Summary
I samodlingssystemet av dorsala rotganglier och Schwann-celler kan myelinering av det perifera nervsystemet studeras. Denna modell ger experimentella möjligheter att observera och kvantifiera perifer myelinisering och att studera effekterna av föreningar av intresse på myelinskidan.
Abstract
Myeliniseringsprocessen är avgörande för att möjliggöra snabb och tillräcklig signaltransduktion i nervsystemet. I det perifera nervsystemet engagerar neuroner och Schwann-celler en komplex interaktion för att kontrollera myelineringen av axoner. Störningar av denna interaktion och nedbrytning av myelinskidan är kännetecken för inflammatoriska neuropatier och förekommer sekundärt vid neurodegenerativa störningar. Här presenterar vi en samodlingsmodell av dorsala rotganglieexplantat och Schwann-celler, som utvecklar en robust myelinering av perifera axoner för att undersöka myeliniseringsprocessen i det perifera nervsystemet, studera axon-Schwann-cellinteraktioner och utvärdera de potentiella effekterna av terapeutiska medel på varje celltyp separat. Metodologiskt skördades dorsala rotganglioner av embryonala råttor (E13.5), dissocierades från sin omgivande vävnad och odlades som hela explantat i 3 dagar. Schwannceller isolerades från 3 veckor gamla vuxna råttor och ischiasnerver smältes enzymatiskt. De resulterande Schwann-cellerna renades genom magnetaktiverad cellsortering och odlades under neuregulin- och forskolinberikade förhållanden. Efter 3 dagar av dorsal root ganglion explantkultur tillsattes 30 000 Schwann-celler till en dorsal root ganglion explantat i ett medium innehållande askorbinsyra. De första tecknen på myelinisering upptäcktes på dag 10 av samodling, genom spridda signaler för myelinbasprotein vid immunocytokemisk färgning. Från dag 14 och framåt bildades myelinmantlar och förökades längs axonerna. Myelinisering kan kvantifieras genom myelinbasisk proteinfärgning som ett förhållande mellan myeliniseringsområdet och axonområdet för att ta hänsyn till skillnaderna i axonal densitet. Denna modell ger experimentella möjligheter att studera olika aspekter av perifer myelinisering in vitro, vilket är avgörande för att förstå patologin och möjliga behandlingsmöjligheter för demyelinisering och neurodegeneration vid inflammatoriska och neurodegenerativa sjukdomar i det perifera nervsystemet.
Introduction
I det perifera nervsystemet (PNS) förmedlas snabb informationstransduktion av myelinlindade axoner. Myelineringen av axoner är avgörande för att möjliggöra snabb utbredning av elektriska impulser, eftersom nervfibrernas ledningshastighet korrelerar med axondiametern och myelintjockleken1. Sensorisk signalering från periferin till centrala nervsystemet (CNS) bygger på aktivering av första ordningens sensoriska neuroner som ligger i utvidgningar av dorsalroten, kallad dorsala rotganglier (DRG). För bildning och underhåll av myelin är kontinuerlig kommunikation mellan axoner och Schwann-celler, vilka är de myeliniserande Glia-cellerna i PNS, obligatorisk2.
Många sjukdomar i PNS stör överföringen av information genom antingen primär axonal eller demyeliniserande skada, vilket resulterar i hypestesi eller dysestesi. Första ordningens sensoriska neuroner har förmågan att regenerera i viss utsträckning efter neuronal skada, genom en komplex interaktion mellan neuronen och omgivande Schwann-celler3. I detta fall kan Schwann-celler genomgå cellulär omprogrammering för att rensa axonalt såväl som myelinskräp och främja axonal regenerering, vilket resulterar i remyelinering4. Att förstå mekanismerna för myelinisering vid hälsa och sjukdom är viktigt för att hitta möjliga behandlingsalternativ för demyeliniserande störningar i PNS. Myelin kan också skadas av akut neurotrauma, och metoder för att främja myelinisering för att främja funktionell återhämtning efter perifer nervskada undersöks5.
Vår kunskap om perifer myelinisering har till stor del gynnats av myeliniserande samkulturer av Schwann-celler och sensoriska neuroner. Sedan de första metoderna tillämpades 6,7,8 har myelinisering studerats intensivt med användning av olika samkultursystem9,10,11. Här tillhandahåller vi ett snabbt och enkelt protokoll för robust in vitro-myelinering av dorsalrotganglieaxoner. Protokollet för Schwann-cellberedning är baserat på protokollet av Andersen et al.12, tidigare publicerat i Pitarokoili et al.13. Vi använder Schwann-celler som härrör från unga råttor och embryonala DRG-explantkulturer för samkulturen, där myelinisering sker runt dag 14. Målet med metoden är att tillhandahålla ett system för att undersöka bildandet av myelin som ett resultat av direkt axon-Schwann-cellinteraktion, och att studera modulatorer av PNS-myelinisering. I jämförelse med dissocierade neuronala cellkulturer är DRG-explantat mer anatomiskt bevarade och bildar långa axonala processer. Kvantifiering av det myeliniserade axonområdet ger en tillräcklig avläsning för myelinisering i samkulturen. Metoden är ett värdefullt verktyg för att screena terapeutiska substanser för deras potentiella effekt på PNS-myelinisering, och kan även användas som tillägg till in vivo-studier i djurmodeller14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök utfördes i enlighet med Europeiska gemenskapernas rådsdirektiv för vård och användning av försöksdjur.
1. Schwann cellodling
- Beläggning för Schwann-cellodling
- Belägg cellodlingsrätterna under sterila förhållanden. Applicera 2 ml 0,01% poly-L-lysin (PLL) på två 60 mm vävnadsodlingsrätter (TC) vardera och inkubera över natten vid 4 °C.
- Ta bort PLL, tvätta TC-diskarna 2x med destillerat vatten och inkubera med 2 ml 1 μg/cm2 laminin över natten vid 4 °C. Tvätta TC-diskarna 2x med aqua dest och låt tallrikarna lufttorka.
- Medium beredning för Schwann cellodling
- Förbered 50 ml Schwann-cellmedium genom att tillsätta 10% värmeinaktiverat fosterkalvserum (FCS), 2 μM forskolin, 10 nM neuregulin och 50 μg / ml gentamycin till Dulbeccos modifierade Eagle's Medium (DMEM) / F-12 (hög glukos) under sterila förhållanden.
- Bered 70 ml av Leibovitz L-15-medium med 50 μg/ml gentamycin under sterila förhållanden.
- Ischias nervberedning
OBS: Alla steg för förberedelse av ischiasnerven utförs under en ren bänk.- Förbered en 100 mm TC-skål med 5 ml iskall Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) utan Ca 2+ och Mg2+, en 100 mm TC-skål med 5 ml iskall Leibovitz L-15-medium och en 100 mm TC-skål med 5 ml iskall Leibovitz L-15-medium och 50 μg/ml gentamycin.
- Rengör alla instrument genom autoklavering. Spraya instrumenten och arbetsområdet med 70% etanol.
- Avliva fem 3 veckor gamla manliga Sprague Dawley-råttor med hjälp av CO2-inandning och halshuggning. Spraya råttans torso med 70% etanol.
- Öppna den dorsala nedre vänstra extremiteten med sax och ta bort biceps femoris-muskeln försiktigt. Lossa ischiasnerven genom jämn höjd med böjda pincett, se till att inte blåsa nerven.
- Håll den mest proximala delen av nerven med de böjda pincetterna för att räta ut nerven och klipp nerven så högt som möjligt med sax. Klipp sedan nerven nära sakral plexus och tassen med sax. Upprepa steg 1.3.4-1.3.5 för höger sida.
OBS: När du öppnar lemmen, var försiktig så att du inte får blåmärken på några blodkärl. - Använd pincett och lägg vänster och höger ischiasnerver i en 100 mm TC-skål med iskall DPBS.
- Ischiasnerv renovering
- Använd pincett för att överföra alla nerver till en 100 mm TC-skål med iskall Leibovitz L-15 medium och 50 μg/ml gentamycin. Fortsätt använda ett stereomikroskop och ta bort fett, muskler och blodkärl från nerverna med två par fina pincett. Ta tag i nerverna med pincett och överför dem till en 100 mm TC-skål med iskall Leibovitz L-15-medium.
- Identifiera de proximala och distala ändarna av ischiasnerven. Ta bort epineurium med ett par fina pincett i proximal till distal riktning, medan du håller den proximala nervänden med det andra paret fina pincett.
- Överför de renade nerverna till en 100 mm TC-skål med iskall Leibovitz L-15 medium och 50 μg/ml gentamycin. Reta de isolerade nervfasciklarna för att separera och isolera enstaka nervfibrer med två par fina pincett.
- Överför nervfibrerna till ett 50 ml rör med en 10 ml serologisk pipett och ta upp så lite medium som möjligt. Tillsätt 50 ml Leibovitz L-15-medium med 50 μg / ml gentamycin till nervfibrerna och sväng några gånger i 50 ml röret.
- Enzymatisk matsmältning av ischiasnerven
Nästa steg (steg 1.5-1.8, 2.1 och 2.2) utförs under sterila förhållanden.- Bered den enzymatiska digestionslösningen innehållande 0,25% dispase II, 0,05% typ I kollagenas och 50 μg / ml gentamycin i 10 ml DMEM (hög glukos).
- Centrifugera röret vid 188 x g i 5 minuter vid 4 °C, avlägsna supernatanten med en 25 ml serologisk pipett och överför pelleten med det återstående Leibovitz-L-15-mediet till en 60 mm TC-skål med en 1 000 ml pipett.
- Skölj 50 ml röret med 10 ml enzymatisk digestionslösning och tillsätt det till skålen som innehåller nervfibrerna. Fördela vävnaden i skålen försiktigt med spetsen på en pipett för att maximera den tillgängliga ytan för matsmältningen.
- Inkubera vid 37 °C och 5%CO2 i 18 timmar och stoppa matsmältningen genom att tillsätta 10 ml 40% FCS i Hanks balanserade saltlösning, utan Ca2 och Mg2+ (HBSS).
- Cellseparation
- Överför de nedbrutna nerverna till ett 50 ml rör med en serologisk pipett och centrifugera vid 188 x g i 10 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och suspendera pelleten på nytt i 10 ml DMEM innehållande 10 % FCS och 50 μg/ml gentamycin. Suspendera därefter pelleten 20 gånger med en pipettspets på 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml och 200 μl.
- Filtrera cellsuspensionen genom en 100 μm cellsil och centrifugera vid 188 x g i 10 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och suspendera pelleten på nytt med 4 ml DMEM innehållande 10 % FCS och 50 μg/ml gentamycin.
- Tillsätt 2 ml av cellsuspensionen till var och en av de två PLL- och lamininbelagda 60 mm TC-skålarna och inkubera vid 37 °C och 5 %CO2. Lämna plattorna orörda i 2 dagar i inkubatorn för att skydda cellerna från mekanisk stress och för att stödja vidhäftning.
- Schwann celldifferentiering
- Efter 2 dagar, ta bort mediet och skölj försiktigt plattorna 2x med DMEM (hög glukos), 10% FCS och 50 μg / ml gentamycin. Tillsätt sedan 2 ml Schwann-cellmedium. Byt ut Schwann-cellmediet var 2:a dag och observera cellens utseende och sammanflöde med hjälp av ett mikroskop.
OBS: Schwannceller och DRG-explantat måste förberedas i tid, samordnat sätt för samodlingen. Se till att en råtta med embryon vid E 13.5 är tillgänglig för DRG-beredning när Schwann-cellerna är nära ett sammanflöde på 80%.
- Efter 2 dagar, ta bort mediet och skölj försiktigt plattorna 2x med DMEM (hög glukos), 10% FCS och 50 μg / ml gentamycin. Tillsätt sedan 2 ml Schwann-cellmedium. Byt ut Schwann-cellmediet var 2:a dag och observera cellens utseende och sammanflöde med hjälp av ett mikroskop.
- Celltrypsinisering och magnetisk separation
OBS: För exemplifierande bilder av olika Schwann-cellodlingsstadier, se kompletterande figur 1.- När cellerna når ett sammanflöde på cirka 80% (6-12 dagars odling), tvätta försiktigt plattorna 2x med 3 ml DPBS och inkubera med 2 ml 0,05% trypsin / EDTA (förvärmd till 37 ° C) i 3 minuter. När cellerna lossnar från plattans botten, inaktivera matsmältningen genom tillsats av 2 ml DMEM med 10% FCS och 50 μg/ml gentamycin.
OBS: Håll dig till en trypsiniseringstid på strikt 3 minuter och fortsätt snabbt efteråt. - Resuspendera cellpelleten i 2 ml magnetisk cellseparationsbuffert innehållande DPBS med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 2 nM EDTA. Kombinera 10 μL av cellsuspensionen med 10 μL trypanblått och räkna cellerna med hjälp av en färgningskammare.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 188 x g i 10 minuter vid 4 °C och suspendera cellpelleten på nytt i 90 μl magnetisk cellseparationsbuffert per 1 x 107 celler. Tillsätt 10 μL Thy-1 mikrokulor per 1 x 107 celler. Blanda upp lösningen några gånger och inkubera i 15 minuter i mörker vid 8 °C.
- Tillsätt 2 ml av den magnetiska cellseparationsbufferten till cellsuspensionen och centrifugera vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 500 μl magnetisk cellseparationsbuffert.
- Fukta den magnetiska cellseparationskolonnen med 1 ml av den magnetiska cellseparationsbufferten. Placera den magnetiska cellseparationskolonnen i den magnetiska cellseparatorn. Applicera cellerna på den magnetiska cellseparationskolonnen. Samla upp flödet och centrifugera vid 300 x g vid 4 °C i 10 minuter.
OBS: Fibroblaster väljs positivt och förblir i kolumnen, medan Schwann-celler passerar kolumnen. Fibroblaster kan samlas in med en stämpel (t.ex. som en negativ kontroll för Schwann-cellfärgningsprotokoll). - Kassera supernatanten och suspendera pelleten på nytt i 1 ml av odlingsmediet (se steg 3.1.1). Räkna cellerna efter färgning med trypanblått och en färgkammare.
- När cellerna når ett sammanflöde på cirka 80% (6-12 dagars odling), tvätta försiktigt plattorna 2x med 3 ml DPBS och inkubera med 2 ml 0,05% trypsin / EDTA (förvärmd till 37 ° C) i 3 minuter. När cellerna lossnar från plattans botten, inaktivera matsmältningen genom tillsats av 2 ml DMEM med 10% FCS och 50 μg/ml gentamycin.
2. DRG explantkultur
- DRG tillväxtmedium förberedelse
- Förbered DRG tillväxtmedium genom att tillsätta 2% B27, 2% hästserum, 1% L-glutamin, 0,5% penicillin / streptomycin och 10 ng / ml nervtillväxtfaktor (NGF) till det neurobasala mediet. Förvara odlingsmediet vid 4 °C.
OBS: Tillväxtmediet kan användas i 2 dagar.
- Förbered DRG tillväxtmedium genom att tillsätta 2% B27, 2% hästserum, 1% L-glutamin, 0,5% penicillin / streptomycin och 10 ng / ml nervtillväxtfaktor (NGF) till det neurobasala mediet. Förvara odlingsmediet vid 4 °C.
- Beläggning för DRG-explantat
- Inkubera täckglasen i 70% etanol i 1 timme och placera i brunnarna på 4-brunnskålar med böjda pincett. När etanolen har torkat, applicera 300 μl 0,2 mg/ml poly-D-lysin (PDL) per brunn och inkubera över natten vid 37 °C och 5 %CO2.
- Tvätta täckglasen 3x i 5 minuter vardera med DPBS i följd. Ta av DPBS, applicera 300 μl 1 μg/ml laminin på täckglasen och inkubera över natten vid 37 °C och 5 %CO2.
- Efter tre tvättsteg med DPBS i 5 minuter, byt ut DPBS mot 190 μL DRG-tillväxtmedium. Placera plattorna med 4 brunnar i inkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2.
- DRG-förberedelse
OBS: Skörda DRG av embryonala råttor under en ren bänk.- Rengör alla instrument med 70% etanol före beredningen. Fyll 10 (två per embryo) 35 mm TC-fat med 2 ml iskall HBSS per fat och två 100 mm TC-fat med 5 ml iskall HBSS per maträtt.
- Avliva dräktiga råttor (vuxna honråttor av Sprague Dawley, E13.5) genom inandning och halshuggning av CO2 .
- Spraya kroppen med 70% etanol och öppna råttans ventrala torso. Ta försiktigt bort livmodern och placera den i en 100 mm TC-skål med iskall HBSS.
- Håll livmodern med böjda pincett och öppna livmoderväggen med fina pincett. Ta bort en fostersäck och öppna den försiktigt genom att klämma ett hål med fina pincett.
- Ta bort embryot från de omgivande vävnaderna, klipp navelsträngen och halshugga embryot med fina pincett. Placera bålen i en 100 mm TC-skål fylld med HBSS med böjda pincett och en spatel.
- Ta snabbt bort alla embryon från livmodern och överför dem till en 100 mm TC-skål fylld med HBSS. Om det finns fler än fem embryon, förbered ytterligare en 35 mm TC-skål med 2 ml HBSS, enligt steg 2.3.1.
- Placera försiktigt en embryotorso i en 35 mm TC-skål fylld med HBSS med en spatel och böjd pincett. Under ett stereomikroskop öppnar du dorsaldelen av torso för att dela embryot i två halvor med fina pincett och mikrosax. Vänd hälften åt sidan och identifiera DRG-strängen som ligger i en linje vid embryonets dorsala del.
- Klipp ut DRG som en hel sträng med fina pincett och mikrosaxar. Placera DRG i en ny 35 mm TC-skål fylld med 2 ml HBSS och separera en enda DRG från den återstående vävnaden med fina pincett och mikrosaxar.
- DRG-cellodling
- Ta 4-brunnsplattor innehållande 190 μL DRG-tillväxtmedium från inkubatorn till den rena bänken där DRG ska beredas. Överför en enda DRG försiktigt till en brunn på en 4-brunns odlingsplatta med fina pincett och en spatel. Placera DRG i mitten av varje brunn, eftersom en central position är viktig för fastsättningen av DRG.
- Arbeta under sterila förhållanden från och med nu. Placera explantkulturerna i inkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2. Nästa dag, tillsätt 50 μL av DRG-tillväxtmediet försiktigt till varje brunn med en 100 ml pipett.
- Observera DRG explanta vidhäftning och axonutväxt med hjälp av ett mikroskop dagligen och kassera DRG-explantat som har lossnat från täckglaset eller misslyckats med att växa ut axoner på dag 3 av kulturen.
DRG-explantat är mycket ömtåliga under de första dagarna av kulturen och måste hanteras med försiktighet, särskilt när plattorna flyttas in och ut ur inkubatorn när mediet byts eller till och med när inkubatordörren stängs. Den exakta volymen på 190 μL medium per brunn är avgörande för att hålla DRG-explanterna på plats under den första odlingsdagen. Lösa DRG-explantat kan lätt identifieras under den dagliga kontrollen, eftersom de simmar i mediet istället för att fästa vid täckglaset.
3. Samkultur
- Överföring av Schwann-celler till DRG-explantkulturen
- Förbered samodlingsmediet genom att tillsätta 0,1% askorbinsyra till DRG-tillväxtmediet.
- På dag 3 av DRG-explantkulturen, ersätt försiktigt DRG-tillväxtmediet med 250 μL av samodlingsmediet innehållande 30 000 Schwann-celler (från steg 1.8) per brunn.
- Håll samkulturen av DRG-explantaterna och Schwann-cellerna i upp till 22 dagar. Byt ut 250 μL av odlingsmediet noggrant varannan dag och observera cellernas utseende med hjälp av ett mikroskop.
OBS: För ett exempel på DRG-axoner och Schwann-celler i samkulturen under de första dagarna av kulturen, se figur 1.
- Immunocytokemisk färgning
OBS: Hantera samkulturproverna extremt noggrant under färgningsproceduren, eftersom de lätt kan skadas.- För att fixera cellerna på täckglasen, ta bort mediet långsamt, tvätta 3x med DPBS försiktigt och inkubera i 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minuter. Byt ut PFA mot DPBS och förvara de fasta cellerna vid 4 °C i upp till 1 vecka.
VARNING: Vid hantering av 4% PFA, använd rekommenderad personlig skyddsutrustning. - Tvätta täckglasen 3x med DPBS i 5 minuter och blockera sedan med blockeringslösning (10% getserum, 10% bovint serumalbumin [BSA], 0,1% gelatin och 0,05% Triton X-100) i DPBS i 1 timme. Späd de primära antikropparna βIII-tubulin (1:7 500) och basproteinet myelin (MBP) (1:750) i blockeringslösningen och inkubera över natten vid 4 °C.
- Tvätta cellerna 3x med DPBS i 5 minuter. Använd fluorescerande färgkonjugerade sekundära antikroppar i en spädning av 1:1 000 i blockerande lösning och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta cellerna 3x med DPBS i 5 minuter och montera cellerna på mikroskopiska glas med fluorescensmonteringsmedium, inklusive 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Förvara glasen i mörker vid 4 °C tills mikroskopisk dokumentation föreligger.
VARNING: Vid hantering av fluorescensmonteringsmedium, använd rekommenderad personlig skyddsutrustning.
- För att fixera cellerna på täckglasen, ta bort mediet långsamt, tvätta 3x med DPBS försiktigt och inkubera i 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minuter. Byt ut PFA mot DPBS och förvara de fasta cellerna vid 4 °C i upp till 1 vecka.
- Analys
- Ta bilder av åtta definierade regioner som omger DRG-explanten i mitten med hjälp av ett inverterat mikroskop.
- Använda ett bildanalysprogram för att kvantifiera områdena βIII-tubulinpositiva axoner och myelinisering färgade av MBP.
- Beräkna procentandelen myelinisering som ett förhållande mellan de myeliniserade axonerna och icke-myeliniserade axonerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myelinisering i samkulturen bedömdes dag 10, 12, 14, 16, 18 och 20. DRG-explantaterna och Schwann-cellerna färgades för MBP, βIII-tubulin och DAPI. Axonalnätverket i samkulturen var tätt och förändrades inte synligt under observationens tidsförlopp. De första tecknen på myelin, i form av små fragment, detekterades på dag 10 och ökade på dag 12 (figur 2). De MBP-positiva områdena ökade över tid fram till dag 20 av kulturen. Myeliniseringen kvantifierades som ett förhållande mellan de positiva områdena MBP och βIII-tubulin. Myeliniseringen ökade signifikant dag 18 och 20 jämfört med dag 10 (figur 3; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001).
Figur 1: Utseende av Schwannceller och axoner i samkulturen. Föredömlig bild av samkulturen dag 3. Svarta pilar visar tunna DRG-axoner, och den vita pilen pekar på en Schwann-cell med en långsträckt och spindelformad morfologi fäst vid en axon. Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Myelinisering i en samkultur av DRG-explantat och Schwann-celler. Färgning för neuronmarkören βIII-tubulin och MBP utfördes dag 10, 12, 14, 16, 18 och 20, efter att ha gått med i båda kulturerna för att undersöka utvecklingen av myelinering i samkulturen. De första tecknen på myelinisering syntes på dag 10 och 12 av samodling. Från dag 14 och framåt var MBP-signalen mer uttalad och myelinlindade axoner detekterades. Myeliniseringen ökade med tiden för samodling fram till dag 20. Skalstänger: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kvantifiering av myelinisering. På dag 10, 12, 14, 16, 18 och 20 av samodling bedömdes myelinisering genom färgning av axoner med βIII-tubulin och myelin med MBP. Procentandelen myeliniserade axoner bestämdes genom beräkning av förhållandet mellan MBP-positiva och βIII-tubulinfärgade områden. Signifikanta skillnader upptäcktes dag 18 och 20 jämfört med dag 10 av samodling. Data uttrycks som medelvärde ± SEM; n = 3. Envägs ANOVA med Kruskal-Wallis och Dunns multipla jämförelse post-hoc-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Steg av Schwann-cellodling. Exempel på ljusfältsbilder av odlade Schwann-celler (A) före och (B) efter magnetisk cellseparation. Före magnetisk cellseparation innefattar kulturen Schwann-celler med en långsträckt och spindelformad morfologi, platta och utspridda fibroblaster och rester av bindväv. För att uppnå en renare kultur av Schwann-celler utförs magnetisk cellseparation. Skalstänger: 200 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Myelinisering av DRG-explantat med och utan ytterligare Schwann-celler. Det MBP-färgade området användes för att mäta myelinisering i samkulturen på dag 14. Myeliniseringen av DRG-explantat ökade signifikant om Schwann-celler tillsattes till kulturen (oparad t-test, **p ≤ 0,01). n = 3. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Genuttrycksanalys i samkulturen. Relativa genuttrycksnivåer av MBP, PMP22, MAG, Oct6, Egr2 och Olig1 analyserades i samodlingsprover dag 22 med qPCR (A). MBP och PMP22 var målen med de högsta genuttrycksnivåerna i samkulturen. En exemplarisk bild av qPCR-amplifieringsprodukter applicerade på en agarosgel visar målens kvalitativa överflöd (B). De första och sista banorna på gelén representerar en DNA-stege (100 baspar). n = 5. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett snabbt och enkelt protokoll för generering av in vitro-myelinering genom att slå samman två separata celltypkulturer, Schwann-celler och dorsalrotganglionexplantat.
Ett kritiskt steg i protokollet är odling av DRG-explantat, särskilt under de första dagarna av kulturen. DRG är mycket ömtåliga innan ett starkt axonalt nätverk byggs och måste hanteras mycket försiktigt, till exempel när de tas ut ur inkubatorn eller vid byte av medium. DRG som lossnar från botten av brunnen och finns simma i mediet visar misslyckad odling. För Schwann-celler kan förändrade proliferationshastigheter på grund av olika odlingsförhållanden och kosttillskott (t.ex. serum i mediet) utgöra en utmaning för samkulturen. Om kulturen är övervuxen av ett alltför stort antal Schwann-celler, lossnar den från botten av brunnen och blir oanvändbar. En titrering av Schwann-cellnummer i kulturen rekommenderas därför. Under upprättandet av Schwann-cellprotokollet bör renhetstester utföras med SOX10 eller S100 immunfärgning. I allmänhet måste hanteringen av kulturen, inklusive byte av medium samt tvätt- och fixeringssteg, utföras noggrant för att säkerställa ett framgångsrikt resultat. Det är viktigt att välja observationstidpunkt enligt forskningsintresset; Dag 14 representerar startpunkten för de första täta myeliniserade axonerna, och kan därför väljas som observationspunkt för initiering av myelinisering, medan senare tidpunkter erbjuder mer kompletta myelinmantlar.
Eftersom denna in vitro-metod för myelinisering endast omfattar DRG- och Schwann-celler, liknar den inte exakt myeliniseringsprocessen i organismen. Andra bidragande faktorer, såsom omgivande vävnad, mikromiljön, immunceller och signalering från avlägsna strukturer, är inte representerade i denna modell. Denna metod ger dock en lämplig modell för att undersöka myelinisering av PNS genom separat analys och manipulation av båda celltyperna 9,15,16. Schwannceller eller DRG för samodling kan skördas från sjuka eller behandlade djur för att dechiffrera bidraget från den specifika celltypen17,18. När du använder de sena stadierna av denna inställning rekommenderas det starkt att inkludera ett kontrollvillkor utan att dessutom lägga till Schwann-celler för att utesluta de möjliga effekterna av DRG-härledda Schwann-celler. Enligt vår erfarenhet detekteras myelinisering i DRG-explantat utan Schwann-celler i betydligt mindre utsträckning än i samkulturen (kompletterande figur 2).
Användningen av DRG-explantat ger fördelen med intakt strukturell arkitektur jämfört med dissocierade neuronala kulturer. Immunofluorescerande färgning av myelinbasprotein (MBP) möjliggör kvantifiering av det myeliniserade axonområdet och ger en tillräcklig avläsning för myelinisering i samkulturen. Genuttrycksanalys av samodlingsprover på dag 22 avslöjade närvaron av MBP, perifert myelinprotein (PMP22), myelinassocierat glykoprotein (MAG), oktamerbindande faktor 6 (Oct6), ETS-relaterad gen 2 (Erg2) och oligodendrocyttranskriptionsfaktor 1 (Olig1), med de högsta uttrycksnivåerna för MBP och PMP22 (kompletterande figur 3). Därför tillhandahåller det beskrivna protokollet en metod med flera målalternativ för myeliniseringsmarkörer i samkulturen.
Potentiella tillämpningar av denna metod inkluderar grundläggande forskningsmetoder för myeliniseringsprocessen i periferin, samt validering av terapeutiska föreningar för sjukdomar i PNS, inklusive skador på myelin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Prof. Dr. Ralf Gold och PD Dr. Gisa Ellrichmann för deras råd och stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
- Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
- Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
- Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
- Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
- Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
- Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
- Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
- Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
- Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
- Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
- Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
- Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
- Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).
