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Neuroscience

Myélinisation in vitro d’axones périphériques dans une coculture d’explants de ganglions radiculaires dorsaux de rat et de cellules de Schwann

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64768
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Ruhr-University Bochum, St. Josef Hospital

Summary

Dans le système de coculture des ganglions de la racine dorsale et des cellules de Schwann, la myélinisation du système nerveux périphérique peut être étudiée. Ce modèle offre des possibilités expérimentales d’observer et de quantifier la myélinisation périphérique et d’étudier les effets des composés d’intérêt sur la gaine de myéline.

Abstract

Le processus de myélinisation est essentiel pour permettre une transduction rapide et suffisante du signal dans le système nerveux. Dans le système nerveux périphérique, les neurones et les cellules de Schwann s’engagent dans une interaction complexe pour contrôler la myélinisation des axones. Les perturbations de cette interaction et la dégradation de la gaine de myéline sont caractéristiques des neuropathies inflammatoires et surviennent secondairement dans les troubles neurodégénératifs. Ici, nous présentons un modèle de coculture d’explants ganglionnaires de la racine dorsale et de cellules de Schwann, qui développe une myélinisation robuste des axones périphériques pour étudier le processus de myélinisation dans le système nerveux périphérique, étudier les interactions axones-cellules de Schwann et évaluer les effets potentiels des agents thérapeutiques sur chaque type de cellule séparément. Méthodologiquement, les ganglions radiculaires dorsaux de rats embryonnaires (E13.5) ont été récoltés, dissociés de leurs tissus environnants et cultivés comme explants entiers pendant 3 jours. Les cellules de Schwann ont été isolées chez des rats adultes âgés de 3 semaines et les nerfs sciatiques ont été digérés par voie enzymatique. Les cellules de Schwann résultantes ont été purifiées par tri cellulaire activé magnétiquement et cultivées dans des conditions enrichies en neuréguline et en forskoline. Après 3 jours de culture d’explantation de ganglions de la racine dorsale, 30 000 cellules de Schwann ont été ajoutées à un ganglion de la racine dorsale explant dans un milieu contenant de l’acide ascorbique. Les premiers signes de myélinisation ont été détectés au jour 10 de la coculture, par des signaux diffusés pour la protéine basique de la myéline dans la coloration immunocytochimique. À partir du jour 14, des gaines de myéline se sont formées et se sont propagées le long des axones. La myélinisation peut être quantifiée par coloration des protéines basiques de la myéline en tant que rapport de l’aire de myélinisation et de la zone axonale, pour tenir compte des différences de densité axonale. Ce modèle offre des possibilités expérimentales d’étudier divers aspects de la myélinisation périphérique in vitro, ce qui est crucial pour comprendre la pathologie et les possibilités de traitement de la démyélinisation et de la neurodégénérescence dans les maladies inflammatoires et neurodégénératives du système nerveux périphérique.

Introduction

Dans le système nerveux périphérique (SNP), la transduction rapide de l’information est médiée par des axones enveloppés de myéline. La myélinisation des axones est essentielle pour permettre la propagation rapide des impulsions électriques, puisque la vitesse de conduction des fibres nerveuses est corrélée au diamètre de l’axone et à l’épaisseur de la myéline1. La signalisation sensorielle de la périphérie au système nerveux central (SNC) repose sur l’activation de neurones sensoriels de premier ordre qui résident dans des élargissements de la racine dorsale, appelés ganglions de la racine dorsale (DRG). Pour la formation et le maintien de la myéline, une communication continue entre les axones et les cellules de Schwann, qui sont les cellules gliales myélinisantes dans le SNP, est obligatoire2.

De nombreuses maladies du SNP perturbent la transduction de l’information par des lésions axonales primaires ou démyélinisantes, entraînant une hypesthésie ou une dysesthésie. Les neurones sensoriels de premier ordre ont la capacité de se régénérer dans une certaine mesure après une lésion neuronale, par une interaction complexe entre le neurone et les cellules de Schwann environnantes3. Dans ce cas, les cellules de Schwann peuvent subir une reprogrammation cellulaire pour éliminer les débris axonaux et de myéline et favoriser la régénération axonale, entraînant une remyélinisation4. Comprendre les mécanismes de myélinisation dans la santé et la maladie est important, afin de trouver des options de traitement possibles pour les troubles démyélinisants du SNP. La myéline peut également être endommagée par un neurotraumatisme aigu, et des approches visant à promouvoir la myélinisation pour faire progresser la récupération fonctionnelle après une lésion nerveuse périphérique sont à l’étude5.

Notre connaissance de la myélinisation périphérique a largement bénéficié des cocultures myélinisantes de cellules de Schwann et de neurones sensoriels. Depuis que les premières approches ont été appliquées 6,7,8, la myélinisation a été étudiée intensément avec l’utilisation de différents systèmes de coculture 9,10,11. Ici, nous fournissons un protocole rapide et facile pour une myélinisation in vitro robuste des axones ganglionnaires de la racine dorsale. Le protocole pour la préparation des cellules de Schwann est basé sur le protocole d’Andersen et al.12, précédemment publié dans Pitarokoili et al.13. Nous utilisons des cellules de Schwann dérivées de rats juvéniles et des cultures embryonnaires d’explantation DRG pour la coculture, dans laquelle la myélinisation se produit vers le 14e jour. L’objectif de la méthode est de fournir un système pour étudier la formation de myéline à la suite de l’interaction directe axone-cellule de Schwann, et d’étudier les modulateurs de la myélinisation PNS. Par rapport aux cultures de cellules neuronales dissociées, les explants DRG sont plus anatomiquement préservés et forment de longs processus axonaux. La quantification de la zone de l’axone myélinisé fournit une lecture suffisante pour la myélinisation dans la coculture. La méthode est un outil précieux pour dépister les composés thérapeutiques pour leur effet potentiel sur la myélinisation PNS, et peut également être utilisée en plus des études in vivo dans des modèles animaux14.

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Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la Directive du Conseil des Communautés européennes sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Culture cellulaire de Schwann

  1. Enrobage pour culture cellulaire Schwann
    1. Enduire les boîtes de culture cellulaire dans des conditions stériles. Appliquer 2 mL de poly-L-lysine (PLL) à 0,01 % sur deux boîtes de culture tissulaire (TC) de 60 mm chacune et incuber pendant une nuit à 4 °C.
    2. Retirer la LPL, laver les plats TC 2x avec de l’eau distillée et incuber avec 2 mL de 1 μg/cm2 de laminine pendant une nuit à 4 °C. Lavez la vaisselle TC 2x avec de l’aqua dest, et laissez les assiettes sécher à l’air.
  2. Préparation du milieu pour la culture cellulaire de Schwann
    1. Préparer 50 mL de milieu cellulaire de Schwann en ajoutant 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) inactivé par la chaleur, 2 μM de forskoline, 10 nM de neuréguline et 50 μg/mL de gentamycine à Dulbecco’s Modified Eagle′s Medium (DMEM)/F-12 (glucose élevé) dans des conditions stériles.
    2. Préparer 70 mL du milieu L-15 de Leibovitz avec 50 μg/mL de gentamycine dans des conditions stériles.
  3. Préparation du nerf sciatique
    REMARQUE: Toutes les étapes de préparation du nerf sciatique sont effectuées sous un banc propre.
    1. Préparer une boîte de 100 mm TC avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) glacée de Dulbecco sans Ca 2+ et Mg2+, une boîte de 100 mm TC avec 5 mL de milieu L-15 de Leibovitz glacé et une boîte de 100 mm TC avec 5 mL de milieu L-15 glacé de Leibovitz et 50 μg/mL de gentamycine.
    2. Nettoyez tous les instruments à l’autoclavage. Pulvériser les instruments et la zone de travail avec de l’éthanol à 70%.
    3. Euthanasier cinq rats Sprague Dawley mâles âgés de 3 semaines en inhalant du CO2 et en le décapitant. Vaporisez le torse du rat avec de l’éthanol à 70%.
    4. Ouvrez le membre inférieur gauche dorsal avec des ciseaux et retirez soigneusement le muscle biceps féminis. Desserrez le nerf sciatique par élévation lisse avec des pinces incurvées, en veillant à ne pas meurtrir le nerf.
    5. Tenez la partie la plus proximale du nerf avec la pince incurvée pour redresser le nerf et coupez le nerf aussi haut que possible à l’aide de ciseaux. Ensuite, coupez le nerf près du plexus sacré et de la patte avec des ciseaux. Répétez les étapes 1.3.4 à 1.3.5 pour le côté droit.
      REMARQUE: Lors de l’ouverture du membre, veillez à ne pas meurtrir les vaisseaux sanguins.
    6. À l’aide de forceps, placez les nerfs sciatiques gauche et droit dans une boîte TC de 100 mm avec du DPBS glacé.
  4. Remise à neuf du nerf sciatique
    1. Utilisez des pinces pour transférer tous les nerfs dans une boîte TC de 100 mm avec du milieu L-15 glacé de Leibovitz et de la gentamycine à 50 μg/mL. Continuez à utiliser un stéréomicroscope et retirez la graisse, les muscles et les vaisseaux sanguins des nerfs avec deux paires de pinces fines. Saisissez les nerfs avec une pince et transférez-les dans un plat TC de 100 mm avec le milieu L-15 glacé de Leibovitz.
    2. Identifier les extrémités proximales et distales du nerf sciatique. Retirez l’épineurium avec une paire de pinces fines dans une direction proximale à distale, tout en maintenant l’extrémité du nerf proximal avec la deuxième paire de pinces fines.
    3. Transférer les nerfs purifiés dans une boîte TC de 100 mm avec le milieu L-15 glacé de Leibovitz et 50 μg/mL de gentamycine. Taquinez les fascicules nerveux isolés pour séparer et isoler les fibres nerveuses simples à l’aide de deux paires de pinces fines.
    4. Transférer les fibres nerveuses dans un tube de 50 ml à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml et prendre le moins de milieu possible. Ajouter 50 mL du milieu L-15 de Leibovitz avec 50 μg/mL de gentamycine aux fibres nerveuses et glisser quelques fois dans le tube de 50 mL.
  5. Digestion enzymatique du nerf sciatique
    REMARQUE: Les étapes suivantes (étapes 1.5-1.8, 2.1 et 2.2) sont effectuées dans des conditions stériles.
    1. Préparer la solution de digestion enzymatique contenant 0,25 % de dispase II, 0,05 % de collagénase de type I et 50 μg/mL de gentamycine dans 10 mL de DMEM (glucose élevé).
    2. Centrifuger le tube à 188 x g pendant 5 min à 4 °C, retirer le surnageant avec une pipette sérologique de 25 ml et transférer la pastille avec le milieu L-15 de Leibovitz restant dans une boîte TC de 60 mm à l’aide d’une pipette de 1 000 mL.
    3. Rincer le tube de 50 ml avec 10 mL de la solution de digestion enzymatique et l’ajouter au plat contenant les fibres nerveuses. Répartir soigneusement le mouchoir dans le plat avec la pointe d’une pipette pour maximiser la surface accessible à la digestion.
    4. Incuber à 37 °C et 5 % de CO 2 pendant 18 h, et arrêter la digestion en ajoutant 10 mL de FCS à 40 % dans la solution saline équilibrée de Hanks, sans Ca2 et Mg2+ (HBSS).
  6. Séparation cellulaire
    1. Transférer les nerfs digérés dans un tube de 50 ml à l’aide d’une pipette sérologique et d’une centrifugeuse à 188 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 10 mL de DMEM contenant 10 % de FCS et 50 μg/mL de gentamycine. Remettez la pastille en suspension 20 fois par la suite, à l’aide d’un embout de pipette de 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL et 200 μL.
    2. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine à cellules de 100 μm et centrifuger à 188 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille avec 4 mL de DMEM contenant 10 % de FCS et 50 μg/mL de gentamycine.
    3. Ajouter 2 mL de la suspension cellulaire à chacune des deux boîtes TC de 60 mm revêtues de PLL et de laminine et incuber à 37 °C et 5 % de CO2. Laissez les plaques intactes pendant 2 jours dans l’incubateur pour protéger les cellules des contraintes mécaniques et favoriser l’adhérence.
  7. Différenciation des cellules de Schwann
    1. Après 2 jours, retirer le milieu et rincer soigneusement les plaques 2x avec DMEM (glucose élevé), 10% FCS et 50 μg / mL de gentamycine. Ensuite, ajoutez 2 mL de milieu cellulaire de Schwann. Remplacez le milieu cellulaire de Schwann tous les 2jours et observez l’aspect et la confluence de la cellule à l’aide d’un microscope.
      REMARQUE: Les cellules de Schwann et les explants DRG doivent être préparés en temps opportun et de manière coordonnée pour la coculture. Assurez-vous qu’un rat avec des embryons à E 13.5 est disponible pour la préparation DRG lorsque les cellules de Schwann sont proches d’une confluence de 80%.
  8. Trypsinisation cellulaire et séparation magnétique
    REMARQUE : Pour des exemples d’images de différents stades de culture cellulaire de Schwann, voir la figure supplémentaire 1.
    1. Lorsque les cellules atteignent une confluence d’environ 80% (6-12 jours de culture), laver soigneusement les plaques 2x avec 3 mL de DPBS et incuber avec 2 mL de 0,05% de trypsine/EDTA (préchauffé à 37 °C) pendant 3 min. Lorsque les cellules se détachent du fond de la plaque, inactiver la digestion par l’ajout de 2 mL de DMEM avec 10% FCS et 50 μg/mL de gentamycine.
      REMARQUE: Tenez-vous-en à un temps de trypsinisation strictement de 3 minutes et procédez rapidement par la suite.
    2. Resuspendre la pastille cellulaire dans 2 mL de tampon de séparation cellulaire magnétique contenant de la DPBS avec 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 nM d’EDTA. Combinez 10 μL de la suspension cellulaire avec 10 μL de bleu de trypan et comptez les cellules à l’aide d’une chambre de coloration.
    3. Centrifuger la suspension cellulaire à 188 x g pendant 10 min à 4 °C et remettre en suspension la pastille de cellule dans 90 μL de tampon de séparation cellulaire magnétique par 1 x 107 cellules. Ajouter 10 μL de microbilles Thy-1 par 1 x 107 cellules. Remettez la solution en suspension plusieurs fois et laissez incuber pendant 15 min dans l’obscurité à 8 °C.
    4. Ajouter 2 mL du tampon de séparation magnétique des cellules à la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 500 μL de tampon de séparation magnétique des cellules.
    5. Humidifiez la colonne de séparation des cellules magnétiques avec 1 mL de tampon de séparation des cellules magnétiques. Placez la colonne de séparation des cellules magnétiques dans le séparateur de cellules magnétiques. Appliquez les cellules sur la colonne de séparation magnétique des cellules. Recueillir le débit et centrifuger à 300 x g à 4 °C pendant 10 min.
      REMARQUE: Les fibroblastes sont sélectionnés positivement et restent dans la colonne, tandis que les cellules de Schwann passent la colonne. Les fibroblastes peuvent être collectés avec un tampon (par exemple, comme contrôle négatif pour les protocoles de coloration cellulaire de Schwann).
    6. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL du milieu de coculture (voir étape 3.1.1). Comptez les cellules après coloration avec du bleu de trypan et une chambre de coloration.

2. Culture d’explant DRG

  1. Préparation du milieu de croissance DRG
    1. Préparer le milieu de croissance DRG en ajoutant 2% de B27, 2% de sérum de cheval, 1% de L-glutamine, 0,5% de pénicilline / streptomycine et 10 ng / ml de facteur de croissance nerveuse (NGF) au milieu neurobasal. Conserver le milieu de croissance à 4 °C.
      REMARQUE: Le milieu de croissance peut être utilisé pendant 2 jours.
  2. Revêtement pour explants DRG
    1. Incuber les lames de couverture dans de l’éthanol à 70% pendant 1 h et les placer dans les puits de plats à 4 puits à l’aide de pinces incurvées. Une fois l’éthanol séché, appliquer 300 μL de poly-D-lysine (PDL) à 0,2 mg/mL par puits et incuber pendant la nuit à 37 °C et 5 % de CO2.
    2. Lavez les lamelles 3x pendant 5 min chacune avec DPBS consécutivement. Décoller le DPBS, appliquer 300 μL de laminine de 1 μg/mL sur les lames de couverture et incuber pendant la nuit à 37 °C et 5 % de CO2.
    3. Après trois étapes de lavage avec DPBS pendant 5 min, remplacez le DPBS par 190 μL de milieu de croissance DRG. Placer les plaques à 4 puits dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2.
  3. Préparation DRG
    NOTE: Récoltez le DRG des rats embryonnaires sous un banc propre.
    1. Avant la préparation, nettoyez tous les instruments avec de l’éthanol à 70%. Remplissez 10 (deux par embryon) boîtes de 35 mm de TC avec 2 ml de HBSS glacé par boîte, et deux boîtes de 100 mm de TC avec 5 ml de HBSS glacé par boîte.
    2. Euthanasier les rates gravides (rats Sprague Dawley femelles adultes, E13.5) par inhalation de CO2 et décapitation.
    3. Vaporisez le corps avec de l’éthanol à 70% et ouvrez le torse ventral du rat. Retirez soigneusement l’utérus et placez-le dans une boîte TC de 100 mm avec HBSS glacé.
    4. Tenez l’utérus à l’aide d’une pince incurvée et ouvrez la paroi de l’utérus avec une pince fine. Retirez un sac amniotique et ouvrez-le soigneusement en pinçant un trou avec une pince fine.
    5. Retirez l’embryon des tissus environnants, coupez le cordon ombilical et décapitez l’embryon à l’aide d’une pince fine. Placez le torse dans une antenne de 100 mm TC remplie de HBSS à l’aide d’une pince incurvée et d’une spatule.
    6. Retirez rapidement tous les embryons de l’utérus et transférez-les dans une boîte TC de 100 mm remplie d’HBSS. S’il y a plus de cinq embryons, préparer une boîte de TC supplémentaire de 35 mm avec 2 ml de HBSS, conformément à l’étape 2.3.1.
    7. Placer délicatement un torse embryonnaire dans une boîte TC de 35 mm remplie d’HBSS à l’aide d’une spatule et d’une pince incurvée. Sous un stéréomicroscope, ouvrez la partie dorsale du torse pour diviser l’embryon en deux moitiés à l’aide de pinces fines et de micro-ciseaux. Tournez une moitié sur le côté et identifiez le brin de DRG situé en ligne à la partie dorsale de l’embryon.
    8. Découpez le DRG comme un brin entier à l’aide de pinces fines et de micro-ciseaux. Placer le DRG dans une boîte TC fraîche de 35 mm remplie de 2 ml de HBSS et séparer un seul DRG du tissu restant à l’aide de pinces fines et de micro-ciseaux.
  4. Culture cellulaire DRG
    1. Prélever des plaques à 4 puits contenant 190 μL de milieu de croissance DRG de l’incubateur au banc propre où le DRG doit être préparé. Transférer soigneusement un seul DRG dans un puits d’une plaque de culture à 4 puits à l’aide d’une pince fine et d’une spatule. Placez le DRG au centre de chaque puits, car une position centrale est importante pour la fixation du DRG.
    2. Travaillez désormais dans des conditions stériles. Placer les cultures d’explantation dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2. Le lendemain, ajouter soigneusement 50 μL du milieu de croissance DRG à chaque puits à l’aide d’une pipette de 100 mL.
    3. Observez quotidiennement l’adhérence des explants DRG et la croissance des axones à l’aide d’un microscope, et jetez les explants DRG qui se sont détachés de la lamelle de couverture ou qui n’ont pas réussi à dépasser les axones le jour 3 de la culture.
      REMARQUE: Les explants DRG sont très fragiles dans les premiers jours de culture et doivent être manipulés avec soin, en particulier lors du déplacement des plaques dans et hors de l’incubateur lorsque le milieu est changé, ou même lors de la fermeture de la porte de l’incubateur. Le volume précis de 190 μL de milieu par puits est crucial pour maintenir les explants DRG en place pendant le premier jour de culture. Les explants DRG en vrac peuvent être facilement identifiés lors du contrôle quotidien, car ils nagent dans le milieu au lieu d’adhérer à la lamelle de couverture.

3. Coculture

  1. Transfert des cellules de Schwann vers la culture d’explants DRG
    1. Préparer le milieu de coculture en ajoutant 0,1% d’acide ascorbique au milieu de croissance DRG.
    2. Le jour 3 de la culture d’explantation DRG, remplacez soigneusement le milieu de croissance DRG par 250 μL de milieu de coculture contenant 30 000 cellules de Schwann (à partir de l’étape 1.8) par puits.
    3. Conservez la coculture des explants DRG et des cellules de Schwann jusqu’à 22 jours. Remplacez soigneusement 250 μL du milieu de coculture tous les deux jours et observez l’apparence des cellules à l’aide d’un microscope.
      REMARQUE: Pour un exemple d’axones DRG et de cellules de Schwann dans la coculture dans les premiers jours de culture, voir la figure 1.
  2. Coloration immunocytochimique
    REMARQUE: Manipulez les échantillons de coculture extrêmement soigneusement pendant la procédure de coloration, car ils peuvent être facilement endommagés.
    1. Pour fixer les cellules sur les lames de couverture, retirez lentement le milieu, lavez soigneusement 3x avec DPBS et incuber dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4% pendant 10 min. Remplacez le PFA par du DPBS et conservez les cellules fixes à 4 °C pendant 1 semaine.
      ATTENTION : Lorsque vous manipulez 4 % de PFA, portez l’équipement de protection individuelle recommandé.
    2. Laver les lamelles 3x avec DPBS pendant 5 min, puis bloquer avec une solution bloquante (10% sérum de chèvre, 10% albumine sérique bovine [BSA], 0,1% gélatine et 0,05% Triton X-100) dans DPBS pendant 1 h. Diluer les anticorps primaires βIII-tubuline (1:7 500) et la protéine basique de myéline (MBP) (1:750) dans la solution bloquante et incuber pendant une nuit à 4 °C.
    3. Lavez les cellules 3x avec DPBS pendant 5 min. Utiliser des anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent dans une dilution de 1:1 000 dans une solution de blocage et incuber pendant 2 h à température ambiante (RT).
    4. Lavez les cellules 3x avec DPBS pendant 5 min, et montez les cellules sur des lames microscopiques avec un support de montage en fluorescence, y compris le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Conservez les lames dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à la documentation microscopique.
      ATTENTION : Lorsque vous manipulez un support de montage en fluorescence, portez l’équipement de protection individuelle recommandé.
  3. Analyse
    1. Prenez des photos de huit régions définies entourant l’explant DRG au centre à l’aide d’un microscope inversé.
    2. Utiliser un logiciel d’analyse d’images pour quantifier les zones des axones positifs de la βIII-tubuline et de la myélinisation colorées par MBP.
    3. Calculer le pourcentage de myélinisation en rapport entre les axones myélinisés et les axones non myélinisés.

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Representative Results

La myélinisation dans la coculture a été évaluée aux jours 10, 12, 14, 16, 18 et 20. Les explants DRG et les cellules de Schwann ont été colorés pour le MBP, la βIII-tubuline et le DAPI. Le réseau axonal dans la coculture était dense et n’a pas changé visiblement au cours de l’observation. Les premiers signes de myéline, sous forme de petits fragments, étaient détectables au jour 10 et ont augmenté au jour 12 (figure 2). Les zones positives pour le MBP ont augmenté au fil du temps jusqu’au jour 20 de la culture. La myélinisation a été quantifiée comme un rapport des zones positives MBP et βIII-tubuline. La myélinisation a augmenté significativement aux jours 18 et 20 par rapport au jour 10 (Figure 3; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001).

Figure 1
Figure 1 : Apparition des cellules de Schwann et des axones dans la coculture. Image exemplaire de la coculture le jour 3. Les flèches noires montrent de minces axones DRG, et la flèche blanche pointe vers une cellule de Schwann avec une morphologie allongée et fusiforme attachée à un axone. Barre d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Myélinisation dans une coculture d’explants DRG et de cellules de Schwann. La coloration du marqueur neuronal βIII-tubuline et MBP a été effectuée les jours 10, 12, 14, 16, 18 et 20, après avoir joint les deux cultures pour étudier le développement de la myélinisation dans la coculture. Les premiers signes de myélinisation étaient visibles aux jours 10 et 12 de la coculture. À partir du jour 14, le signal MBP était plus prononcé et des axones enveloppés de myéline ont été détectés. La myélinisation a augmenté avec le temps de la coculture jusqu’au jour 20. Barres d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Quantification de la myélinisation. Les jours 10, 12, 14, 16, 18 et 20 de coculture, la myélinisation a été évaluée en colorant les axones avec de la βIII-tubuline et la myéline avec du MBP. Le pourcentage d’axones myélinisés a été déterminé par calcul du rapport entre les zones colorées MBP positives et βIII-tubuline. Des différences significatives ont été détectées aux jours 18 et 20 par rapport au jour 10 de la coculture. Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± SEM; n = 3. ANOVA unidirectionnelle avec le test post-hoc de comparaison multiple de Kruskal-Wallis et Dunn. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Stades de la culture cellulaire de Schwann. Exemples d’images en fond clair de cellules de Schwann en culture (A) avant et (B) après séparation des cellules magnétiques. Avant la séparation magnétique des cellules, la culture comprend des cellules de Schwann avec une morphologie allongée et fusiforme, des fibroblastes plats et étalés et des restes de tissu conjonctif. Pour obtenir une culture plus pure de cellules de Schwann, une séparation cellulaire magnétique est effectuée. Barres d’échelle: 200 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Myélinisation d’explants DRG avec et sans cellules de Schwann supplémentaires. La zone colorée MBP a été utilisée pour mesurer la myélinisation dans la coculture au jour 14. La myélinisation des explants DRG était significativement augmentée si des cellules de Schwann étaient ajoutées à la culture (test t non apparié, **p ≤ 0,01). n = 3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Analyse de l’expression génique en coculture. Les niveaux relatifs d’expression génique de MBP, PMP22, MAG, Oct6, Egr2 et Olig1 ont été analysés dans des échantillons de coculture au jour 22 par qPCR (A). MBP et PMP22 étaient les cibles avec les niveaux d’expression génique les plus élevés dans la coculture. Une image exemplaire des produits d’amplification qPCR appliqués à un gel d’agarose démontre l’abondance qualitative des cibles (B). La première et la dernière voie sur le gel représentent une échelle d’ADN (100 paires de bases). n = 5. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Ici, nous présentons un protocole rapide et facile pour la génération de myélinisation in vitro en fusionnant deux cultures de type cellulaire distinctes, les cellules de Schwann et les explants ganglionnaires de la racine dorsale.

Une étape critique du protocole est la culture d’explants DRG, en particulier dans les premiers jours de culture. Les DRG sont très fragiles avant la construction d’un réseau axonal fort et doivent être manipulés avec beaucoup de précaution, par exemple lorsqu’ils sont sortis de l’incubateur ou lors d’un changement de milieu. Les DRG qui se détachent du fond du puits et se retrouvent nageant dans le milieu montrent une culture infructueuse. Pour les cellules de Schwann, la modification des taux de prolifération due aux différentes conditions de culture et aux suppléments (par exemple, le sérum dans le milieu) peut représenter un défi pour la coculture. Si la culture est envahie par un nombre excessif de cellules de Schwann, elle se détache du fond du puits et devient inutilisable. Un titrage du nombre de cellules de Schwann dans la culture est donc recommandé. Lors de l’établissement du protocole sur les cellules de Schwann, des tests de pureté doivent être effectués en utilisant l’immunomarquage SOX10 ou S100. En général, la manipulation de la culture, y compris le changement de milieu ainsi que les étapes de lavage et de fixation, doit être effectuée avec soin pour assurer un résultat positif. Il est important de choisir le point temporel d’observation en fonction de l’intérêt de la recherche; Le jour 14 représente le point de départ des premiers axones myélinisés denses et peut donc être choisi comme point temporel d’observation pour l’initiation de la myélinisation, tandis que les points temporels ultérieurs offrent des gaines de myéline plus complètes.

Comme cette méthode de myélinisation in vitro ne comprend que des cellules DRG et de Schwann, elle ne ressemble pas exactement au processus de myélinisation dans l’organisme. D’autres facteurs contributifs, tels que les tissus environnants, le microenvironnement, les cellules immunitaires et la signalisation provenant de structures distantes, ne sont pas représentés dans ce modèle. Cependant, cette méthode fournit un modèle approprié pour étudier la myélinisation du SNP par l’analyse et la manipulation séparées des deux types cellulaires 9,15,16. Les cellules de Schwann ou DRG pour la coculture peuvent être récoltées sur des animaux malades ou traités pour déchiffrer la contribution du type cellulaire spécifique17,18. Lors de l’utilisation des derniers stades de cette configuration, il est fortement recommandé d’inclure une condition de contrôle sans ajouter de cellules de Schwann supplémentaires, afin d’exclure les effets possibles des cellules de Schwann dérivées de DRG. D’après notre expérience, la myélinisation dans les explants DRG sans cellules de Schwann est détectée dans une mesure significativement moindre que dans la coculture (Figure supplémentaire 2).

L’utilisation d’explants DRG offre l’avantage d’une architecture structurelle intacte par rapport aux cultures neuronales dissociées. La coloration immunofluorescente de la protéine basique de myéline (MBP) permet de quantifier la zone axonale myélinisée et fournit une lecture suffisante pour la myélinisation dans la coculture. L’analyse de l’expression génique des échantillons de coculture au jour 22 a révélé la présence de MBP, de protéine périphérique de myéline (PMP22), de glycoprotéine associée à la myéline (MAG), de facteur de liaison à l’octamère 6 (Oct6), de gène 2 lié à la FTA (Erg2) et de facteur de transcription 1 des oligodendrocytes (Olig1), avec les niveaux d’expression les plus élevés pour MBP et PMP22 (Figure supplémentaire 3). Par conséquent, le protocole décrit fournit une méthode avec plusieurs options cibles pour les marqueurs de myélinisation dans la coculture.

Les applications potentielles de cette méthode comprennent des approches de recherche fondamentale sur le processus de myélinisation en périphérie, ainsi que la validation de composés thérapeutiques pour les maladies du SNP, y compris les dommages causés par la myéline.

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Disclosures

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions le Prof. Dr. Ralf Gold et la Dr. Gisa Ellrichmann pour leurs conseils et leur soutien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-MBP, rabbit Novus Biologicals, Centannial, USA ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse  Biolegend, San Diego, USA 657402
Ascorbic acid  Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  A4403-100MG
B27-supplement Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  70765210
Bovine serum albumin Carl Roth, Karlsruhe, Germany  8076.4
Cell strainer, 100 µM BD Bioscience, Heidelberg, Germany 352360
Centrifuge 5810-R Eppendorf AG, Hamburg, Germany 5811000015
CO2 Incubator Heracell Heraeus Instruments, Hanau, Germany  51017865
Coverslips 12 mm Carl Roth, Karlsruhe, Germany  P231.1
Curved fine forceps  Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11370-42
DAPI fluoromount-G(R) Biozol, Eching, Germany SBA-0100-20
Dispase II Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  4942078001
Distilled water (Water Purification System)  Millipore, Molsheim, France ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  D8537-6X500ML
Ethanol  VWR, Radnor, USA  1009862500
FCS Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  F7524 FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11252-20
Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11370-40
Forskolin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  F6886-10MG
Gelatin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  G1393-20ML
Gentamycin Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  14170138
HERAcell Incubator Heraeus Instruments, Hanau, Germany  51017865
Heraguard ECO 1.2 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  51029882
Horse serum Pan-Biotech, Aidenbach, Germany P30-0712
Image J Software HIH, Bethesda, USA
Laminin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  11415064
L-Glutamine 200 mM  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  25030024
MACS Multistand  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130042303
Microscissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 15000-08
Microscope  Motic, Wetzlar, Germany Motic BA 400
Microscope Axio observer 7 Zeiss, Oberkochen, Germany  491917-0001-000
Microscope slide VWR, Radnor, USA  630-1985
MiniMACS separator Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130091632
MS columns Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-201
Neubauer counting chamber  Assistant, Erlangen, Germany 40441  
Neuregulin Peprotech, Rocky Hill, USA 100-03
Neurobasal medium  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  21103049
NGF Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  N1408
Normal goat serum Biozol, Eching, Germany S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  D6789
Paraformaldehyde Acros Organics, New Jersey, USA  10342243
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  15140-122
Pipetboy Eppendorf AG, Hamburg, Germany 4430000018 
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 2231300004
Poly-D-Lysin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  P6407-5MG
Poly-L-Lysin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  62554502
Reaction tubes, 50 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  62547254
Reaction vessels, 1.5 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  72690001
Safety Cabinet S2020 1.8 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  51026640
Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14083-08
Serological pipette, 10 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  861254025
Serological pipette, 25 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  861685001
Serological pipette, 5 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  861253001
Spatula Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8 Zeiss, Oberkochen, Germany  495015-0012-000 
Surgical scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14007-14
TC dish 100, cell + Sarstedt, Nümbrecht, Germany  833902300
TC dish 35, cell + Sarstedt, Nümbrecht, Germany  833900300
TC dish 60, cell + Sarstedt, Nümbrecht, Germany  833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-094-523
Triton X-100  Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  25300-054
Type I Collagenase Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  C1639
Water bath type 1008 GFL, Burgwedel, Germany  4285

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References

  1. Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
  2. Taveggia, C. Schwann cells-axon interaction in myelination. Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).
  3. Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
  4. Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
  5. Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
  6. Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
  7. Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
  8. Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
  9. Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
  10. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
  11. Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
  12. Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
  13. Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
  14. Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
  15. Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
  16. Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
  17. Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
  18. Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 192
Myélinisation in vitro d’axones périphériques dans une coculture d’explants de ganglions radiculaires dorsaux de rat et de cellules de Schwann
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Blusch, A., Sgodzai, M., Rilke, N.,… More

Blusch, A., Sgodzai, M., Rilke, N., Motte, J., König, J., Pitarokoili, K., Grüter, T. In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells. J. Vis. Exp. (192), e64768, doi:10.3791/64768 (2023).

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