz gibi soğuk HBSS ve iki adet 100 mm TC kabını çanak başına 5 mL buz gibi soğuk HBSS ile doldurun.
- Gebe sıçanları (yetişkin dişi Sprague Dawley sıçanları, E13.5) CO2 inhalasyonu ve dekapitasyonu ile ötenazi yapın.
- Vücudu% 70 etanol ile püskürtün ve sıçanın ventral gövdesini açın. Uterusu dikkatlice çıkarın ve buz gibi HBSS ile 100 mm'lik bir TC kabına yerleştirin.
- Kavisli forseps kullanarak uterusu tutun ve uterus duvarını ince forsepslerle açın. Bir amniyotik kesesi çıkarın ve ince forsepsli bir delik sıkıştırarak dikkatlice açın.
- Embriyoyu çevreleyen dokulardan çıkarın, göbek kordonunu kesin ve ince forsepsler kullanarak embriyonun kafasını kesin. Gövdeyi, kavisli forseps ve spatula kullanarak HBSS ile doldurulmuş 100 mm'lik bir TC kabına yerleştirin.
- Tüm embriyoları uterustan hızlıca çıkarın ve HBSS ile doldurulmuş 100 mm'lik bir TC kabına aktarın. Beşten fazla embriyo varsa, adım 2.3.1'e göre 2 mL HBSS içeren ek bir 35 mm TC kabı hazırlayın.
- Bir embriyo gövdesini, bir spatula ve kavisli forseps kullanarak HBSS ile doldurulmuş 35 mm'lik bir TC kabına yavaşça yerleştirin. Bir stereomikroskop altında, ince forseps ve mikro makas kullanarak embriyoyu iki yarıya bölmek için gövdenin dorsal kısmını açın. Bir yarısını yana çevirin ve embriyonun dorsal kısmındaki bir çizgide bulunan DRG ipliğini tanımlayın.
- DRG'yi ince forseps ve mikro makas kullanarak bir bütün olarak kesin. DRG'yi 2 mL HBSS ile doldurulmuş taze bir 35 mm TC kabına yerleştirin ve ince forseps ve mikro makas kullanarak tek bir DRG'yi kalan dokudan ayırın.
- DRG hücre kültürü
- 190 μL DRG büyüme ortamı içeren 4 kuyucuklu plakaları inkübatörden DRG'nin hazırlanacağı temiz tezgaha götürün. Tek bir DRG'yi, ince forseps ve spatula kullanarak 4 delikli bir kültür plakasının bir kuyucuğuna dikkatlice aktarın. DRG'yi her bir kuyucuğun ortasına yerleştirin, çünkü DRG'nin bağlanması için merkezi bir konum önemlidir.
- Bundan sonra steril koşullarda çalışın. Eksplant kültürlerini inkübatöre 37 ° C'de ve% 5 CO2'de yerleştirin. Ertesi gün, 100 mL'lik bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa dikkatlice 50 μL DRG büyüme ortamı ekleyin.
- DRG eksplant aderansını ve akson büyümesini günlük olarak mikroskop kullanarak gözlemleyin ve kültürün 3. gününde örtü kaymasından ayrılan veya aksonları geçemeyen DRG eksplantlarını atın.
NOT: DRG eksplantları kültürün ilk günlerinde çok kırılgandır ve özellikle ortam değiştirildiğinde plakaları inkübatörün içine ve dışına taşırken, hatta inkübatör kapağını kapatırken bile dikkatle ele alınması gerekir. Kuyu başına 190 μL ortamın hassas hacmi, DRG eksplantlarını kültürün ilk gününde yerinde tutmak için çok önemlidir. Gevşek DRG eksplantları, kapak kaymasına yapışmak yerine ortamda yüzdükleri için günlük kontrol sırasında kolayca tanımlanabilir.
3. Kokültür
- Schwann hücrelerinin DRG eksplant kültürüne aktarılması
- DRG büyüme ortamına% 0.1 askorbik asit ekleyerek kokültür ortamını hazırlayın.
- DRG eksplant kültürünün 3. gününde, DRG büyüme ortamını, kuyu başına 30.000 Schwann hücresi (adım 1.8'den itibaren) içeren 250 μL kokültür ortamı ile dikkatlice değiştirin.
- DRG eksplantlarının ve Schwann hücrelerinin kokültürünü 22 güne kadar saklayın. Kokültür ortamının 250 μL'sini her gün dikkatlice değiştirin ve mikroskop kullanarak hücrelerin görünümünü gözlemleyin.
NOT: Kültürün ilk günlerinde kokültürdeki DRG aksonları ve Schwann hücrelerinin bir örneği için, Şekil 1'e bakınız.
- İmmünositokimyasal boyama
NOT: Boyama işlemi sırasında kokültür numunelerini son derece dikkatli bir şekilde kullanın, çünkü kolayca zarar görebilirler.- Hücreleri kapaklara sabitlemek için, ortamı yavaşça çıkarın, DPBS ile 3 kez dikkatlice yıkayın ve 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) içinde inkübe edin. PFA'yı DPBS ile değiştirin ve sabit hücreleri 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
DİKKAT: %4 PFA kullanırken, önerilen kişisel koruyucu ekipmanı kullanın. - Kapakları DPBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, ardından DPBS'de 1 saat boyunca bloke edici solüsyon (% 10 keçi serumu,% 10 sığır serum albümini [BSA],% 0.1 jelatin ve% 0.05 Triton X-100) ile bloke edin. Birincil antikorlar βIII-tübülin (1: 7.500) ve miyelin bazik proteinini (MBP) (1: 750) bloke edici çözelti içinde seyreltin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Hücreleri DPBS ile 5 dakika boyunca 3 kat yıkayın. Bloke edici çözeltide 1:1.000'lik bir seyreltmede floresan boya konjuge ikincil antikorlar kullanın ve oda sıcaklığında (RT) 2 saat inkübe edin.
- Hücreleri 5 dakika boyunca DPBS ile 3 kez yıkayın ve hücreleri 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) dahil olmak üzere floresan montaj ortamı ile mikroskobik slaytlara monte edin. Slaytları mikroskobik dokümantasyona kadar karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
DİKKAT: Floresan montaj ortamını kullanırken, önerilen kişisel koruyucu ekipmanı kullanın.
- Hücreleri kapaklara sabitlemek için, ortamı yavaşça çıkarın, DPBS ile 3 kez dikkatlice yıkayın ve 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) içinde inkübe edin. PFA'yı DPBS ile değiştirin ve sabit hücreleri 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
- Analiz
- Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak merkezdeki DRG eksplantını çevreleyen sekiz tanımlanmış bölgenin fotoğraflarını çekin.
- MBP ile boyanmış βIII-tübülin pozitif aksonların ve miyelinasyon alanlarının ölçülmesi için bir görüntü analiz yazılımı uygulaması kullanın.
- Miyelinasyon yüzdesini miyelinli aksonların ve miyelinli olmayan aksonların bir oranı olarak hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kokültürde miyelinasyon 10, 12, 14, 16, 18 ve 20. günlerde değerlendirildi. DRG eksplantları ve Schwann hücreleri MBP, βIII-tübülin ve DAPI için boyandı. Kokültürdeki aksonal ağ yoğundu ve gözlemin zaman içinde gözle görülür şekilde değişmedi. Miyelinin ilk belirtileri, küçük parçalar şeklinde, 10. günde tespit edildi ve 12. günde arttı (Şekil 2). MBP pozitif alanlar, kültürün 20. gününe kadar zamanla artmıştır. Miyelinasyon, MBP ve βIII-tübülin pozitif alanlarının bir oranı olarak ölçüldü. Miyelinasyon, 18. ve 20. günlerde 10. güne göre anlamlı olarak artmıştır (Şekil 3; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001).
Şekil 1: Schwann hücrelerinin ve aksonlarının kokültürde ortaya çıkışı. 3. günde kokültürün örnek resmi. Siyah oklar ince DRG aksonları gösterir ve beyaz ok, bir aksona bağlı uzun ve iğ şeklinde bir morfolojiye sahip bir Schwann hücresine işaret eder. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: DRG eksplantları ve Schwann hücrelerinin kokültüründe miyelinasyon. Nöronal belirteç βIII-tübülin ve MBP için boyama, kokültürde miyelinasyon gelişimini araştırmak için her iki kültüre katıldıktan sonra 10, 12, 14, 16, 18 ve 20. günlerde yapıldı. Miyelinasyonun ilk belirtileri kokültürün 10. ve 12. günlerinde görüldü. 14. günden itibaren, MBP sinyali daha belirgindi ve miyelin ile sarılmış aksonlar tespit edildi. Miyelinasyon, kokültür zamanı ile 20. güne kadar artmıştır. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Miyelinasyonun miktarı. Kokültürün 10, 12, 14, 16, 18 ve 20. günlerinde, miyelinasyon, aksonların βIII-tübülin ve miyelinin MBP ile boyanmasıyla değerlendirildi. Miyelinli aksonların yüzdesi, MBP pozitif ve βIII-tübülin boyalı alanların oranının hesaplanmasıyla belirlendi. Kokültürün 18. ve 20. günlerinde 10. güne göre anlamlı farklılıklar tespit edildi. Veriler SEM ± ortalama olarak ifade edilir; n = 3. Kruskal-Wallis ve Dunn'ın çoklu karşılaştırma post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Schwann hücre kültürünün aşamaları. Manyetik hücre ayrımından önce ve sonra (B) kültürlü Schwann hücrelerinin örnek parlak alan resimleri. Manyetik hücre ayrımından önce, kültür, uzatılmış ve iğ şekli morfolojisine, düz ve yayılmış görünen fibroblastlara ve bağ dokusu kalıntılarına sahip Schwann hücrelerini içerir. Schwann hücrelerinin daha saf bir kültürünü elde etmek için, manyetik hücre ayrımı yapılır. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Ek Schwann hücreleri olan ve olmayan DRG eksplantlarının miyelinasyonu. MBP boyalı alan, 14. günde kokültürde miyelinasyonu ölçmek için kullanıldı. Schwann hücreleri kültüre eklenirse DRG eksplantlarının miyelinasyonu anlamlı olarak artmıştır (eşlenmemiş t-testi, **p ≤ 0.01). n = 3. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: Kokültürde gen ekspresyon analizi. MBP, PMP22, MAG, Oct6, Egr2 ve Olig1'in göreceli gen ekspresyon seviyeleri, 22. günde qPCR (A) ile kokültür örneklerinde analiz edildi. MBP ve PMP22, kokültürde en yüksek gen ekspresyon seviyelerine sahip hedeflerdi. Bir agaroz jeline uygulanan qPCR amplifikasyon ürünlerinin örnek bir resmi, hedeflerin (B) kalitatif bolluğunu göstermektedir. Jel üzerindeki ilk ve son şeritler bir DNA merdivenini (100 baz çifti) temsil eder. n = 5. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, iki ayrı hücre tipi kültürü, Schwann hücreleri ve dorsal kök gangliyon eksplantlarını birleştirerek in vitro miyelinasyon üretimi için hızlı ve kolay bir protokol sunuyoruz.
Protokolün kritik bir adımı, özellikle kültürün ilk günlerinde DRG eksplantlarının yetiştirilmesidir. DRG, güçlü bir aksonal ağ kurulmadan önce çok kırılgandır ve örneğin inkübatörden çıkarıldığında veya ortam değişimi sırasında çok dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Kuyunun dibinden ayrılan ve ortada yüzerken bulunan DRG, başarısız ekim gösterir. Schwann hücreleri için, farklı yetiştirme koşulları ve takviyeleri (örneğin, ortamdaki serum) nedeniyle çoğalma oranlarının değişmesi, kokültür için bir zorluk oluşturabilir. Kültür aşırı sayıda Schwann hücresi tarafından büyümüşse, kuyunun dibinden ayrılır ve kullanılamaz hale gelir. Bu nedenle kültürdeki Schwann hücre sayısının titrasyonunun yapılması önerilir. Schwann hücre protokolünün oluşturulması sırasında, SOX10 veya S100 immün boyama kullanılarak saflık testleri yapılmalıdır. Genel olarak, ortamın değiştirilmesinin yanı sıra yıkama ve sabitleme adımları da dahil olmak üzere kültürün ele alınması, başarılı bir sonuç elde etmek için dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Gözlem zaman noktasını araştırma ilgi alanına göre seçmek önemlidir; 14. gün, ilk yoğun miyelinli aksonların başlangıç noktasını temsil eder ve bu nedenle miyelinasyonun başlatılması için gözlem zaman noktası olarak seçilebilirken, daha sonraki zaman noktaları daha eksiksiz miyelin kılıfları sunar.
Bu in vitro miyelinasyon yöntemi sadece DRG ve Schwann hücrelerini içerdiğinden, organizmadaki miyelinasyon sürecine tam olarak benzemez. Çevreleyen doku, mikro çevre, bağışıklık hücreleri ve uzak yapılardan gelen sinyaller gibi diğer katkıda bulunan faktörler bu modelde temsil edilmemektedir. Bununla birlikte, bu yöntem, her iki hücre tipinin ayrı analizi ve manipülasyonu ile PNS'nin miyelinasyonunu araştırmak için uygun bir model sağlar 9,15,16. Kokültür için Schwann hücreleri veya DRG, spesifik hücre tipi17,18'in katkısını deşifre etmek için hastalıklı veya tedavi edilmiş hayvanlardan toplanabilir. Bu kurulumun geç aşamalarını kullanırken, DRG türevli Schwann hücrelerinin olası etkilerini dışlamak için Schwann hücrelerini eklemeden bir kontrol koşulu eklemeniz şiddetle tavsiye edilir. Deneyimlerimize göre, Schwann hücreleri olmayan DRG eksplantlarında miyelinasyon, kokültüre göre önemli ölçüde daha az tespit edilmiştir (Ek Şekil 2).
DRG eksplantlarının kullanımı, ayrışmış nöronal kültürlere kıyasla sağlam yapısal mimarinin avantajını sağlar. Miyelin bazik proteininin (MBP) immünofloresan boyanması, miyelinli akson alanının ölçülmesine izin verir ve kokültürde miyelinasyon için yeterli bir okuma sağlar. 22. günde kokültür örneklerinin gen ekspresyon analizi, MBP ve PMP22 için en yüksek ekspresyon seviyelerine sahip MBP, periferik miyelin proteini (PMP22), miyelinle ilişkili glikoprotein (MAG), oktamer bağlayıcı faktör 6 (Oct6), ETS ile ilişkili gen 2 (Erg2) ve oligodendrosit transkripsiyon faktörü 1'in (Olig1) varlığını ortaya koymuştur. Bu nedenle, açıklanan protokol, kokültürdeki miyelinasyon belirteçleri için çeşitli hedef seçeneklere sahip bir yöntem sunmaktadır.
Bu yöntemin potansiyel uygulamaları, periferdeki miyelinasyon süreci ile ilgili temel araştırma yaklaşımlarını ve ayrıca miyelin hasarı da dahil olmak üzere PNS hastalıkları için terapötik bileşiklerin doğrulanmasını içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Prof. Dr. Ralf Gold ve PD Dr. Gisa Ellrichmann'a tavsiye ve destekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
- Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
- Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
- Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
- Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
- Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
- Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
- Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
- Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
- Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
- Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
- Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
- Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
- Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).
