Summary
我们使用简单的实验室工具来检查拟南芥和Medicago的根系结构（RSA）。将小苗水培生长在网眼上，并使用艺术刷展开以露出RSA。使用扫描或高分辨率相机拍摄图像，然后使用ImageJ进行分析以映射特征。
Abstract
全面了解植物根系结构（RSA）的发展对于提高养分利用效率和提高作物品种对环境挑战的耐受性至关重要。提出了用于建立水培系统，幼苗生长，RSA传播和成像的实验方案。该方法使用基于洋红色箱的水培系统，其中包含由聚碳酸酯楔块支撑的聚丙烯网。实验设置通过评估不同营养（磷酸盐[Pi]）供应下幼苗的RSA来举例说明。该系统的建立是为了检查拟南芥的RSA，但它很容易适应研究其他植物，如 Medicago sativa （苜蓿）。拟 南芥 （Col-0）幼苗在本次调查中用作了解植物RSA的示例。通过处理乙醇和稀释的商业漂白剂对种子进行表面灭菌，并保持在4°C进行分层。种子在由聚碳酸酯楔块支撑的聚丙烯网上的液体半MS培养基上发芽并生长。将幼苗在标准生长条件下生长所需的天数，从网中轻轻挑出，并浸没在含水的琼脂平板中。在圆形艺术刷的帮助下，将小苗的每个根系轻轻地铺在充满水的盘子上。这些培养皿以高分辨率拍照或扫描以记录RSA性状。根性状，如主根、侧根和分支区，使用免费提供的 ImageJ 软件进行测量。本研究提供了在受控环境环境中测量植物根系特征的技术。我们讨论了如何（1）种植幼苗，收集和传播根样本，（2）获得传播RSA样本的图片，（3）捕获图像，以及（4）使用图像分析软件量化根属性。该方法的优点是可以通用、简单、有效地测量RSA性状。
Introduction
地下的根系结构（RSA）是植物生长和生产力的重要器官1，2，3。在胚胎阶段之后，植物经历了最显着的形态变化。根在土壤中的生长方式极大地影响了地面上植物部分的生长。根系生长是发芽的第一步。这是一个信息性状，因为它对不同的可用营养素做出独特的反应1，2，3，4。RSA表现出高度的发展可塑性，这意味着环境总是被用来做出有关发展的决策2，5。在目前的情况下，环境的变化使作物生产更加困难。RSA持续地将环境信号纳入发展选择5。因此，彻底了解根系发育背后的原理对于了解植物如何应对不断变化的环境至关重要2，5。
RSA感知不同的营养浓度，并呈现表型改变4，6，7，8，9，10，11，12。研究表明，与枝条形态相比，根形态/RSA 具有高度可塑性1，3。RSA性状映射在记录周围土壤环境变化的影响方面非常有效1，11，12。
一般来说，在许多早期研究中已经报道了各种营养缺乏对根表型的影响的差异3，11，13，14，15。例如，有几个关于磷酸盐 （Pi） 饥饿引起的侧根 （LR） 数量、长度和密度变化的对比报告。据报道，在 Pi 缺陷条件下6，8 下 LR 密度增加。相比之下，其他作者也报告了在Pi缺陷条件下LR密度的降低3，13，16。这些不一致的主要原因之一是使用了容易发生元素污染的胶凝培养基，琼脂通常含有10种。研究人员通常在基于琼脂的平板系统上种植实验植物并记录根性状。许多RSA性状经常隐藏或根深蒂固地存在于琼脂材料中，无法记录。与诱导营养缺乏相关的实验，其中使用者经常从培养基中完全排除一种成分，不能在容易发生元素污染的胶凝培养基中进行11，14，15。琼脂培养基中经常大量存在许多营养素，包括P，Zn，Fe以及更多11，14，15。此外，RSA在琼脂基培养基中的生长速度低于非琼脂基液体培养基。因此，有必要建立一种替代的非琼脂方法，用于定量和定性记录RSA的表型。因此，已经开发了目前的方法，其中幼苗在基于洋红色盒的水培系统中生长，该系统位于由聚碳酸酯楔块1，10，11支撑的聚丙烯网之上。
这项研究提出了Jain等人描述的早期方法的详细即兴版本10。该策略已针对植物根系生物学的当前需求进行了调整，也可用于除模式植物以外的苜蓿等植物。该协议是测量 RSA 变化的主要方法，它只需要简单的设备。本协议说明了如何表型几种根特征，例如正常和修饰培养基（Pi缺陷）中的主根和侧根。提供了从作者的经验中收集的分步说明和其他有用的提示，以帮助研究人员遵循该方法中提供的方法。本研究旨在提供一种简单有效的方法来揭示植物的整个根系，包括高阶LRs。这种方法涉及用圆形水彩艺术刷手动涂抹根系，从而可以精确控制根部的曝光1，10，11，12。它不需要昂贵的设备或复杂的软件。这种方法提高了养分吸收和生长速度;植物具有易于被根部吸收的营养丰富的溶液。本方法适用于希望详细绘制植物根系特征的研究人员，特别是在早期发育期间（发芽后10-15天）。它适用于小根系、拟南芥和烟草等模式植物，以及苜蓿等非传统植物，直到它们的根系适合洋红色盒子。
该协议概述了拟南芥中RSA发育的表型分析步骤如下：（1）植物种子表面灭菌的方法（拟南芥），（2）建立水培系统的步骤，然后在培养基上播种，（3）取出完整种子并在培养皿上铺展以进行RSA分析的程序， （4）如何记录RSA的图像，以及（5）使用ImageJ软件计算重要的RSA参数。
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Protocol
图1示意性地总结了整个协议，显示了揭示小苗根系结构（RSA）所涉及的所有基本步骤。协议步骤详见下文：
1.拟南芥种子表面杀菌
- 将一小勺（约100粒种子=约2.5毫克）种子转移到微量离心管中，并在室温（RT）下在蒸馏水中浸泡30分钟。整个过程在无菌条件下进行。
- 将含有种子的微量离心管以500 x g 短暂离心5秒，在室温下使用任何台式离心机让种子沉淀下来。
- 倒出水，加入 700 μL 70% （v/v） 乙醇，涡旋几秒钟，然后旋转。如果需要，重复涡旋和旋转，但确保70%乙醇的处理时间保持在3分钟。
- 3分钟后，立即用无菌水冲洗一次。保持乙醇洗涤步骤尽可能及时，因为长时间接触乙醇会减少发芽。
- 用稀释的商业漂白剂（4% v / v）处理种子，滴入吐温-207分钟。通过将试管快速倒置 8-12 次，将种子与漂白剂溶液混合，然后进行短暂的离心机（室温下 500 x g 5 秒）。可以看到泡沫出现在管中。
- 使用 1 mL 移液管倒出上清液，并按照相同的涡旋程序用无菌水冲洗种子至少五次。
- 将表面灭菌的种子留在水中，并在4°C下孵育2-3天以进行分层10。
2. 为种子发芽设置水培系统
- 用蒸馏水将标准洋红色盒装满一半并高压灭菌。高压灭菌聚碳酸酯板（颜色清晰，质地光滑）并切割4厘米x 8厘米矩形，中点在矩形的一半以上切口，以便两个矩形可以缝合在一起形成X形10。使用此设置固定从 12x 24 英寸片材上切割的聚丙烯网（6 cm x 6 cm 正方形，孔径为 250 μm，或取决于要求）10。
注意：聚丙烯对酸、碱和其他化学品具有很强的耐受性;因此，它已被选择。高压灭菌容易使聚丙烯网变形;因此，建议用铝箔单独包裹。建议使用 16 分钟、121 °C、15 psi 或 775 mm Hg 的典型高压灭菌条件。 - 如Shukla等人1所述，向每个盒子中加入含有维生素+ 1.5%（w / v）蔗糖的无菌半MS基础培养基，以层流到达聚丙烯网的底部边缘。所有程序均在无菌条件下进行。
- 将表面灭菌的种子水培在网眼（250μm孔径）上播种，并让它们生长3天。
- 3天后，将幼苗转移到网状物（500μm孔径）上，让它们生长2天。
- 2天后（共5天），将幼苗转移到对照培养基上（即，含有2.0mM NH 4 NO3，1.9 mM KNO3，0.15 mM MgSO 4·7H2O，0.1 mM MnSO4·H2O， 3.0 μM 氧化锌 4·7H 2 O， 0.1 μM CuSO 4·5H 2 O， 0.3 mM 氯化钙 2·2H 2 O， 5.0 μM KI， 0.1 μM 氯化钴 2·6H 2 O， 0.1 mM FeSO4·7H 2 O， 0.1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O， 1.25 mM KH 2PO 4， 100 μM H 3 BO3， 1 μMNa2 MoO4·2H2O，1.5%蔗糖，1.25 mM MES，pH 5.7调节用0.1 M MES [pH 6.1]）和实验培养基（例如，P-[0 mM]处理;KH2 PO 4被0.62 mM K2SO4取代，从上述1的对照培养基组合物中取出。对于过量的Pi处理，KH 2 PO4的浓度在改性MS培养基[2.5，5.0，10.0，20.0mM]1）中增加，并使种子生长7天。
注意：较大的网孔尺寸（500μm）有助于顺利地将整个幼苗采摘出来，而不会损坏或需要在下胚轴处切割。幼苗在标准生长条件下（即16 h光照/8 h暗光周期，150 μmol·m-2·s-1光强，60%- 70%湿度）在23 °C下生长。
3. 审查 RSA
- 准备琼脂（1.1%）平板用于根部铺展（培养皿尺寸：150 mm x 15 mm）。
- 如上所述，向培养皿中加入10-20mL高压灭菌的过滤自来水。轻轻地从网眼（500μm）中拉出幼苗，并将它们浸入板上的水中。
- 在圆形水彩艺术刷（尺寸：14、16、18 和 20 号）的帮助下，将每个小苗的根轻轻铺在充满水的盘子中。
注意：在进行根系的扩散时，首先抓住主根并将其展开成一条直线，因为它用作轴。然后，尽可能将 LR 对称地分布在主根的每一侧。之后，传播链接到一阶LR的二阶LR。这种传播过程是一种艺术;轻轻地，慢慢地做，就像艺术家画RSA的图像一样。 - 稍微倾斜盘子以除去水。
注意：此时，可以通过将这些铺板置于4°C来暂停该过程。 稍后，当需要图像处理时，取出板并将其置于室温下一段时间。擦掉冷凝水，然后可以方便地处理图像。
4. 为 RSA 录制图像
- 适当地扫描或拍摄这些培养皿。
注意：要获得高质量的照片，建议使用 600 dpi 分辨率进行扫描，建议至少使用 1200 万像素的相机进行摄影。 - 使用免费提供的 ImageJ 软件 （https://imagej.nih.gov/ij/index.html） 测量根系统架构特征。要快速按照步骤使用 ImageJ 软件测量根长，请参阅示例“测量 DNA 轮廓长度”17。
注意：按照以下步骤测量使用高分辨率扫描仪或相机拍摄的照片的根长度。- 使用给定的长度距离来设置比例。 图 3 中比例尺的已知距离为 2 厘米。从 ImageJ 工具栏中选择 “直线 ”工具（左起第五个工具）。使用 直线 工具创建轮廓比例尺的线选择。通过右键单击、双击或单击开头的框来完成大纲。
- 使用 分析>测量 工具条测量已知比例尺的长度（以像素为单位）。记下像素长度。
- 通过单击分析选项卡中的设置比例选项卡打开设置比例对话框。在“以像素为单位的距离”字段中，输入像素长度（如上所述）。接下来，在已知距离字段中，输入值，如比例尺所示（此处为 20 毫米）。将长度单位设置为 mm。像素长宽比为 1.0。现在，比例由每毫米的 x 像素数指定。要锁定此特定图像的比例，请单击“确定”。
- 使用分割线工具创建勾勒根长度的 线 选择。通过右键单击、双击或单击开头的框来完成大纲。沿轮廓单击并拖动黑色和白色小“手柄”，以根据需要调整线条选择。
- 使用 ImageJ 的“分析”选项卡下的“测量”命令来量化根的长度。要将测量数据传输到电子表格，请右键单击“结果”窗口，从弹出菜单中选择“全部复制”，切换到电子表格，然后粘贴数据。
注意：如上所述，使用 ImageJ 设置比例选项中比例尺的已知距离设置比例。这给出了每单位长度的像素数。每次分析新图像时，都需要重新设置比例。
- RSA 性状的测量和计算
- 测量下胚轴连接处到根尖末端之间的主根长度。
- 测量一阶和二阶 LR 长度。
- 测量主根的分支区域 （BZ）。主根 （BZPR） 的分支区域跨越第一个 LR 出现点到最后一个 LR 出现点。
- 记录 LR 的数量，即源自 BZPR 边界内的 LR 数量。
- 测量一阶和高阶 LR 的平均长度。 通过将 1° LR 的总长度除以 1° LR 的总数来得出一阶 LR （1° LR）（每根厘米）的平均长度。
- 测量二阶 LR 的平均长度。通过将 2° LR 的总长度除以 2° LR 的总数来计算二阶 LR （2° LR） 的平均长度。
- 测量 1° LR 密度。通过将 1° LR 的数量除以 BZPR 的长度来计算 1° LR 密度（BZPR 单位长度 1° LR 的数量）。
- 测量 2° LR 密度。通过将 2° LR 的数量除以 1° LR 的 BZ 长度（1° 侧根的 BZ 每单位长度的 2° LR 数）来计算 2° LR 密度。
- 测量总根长度 （TRL）。这是主根、1° LR 和 2° LR（如果存在更多）长度的总和。
5. 根毛测量
注意：尽管水培系统不擅长促进根毛的生长和发育，尽管它在固体生长培养基中一样健壮，但在目前的情况下研究它仍然很重要。按照以下步骤分析从幼苗主根尖端开始的 5 毫米截面的根毛发育。
- 从根尖切掉主根的 2 厘米部分。
- 使用10%甘油作为安装介质将根部安装在载玻片上。
- 将载玻片放在体视显微镜下。
- 使用轴向载体可视化和捕获根毛的图像。
- 如前所述，使用ImageJ软件分析图像以研究根毛的结构和特征。
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Representative Results
使用简单的实验室工具测量根系结构（RSA）的不同形态特征，步骤示意性地描述在 图1中。水培设置的细节证明了该方案在测量RSA方面的潜力（图1 和 图2）。
鉴于观察到的胶凝剂差异，我们使用水培生长系统进行所有研究3，10。作为概念证明，这种水培系统运行良好，反映了Pi缺陷和充分条件下的明显对比表型（图3）。拟南芥种子在聚丙烯网的半MS培养基中水培5天，如图 2所示。将幼苗在5天后移植到Pi缺陷和足够的条件下，并使其生长7天（图3）。
不同养分（Pi）供应下的RSA性状证明
我们遵循既定的方案来分析和记录RSA3的特征。在水培条件下对比的Pi制度下分析了不同的RSA性状（图3）。与Pi充分条件相比，Pi缺陷处理（0 mM Pi）调用了通常报告的根表型，表现出更短，更浅且分支较少的RSA（图3A）。在Pi缺陷条件下，主根长度显著衰减（图3A，B）。在Pi（1.25 mM）存在下迅速获得的初级根长度显示了水培系统的效率，充分反映了生理形态变化（图3A，B）。在Pi缺陷条件下，TRL显着降低（图3B）。如图3A所示，分支区（BZPR）在Pi缺陷条件下显着衰减（图3B）。
在这些性状中，受影响最大的是TRL，因为两种Pi条件之间的LR数差异很大。在Pi充分条件（1.25 mM）下RSA的剧烈生长是由于1° LR的数量和长度显着增加。因此，RSA发生了快速变化，主要是由于LR发展的改变。我们测量了起源于主根分支区边界内的LR数量，因为它们被认为更有意义1，3，18。在Pi缺陷条件下，1° LR（每根厘米）的平均长度显着减少（图3C）。由于P0条件，平均2° LR长度同样减少;然而，它的数量低于平均1° LR长度（图3C）。与P1.25条件相比，在P0条件下，1° LR和2° LR的数量显着减少（图3D）。相对于P1.25条件，在P0条件下，1° LR密度（BZPR长度每厘米1° LR的数量）没有变化（图3E）。2° LR密度（1° LR的BZ每厘米2°LR的数量）也没有显着变化（图3E）。因此，确定LR的密度对于深入了解RSA塑性至关重要。
不同磷酸盐（Pi）条件下根毛发育分析
研究了Pi供应对幼苗主根系毛发育的影响。结果发现根毛长度随着Pi浓度的增加而增加至2.5 mM，但在5 mM和10 mM时减少。然而，在20 mM时，根毛长度恢复到接近峰值水平（补充图1）。与所有其他Pi耗材相比，0 mM的根毛数量显着增加，在20 mM时观察到的数量最多（补充图1）。
本方法在拟南芥以外的植物上的应用
我们研究了本方法在拟南芥以外的植物上的可行性，以紫花苜蓿（苜蓿）为试验植物。该方案已根据两个方面的要求进行了修改：（1）种子表面灭菌方法，以及（2）聚丙烯网的孔径（现在更大，1，000μm）。表面种子灭菌和分层方案始终需要根据要研究的所选植物进行优化。对于苜蓿，遵循了Weeks等人所描述的步骤19。表面灭菌后，将种子在4°C孵育7天进行分层。之后，我们遵循本协议中描述的相同程序，修改了网孔尺寸。如图4A，B所示，幼苗生长良好，在不同Pi供应下RSA改变。图4C显示了1.25、0和20 mMPi营养液下的根系可塑性。与Pi充分（1.25mM）条件（对照）相比，过量的Pi（20mM）和Pi供应不足导致根系的发育减少（图4C）。可以使用协议中描述的 ImageJ 软件针对不同的特征映射 RSA。因此，该方案简单，高效，并且可以根据所选的植物物种轻松修改。它提供了研究不同营养条件下不同植物物种的RSA的机会。
图 1：过程示意图。 示意图概述了用于映射 RSA 的方法协议中涉及的主要步骤。 请点击此处查看此图的大图。
图2：洋红色盒子中用于种植幼苗的水培设置显示。 （如Jain等人10所述，经过修改）。（A） 两个矩形件（4 cm x 8 cm），带有聚碳酸酯楔形凹口，用于组装装置。（B）聚碳酸酯楔块通过凹口相互组装成X形以支撑网面。（C） 250微米聚丙烯网片（6厘米x 6厘米）。（D） 洋红色箱中聚碳酸酯楔块组件的顶视图。（E） 在装满介质的洋红色盒中组装聚碳酸酯楔块上的聚丙烯网。（F）网状物上萌发的拟南芥幼苗的展示。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：使用这种表型方法在不同营养条件下（Pi 缺陷 [0 mM] 和充足 [1.25 mM]）下的典型 RSA 调节演示。 拟南芥（Col-0）幼苗在0.5x MS培养基中水培生长5天，然后经受Pi缺陷和充足的供应（分别为0和1.25mM）并生长7天，如图 2所示。（A）从聚丙烯网（500μm）中拉出单个幼苗，并在圆形艺术刷和水的帮助下铺在琼脂培养皿上。RSA性状数据包括（B）主根（PR）长度、总根长（TRL）、分枝区（BZ）、（C）平均（Av.）一阶侧根长度（1° LR长度）、平均（Av.）二阶侧根长度（2° LR长度）、（D）1° LR和2° LR的数量以及（E）1° LR和2° LR密度。值是 SE ±平均值;n = 21。这个数字是从舒克拉等人1修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图4：以苜蓿根系为例，展示了该方法对拟南芥以外的其他植物的适用性。 （A）洋红色框的侧视图，显示苜蓿幼苗的生长情况。（B）洋红色框的顶视图显示了芽在聚丙烯网（孔径为1，000μm）上的出现。（C）使用这种RSA表型方法在不同营养条件下（Pi缺乏[0 mM]，过量Pi[20 mM]和充足或对照[1.25 mM]）下紫花苜蓿调节的典型根系结构（RSA）。将苜蓿幼苗在0.5x MS培养基中水培生长5天，经受Pi缺陷，充足和过量供应（分别为0，1.25和20mM），并生长7天。在艺术刷和水的帮助下，从聚丙烯网（1，000μm）中取出单个幼苗并铺展在琼脂培养皿上，如C所示。请点击此处查看此图的大图。
补充图1：不同的过量Pi浓度调节根毛发育。 WT幼苗以水培方式生长，如协议中所述。（A）从主根尖端切开1-2厘米的部分，并用10%甘油安装在载玻片上，并记录从尖端5毫米的区域的根毛数和长度。提供了（B）根毛长度和（C）主根尖5毫米区域中根毛的数量的数据。值是 SE ±平均值;n = 10（B 和 C）。根据学生配对 t 检验，具有不同字母的条形差异显著 （p ≤ 0.05）。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
这项工作演示了使用简单的实验室设备绘制RSA的地图。使用这种方法，在精细水平上记录表型改变。这种策略的好处是芽部永远不会与培养基接触，因此小苗的表型是原始的。该方法涉及建立水培系统以按照协议中所述种植幼苗。然后，将每个幼苗完整取出并放置在充满琼脂的培养皿上。然后允许使用艺术刷手动涂抹根系，并拍摄照片以使用ImageJ软件1，10，11，12进行分析。
种子发芽需要种子表面灭菌以去除细菌、真菌和病毒。酒精 - 70%乙醇 - 用于对种子表面进行消毒。为了在不破坏种子的情况下对其进行消毒，需要仔细遵循酒精灭菌的处理时间。当酒精灭菌过度时，种子发芽减少。治疗时间因植物物种而异（例如，对于拟南芥，时间限制仅为3分钟1，10，11，12，20，而对于Medicago sativa，时间为5分钟19。为了便于顺利采摘RSA进行分析，重要的是限制每个目或洋红色盒子的种子数量，以防止根系在自身之间纠缠1，10，11，12。这可以通过每个网格使用较少数量的种子来实现。例如，每个网格使用四个种子可以帮助降低缠绕的风险，同时允许根系的稳健生长和发育。需要注意的是，每个网格的最佳种子数量取决于特定的植物物种和RSA分析的目标。例如，如果实验需要组织来满足进一步的下游加工要求，如RNA分离，在这种情况下，建议批量播种（拟南芥每目100粒种子）1，10，11，12。从网眼中采摘幼苗是一个微妙的过程，需要格外小心和关注1，10，11。重要的是缓慢、温和、小心地处理这项任务，以避免损坏娇嫩的幼苗。要从网状物中挑选幼苗，建议使用细镊子或镊子轻柔而牢固地抓住幼苗。应小心地将幼苗从网中取出，以免干扰根系或对幼苗造成任何损害。必须保持耐心，并花时间小心地从网状物上取下每个幼苗，以确保它们在此过程中不会损坏。这是一个循序渐进的过程，应该缓慢、温和、仔细地进行，以确保实验的成功。为了准确测量小苗的RSA，在培养皿上标记刻度以进行精确测量至关重要1，10，11。这可以通过使用永久性标记在已知距离（例如 1 厘米或 2 厘米）的培养皿上画一条线来完成。秤应沿培养皿边缘放置在可见位置。使用刷子，在涂抹 RSA 时也必须格外小心。主根应小心地放置在培养皿的中心，侧根应在主根的两侧展开。根系应部分浸没在水中，以利于扩散。要测量每个新的培养皿，每次都必须在 ImageJ 软件中设置刻度。
很少的修改可以提高RSA分析的效率，非侵入性和有效性1。其中一项改进是改变用于固定幼苗的聚丙烯网的孔径。可以调整网孔的孔径以适应正在研究的植物物种的特定需求，并优化根系的生长和发育1，10，11，12。例如，更大的网孔尺寸（500μm）有助于顺利采摘整个幼苗，而无需切割下胚轴，这是早期的做法10，11，12。此外，较大的孔径可能更适合较大的植物物种RSA，而较小的孔径可能更适合较小的植物物种。可以进行的另一种修改是将聚丙烯网包裹在铝箔中以防止其弯曲。这有助于保持网格的形状和完整性，使其适合用作平面基质。除了这些修改之外，还可以采用其他故障排除技术来解决 RSA 分析过程中可能出现的任何问题。例如，如果幼苗没有按预期生长或发育，则可能需要调整环境条件，例如温度、湿度和光照水平。如果根系纠缠在一起，如上所述，可能需要减少每个网格的种子数量。
RSA分析的主要优点之一是它允许在不需要琼脂的情况下研究植物根系。琼脂通常用作植物组织培养和种子萌发实验中的固化剂。然而，使用琼脂可能会引入元素污染，这可能会产生伪影并影响结果的准确性10。通过排除对琼脂的要求，RSA分析消除了琼脂衍生元素污染的风险和潜在的人为因素。这使得RSA分析成为研究植物根系的更可靠和准确的方法1，3，10，11，12。例如，Pi剥夺对侧根密度的影响一直是许多相互矛盾的报告的主题。据报道，当 Pi 低6，8 时，LR 密度增加。相比之下，在Pi缺陷条件下也发现侧根密度下降3，13，16。这些差异可能归因于基于琼脂的生长培养基系统，其中工人利用不同品牌的琼脂将具有不同程度Pi污染的培养基凝胶化10。同样，试图说明锌缺乏对RSA影响的实验可能无法充分利用基于琼脂的培养皿方法进行，因为基于琼脂的胶凝培养基还包括Zn污染11。因此，进行RSA分析可能不适合使用琼脂胶凝培养基研究营养缺乏症。其次，在琼脂胶凝培养基上生长的幼苗发育不如水培培养的幼苗快。第三，由于RSA通常嵌入在琼脂培养基中，因此无法正确显示许多根特征。第四，从介质中移除RSA通常会对RSA造成重大损害，并使其成为一种破坏性的采样技术。
Jain等人发表的先前的水培技术10使用250μm的聚丙烯网孔尺寸，其孔隙较窄，无法拉出完整的RSA。结果，在这种特殊情况下，我们不得不从下胚轴区域切割幼苗以分离RSA，将其变成破坏性采样方法10，11，12。现有的方法是即兴的，通过使用具有较大孔径（500μm）的聚丙烯网将其变成非破坏性的，该网可以完整地拉出整个拟南芥幼苗而不会对RSA1造成任何损坏。值得注意的是，我们始终可以根据幼苗的类型调整聚丙烯网的孔径。例如，图4说明了如何使用类似的方法来绘制不同植物的RSA，例如Medicago sativa（苜蓿）。我们选择了1毫米的聚丙烯孔径来适应Medicago根系。
该系统的一个缺点可能是根毛的发育，与琼脂平板系统相比，根毛在水培系统下通常不会蓬勃发展。主要原因是液体培养基而不是固体培养基中容易获得营养物质。即使我们使用相同的系统观察根毛（不健壮）的发展并获得结果（补充图1）。Pi的可用性强烈影响根毛的发育10，11。本文中，根毛长度最初增加至2.5 mM，然后下降。
总之，该系统的主要优点是：（1）它是一种简单而精确的方法，不需要任何复杂的高端设备;（2）该方法由于其水培性质，允许幼苗快速生长;（3）是一种非破坏性方法;（4） 手动扩展 RSA 允许正确显示每个特征，揭示隐藏的 RSA，为用户提供完全控制;（5）该方法采用免费提供的成像软件（即ImageJ），该软件也易于使用。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢美国农业部（拨款58-6406-1-017）支持这项研究。我们还要感谢位于美国肯塔基州鲍灵格林的西肯塔基大学温肯生物技术中心和印度勒克瑙CSIR中央药用和芳香植物研究所所长提供仪器设施和支持（CSIR CIMAP手稿通信编号CIMAP/PUB/2022/103）。SS感谢美国费城圣约瑟夫大学的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
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