Summary
Im Kokultursystem von dorsalen Wurzelganglien und Schwann-Zellen kann die Myelinisierung des peripheren Nervensystems untersucht werden. Dieses Modell bietet experimentelle Möglichkeiten zur Beobachtung und Quantifizierung der peripheren Myelinisierung und zur Untersuchung der Auswirkungen von Wirkstoffen auf die Myelinscheide.
Abstract
Der Prozess der Myelinisierung ist essentiell, um eine schnelle und ausreichende Signalübertragung im Nervensystem zu ermöglichen. Im peripheren Nervensystem interagieren Neuronen und Schwann-Zellen in einem komplexen Zusammenspiel, um die Myelinisierung von Axonen zu steuern. Störungen dieses Zusammenspiels und der Abbau der Myelinscheide sind Kennzeichen entzündlicher Neuropathien und treten sekundär bei neurodegenerativen Erkrankungen auf. In dieser Arbeit stellen wir ein Kokulturmodell von Explantaten aus dorsalen Wurzelganglien und Schwann-Zellen vor, das eine robuste Myelinisierung peripherer Axone entwickelt, um den Prozess der Myelinisierung im peripheren Nervensystem zu untersuchen, Axon-Schwann-Zell-Interaktionen zu untersuchen und die potenziellen Auswirkungen von Therapeutika auf jeden Zelltyp separat zu bewerten. Methodisch wurden dorsale Wurzelganglien embryonaler Ratten (E13.5) geerntet, von ihrem umgebenden Gewebe dissoziiert und 3 Tage lang als ganze Explantate kultiviert. Schwann-Zellen wurden aus 3 Wochen alten erwachsenen Ratten isoliert und Ischiasnerven enzymatisch verdaut. Die resultierenden Schwann-Zellen wurden durch magnetisch aktivierte Zellsortierung gereinigt und unter Neuregulin- und Forskolin-angereicherten Bedingungen kultiviert. Nach 3-tägiger dorsaler Wurzelganglien-Explantatkultur wurden 30.000 Schwann-Zellen in einem ascorbinsäurehaltigen Medium zu einem dorsalen Wurzelganglien-Explantat hinzugefügt. Die ersten Anzeichen einer Myelinisierung wurden am 10. Tag der Kokultur durch gestreute Signale für das basische Myelinprotein in der immunzytochemischen Färbung nachgewiesen. Ab dem 14. Tag bildeten sich Myelinscheiden, die sich entlang der Axone ausbreiteten. Die Myelinisierung kann durch die Färbung des basischen Myelinproteins als Verhältnis der Myelinisierungsfläche und der Axonfläche quantifiziert werden, um die Unterschiede in der axonalen Dichte zu berücksichtigen. Dieses Modell bietet experimentelle Möglichkeiten, verschiedene Aspekte der peripheren Myelinisierung in vitro zu untersuchen, was für das Verständnis der Pathologie und der möglichen Behandlungsmöglichkeiten der Demyelinisierung und Neurodegeneration bei entzündlichen und neurodegenerativen Erkrankungen des peripheren Nervensystems von entscheidender Bedeutung ist.
Introduction
Im peripheren Nervensystem (PNS) wird die schnelle Informationstransduktion durch myelinumhüllte Axone vermittelt. Die Myelinisierung von Axonen ist essentiell, um eine schnelle Ausbreitung elektrischer Impulse zu ermöglichen, da die Leitungsgeschwindigkeit der Nervenfasern mit dem Axondurchmesser und der Myelindicke korreliert1. Die sensorische Signalübertragung von der Peripherie zum Zentralnervensystem (ZNS) beruht auf der Aktivierung sensorischer Neuronen erster Ordnung, die sich in Vergrößerungen der dorsalen Wurzel befinden, die als dorsale Wurzelganglien (DRG) bezeichnet werden. Für die Bildung und Aufrechterhaltung von Myelin ist eine kontinuierliche Kommunikation zwischen Axonen und Schwann-Zellen, den myelinisierenden Gliazellen im PNS, unerlässlich2.
Viele Erkrankungen des PNS stören die Informationsweiterleitung entweder durch primäre axonale oder demyelinisierende Schäden, was zu Hypästhesien oder Dysästhesien führt. Sensorische Neuronen erster Ordnung haben die Fähigkeit, sich nach einer neuronalen Schädigung durch eine komplexe Interaktion zwischen dem Neuron und den umgebenden Schwann-Zellen bis zu einem gewissen Grad zu regenerieren3. In diesem Fall können Schwann-Zellen eine zelluläre Reprogrammierung durchlaufen, um sowohl axonale als auch myelinale Trümmer zu beseitigen und die axonale Regeneration zu fördern, was zu einer Remyelinisierung führt4. Es ist wichtig, die Mechanismen der Myelinisierung in Gesundheit und Krankheit zu verstehen, um mögliche Behandlungsoptionen für demyelinisierende Störungen des PNS zu finden. Myelin kann auch durch ein akutes Neurotrauma geschädigt werden, und Ansätze zur Förderung der Myelinisierung zur Förderung der funktionellen Erholung nach peripheren Nervenverletzungen werden untersucht5.
Unser Wissen über die periphere Myelinisierung hat weitgehend von myelinisierenden Kokulturen von Schwann-Zellen und sensorischen Neuronen profitiert. Seit der Anwendung der ersten Ansätze 6,7,8 wurde die Myelinisierung unter Verwendung verschiedener Kokultursysteme intensiv untersucht9,10,11. Hier stellen wir ein schnelles und einfaches Protokoll für eine robuste in vitro Myelinisierung von Axonen der dorsalen Wurzelganglien zur Verfügung. Das Protokoll für die Schwann-Zellpräparation basiert auf dem Protokoll von Andersen et al.12, das zuvor in Pitarokoili et al.13 veröffentlicht wurde. Wir verwenden Schwann-Zellen von juvenilen Ratten und embryonale DRG-Explantatkulturen für die Kokultur, bei der die Myelinisierung etwa am 14. Tag stattfindet. Ziel der Methode ist es, ein System zur Verfügung zu stellen, mit dem die Bildung von Myelin als Folge der direkten Axon-Schwann-Zell-Interaktion untersucht und Modulatoren der PNS-Myelinisierung untersucht werden können. Im Vergleich zu dissoziierten neuronalen Zellkulturen sind DRG-Explantate anatomisch besser erhalten und bilden lange axonale Fortsätze. Die Quantifizierung des myelinisierten Axonbereichs liefert einen ausreichenden Messwert für die Myelinisierung in der Kokultur. Die Methode ist ein wertvolles Werkzeug, um therapeutische Verbindungen auf ihre potenzielle Wirkung auf die PNS-Myelinisierung zu untersuchen, und kann auch zusätzlich zu In-vivo-Studien in Tiermodellen eingesetzt werden14.
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Protocol
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften über die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt.
1. Schwann-Zellkultur
- Beschichtung für Schwann-Zellkultur
- Beschichten Sie die Zellkulturschalen unter sterilen Bedingungen. Tragen Sie 2 ml 0,01 % Poly-L-Lysin (PLL) auf je zwei 60-mm-Gewebekulturschalen (TC) auf und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
- Entfernen Sie die PLL, spülen Sie das TC-Geschirr 2x mit destilliertem Wasser und inkubieren Sie es mit 2 mL 1 μg/cm2 Laminin über Nacht bei 4 °C. Spülen Sie das TC-Geschirr 2x mit Aqua Dest und lassen Sie die Teller an der Luft trocknen.
- Mediumpräparation für die Schwann-Zellkultur
- Bereiten Sie 50 ml Schwann-Zellmedium zu, indem Sie unter sterilen Bedingungen 10 % hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum (FCS), 2 μM Forskolin, 10 nM Neuregulin und 50 μg/ml Gentamycin zu Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F-12 (hoher Glukosegehalt) hinzufügen.
- Bereiten Sie 70 ml des L-15-Mediums von Leibovitz mit 50 μg/ml Gentamycin unter sterilen Bedingungen vor.
- Vorbereitung des Ischiasnervs
HINWEIS: Alle Schritte zur Vorbereitung des Ischiasnervs werden unter einer sauberen Bank durchgeführt.- Bereiten Sie eine 100-mm-TC-Schale mit 5 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco ohne Ca 2+ und Mg2+, eine 100-mm-TC-Schale mit 5 ml eiskaltem L-15-Medium von Leibovitz und eine 100-mm-TC-Schale mit 5 ml eiskaltem L-15-Medium von Leibovitz und 50 μg/ml Gentamycin vor.
- Reinigen Sie alle Instrumente durch Autoklavieren. Sprühen Sie die Instrumente und den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol ein.
- Euthanasieren Sie fünf 3 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten durch Inhalation und Enthauptung von CO2 . Besprühen Sie den Oberkörper der Ratte mit 70% Ethanol.
- Öffnen Sie die untere linke Rückengliedmaße mit einer Schere und entfernen Sie vorsichtig den Musculus biceps femoris. Lockern Sie den Ischiasnerv durch sanftes Anheben mit einer gebogenen Pinzette, um sicherzustellen, dass der Nerv nicht gequetscht wird.
- Halten Sie den proximalsten Teil des Nervs mit der gekrümmten Pinzette fest, um den Nerv zu begradigen, und schneiden Sie den Nerv mit einer Schere so hoch wie möglich ab. Schneiden Sie dann den Nerv in der Nähe des Plexus sacralis und der Pfote mit einer Schere ab. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.4-1.3.5 für die rechte Seite.
Anmerkungen: Achten Sie beim Öffnen der Gliedmaße darauf, keine Blutgefäße zu verletzen. - Legen Sie den linken und rechten Ischiasnerv mit einer Pinzette in eine 100-mm-TC-Schale mit eiskaltem DPBS.
- Sanierung des Ischiasnervs
- Mit einer Pinzette werden alle Nerven in eine 100-mm-TC-Schale mit eiskaltem L-15-Medium von Leibovitz und 50 μg/ml Gentamycin übertragen. Verwenden Sie weiterhin ein Stereomikroskop und entfernen Sie Fett, Muskeln und Blutgefäße mit zwei feinen Zangenpaaren aus den Nerven. Fassen Sie die Nerven mit einer Pinzette und übertragen Sie sie in eine 100-mm-TC-Schüssel mit eiskaltem L-15-Medium von Leibovitz.
- Identifiziere die proximalen und distalen Enden des Ischiasnervs. Entfernen Sie das Epineurium mit einer feinen Pinzette in proximaler bis distaler Richtung, während Sie das proximale Nervenende mit der zweiten feinen Pinzette halten.
- Übertragen Sie die gereinigten Nerven in eine 100-mm-TC-Schale mit eiskaltem L-15-Medium von Leibovitz und 50 μg/ml Gentamycin. Necken Sie die isolierten Nervenfaszikel, um einzelne Nervenfasern mit zwei Paar feiner Pinzetten zu trennen und zu isolieren.
- Übertragen Sie die Nervenfasern mit einer serologischen 10-ml-Pipette in ein 50-ml-Röhrchen und nehmen Sie so wenig Medium wie möglich auf. Geben Sie 50 ml des L-15-Mediums von Leibovitz mit 50 μg/ml Gentamycin zu den Nervenfasern und schwenken Sie einige Male in das 50-ml-Röhrchen.
- Enzymatische Verdauung des Ischiasnervs
Anmerkungen: Die nächsten Schritte (Schritte 1.5-1.8, 2.1 und 2.2) werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.- Bereiten Sie die enzymatische Verdauungslösung vor, die 0,25 % Dispase II, 0,05 % Kollagenase Typ I und 50 μg/ml Gentamycin in 10 ml DMEM (hoher Glukosegehalt) enthält.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 188 x g für 5 min bei 4 °C, entfernen Sie den Überstand mit einer serologischen 25-ml-Pipette und übertragen Sie das Pellet mit dem restlichen L-15-Medium von Leibovitz mit einer 1.000-ml-Pipette in eine 60-mm-TC-Schale.
- Spülen Sie das 50-ml-Röhrchen mit 10 ml der enzymatischen Verdauungslösung aus und geben Sie es in die Schale mit den Nervenfasern. Verteilen Sie das Gewebe vorsichtig mit der Spitze einer Pipette in der Schale, um die zugängliche Oberfläche für die Verdauung zu maximieren.
- Bei 37 °C und 5 % CO 2 für 18 h inkubieren und den Aufschluss durch Zugabe von 10 ml 40 % FCS in Hanks' ausgewogener Salzlösung ohne Ca2 und Mg2+ (HBSS) stoppen.
- Zelltrennung
- Die verdauten Nerven werden mit einer serologischen Pipette in ein 50-ml-Röhrchen übertragen und bei 188 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml DMEM, das 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin enthält. Resuspendieren Sie das Pellet anschließend 20 Mal mit einer 10-ml-, 5-ml-, 2-ml-, 1-ml- und 200-μl-Pipettenspitze.
- Die Zellsuspension wird durch ein 100 μm Zellsieb gefiltert und bei 188 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 4 ml DMEM, das 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin enthält.
- Geben Sie 2 ml der Zellsuspension in jede der beiden PLL- und lamininbeschichteten 60-mm-TC-Schalen und inkubieren Sie sie bei 37 °C und 5 % CO2. Lassen Sie die Platten 2 Tage unberührt im Inkubator, um die Zellen vor mechanischer Belastung zu schützen und die Adhärenz zu unterstützen.
- Differenzierung von Schwann-Zellen
- Entfernen Sie nach 2 Tagen das Medium und spülen Sie die Platten 2x vorsichtig mit DMEM (hoher Glukosespiegel), 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin aus. Fügen Sie anschließend 2 ml Schwann-Zellmedium hinzu. Tauschen Sie das Schwann-Zellmedium jeden 2. Tag aus und beobachten Sie das Erscheinungsbild und die Konfluenz der Zellen mit einem Mikroskop.
HINWEIS: Schwann-Zellen und DRG-Explantate müssen rechtzeitig und koordiniert für die Kokultur vorbereitet werden. Stellen Sie sicher, dass eine Ratte mit Embryonen bei E 13,5 für die DRG-Präparation zur Verfügung steht, wenn die Schwann-Zellen nahe einer Konfluenz von 80 % liegen.
- Entfernen Sie nach 2 Tagen das Medium und spülen Sie die Platten 2x vorsichtig mit DMEM (hoher Glukosespiegel), 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin aus. Fügen Sie anschließend 2 ml Schwann-Zellmedium hinzu. Tauschen Sie das Schwann-Zellmedium jeden 2. Tag aus und beobachten Sie das Erscheinungsbild und die Konfluenz der Zellen mit einem Mikroskop.
- Zelltrypsinisierung und magnetische Trennung
HINWEIS: Beispielhafte Bilder der verschiedenen Schwann-Zellkulturstadien finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.- Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben (6-12 Tage Kultur), waschen Sie die Platten vorsichtig 2x mit 3 mL DPBS und inkubieren Sie sie mit 2 mL 0,05% Trypsin/EDTA (vorgewärmt auf 37 °C) für 3 min. Wenn sich die Zellen vom Plattenboden lösen, inaktivieren Sie die Verdauung durch Zugabe von 2 ml DMEM mit 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin.
Anmerkungen: Halten Sie sich an eine Trypsinisierungszeit von ausschließlich 3 Minuten und fahren Sie danach schnell fort. - Resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml magnetischem Zellseparationspuffer, der DPBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 nM EDTA enthält. Kombinieren Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau und zählen Sie die Zellen in einer Färbekammer.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 188 x g für 10 min bei 4 °C und resuspendieren Sie das Zellpellet in 90 μl magnetischem Zellseparationspuffer pro 1 x 107 Zellen . Fügen Sie 10 μl Thy-1-Mikrokügelchen pro 1 x 107 Zellen hinzu . Die Lösung wird einige Male resuspendiert und 15 Minuten im Dunkeln bei 8 °C inkubiert.
- 2 ml des magnetischen Zelltrennpuffers in die Zellsuspension geben und bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Magnetzellen-Trennpuffer.
- Befeuchten Sie die magnetische Zelltrennsäule mit 1 ml des magnetischen Zelltrennpuffers. Setzen Sie die Magnetzellentrennsäule in den Magnetzellenseparator ein. Legen Sie die Zellen auf die magnetische Zelltrennsäule. Sammeln Sie den Durchfluss und zentrifugieren Sie ihn 10 min lang bei 300 x g bei 4 °C.
HINWEIS: Fibroblasten werden positiv selektiert und verbleiben in der Säule, während Schwann-Zellen die Säule passieren. Fibroblasten können mit einem Stempel entnommen werden (z.B. als Negativkontrolle für Schwann-Zell-Färbeprotokolle). - Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 1 ml des Kokulturmediums resuspendiert (siehe Schritt 3.1.1). Zählen Sie die Zellen nach der Färbung mit Trypanblau und einer Färbekammer.
- Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben (6-12 Tage Kultur), waschen Sie die Platten vorsichtig 2x mit 3 mL DPBS und inkubieren Sie sie mit 2 mL 0,05% Trypsin/EDTA (vorgewärmt auf 37 °C) für 3 min. Wenn sich die Zellen vom Plattenboden lösen, inaktivieren Sie die Verdauung durch Zugabe von 2 ml DMEM mit 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin.
2. DRG-Explantatkultur
- DRG-Nährbodenaufbereitung
- Bereiten Sie das DRG-Nährmedium vor, indem Sie dem neurobasalen Medium 2 % B27, 2 % Pferdeserum, 1 % L-Glutamin, 0,5 % Penicillin/Streptomycin und 10 ng/ml Nervenwachstumsfaktor (NGF) hinzufügen. Lagern Sie das Nährmedium bei 4 °C.
HINWEIS: Das Nährmedium kann 2 Tage lang verwendet werden.
- Bereiten Sie das DRG-Nährmedium vor, indem Sie dem neurobasalen Medium 2 % B27, 2 % Pferdeserum, 1 % L-Glutamin, 0,5 % Penicillin/Streptomycin und 10 ng/ml Nervenwachstumsfaktor (NGF) hinzufügen. Lagern Sie das Nährmedium bei 4 °C.
- Beschichtung für DRG-Explantate
- Die Deckgläser in 70%igem Ethanol 1 h inkubieren und mit einer gebogenen Pinzette in die Vertiefungen von 4-Well-Schalen geben. Nach dem Trocknen des Ethanols werden 300 μl 0,2 mg/ml Poly-D-Lysin (PDL) pro Well aufgetragen und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- Waschen Sie die Deckgläser 3x nacheinander für je 5 min mit DPBS. Nehmen Sie das DPBS ab, tragen Sie 300 μl 1 μg/ml Laminin auf die Deckgläser auf und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2.
- Ersetzen Sie das DPBS nach drei Waschschritten mit DPBS für 5 min durch 190 μl DRG-Nährmedium. Legen Sie die 4-Well-Platten bei 37 °C und 5 % CO 2 in den Inkubator.
- DRG-Vorbereitung
HINWEIS: Ernten Sie das DRG von embryonalen Ratten unter einer sauberen Bank.- Reinigen Sie vor der Zubereitung alle Instrumente mit 70% Ethanol. Füllen Sie 10 (zwei pro Embryo) 35-mm-TC-Schalen mit 2 ml eiskaltem HBSS pro Schale und zwei 100-mm-TC-Schalen mit 5 ml eiskaltem HBSS pro Schale.
- Euthanasieren Sie die trächtigen Ratten (erwachsene weibliche Sprague-Dawley-Ratten, E13.5) durch CO2 - Inhalation und Enthauptung.
- Besprühen Sie den Körper mit 70% Ethanol und öffnen Sie den ventralen Rumpf der Ratte. Entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutter und legen Sie sie in eine 100 mm TC-Schale mit eiskaltem HBSS.
- Halten Sie die Gebärmutter mit einer gebogenen Pinzette fest und öffnen Sie die Gebärmutterwand mit einer feinen Pinzette. Entfernen Sie eine Fruchtblase und öffnen Sie sie vorsichtig, indem Sie mit einer feinen Pinzette ein Loch einklemmen.
- Entfernen Sie den Embryo aus dem umgebenden Gewebe, durchtrennen Sie die Nabelschnur und enthaupten Sie den Embryo mit einer feinen Pinzette. Legen Sie den Torso mit einer gebogenen Pinzette und einem Spatel in eine 100-mm-TC-Schale, die mit HBSS gefüllt ist.
- Entfernen Sie schnell alle Embryonen aus der Gebärmutter und übertragen Sie sie in eine 100-mm-TC-Schale, die mit HBSS gefüllt ist. Wenn mehr als fünf Embryonen vorhanden sind, ist eine zusätzliche 35-mm-TC-Schale mit 2 ml HBSS gemäß Schritt 2.3.1 vorzubereiten.
- Legen Sie einen Embryotorso vorsichtig mit einem Spatel und einer gebogenen Pinzette in eine 35-mm-TC-Schale, die mit HBSS gefüllt ist. Öffnen Sie unter einem Stereomikroskop den dorsalen Teil des Rumpfes, um den Embryo mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere in zwei Hälften zu teilen. Drehen Sie eine Hälfte zur Seite und identifizieren Sie den DRG-Strang, der sich in einer Linie im dorsalen Teil des Embryos befindet.
- Schneiden Sie den DRG als ganzen Strang mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere aus. Legen Sie das DRG in eine frische 35-mm-TC-Schale, die mit 2 ml HBSS gefüllt ist, und trennen Sie ein einzelnes DRG mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere vom restlichen Gewebe.
- DRG-Zellkultur
- Bringen Sie 4-Well-Platten mit 190 μl DRG-Nährmedium aus dem Inkubator auf die Reinbank, wo das DRG aufbereitet werden soll. Übertragen Sie ein einzelnes DRG vorsichtig mit einer feinen Pinzette und einem Spatel in eine Vertiefung einer 4-Well-Kulturplatte. Platzieren Sie das DRG in der Mitte jeder Vertiefung, da eine zentrale Position für die Befestigung des DRG wichtig ist.
- Arbeiten Sie von nun an unter sterilen Bedingungen. Stellen Sie die Explantatkulturen bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator. Geben Sie am nächsten Tag vorsichtig 50 μl des DRG-Nährmediums mit einer 100-ml-Pipette in jede Vertiefung.
- Beobachten Sie die Adhärenz und das Axonwachstum des DRG-Explantops täglich mit einem Mikroskop und verwerfen Sie DRG-Explantate, die sich am Tag 3 der Kultur vom Deckglas gelöst haben oder nicht aus Axonen herausgewachsen sind.
HINWEIS: DRG-Explantate sind in den ersten Tagen der Kultur sehr zerbrechlich und müssen mit Vorsicht behandelt werden, insbesondere beim Ein- und Ausfahren der Platten in den Inkubator, wenn das Medium gewechselt wird, oder sogar beim Schließen der Inkubatortür. Das exakte Volumen von 190 μl Medium pro Well ist entscheidend, um die DRG-Explantate am ersten Tag der Kultivierung an Ort und Stelle zu halten. Lose DRG-Explantaten können bei der täglichen Kontrolle leicht identifiziert werden, da sie im Medium schwimmen, anstatt am Deckglas zu haften.
3. Kokultur
- Transfer von Schwann-Zellen in die DRG-Explantatkultur
- Bereiten Sie das Kokulturmedium vor, indem Sie dem DRG-Nährboden 0,1%ige Ascorbinsäure hinzufügen.
- Ersetzen Sie an Tag 3 der DRG-Explantatkultur das DRG-Nährmedium vorsichtig durch 250 μl des Cokulturmediums mit 30.000 Schwann-Zellen (ab Schritt 1.8) pro Well.
- Bewahren Sie die Kokultur der DRG-Explantate und Schwann-Zellen bis zu 22 Tage auf. Ersetzen Sie jeden zweiten Tag vorsichtig 250 μl des Kokulturmediums und beobachten Sie das Aussehen der Zellen mit einem Mikroskop.
HINWEIS: Ein Beispiel für DRG-Axone und Schwann-Zellen in der Kokultur in den ersten Tagen der Kultur finden Sie in Abbildung 1.
- Immunzytochemische Färbung
HINWEIS: Behandeln Sie die Kokulturproben während des Färbevorgangs äußerst vorsichtig, da sie leicht beschädigt werden können.- Um die Zellen auf den Deckgläsern zu fixieren, entfernen Sie das Medium langsam, waschen Sie es 3x sorgfältig mit DPBS und inkubieren Sie es 10 Minuten lang in 4%igem Paraformaldehyd (PFA). Ersetzen Sie das PFA durch DPBS und lagern Sie die fixierten Zellen bis zu 1 Woche bei 4 °C.
VORSICHT: Tragen Sie beim Umgang mit 4 % PFA die empfohlene persönliche Schutzausrüstung. - Waschen Sie die Deckgläser 3x mit DPBS für 5 Minuten und blockieren Sie sie dann 1 Stunde lang mit Blockierlösung (10 % Ziegenserum, 10 % Rinderserumalbumin [BSA], 0,1 % Gelatine und 0,05 % Triton X-100) in DPBS. Die primären Antikörper βIII-Tubulin (1:7.500) und das basische Myelinprotein (MBP) (1:750) werden in der Blockierungslösung verdünnt und über Nacht bei 4 °C inkubiert.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS für 5 min. Verwenden Sie fluoreszenzfarbstoffkonjugierte Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:1.000 in Blockierungslösung und inkubieren Sie sie 2 h lang bei Raumtemperatur (RT).
- Waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS für 5 min und montieren Sie die Zellen auf mikroskopisch kleine Objektträger mit Fluoreszenzeinbettmedium, einschließlich 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Lagern Sie die Objektträger bis zur mikroskopischen Dokumentation im Dunkeln bei 4 °C.
VORSICHT: Tragen Sie beim Umgang mit Fluoreszenz-Eindeckmedium die empfohlene persönliche Schutzausrüstung.
- Um die Zellen auf den Deckgläsern zu fixieren, entfernen Sie das Medium langsam, waschen Sie es 3x sorgfältig mit DPBS und inkubieren Sie es 10 Minuten lang in 4%igem Paraformaldehyd (PFA). Ersetzen Sie das PFA durch DPBS und lagern Sie die fixierten Zellen bis zu 1 Woche bei 4 °C.
- Analyse
- Fotografieren Sie mit einem inversen Mikroskop acht definierte Bereiche rund um den DRG-Explantat in der Mitte.
- Verwenden Sie eine Bildanalysesoftware, um die Bereiche von βIII-Tubulin-positiven Axonen und Myelinisierung zu quantifizieren, die mit MBP gefärbt wurden.
- Berechnen Sie den prozentualen Anteil der Myelinisierung als Verhältnis der myelinisierten Axone und der nicht-myelinisierten Axone.
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Representative Results
Die Myelinisierung in der Kokultur wurde an den Tagen 10, 12, 14, 16, 18 und 20 beurteilt. Die DRG-Explantaten und Schwann-Zellen wurden auf MBP, βIII-Tubulin und DAPI gefärbt. Das axonale Netzwerk in der Kokultur war dicht und veränderte sich im zeitlichen Verlauf der Beobachtung nicht sichtbar. Die ersten Anzeichen von Myelin in Form von kleinen Fragmenten waren an Tag 10 nachweisbar und nahmen an Tag 12 zu (Abbildung 2). Die MBP-positiven Bereiche nahmen im Laufe der Zeit bis zum 20. Tag der Kultur zu. Die Myelinisierung wurde als Verhältnis der MBP- und βIII-Tubulin-positiven Areale quantifiziert. Die Myelinisierung nahm an den Tagen 18 und 20 im Vergleich zu Tag 10 signifikant zu (Abbildung 3; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001).
Abbildung 1: Vorkommen von Schwann-Zellen und Axonen in der Kokultur. Beispielhaftes Bild der Kokultur an Tag 3. Schwarze Pfeile zeigen dünne DRG-Axone, und der weiße Pfeil zeigt auf eine Schwann-Zelle mit einer länglichen und spindelförmigen Morphologie, die an einem Axon befestigt ist. Maßstabsleiste: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Myelinisierung in einer Kokultur von DRG-Explantaten und Schwann-Zellen. Die Färbung für den neuronalen Marker βIII-Tubulin und MBP wurde an den Tagen 10, 12, 14, 16, 18 und 20 durchgeführt, nachdem beide Kulturen zusammengeführt wurden, um die Entwicklung der Myelinisierung in der Kokultur zu untersuchen. Erste Anzeichen einer Myelinisierung waren an den Tagen 10 und 12 der Kokultur sichtbar. Ab Tag 14 war das MBP-Signal stärker ausgeprägt und es wurden myelinumhüllte Axone nachgewiesen. Die Myelinisierung nahm mit der Zeit der Kokultur bis zum 20. Tag zu. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Quantifizierung der Myelinisierung. An den Tagen 10, 12, 14, 16, 18 und 20 der Kokultur wurde die Myelinisierung durch Färbung von Axonen mit βIII-Tubulin und Myelin mit MBP beurteilt. Der prozentuale Anteil myelinisierter Axone wurde durch Berechnung des Verhältnisses der MBP-positiven und βIII-Tubulin-gefärbten Areale bestimmt. An den Tagen 18 und 20 wurden signifikante Unterschiede im Vergleich zu Tag 10 der Kokultur festgestellt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. n = 3. Einfaktorielle ANOVA mit dem Post-hoc-Test des Mehrfachvergleichs von Kruskal-Wallis und Dunn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Stadien der Schwann-Zellkultur. Beispielhafte Hellfeldaufnahmen von kultivierten Schwann-Zellen (A) vor und (B) nach magnetischer Zelltrennung. Vor der magnetischen Zelltrennung umfasst die Kultur Schwann-Zellen mit einer länglichen und spindelförmigen Morphologie, flachen und ausgebreitet erscheinenden Fibroblasten und Resten von Bindegewebe. Um eine reinere Kultur von Schwann-Zellen zu erreichen, wird eine magnetische Zelltrennung durchgeführt. Maßstabsbalken: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Myelinisierung von DRG-Explantaten mit und ohne zusätzliche Schwann-Zellen. Der MBP-gefärbte Bereich wurde verwendet, um die Myelinisierung in der Kokultur an Tag 14 zu messen. Die Myelinisierung von DRG-Explantaten war signifikant erhöht, wenn Schwann-Zellen in die Kultur gegeben wurden (ungepaarter t-Test, **p ≤ 0,01). n = 3. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Genexpressionsanalyse in der Kokultur. Die relativen Genexpressionsniveaus von MBP, PMP22, MAG, Oct6, Egr2 und Olig1 wurden an Tag 22 in Kokulturproben mittels qPCR (A) analysiert. MBP und PMP22 waren die Targets mit den höchsten Genexpressionsraten in der Kokultur. Ein beispielhaftes Bild von qPCR-Amplifikationsprodukten, die auf ein Agarosegel appliziert werden, zeigt die qualitative Häufigkeit der Targets (B). Die erste und letzte Spur auf dem Gel stellen eine DNA-Leiter (100 Basenpaare) dar. n = 5. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Arbeit stellen wir ein schnelles und einfaches Protokoll für die Generierung von in vitro Myelinisierung vor, indem zwei separate Zelltypkulturen, Schwann-Zellen und dorsale Wurzelganglien-Explantate, zusammengeführt werden.
Ein kritischer Schritt des Protokolls ist die Kultivierung von DRG-Explantaten, insbesondere in den ersten Tagen der Kultur. DRG sind sehr fragil, bevor ein starkes axonales Netzwerk aufgebaut ist, und müssen sehr vorsichtig gehandhabt werden, z. B. bei der Entnahme aus dem Inkubator oder bei einem Medienwechsel. DRG, die sich vom Brunnenboden lösen und im Medium schwimmend gefunden werden, zeigen eine erfolglose Kultivierung. Für Schwann-Zellen können veränderte Proliferationsraten aufgrund unterschiedlicher Kultivierungsbedingungen und Zusätze (z.B. Serum im Medium) eine Herausforderung für die Kokultur darstellen. Wird die Kultur von einer übermäßigen Anzahl von Schwann-Zellen überwuchert, löst sie sich vom Boden des Brunnens und wird unbrauchbar. Eine Titration der Schwann-Zellzahl in der Kultur wird daher empfohlen. Während der Erstellung des Schwann-Zellprotokolls sollten Reinheitstests mit SOX10- oder S100-Immunfärbung durchgeführt werden. Generell muss der Umgang mit der Kultur, einschließlich des Medienwechsels sowie der Wasch- und Fixierungsschritte, sorgfältig durchgeführt werden, um ein erfolgreiches Ergebnis zu gewährleisten. Es ist wichtig, den Zeitpunkt der Beobachtung entsprechend dem Forschungsinteresse zu wählen; Tag 14 stellt den Ausgangspunkt für die ersten dichten myelinisierten Axone dar und kann daher als Beobachtungszeitpunkt für den Beginn der Myelinisierung gewählt werden, während spätere Zeitpunkte vollständigere Myelinscheiden bieten.
Da diese In-vitro-Methode der Myelinisierung nur aus DRG- und Schwann-Zellen besteht, ähnelt sie nicht exakt dem Prozess der Myelinisierung im Organismus. Andere Faktoren, die dazu beitragen, wie das umgebende Gewebe, die Mikroumgebung, Immunzellen und Signalübertragungen von entfernten Strukturen, werden in diesem Modell nicht dargestellt. Diese Methode stellt jedoch ein geeignetes Modell dar, um die Myelinisierung des PNS durch die getrennte Analyse und Manipulation beider Zelltypenzu untersuchen 9,15,16. Schwann-Zellen oder DRG für die Kokultur können von erkrankten oder behandelten Tieren entnommen werden, um den Beitrag des spezifischen Zelltyps zu entschlüsseln17,18. Bei Verwendung der späten Stadien dieses Aufbaus wird dringend empfohlen, eine Kontrollbedingung ohne zusätzliche Zugabe von Schwann-Zellen einzubeziehen, um die möglichen Auswirkungen von DRG-abgeleiteten Schwann-Zellen auszuschließen. Unserer Erfahrung nach wird die Myelinisierung in DRG-Explantaten ohne Schwann-Zellen in signifikant geringerem Ausmaß nachgewiesen als in der Kokultur (ergänzende Abbildung 2).
Die Verwendung von DRG-Explantaten bietet den Vorteil einer intakten Strukturarchitektur im Vergleich zu dissoziierten neuronalen Kulturen. Die immunfluoreszierende Färbung des basischen Myelinproteins (MBP) ermöglicht die Quantifizierung des myelinisierten Axonbereichs und liefert einen ausreichenden Messwert für die Myelinisierung in der Kokultur. Die Genexpressionsanalyse von Kokulturproben an Tag 22 ergab das Vorhandensein von MBP, peripherem Myelinprotein (PMP22), Myelin-assoziiertem Glykoprotein (MAG), Oktamer-bindendem Faktor 6 (Oct6), ETS-verwandtem Gen 2 (Erg2) und Oligodendrozyten-Transkriptionsfaktor 1 (Olig1), mit den höchsten Expressionswerten für MBP und PMP22 (ergänzende Abbildung 3). Das beschriebene Protokoll stellt somit eine Methode mit mehreren Zieloptionen für Myelinisierungsmarker in der Kokultur zur Verfügung.
Mögliche Anwendungen dieser Methode sind Ansätze der Grundlagenforschung zum Prozess der Myelinisierung in der Peripherie sowie die Validierung von therapeutischen Wirkstoffen für Erkrankungen des PNS, einschließlich der Schädigung des Myelin.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Wir danken Prof. Dr. Ralf Gold und PD Dr. Gisa Ellrichmann für ihren Rat und ihre Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
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