Summary
Utilizamos herramientas de laboratorio simples para examinar la arquitectura del sistema radicular (RSA) de Arabidopsis y Medicago. Las plántulas se cultivan hidropónicamente sobre malla y se extienden usando un pincel artístico para revelar el RSA. Las imágenes se toman mediante escaneo o una cámara de alta resolución, luego se analizan con ImageJ para mapear rasgos.
Abstract
El conocimiento integral del desarrollo de la arquitectura del sistema radicular de las plantas (RSA) es fundamental para mejorar la eficiencia del uso de nutrientes y aumentar la tolerancia de los cultivadores de cultivos a los desafíos ambientales. Se presenta un protocolo experimental para configurar el sistema hidropónico, el crecimiento de las plántulas, la propagación de RSA y la obtención de imágenes. El enfoque utilizó un sistema hidropónico basado en caja magenta que contenía malla de polipropileno soportada por cuñas de policarbonato. Los ajustes experimentales se ejemplifican evaluando el RSA de las plántulas bajo un suministro variable de nutrientes (fosfato [Pi]). El sistema se estableció para examinar el RSA de Arabidopsis, pero es fácilmente adaptable para estudiar otras plantas como Medicago sativa (Alfalfa). Las plántulas de Arabidopsis thaliana (Col-0) se utilizan en esta investigación como ejemplo para comprender la planta RSA. Las semillas se esterilizan en la superficie mediante el tratamiento de etanol y lejía comercial diluida, y se mantienen a 4 °C para su estratificación. Las semillas se germinan y se cultivan en un medio líquido semi-MS sobre una malla de polipropileno soportada por cuñas de policarbonato. Las plántulas se cultivan en condiciones de crecimiento estándar durante el número deseado de días, se recogen suavemente de la malla y se sumergen en placas de agar que contienen agua. Cada sistema de raíces de las plántulas se extiende suavemente sobre la placa llena de agua con la ayuda de un pincel de arte redondo. Estas placas de Petri se fotografían o escanean a alta resolución para documentar los rasgos RSA. Los rasgos de la raíz, como la raíz primaria, las raíces laterales y la zona de ramificación, se miden utilizando el software ImageJ disponible gratuitamente. Este estudio proporciona técnicas para medir las características de las raíces de las plantas en entornos ambientales controlados. Discutimos cómo (1) cultivar las plántulas y recolectar y esparcir muestras de raíces, (2) obtener imágenes de muestras RSA extendidas, (3) capturar las imágenes y (4) usar software de análisis de imágenes para cuantificar los atributos de la raíz. La ventaja del método actual es la medición versátil, fácil y eficiente de los rasgos RSA.
Introduction
La arquitectura del sistema radicular (RSA), que es subterránea, es un órgano vital para el crecimiento y la productividad de las plantas 1,2,3. Después de la etapa embrionaria, las plantas experimentan sus cambios morfológicos más significativos. La forma en que crecen las raíces en el suelo afecta en gran medida el crecimiento de las partes de la planta sobre el suelo. El crecimiento de la raíz es el primer paso en la germinación. Es un rasgo informativo ya que responde de manera única a diferentes nutrientes disponibles 1,2,3,4. El RSA exhibe un alto grado de plasticidad del desarrollo, lo que significa que el ambiente siempre se utiliza para tomar decisiones sobre el desarrollo 2,5. Los cambios en el medio ambiente han dificultado la producción de cultivos en el escenario actual. De forma continua, el RSA incorpora señales ambientales en las opciones de desarrollo5. Como resultado, una comprensión profunda de los principios detrás del desarrollo de las raíces es esencial para aprender cómo las plantas responden a los ambientes cambiantes 2,5.
El RSA detecta concentraciones variables de nutrientes y produce alteraciones fenotípicas 4,6,7,8,9,10,11,12. Los estudios sugieren que la morfología de la raíz/RSA es altamente plástica en comparación con la morfología del brote 1,3. El mapeo de rasgos RSA es altamente efectivo para registrar el efecto de cambiar el ambiente del suelo circundante 1,11,12.
En general, las discrepancias en el efecto de diversas deficiencias de nutrientes en el fenotipo de la raíz han sido reportadas en muchos estudios anteriores 3,11,13,14,15. Por ejemplo, hay varios informes contrastantes sobre los cambios inducidos por la inanición de fosfato (Pi) en el número, la longitud y la densidad de las raíces laterales (LR). Se ha reportado un aumento en la densidad de LR bajo la condición deficiente Pi 6,8. En contraste, una disminución en la densidad de LR en condiciones deficientes de Pi también ha sido reportada por otros autores 3,13,16. Una de las causas prominentes de estas inconsistencias es el uso del medio gelificante propenso a la contaminación elemental, que el agar a menudo contiene10. Los investigadores suelen cultivar sus plantas experimentales en un sistema de placas a base de agar y registran los rasgos de la raíz. Numerosos rasgos de RSA están frecuentemente ocultos o arraigados dentro del material de agar y no pueden ser documentados. Los experimentos relacionados con la inducción de deficiencia de nutrientes, en los que los usuarios a menudo excluyen un componente totalmente del medio, no pueden realizarse en un medio gelificante propenso a la contaminación elemental11,14,15. Numerosos nutrientes están frecuentemente presentes en cantidades significativas en los medios de agar, incluyendo P, Zn, Fe, y muchos más11,14,15. Además, el crecimiento de RSA es más lento en medios basados en agar que en medios líquidos no basados en agar. Como resultado, es necesario establecer un enfoque alternativo no basado en agar para cuantificar y registrar cualitativamente el fenotipo de RSA. En consecuencia, se ha desarrollado el método actual, en el que las plántulas se crían en un sistema hidropónico basado en caja magenta sobre una malla de polipropileno soportada por cuñas de policarbonato 1,10,11.
Este estudio presenta una versión improvisada detallada del método anterior descrito por Jain et al.10. Esta estrategia se ha ajustado para las demandas actuales en la biología de las raíces de las plantas y también se puede utilizar para plantas como la alfalfa, que no sean plantas modelo. El protocolo es la forma principal de medir los cambios en RSA, y solo requiere un equipo simple. El presente protocolo ilustra cómo fenotipar varias características radiculares, como las raíces primarias y laterales en medio normal y modificado (Pi deficiente). Se proporcionan instrucciones paso a paso y otros consejos útiles extraídos de las experiencias del autor para ayudar a los investigadores a seguir las metodologías ofrecidas en este método. El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un método simple y eficaz para revelar todo el sistema radicular de las plantas, incluidas las LR de orden superior. Este método consiste en extender manualmente el sistema radicular con un pincel de arte de acuarela redonda, lo que permite un control preciso sobre la exposición de las raíces 1,10,11,12. No requiere equipos costosos ni software complicado. Este método ha mejorado la absorción de nutrientes y la tasa de crecimiento; Las plantas tienen una solución rica en nutrientes fácilmente absorbida por sus raíces. El presente método es adecuado para investigadores que desean mapear los rasgos del sistema radicular de una planta en detalle, particularmente durante el desarrollo temprano (10-15 días después de la germinación). Es adecuado para sistemas radiculares pequeños, plantas modelo como Arabidopsis y tabaco, y plantas no convencionales como Alfalfa hasta que su sistema radicular encaje en las cajas magenta.
Los pasos para el análisis fenotípico del desarrollo de RSA en Arabidopsis se describen en este protocolo de la siguiente manera: (1) el método de esterilización de la superficie de la semilla para plantas (Arabidopsis), (2) los pasos para configurar el sistema hidropónico, seguido de la siembra de semillas en un medio, (3) procedimiento para extraer las siembras completas y esparcirlas en la placa de Petri para el análisis de RSA, (4) cómo grabar las imágenes para RSA, y (5) calcular parámetros RSA importantes utilizando el software ImageJ.
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Protocol
Todo el protocolo se resume esquemáticamente en la Figura 1, mostrando todos los pasos esenciales involucrados en la revelación de la arquitectura del sistema raíz (RSA) de las plántulas. Los pasos del protocolo se detallan a continuación:
1. Esterilización de la superficie de la semilla de Arabidopsis
- Transfiera una pequeña cucharada (aproximadamente 100 semillas = aproximadamente 2,5 mg) de semillas a un tubo de microfuga y remoje durante 30 minutos en agua destilada a temperatura ambiente (RT). Todo este procedimiento se lleva a cabo en condiciones asépticas.
- Centrifugar brevemente el tubo de microfuga que contiene semillas a 500 x g durante 5 s, utilizando cualquier centrífuga de mesa en RT para dejar que las semillas se asienten.
- Decantar el agua, agregar 700 μL de etanol al 70% (v / v), vórtice durante unos segundos y girar. Repita el vórtice y el giro si es necesario, pero asegúrese de que el tiempo de tratamiento de etanol al 70% permanezca en 3 min.
- Después de 3 minutos, enjuague inmediatamente una vez con agua estéril. Mantenga el paso de lavado de etanol lo más oportuno posible, ya que la exposición prolongada al etanol disminuye la germinación.
- Tratar las semillas con lejía comercial diluida (4% v/v) con una gota de Tween-20 durante 7 min. Mezclar las semillas con una solución de lejía invirtiendo los tubos rápidamente 8-12 veces, seguido de una breve centrífuga (500 x g durante 5 s en RT). La espuma se ve aparecer en el tubo.
- Decantar el sobrenadante con una pipeta de 1 ml y enjuagar las semillas con al menos cinco lavados con agua estéril, siguiendo el mismo procedimiento de vórtice.
- Dejar las semillas esterilizadas en la superficie en agua e incubar durante 2-3 días a 4 °C para la estratificación10.
2. Establecimiento de un sistema hidropónico para la germinación de semillas
- Llene a la mitad una caja magenta estándar con agua destilada y esterilize en autoclave. Autoclave la lámina de policarbonato (color claro y textura lisa) y corte rectángulos de 4 cm x 8 cm, con un punto medio entallado más de la mitad del rectángulo para que dos rectángulos puedan encajarse para formar una forma de X10. Utilice esta configuración para sostener la malla de polipropileno (cuadrados de 6 cm x 6 cm de tamaño de poro de 250 μm, o dependiendo del requisito) cortada de hojas de 12x 24 pulgadas10.
NOTA: El polipropileno es altamente resistente a ácidos, álcalis y otros productos químicos; por lo tanto, se ha optado. El autoclave tiende a distorsionar la malla de polipropileno; Por lo tanto, se recomienda llevarlo por separado envuelto en papel de aluminio. Se recomiendan condiciones típicas de autoclave de 16 min, 121 °C, 15 psi o 775 mm Hg. - Agregue medios basales semi-MS estériles con vitaminas + 1.5% (p/v) de sacarosa, como lo describe Shukla et al.1, a cada caja para llegar al borde inferior de la malla de polipropileno en un flujo laminar. Todos los procedimientos se llevan a cabo en condiciones asépticas.
- Siembre las semillas esterilizadas en la superficie en la malla (tamaño de poro de 250 μm) hidropónicamente y déjelas crecer durante 3 días.
- Después de 3 días, transfiera las plántulas a una malla (tamaño de poro de 500 μm) y déjelas crecer durante 2 días.
- Después de 2 días (total de 5 días), transfiera las plántulas al medio de control (es decir, medios nutritivos modificados para la EM 1 que contengan 2.0 mM NH 4 NO 3, 1.9 mM KNO3, 0.15 mM MgSO 4·7H 2O,0.1 mM MnSO4· H 2 O, 3.0 μM ZnSO 4·7H 2 O, 0.1 μM CuSO 4·5H 2 O, 0.3 mM CaCl 2·2H 2 O, 5.0 μM KI, 0.1 μM CoCl 2·6H 2 O, 0.1 mM FeSO 4·7H 2 O, 0.1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O, 1.25 mM KH 2PO 4, 100 μM H 3 BO3, 1 μM Na 2 MoO4·2H2O, sacarosa al1,5%, MES 1,25 mM, pH 5,7 ajustado con 0,1 M MES [pH 6,1]) y al tratamiento con medios experimentales (por ejemplo, P- [0 mM]); KH2 PO 4 se reemplaza con 0.62 mM K2SO4 de la composición del medio de control como se mencionó anteriormente1. Para tratamientos de exceso de Pi, la concentración de KH 2 PO4 se incrementa en el medio MS modificado [2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mM]1) y deja que las semillas crezcan durante 7 días.
NOTA: Un tamaño de poro de malla más grande (500 μm) facilita la recolección suave de plántulas enteras sin ningún daño o necesidad de cortar en el hipocótilo. Las plántulas crecen en condiciones de crecimiento estándar (es decir, fotoperiodo de 16 h claro/8 h oscuro, 150 μmol·m-2·s-1 intensidad de luz, 60%-70% de humedad) a 23 °C.
3. Examen de RSA
- Preparar placas de agar (1,1%) para extender la raíz (tamaño de la placa de Petri: 150 mm x 15 mm).
- Agregue 10-20 ml de agua del grifo filtrada en autoclave a la placa de Petri, como se mencionó anteriormente. Saque suavemente las plántulas de la malla (500 μm) y sumérjalas en agua en las placas.
- Extienda suavemente la raíz de cada plántula en la placa llena de agua con la ayuda de un pincel de arte de acuarela redonda (tamaños: no. 14, 16, 18 y 20).
NOTA: Mientras se lleva a cabo la propagación del sistema radicular, primero obtenga la raíz primaria y extiéndala en línea recta, ya que sirve como eje. Luego, extienda los LR simétricamente a cada lado de la raíz primaria, siempre que sea posible. Después de eso, difunda el LR de segundo orden vinculado al LR de primer orden. Este proceso de difusión es una especie de arte; hazlo suavemente, lentamente, como un artista dibujando una imagen de la RSA. - Incline la placa ligeramente para eliminar el agua.
NOTA: En este punto, el procedimiento se puede pausar colocando estas placas extendidas a 4 °C. Más tarde, cuando se requiera procesamiento de imágenes, saque las placas y colóquelas en RT por un tiempo. Limpie el agua condensada y luego la imagen se puede procesar convenientemente.
4. Grabación de imágenes para RSA
- Escanee o fotografíe estas placas de Petri apropiadamente.
NOTA: Para obtener fotografías de alta calidad, se recomienda la resolución de 600 ppp para escanear, y se recomienda al menos una cámara de 12 megapíxeles para la fotografía. - Mida los rasgos de la arquitectura del sistema raíz utilizando el software ImageJ disponible gratuitamente (https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Para seguir rápidamente los pasos para medir la longitud de la raíz utilizando el software ImageJ, consulte el ejemplo "medición de la longitud del contorno del ADN"17.
NOTA: Estos pasos se siguen para medir las longitudes de raíz en las imágenes capturadas con un escáner o cámara de alta resolución.- Utilice una distancia de longitud determinada para establecer la escala. La distancia conocida de la barra de escala en la Figura 3 es de 2 cm. Seleccione la herramienta Línea recta en la barra de herramientas ImageJ (quinta herramienta desde la izquierda). Utilice la herramienta Línea recta para crear una selección de línea que delinee la barra de escala. Para terminar de esbozar, haga clic con el botón secundario, haga doble clic o haga clic en el cuadro al principio.
- Mida la longitud de la barra de escala conocida en píxeles mediante la barra de herramientas Analizar > medir . Anota la longitud del píxel.
- Para abrir el cuadro de diálogo Definir escala, haga clic en la ficha Definir escala de la ficha Analizar. En el campo Distancia en píxeles, introduzca la longitud de píxeles (como se indicó anteriormente). A continuación, en el campo Distancia conocida, introduzca el valor, como se muestra en la barra de escala (aquí, es de 20 mm). Establezca la unidad de longitud como mm. La relación píxel-aspecto es 1.0. Ahora, la escala se especifica por el número x de píxeles por milímetro. Para bloquear la escala de esta imagen en particular, haga clic en Aceptar.
- Cree una selección de línea que describa la longitud de la raíz con la herramienta Línea segmentada . Para terminar de esbozar, haga clic con el botón secundario, haga doble clic o haga clic en el cuadro al principio. Haga clic y arrastre los pequeños "controles" en blanco y negro a lo largo del contorno para ajustar la selección de línea según sea necesario.
- Utilice el comando Medir de la ficha Analizar de ImageJ para cuantificar la longitud de la raíz. Para transferir los datos medidos a una hoja de cálculo, haga clic con el botón derecho en la ventana Resultados , seleccione Copiar todo en el menú emergente, cambie a la hoja de cálculo y, a continuación, pegue los datos.
NOTA: Como se describió anteriormente, defina la escala utilizando la distancia conocida de la barra de escala en la opción ImageJ set scale. Esto da el número de píxeles por unidad de longitud. Se requiere ajustar la escala cada vez, cada vez que se analiza una nueva imagen.
- Medición y cálculo de rasgos RSA
- Mida la longitud de la raíz primaria entre la unión del hipocótilo hasta el extremo de la punta de la raíz.
- Mida la longitud LR de primer y segundo orden.
- Mida la zona de ramificación (BZ) de la raíz primaria. La zona de ramificación de la raíz primaria (BZPR) abarca desde el primer punto emergente LR hasta el último punto emergente LR.
- Registre el número de LR, que es el número de LR originados dentro de los límites delBZ PR.
- Medir la longitud media de los LR de primer orden y de orden superior. Obtener la longitud media de los LR de primer orden (1° LR) (centímetros por raíz) dividiendo la longitud total del 1° LR por el número total de 1° LR.
- Mida la longitud media de la LR de segundo orden. Calcule la longitud media de la LR de segundo orden (2° LR) dividiendo la longitud total de la LR de 2° por el número total de LR de 2°.
- Mida la densidad de 1° LR. Calcule la densidad de 1° LR (número de 1° LR por unidad de longitud de BZ PR) dividiendo el número de 1° LR por la longitud delBZ PR.
- Mida la densidad de 2° LR. Calcular la densidad de 2° LR dividiendo el número de 2° LR por la longitud de la BZ de 1° LR (número de 2° LR por unidad de longitud de la BZ de 1° raíces laterales).
- Mida la longitud total de la raíz (TRL). Este es el agregado de las longitudes de la raíz primaria, 1° LR y 2° LR (y más si está presente).
5. Medición del cabello de la raíz
NOTA: Aunque el sistema hidropónico no es bueno para promover el crecimiento y desarrollo del vello de la raíz, a pesar de ser tan robusto como lo es en medios de crecimiento sólidos, sigue siendo importante estudiarlo en el contexto actual. Siga los pasos a continuación para analizar el desarrollo del pelo de la raíz en una sección de 5 mm desde la punta de la raíz primaria de las plántulas.
- Corte una sección de 2 cm de la raíz primaria desde la punta de la raíz.
- Monte la sección de la raíz en un portaobjetos utilizando glicerol al 10% como medio de montaje.
- Coloque el portaobjetos bajo un microscopio estéreo.
- Utilice el portador axial para visualizar y capturar imágenes de los pelos de la raíz.
- Analice las imágenes para estudiar la estructura y las características de los pelos de la raíz utilizando el software ImageJ como se describió anteriormente.
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Representative Results
Los diferentes rasgos morfométricos de la arquitectura del sistema radicular (RSA) se miden utilizando herramientas de laboratorio simples, y los pasos se representan esquemáticamente en la Figura 1. Los detalles de la configuración hidropónica demuestran el potencial del protocolo en la medición del RSA (Figura 1 y Figura 2).
Dadas las diferencias observadas en los agentes gelificantes, se utilizó un sistema de cultivo hidropónico para realizar todos los estudios 3,10. Como prueba de concepto, este sistema hidropónico funciona bien, reflejando el fenotipo contrastante aparente en condiciones deficientes y suficientes de Pi (Figura 3). Las semillas de Arabidopsis se cultivaron hidropónicamente durante 5 días en un medio de media MS en una malla de polipropileno, como se ilustra en la Figura 2. Las plántulas se trasplantaron después de 5 días en condiciones deficientes y suficientes de Pi, y se dejaron crecer durante 7 días (Figura 3).
Demostración de rasgos RSA bajo suministro variado de nutrientes (Pi)
Hemos seguido un esquema establecido para analizar y registrar los rasgos del RSA3. Se analizaron diferentes rasgos de RSA bajo regímenes de Pi contrastantes en condiciones hidropónicas (Figura 3). El tratamiento deficiente en Pi (0 mM Pi) invocó un fenotipo radicular típicamente reportado que exhibía un RSA más corto, menos profundo y menos ramificado en comparación con la condición suficiente de Pi (Figura 3A). La longitud de la raíz primaria se atenuó significativamente bajo la condición deficiente de Pi (Figura 3A, B). La longitud de la raíz primaria, ganada rápidamente en presencia de Pi (1,25 mM), muestra la eficiencia del sistema hidropónico que refleja adecuadamente los cambios fisiomorfológicos (Figura 3A, B). El TRL disminuyó significativamente bajo la condición deficiente de Pi (Figura 3B). La zona de ramificación (BZPR), como se muestra en la Figura 3A, se atenuó significativamente en la condición de deficiencia de Pi (Figura 3B).
De estos rasgos, el más afectado fue el TRL, debido a la alta diferencia en el número de LR entre las dos condiciones Pi. El vigoroso crecimiento del RSA bajo la condición suficiente de Pi (1,25 mM) se debió a un aumento significativo en el número y la longitud de 1° LRs. Por lo tanto, se produjo un cambio rápido de RSA, principalmente debido a la alteración en el desarrollo de LR. Medimos el número de LR originados dentro del límite de la zona de ramificación de la raíz primaria, ya que se consideran más significativos 1,3,18. La longitud promedio del 1° LR (centímetro por raíz) se redujo significativamente en la condición deficiente de Pi (Figura 3C). La longitud promedio de 2° LR se redujo de manera similar, debido a la condición P0; sin embargo, fue menor en cantidad que la longitud promedio de 1° LR (Figura 3C). El número de LR de 1° y LR de 2° disminuyó considerablemente bajo la condición P0 en comparación con la condición P1.25 (Figura 3D). La densidad de 1° LR (número de 1° LR por centímetro de longitud BZPR) no se modificó bajo la condición P0 en relación con la condición P1.25 (Figura 3E). La densidad de 2° LR (número de 2° LRs por centímetro del BZ de 1° LRs) tampoco mostró cambios significativos (Figura 3E). Como resultado, determinar la densidad de LR es esencial para obtener información útil sobre la plasticidad RSA.
Análisis del desarrollo del vello radicular bajo diferentes regímenes de fosfato (Pi)
El efecto del suministro de Pi en el desarrollo del pelo de la raíz se estudió en la raíz primaria de las plántulas. Se encontró que la longitud del pelo de la raíz aumentó con el aumento de las concentraciones de Pi hasta 2,5 mM, pero disminuyó a 5 mM y 10 mM. Sin embargo, a 20 mM, la longitud del pelo de la raíz volvió a niveles cercanos al pico (Figura suplementaria 1). El número de pelos radiculares fue significativamente mayor a 0 mM en comparación con todos los demás suministros de Pi, con el número más alto observado a 20 mM (Figura suplementaria 1).
Aplicación del presente método en vegetales distintos de Arabidopsis
Hemos examinado la viabilidad del presente método en plantas distintas de Arabidopsis, tomando Medicago sativa (Alfalfa) como planta de prueba. El protocolo se ha modificado de acuerdo con el requisito de dos aspectos: (1) el método de esterilización de la superficie de la semilla, y (2) el tamaño de poro de la malla de polipropileno (ahora más grande, 1.000 μm). El protocolo de esterilización y estratificación de semillas superficiales siempre debe optimizarse dependiendo de las plantas seleccionadas a estudiar. Para la Alfalfa, se siguieron los pasos descritos por Weeks et al.19. Después de la esterilización superficial, las semillas se incubaron a 4 °C durante 7 días para su estratificación. Después de eso, seguimos el mismo procedimiento descrito en este protocolo con una modificación del tamaño de poro de la malla. Como se muestra en la Figura 4A, B, las plántulas estaban bien desarrolladas, con un RSA alterado bajo diferentes suministros de Pi. La Figura 4C muestra la plasticidad del sistema radicular bajo 1.25, 0 y 20 mM de solución nutritiva Pi. El exceso de Pi (20 mM) y el suministro deficiente de Pi condujeron a disminuir el desarrollo del sistema radicular, en comparación con la condición de Pi suficiente (1,25 mM) (control) (Figura 4C). El RSA se puede asignar para diferentes rasgos utilizando el software ImageJ descrito en el protocolo. Por lo tanto, el protocolo es simple, eficiente y se puede modificar fácilmente de acuerdo con las especies de plantas seleccionadas. Ofrece la oportunidad de estudiar el RSA de diversas especies de plantas bajo diferentes condiciones de nutrientes.
Figura 1: Esquema del procedimiento. El diagrama esquemático describe los pasos principales involucrados en el protocolo de método para mapear el RSA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visualización de la configuración hidropónica en cajas magenta para cultivar plántulas . (Según lo descrito por Jain et al.10, con modificaciones). (A) Dos piezas rectangulares (4 cm x 8 cm) con muescas de cuñas de policarbonato para ensamblar el montaje. (B) El ensamblaje de cuñas de policarbonato entre sí a través de una muesca que se convierte en una forma de X para soportar la superficie de la malla. (C) Una lámina de malla de polipropileno de 250 μm (6 cm x 6 cm). (D) Vista superior del conjunto de cuñas de policarbonato en la caja magenta. (E) Montaje de la malla de polipropileno en las cuñas de policarbonato en una caja magenta llena de medios. (F) Una exhibición de plántulas de Arabidopsis germinadas en la malla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Demostración de la modulación típica de RSA bajo condiciones de nutrientes variables (Pi deficiente [0 mM] y suficiente [1.25 mM]) utilizando este método de fenotipado. Las plántulas de Arabidopsis (Col-0) se cultivan hidropónicamente en medios 0.5x MS durante 5 días, y luego se someten a suministros deficientes y suficientes de Pi (0 y 1.25 mM, respectivamente) y se cultivan durante 7 días, como se muestra en la Figura 2. (A) Las plántulas individuales se extraen de la malla de polipropileno (500 μm) y se extienden sobre las placas de Petri de agar con la ayuda de un pincel de arte redondo y agua. Los datos de los rasgos RSA se presentan para (B) longitud de la raíz primaria (PR), longitud total de la raíz (TRL), zona de ramificación (BZ), (C) longitud de la raíz lateral de primer orden promedio (Av.), longitud de la raíz lateral promedio (Av.) de segundo orden (longitud de 2° LR), (D) número de 1° LR y 2° LR, y (E) densidad de 1° LR y 2° LR. Los valores son medias ± SE; n = 21. Esta figura ha sido modificada de Shukla et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Demostración del sistema radicular de Medicago sativa (Alfalfa) como ejemplo para mostrar la aplicabilidad de este método a otras plantas además de Arabidopsis. (A) Vista lateral de la caja magenta que muestra el crecimiento de las plántulas de alfalfa. (B) La vista superior de la caja magenta muestra la aparición del brote en la malla de polipropileno (tamaño de poro de 1.000 μm). (C) La arquitectura típica del sistema radicular (RSA) de la modulación de la alfalfa bajo condiciones variables de nutrientes (Pi deficiente [0 mM], exceso de Pi [20 mM] y suficiente o control [1.25 mM]) utilizando este método de fenotipado RSA. Las plántulas de alfalfa se cultivan hidropónicamente en medios 0.5x MS durante 5 días, se someten a suministros deficientes, suficientes y excesivos de Pi (0, 1.25 y 20 mM, respectivamente) y se cultivan durante 7 días. Las plántulas individuales se extraen de la malla de polipropileno (1.000 μm) y se extienden sobre las placas de Petri de agar, como se muestra en C, con la ayuda de un pincel de arte y agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Diferentes concentraciones excesivas de Pi modulan el desarrollo del pelo radicular. Las plántulas WT se cultivaron hidropónicamente, como se describe en el protocolo. (A) Se cortó una sección de 1-2 cm desde la punta de la raíz primaria y se montó en un portaobjetos con 10% de glicerol, y se documentó una región de 5 mm desde la punta para el número y la longitud del pelo de la raíz. Los datos se presentan para (B) la longitud del pelo de la raíz y (C) el número de pelos de la raíz en una región de 5 mm de la punta de la raíz primaria. Los valores son medias ± SE; n = 10 (B y C). Las barras con diferentes letras alfa difieren significativamente (p ≤ 0,05) según la prueba t pareada de Student. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este trabajo demostró el mapeo de RSA utilizando equipos de laboratorio simples. Usando este método, las alteraciones fenotípicas se registran a nivel refinado. El beneficio de esta estrategia es que la porción del brote nunca entra en contacto con los medios, por lo que el fenotipo de las plántulas es original. Este método implica la configuración de un sistema hidropónico para cultivar plántulas como se describe en el protocolo. Luego, cada plántula se saca intacta y se coloca en una placa de Petri llena de agar. Luego se permite que el sistema de raíces se extienda manualmente con un pincel artístico, y se toman fotografías para analizarlas con el software ImageJ 1,10,11,12.
La germinación de las semillas requiere la esterilización de la superficie de la semilla para eliminar bacterias, hongos y virus. El alcohol - 70% de etanol - se utiliza para esterilizar las superficies de las semillas. Para desinfectar las semillas sin destruirlas, el tiempo de tratamiento de la esterilización por alcohol debe seguirse cuidadosamente. La germinación de las semillas disminuye cuando la esterilización por alcohol es exagerada. Los tiempos de tratamiento varían con las diferentes especies de plantas (por ejemplo, para Arabidopsis, el límite de tiempo es de 3 min 1,10,11,12,20 solamente, mientras que para Medicago sativa, es de 5 min 19. Con el fin de facilitar la recolección suave del RSA para el análisis, es importante limitar el número de semillas por malla o caja magenta, para evitar el enredo del sistema radicular entre sí 1,10,11,12. Esto se puede lograr utilizando un número menor de semillas por malla. Por ejemplo, el uso de cuatro semillas por malla puede ayudar a reducir el riesgo de enredo al tiempo que permite un crecimiento y desarrollo robustos de los sistemas radiculares. Es importante tener en cuenta que el número óptimo de semillas por malla depende de la especie de planta específica y de los objetivos del análisis RSA. Por ejemplo, si un experimento requiere tejido para otros requisitos de procesamiento posterior, como el aislamiento de ARN, en este caso, se recomienda la siembra a granel (100 semillas por malla en el caso de Arabidopsis)1,10,11,12. La recolección de plántulas de la malla es un proceso delicado que requiere el máximo cuidado y atención 1,10,11. Es importante abordar esta tarea lentamente, con suavidad y cuidado para evitar dañar las delicadas plántulas. Para recoger las plántulas de la malla, se recomienda usar pinzas finas o pinzas para agarrar las plántulas con suavidad pero firmeza. Las plántulas deben levantarse cuidadosamente de la malla para evitar perturbar los sistemas radiculares o causar daños a las plántulas. Es esencial ser paciente y tomarse el tiempo para retirar cuidadosamente cada plántula de la malla para asegurarse de que no se dañen durante el proceso. Es un proceso gradual que debe llevarse a cabo lentamente, con suavidad y cuidado para garantizar el éxito del experimento. Para medir con precisión el RSA de las plántulas, es crucial marcar una escala en la placa de Petri para permitir una medición precisa 1,10,11. Esto se puede hacer usando un marcador permanente para dibujar una línea en la placa de Petri a una distancia conocida, como 1 cm o 2 cm. La escala debe colocarse a lo largo del borde de la placa de Petri en un lugar visible. Usando un cepillo, también es esencial tener el máximo cuidado al difundir el RSA. La raíz primaria debe colocarse cuidadosamente en el centro de la placa de Petri, y las raíces laterales deben extenderse a ambos lados de la raíz primaria. El sistema radicular debe sumergirse parcialmente en agua para facilitar la propagación. Para medir cada nueva placa de Petri, uno debe establecer la escala en el software ImageJ cada vez.
Se pueden emplear pocas modificaciones para mejorar la eficiencia, la no invasividad y la efectividad del análisis RSA1. Una de esas mejoras es alterar el tamaño de poro de la malla de polipropileno utilizada para sostener las plántulas. El tamaño de poro de la malla se puede ajustar para adaptarse a las necesidades específicas de las especies de plantas estudiadas y para optimizar el crecimiento y desarrollo de los sistemas radiculares 1,10,11,12. Por ejemplo, un tamaño de poro de malla más grande (500 μm) facilita la recolección suave de plántulas enteras sin cortar el hipocótilo, que antes se practicaba10,11,12. Además, un tamaño de poro más grande puede ser más adecuado para especies de plantas más grandes RSA, mientras que un tamaño de poro más pequeño puede ser más apropiado para especies de plantas más pequeñas. Otra modificación que se puede hacer es envolver la malla de polipropileno en papel de aluminio para evitar que se doble. Esto puede ayudar a mantener la forma y la integridad de la malla, por lo que es adecuada para servir como una matriz de piso plano. Además de estas modificaciones, se pueden emplear otras técnicas de solución de problemas para abordar cualquier problema que pueda surgir durante el análisis RSA. Por ejemplo, si las plántulas no están creciendo o desarrollándose como se esperaba, puede ser necesario ajustar las condiciones ambientales, como la temperatura, la humedad y los niveles de luz. Si los sistemas radiculares están entrelazados, puede ser necesario reducir el número de semillas por malla, como se mencionó anteriormente.
Una de las principales ventajas del análisis RSA es que permite estudiar los sistemas radiculares de las plantas sin necesidad de agar. El agar se usa comúnmente como agente solidificante en cultivos de tejidos vegetales y experimentos de germinación de semillas. Sin embargo, el uso de agar puede introducir contaminación elemental que potencialmente puede generar artefactos y afectar la precisión de los resultados10. Al excluir el requisito de agar, el análisis RSA elimina el riesgo de contaminación elemental derivada del agar y el potencial de artefactos. Esto hace que el análisis RSA sea un método más confiable y preciso para estudiar los sistemas radiculares de las plantas 1,3,10,11,12. Por ejemplo, los efectos de la privación de Pi en la densidad de la raíz lateral han sido objeto de una serie de informes contradictorios. Se ha informado que la densidad LR aumenta cuando Pi es baja 6,8. En contraste, también se ha encontrado una caída en la densidad radicular lateral en condiciones deficientes de Pi 3,13,16. Estas discrepancias pueden atribuirse al sistema de medios de crecimiento basado en agar, en el que los trabajadores utilizan diferentes marcas de agar para gelatinizar medios con diversos grados de contaminación por Pi10. Una vez más, los experimentos que buscan ilustrar el efecto de la deficiencia de Zn en RSA pueden no llevarse a cabo adecuadamente utilizando el método de placa de Petri a base de agar, porque el medio gelificante a base de agar también incluye contaminación por Zn11. Por lo tanto, la realización del análisis de RSA puede no ser apropiada para investigar la deficiencia de nutrientes utilizando el medio gelificante a base de agar. En segundo lugar, las plántulas cultivadas en medios gelificantes a base de agar no se desarrollan tan rápido como las cultivadas hidropónicamente. En tercer lugar, debido a que el RSA generalmente está incrustado en un medio de agar, numerosas características de raíz no se muestran correctamente. En cuarto lugar, la eliminación del RSA del medio a menudo causa daños sustanciales al RSA y lo convierte en una técnica de muestreo destructiva.
La técnica hidropónica anterior, publicada por Jain et al.10, utilizaba un tamaño de malla de polipropileno de 250 μm, que tenía poros más estrechos que no permitían extraer el RSA intacto. Como resultado, en ese caso particular, tuvimos que cortar las plántulas de la región hipocótilo para separar el RSA, convirtiéndolo en un método de muestreo destructivo10,11,12. El método existente se improvisa para convertirlo en no destructivo mediante el uso de una malla de polipropileno con un tamaño de poro más grande (500 μm) que permite extraer plántulas enteras de Arabidopsis intactas sin infligir ningún daño al RSA1. Vale la pena señalar que siempre podemos ajustar el tamaño de poro de la malla de polipropileno, dependiendo del tipo de plántula. Por ejemplo, la Figura 4 ilustra cómo se puede utilizar un enfoque similar para mapear el RSA de diferentes plantas, como Medicago sativa (Alfalfa). Hemos optado por el tamaño de poro de polipropileno de 1 mm para acomodar el sistema radicular de Medicago.
Una desventaja de este sistema podría ser el desarrollo de pelos radiculares, que a menudo no florecen bajo sistemas hidropónicos en comparación con los sistemas de placas de agar. La causa principal es la fácil disponibilidad de nutrientes en medios líquidos en lugar de en medios sólidos. A pesar de que observamos el desarrollo de pelos radiculares (no robustos) utilizando el mismo sistema y obtuvimos los resultados (Figura complementaria 1). La disponibilidad de Pi afecta fuertemente el desarrollo del cabello radicular10,11. Aquí, la longitud del cabello de la raíz aumentó inicialmente hasta 2.5 mM, y luego disminuyó.
En conjunto, las ventajas clave del sistema son: (1) es un método simple y preciso que no requiere ningún equipo sofisticado de alta gama; (2) el método permite un rápido crecimiento de las plántulas debido a su naturaleza hidropónica; (3) es un método no destructivo; (4) la difusión manual del RSA permite la visualización adecuada de cada rasgo, revelando el RSA oculto, ofreciendo un control total al usuario; y (5) el método emplea un software de imágenes disponible gratuitamente (es decir, ImageJ), que también es fácil de usar.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Reconocemos al Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (Subvención 58-6406-1-017) por apoyar esta investigación. También agradecemos al Centro de Biotecnología WKU, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, EE.UU., y al Director del Instituto Central de Plantas Medicinales y Aromáticas CSIR, Lucknow, India, por proporcionar las instalaciones y el apoyo del instrumento (comunicación manuscrita CSIR CIMAP NO. CIMAP/PUB/2022/103). SS reconoce el apoyo financiero de Saint Joseph's University, Filadelfia, EE.UU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
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