Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ייצור סרום מותנה אוטולוגי מותאם והערכת Ex Vivo של פוטנציאל הריפוי שלו באפיתל הקרנית

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64911
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 4,5, 2,6,7, 2,6
1Department of Education, Chang Gung Memorial Hospital Linkou, 2School of Medicine, Chang Gung University, 3Department of Chemical Engineering and Biotechnology, National Taipei University of Technology, 4Cell Therapy Center, Tri-Service General Hospital, 5Department of General Surgery, Bo-Ai Clinic, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital Linkou, 7Institute of Clinical Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לפשט את התהליך ולהפוך את הכנת סרום מותנה אוטולוגי (ACS) לפחות יקר. אין צורך במזרקים מיוחדים או בחרוזי זכוכית מצופים פני שטח. יתר על כן, ACS שונה (mACS) יש יתרונות תחרותיים על פני סרום אוטולוגי קונבנציונאלי ריפוי פצע הקרנית של העיניים murine ex vivo.

Abstract

טיפולים מקומיים שמקורם בדם אנושי היו ברכה לרופאים בעשורים האחרונים. סרום אוטולוגי (AS) ופלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) מועשרים בגורמי גדילה אפיתליאוטרופיים החיוניים לריפוי פצעים בקרנית. בניגוד ל-AS, PRP מבוסס על מערכת צנטריפוגות דיפרנציאלית, המניבה יותר גורמי גדילה שמקורם בטסיות. סרום אוטולוגי מותנה (ACS) לא רק משמר את הכנת AS ו- PRP, אלא גם מתמקד בתכונות מווסתות חיסון, החשובות במחלות דלקתיות.

היעדר פרוטוקולים סטנדרטיים ועלויות הכנה גבוהות הם מגבלות ליישום קליני של ACS. ניסוי וידאו זה מדגים הליך הפעלה סטנדרטי להכנת טיפות עיניים מסוג סרום מותנה אוטולוגי (mACS). ראשית, גליצרול נוסף למזרקי הפרין כמייצב תאי הדם במהלך דגירה היפוקסית. כדי להפעיל את תאי הדם, החלה דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דגימות הדם היו צנטריפוגות ב 3,500 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סינון הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר, טיפות העיניים mACS הוכנו במלואן.

ניסוי טנטטיבי של ההשפעה הטיפולית של mACS הראה כי עשויים להיות לו יתרונות תחרותיים על פני AS קונבנציונלי בריפוי פצע הקרנית בעיני עכבר ex vivo . ה- AS המשמש במחקר זה הוכן על פי מחקרים שפורסמו והפרקטיקה הקלינית בבית החולים שלנו. לכן, ניתן להעריך את היעילות של mACS על מחלות פני השטח של העין במחקר עתידי באמצעות מחקרים בבעלי חיים in vivo וניסויים קליניים.

Introduction

ההשפעות הטיפוליות של סרום אוטולוגי (AS) במחלות עיניים יבשות דווחו לראשונה בשנות השמונים על ידי פוקס ואחרים1. הוא האמין כי הן את תכונת סיכה ואת המרכיבים הביוכימיים epitheliotropic חיוני AS, מחקה דמעות טבעיות, לטובת התפשטות של תאי אפיתל הקרנית. במהלך העשורים האחרונים בוצעו מספר מחקרים על בסיס זה. מרכיבים טרופיים כוללים גורם גדילה אפידרמיס (EGF), ויטמין A, גורם גדילה טרנספורמטיבי β (TGF- β), וציטוקינים אחרים. באופן מעניין, הסרום עשיר ב-TGF-β ובוויטמין A, אשר מאמינים כי יש להם תפקיד מרכזי בהתפשטות האפידרמיס 2,3,4,5. בנוסף, כאשר מטפלים בחולים עם מחלות פני העין, מספר מחקרים הראו כמה יתרונות של טיפות עיניים AS בתוצאות המדווחות על ידי המטופלים, פרמטרים אובייקטיביים אחרים של עין יבשה 6,7, וממצאים מיקרוסקופיים כגון צפיפות תאים8. מחקרי מטא-אנליזה גילו כי עשויים להיות כמה יתרונות בשיפור תסמונות המטופל עם טיפול בטיפות עיניים AS, אך תוצאות ותצפיות ארוכות טווח עדיין חסרות 9,10.

שלא כמו AS, פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) נגזרת מהוספת נוגד קרישה במהלך ההכנה, עם צנטריפוגה דיפרנציאלית נוספת והפעלה כימית של טסיות הדם. בהשוואה ל- AS, כימיקלים וגורמי גדילה רבים, כגון TGF- β, גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF) ו- EGF, נמצאים ב- PRP. זה כבר מיושם גם על מחלות פני השטח של העין עם יתרונות קליניים בהקלה על סימפטומים11.

הקשר הצולב, בין פגמים אפיתליאליים לדלקת, הוא מורכב. יש לציין כי אימונופתופיזיולוגיה היא נושא חשוב נוסף במחלות פני העין. מאמינים כי ציטוקינים מעודדי דלקת, כגון IL-1β ו-IFN-γ, הם מתווכים מרכזיים במפל דלקתי12. כך נפתחים אפיקי טיפול חדשים המבוססים על הבנת מנגנון החיסון. אסטרטגיות לעצור את התהליך הדלקתי הזה, כולל ייצור אנטגוניסט קולטן אינטרלוקין-1 (IL-1Ra) וציטוקינים אנטי דלקתיים אחרים, עשויות גם לשחק תפקיד חשוב במחלות פני השטח של העין13,14,15.

מאז 1998, אורתוקין, סרום אוטולוגי מותנה מסחרי (ACS), נמצא בשימוש קליני בחולים אורתופדיים הסובלים מאוסטאוארתריטיס (OA), דלקת מפרקים שגרונית (RA) והפרעות בעמוד השדרה13. בהשוואה ל- AS ו- PRP, טיפול בחרוזי זכוכית מצופים כימית ודגירה היפוקסית להפעלת מונוציטים הם התכונות הספציפיות של ACS16. תיאורטית, ניתן להפריש יותר גורמים אנטי דלקתיים על-ידי הוספת עקה הישרדותית לתאים, וכתוצאה מכך ריכוז גבוה יותר של רכיבים חיוניים המווסתים את מערכת החיסון, כולל IL-1Ra. היתרונות הטיפוליים המשופרים של ACS ב- OA, בהשוואה ל- AS, דווחו גם הם17. מחלות פני השטח של העין חולקות רקע חיסוני דומה עם מחלות דלקתיות אורתופדיות במובנים מסוימים. לכן, בהתבסס על התוצאות המוצלחות של טיפול שמקורו בדם אנושי בתחום האורתופדי, ACS עשוי להיות בעל יתרונות על פני טיפולים קונבנציונליים בקליניקה על ידי תכונות אפיתליאוטרופיות ומווסתות חיסון. למרות ACS כבר בשימוש נרחב במחלות דלקתיות אורתופדיות, היישומים הקליניים שלה ברפואת עיניים עדיין צריך להיחקר, אשר עשוי להיות מעוכב על ידי העלות הגבוהה שלה, חוסר תמיכה ספרותית, וחוסר סטנדרטיזציה של תהליך ההכנה, וכתוצאה מכך ביצועים מגוונים.

במאמר וידאו זה, הודגמה שיטה חדשנית, חסכונית ונוחה ליצירת ACS שונה (mACS), או פלזמה עשירה בגורמי גדילה (PRGF), המייצרת פתרון טיפות עיניים עם ערך מעשי דומה ל- ACS ממוסחר. רעיונות המפתח של הוספת נוגדי קרישה והפעלת תאי הדם להפריש ציטוקינים אנטי דלקתיים על ידי דגירה בלחץ נשמרו, אך בניגוד לשיטות המושרות כימית, כגון אלה המבוססות על חרוזי זכוכית מצופים CrSO4 וערכות מסחריות, מצב הלחץ הקריטי נגרם פיזית על ידי דגירה היפוקסית בשיטה זו. יתר על כן, גליצרול נוסף כדי לספק יתרונות נוספים, כולל עלייה ביציבות הממברנה של תאי הדם, שמירה על לחץ נוזל חוץ תאי אוסמוטי תקין18, ומקור מתאים של חומרים מזינים בתנאים היפוקסיים המונעים עומס יתר על התאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות בתחילת פרק הפרוטוקול. כל הפרוטוקולים והנהלים בוצעו על פי הצהרת הלסינקי ונבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של הקרן הרפואית צ'אנג גונג. כל המתנדבים קיבלו מידע על אופי המחקר וחתמו על טופס הסכמה מדעת לפני הכללתם. החומרים המתכלים הדרושים לכל הליך הניסוי מוצגים באיור 1 ובאיור 2, כמו גם בטבלת החומרים.

1. הכנת החומרים הדרושים לייצור טיפות עיניים mACS

  1. הכינו 250 מ"ל של תמיסת גליצרול 10% והחזיקו ערכת עירוי 21 גרם כנפי פרפר, מזרק 3 מ"ל ללא המחט, ושישה צינורות vacutainer 10 מ"ל המכילים הפרין 158 יחידות USP מוכנות (איור 1).
  2. חבר את מחט איסוף הדם 21 גרם למזרק 3 מ"ל ומשוך 3 מ"ל של תמיסת גליצרול 10% לתוך המזרק המוכן.
    הערה: יש לעקר את כל החומרים לפני החדרת המחט.
  3. פזרו את תמיסת הגליצרול 10% לתוך צינורות הוואקוטאיינר ברצף, עם כ-0.5 מ"ל של תמיסת גליצרול 10% בכל אחד מהם (איור 3A).
    הערה: בגלל הלחץ השלילי במבחנה, המחט חייבת לצאת מיד לאחר שהיא נכנסת כדי להפיץ באופן שווה 3 מ"ל של תמיסת גליצרול לשש המבחנות.
  4. לעקר את העור של המטופל עם 75% אלכוהול צמר גפן סטרילי. לנקב את הווריד השטחי של הגפיים העליונות של המטופל עם מחט איסוף הדם 18 G. צייר 60-70 מ"ל של דם ורידי מן הווריד השטחי בסך הכל.

2. הכנה לטיפות עיניים mACS

  1. הזריקו ברצף 10 מ"ל של הדם הוורידי הנשאב לתוך כל אחד מששת צינורות ה-vacutainer (איור 3B).
    הערה: שלב זה מסתמך על הלחץ השלילי של הוואקום כדי למלא את הצינורות. כדי למנוע הפרעה לתאי הדם והמוליזה, אין להפעיל לחץ חיובי.
  2. הניחו את ששת צינורות הוואקוטיינר באינקובטור עם טמפרטורה קבועה של 37°C למשך 4 שעות (איור 3C).
    הערה: המצב ההיפוקסי נשמר ומיוצב על ידי הלחץ השלילי שנותר בצינור אטום שקיבל גליצרול.
  3. מוציאים את הצינורות מהאינקובטור לאחר 4 שעות וצנטריפוגות אותם ב-3,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. בשלב זה, הכינו את החומרים למיצוי mACS, כולל בקבוקי טיפות עיניים מעוקרים, מזרק 3 מ"ל עם המחט, מסנן 0.22 מיקרומטר, מחט 18 גרם וזוג כפפות סטריליות (איור 2).
    הערה: יש לנגב את שולחן הניתוחים עם 75% אלכוהול כדי להבטיח סביבה אספטית. הסופרנטנט, אחרי הצנטריפוגה, הוא כבר מוצר חצי מוגמר של mACS.
  5. הניחו את ששת הצינורות על מדף הצינור ופתחו את הפקקים לאחר צנטריפוגה מלאה (איור 3D).
    הערה: עקרות אינה נדרשת בשלב זה.
  6. שים כפפות סטריליות ולשלוף את mACS אחד אחד באמצעות מזרק 3 מ"ל עם מחט 18 גרם.
    הערה: היזהרו לא למשוך את שכבת תאי הדם התחתונה במהלך השלב הזה (איור 3E).
  7. משכו את המחט, חברו אותה למסנן של 0.22 מיקרומטר, וחברו את מחט איסוף הדם 23 G, 1.5 אינץ' עם מזרק 3 מ"ל המקורי לשקע למטה (איור 3F).
  8. דחפו את המחט בעדינות דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוקי טיפות העיניים הסטריליים המוכנים (איור 3G).
  9. חזרו על השלבים לעיל עד שכל ה-mACS יסונן ויאוחסן בבקבוקי טיפות עיניים (איור 3H).
  10. יש לאחסן את טיפות העיניים mACS בטמפרטורה של 4°C לשימוש מיידי; יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C לשימור לטווח ארוך.
    הערה: אין לשמור אותם במשך יותר משבועיים ב 4 ° C או במשך יותר מ 3 חודשים ב -20 ° C 9,19.

3. מודל ריפוי פצע Ex vivo של אפיתל הקרנית מורין

הערה: המודל הבא של בעלי חיים ex vivo התבסס על ניסיון קודם של Hung et al. על פציעות מכניות של אפיתל הקרנית20. את השלבים הבאים יש לבצע תחת המיקרוסקופ כדי ליצור פצע אפיתל קרנית מוגבל היטב ועקבי.

  1. מרדימים עכברי C57BL/6 עם איזופלורן 3%-4%. הכניסו פנימה את אגרוף ביופסיית העור מעל הקרנית המרכזית של מורין, והותירו עיגול רדוד על האפיתל כשולי פצע אחידים.
    הערה: היו עדינים כדי למנוע קרע בגלגל העין.
  2. יש להוריד את אפיתל הקרנית בתוך האזור המאושר עד לשכבת באומן, בעזרת מסיר טבעת חלודה בקרנית המצויד בבור בקוטר 0.5 מ"מ.
  3. כדי לבסס את מודל בעלי החיים ex vivo של פצע הקרנית מכני, לקצור את גלגל העין ולהכין את התרבות היטב.
    1. להרדים תחילה את העכברים; לאחר מכן, לחץ בעדינות על שולי המסלול העליונים והנחותים של העכברים, הכנס את קצה המלקחיים מעל חלל הרטרובולבר, והחוצה את גלגל העין והחזק אותו במלקחיים.
    2. חותכים את עצב הראייה ואת הרקמה הרכה periorbital עם מספריים הקרנית כדי לבודד את גלגל העין בצורה מושלמת.
    3. מכינים צלחת 96 בארות עם שעווה מומסת בתוכה. צור במהירות חור עגול באמצעות קצות המלקחיים ולאחר מכן המתן להתמצקות.
  4. הכינו את המדיה לבדיקה: 0.5% mACS, 0.5% AS להשוואה, מי מלח רגילים כבקרה שלילית, ותווך הנשר המותאם של דולבקו (DMEM).
    הערה: mACS מתקבל באמצעות הפרוטוקול שהוזכר לעיל.
  5. לתרבות ex vivo , הניחו את גלגל העין שנקטף על צלחת מוכנה בת 96 בארות. הוסף 200 μL של כל מדיום לתוך צלחת 96 בארות.
  6. הכניסו את צלחת התרבית בת 96 הקידוחים לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2. ודא כי מדיה תרבותית משתנה כל 24 שעות.
  7. כדי לאשר את אפקט ריפוי הפצע הרציף, עקוב אחר אזור פצע האפיתל מתחת למיקרוסקופ כל 8 שעות על ידי צביעת פלואורסצאין.
    1. ממיסים את הפלואורסצאין על נייר הפלואורסצאין במי מלח רגילים.
    2. זרקו את הצבע הפלואורסצאין על הקרנית המרכזית של המורין, ואז התבוננו ותיעדו אותו במיקרוסקופ. תוצאה אופיינית מוצגת באיור 4.
      הערה: טיפה אחת (כ-0.05 מ"ל) של צבע פלואורסצאין מספיקה לתצפית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 ואיור 2 מראים את החומרים הדרושים לניסוי, ואיור 3 מציג את השלבים הרציפים ואת תוצרי הביניים המוצלחים במהלך הכנת mACS. ראשית, 0.5 מ"ל של תמיסת גליצרול 10% נוספה לכל מבחנה סטרילית של 10 מ"ל (איור 3A). לאחר מכן, 60-70 מ"ל של דם ורידי התקבלו מהמטופל, ו-10 מ"ל דם הוזרקו לכל צינור (איור 3B). דמו של המטופל חייב להיות נתון לבדיקות מעבדה יסודיות וסדירות לפני ההכנה כדי להבטיח כי איכות הדם היא סטנדרטית. מוצר הדם הנפוץ ביותר באיכות נמוכה נובע מדיסליפידמיה, מה שגורם לשכבה עליונה עכורה של סרום לאחר צנטריפוגה שקשה להסיר; לא ניתן להמשיך בהכנה נוספת של טיפות עיניים (איור 5A).

לאחר מכן, המבחנה האטומה ממוקמת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך 4 שעות (איור 3C). לאחר הדגירה והצנטריפוגה, ניתן היה להפריד את הדגימה לשכבה עליונה המכילה את המוצר הראשוני של mACS ולשכבת תאי דם תחתונה (איור 3D). לאחר מכן נאסף נוזל השכבה העליונה. טכניקות אספטיות חיוניות בהמשך. מכיוון שהסרום הוא סביבת רבייה מזינה מאוד למיקרואורגניזמים, יש לחטא תחילה כל משטח שבא במגע עם המחט ב-75% אלכוהול, ולהשתמש בכפפות סטריליות במהלך התהליך. חשוב לציין שיש להימנע מהפרעה של תאי הדם מהשכבה התחתונה בעת הסרת הסופרנאטנט (איור 3E).

בשלב זה, צפוי כי supernatant הוא בהיר או צהוב חיוור. אולם אם רואים צבע אדום קל, ייתכן שהתרחשה המוליזה, וייתכן שההכנה לא מתאימה לשלבים הבאים (איור 5B). הסרום שנאסף יכול להיות צנטריפוגה שוב כדי להבטיח שהסופרנאטנט נקי מכדוריות דם אדומות. הסרום סונן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק טיפות עיניים סטרילי (איורים 3F,G). המוצר הסופי, טיפות עיניים mACS, נשמר בקירור או הוקפא בהקדם האפשרי, בהתאם למטרה (איור 3H). טיפות העיניים לא יכלו להיות מאוחסנות זמן רב מדי בגלל העושר שלהם בחומרים מזינים labile ואת חוסר חומרים משמרים.

במודל ריפוי פני השטח ex vivo , טיפת העיניים mACS הראתה תוצאה טובה יותר בריפוי פצעים בקרנית בהשוואה לטיפת העיניים AS. קצירת גלגלי העיניים של עכברי C57BL/6 נעשתה לאחר יצירת פצע קרנית קונצנטרי על ידי שחיקה פיזית מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, עיני העכברים שהוקרבו תורבתו בארבע מדיות שונות, כולל מי מלח רגילים טהורים, DMEM, 0.5% AS, ו-0.5% mACS.

מדיום AS המשמש כאן הוכן בהתבסס על ספרות21 והפרקטיקה הקלינית בבית החולים צ'אנג גונג ממוריאל לינקו. דם ורידי, 40 מ"ל בסך הכל, נשאב לתוך צינורות vacutainer של מתנדבים לאחר עיקור העור. לא נוסף נוגד קרישה לצינורות. הדם אוחסן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להבטיח קרישה מלאה ולאחר מכן צנטריפוגה ב 3,500 × גרם במשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, ה- AS הטהור תפס את השכבה העליונה של הצינורות, אשר דוללה על ידי BSS (תמיסת השקיה סטרילית) ל -0.5% במודל זה של בעלי חיים ex vivo .

פצעי הקרנית נצפו ברצף בשש נקודות זמן שונות, כלומר 0, 8, 16, 24, 32 ו-48 שעות. התוצאות הראשוניות הראו כי לאחר 16 שעות, פצעי הקרנית החלימו מהר יותר תחת טיפת עיניים mACS של 0.5% בהשוואה לקבוצות האחרות. לאחר 24 שעות, לקבוצות AS ו-DMEM של 0.5% היו השפעות טיפוליות דומות עם טיפת עיניים של 0.5% mACS. ריפוי פצעי הקרנית, קרוב להחלמה מלאה, נצפה לאחר 32 שעות, למעט קבוצת המלח הרגילה (איור 4).

Figure 1
איור 1: החומרים הדרושים להוספת תמיסת גליצרול 10% לתוך הצינורות . (A) ערכת עירוי 21 גרם כנפי פרפר. (B) 250 מ"ל של תמיסת גליצרול 10%. (C) שישה צינורות vacutainer 10 מ"ל המכילים הפרין 158 יחידות USP. (D) מזרק 3.0 מ"ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: החומרים למיצוי וסינון של הסופרנאטנט של דגימת הדם . (A) מסנן של 0.22 מיקרומטר. (B) בקבוק טיפת עיניים מעוקר 5 מ"ל. (C) זוג כפפות סטריליות. (D) מזרק 3 מ"ל עם מחט 23 גרם. (E) מזרק בנפח 20 מ"ל. (ו) 18 גרם מחטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: נהלים לצנטריפוגה בדם והכנה לייצור טיפות עיניים אוטולוגיות מותנות בסרום . (A) 0.5 מ"ל של תמיסת גליצרול 10% נוספו לכל מבחנה. (B) דגימת הדם שנאספה מהמטופל חולקה שווה בשווה לשש מבחנות (רק אחת מוצגת בתמונה). (C) מראה המבחנה לאחר שהונחה באינקובטור של 37°C למשך 4 שעות. (D) שכבות הסרום ותאי הדם לאחר הצנטריפוגה. (ה) השאריות לאחר שאיפת הסופרנטנט. יש להיזהר שלא לשאוף את שכבת תאי הדם התחתונה. (F) הסופרנאטנט נאסף במזרק 3 מ"ל ומתחתיו מוחדרים מסנן 0.22 מיקרומטר ומחט 23 גרם. (G) המחט נדחפת בעדינות לתוך בקבוק טיפות העיניים הסטרילי. (H) המוצר הסופי של טיפות העיניים ACS שעברו שינוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: שינויים רציפים של פצעים בקרנית (אזורים ירוקים בדמויות לאחר צביעת פלואורסצאין) בעיניים מורניות בארבע מדיות תרבית שונות לאורך זמן. לא נצפה הבדל משמעותי בקבוצת המלוחים, בעוד ריפוי פצעים (חיצים) לאורך זמן נצפה בקבוצות DMEM, 0.5% AS, ו 0.5% mACS. בקבוצת mACS של 0.5%, ריפוי הפצע (חיצים) היה שלם יותר באופן משמעותי לאחר 16 שעות מאשר אלה שטופלו ב- AS ו- DMEM. לאחר 24 שעות, קבוצות DMEM, 0.5% mACS ו-0.5% AS הראו השפעות ריפוי נוספות (חיצים), במיוחד בקבוצת mACS. התאוששות כמעט מוחלטת נצפתה לאחר 32 שעות עבור כל הקבוצות, למעט קבוצת מלוחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: דוגמאות למוצרי דם ירודים לאחר צנטריפוגה . (A) דיסליפידמיה. המוצרים הפגומים הנפוצים ביותר נובעים מהשמנת יתר או סוכרת, שכן הסרום העליון מכיל שומן גבוה וכולסטרול. (B) המוליזה. זהו גם מוצר תת-אופטימלי נפוץ. הסיבה העיקרית ניתן לייחס לשימוש מחטים קטנות משעמם לשאיבת דם או שימוש בכוח חיצוני לא מתאים בהזרקת מוצרי דם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, פרוטוקול להכנת mACS מתואר והיתרון של טיפות עיניים mACS בריפוי פצעים של מודלים של בעלי חיים מוצג עוד יותר. השינוי המכריע של פרוטוקול mACS זה הוא תוספת של כ -0.5 מ"ל של תמיסת גליצרול 10% בכל מבחנה, היוצרת תנאים היפוקסיים מתאימים במהלך הדגירה של 4 שעות ב -37 מעלות צלזיוס. הגדרה זו מספקת ל- AS מתח מתאים ותאים מעודדים להפריש את גורמי הגדילה הדרושים המסייעים לריפוי פצעים. מסנן 0.22 מיקרומטר יכול לעזור לחסל את החלבונים המקרומולקולריים, תאי הדם והזיהומים, ובכך להפוך את המוצר הסופי לטהור ופחות דביק.

הדם מודגר במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, ועוד צנטריפוגה וסינון מבוצעים. הקפדה קפדנית על סטריליות במהלך ההכנה והאחסון של המוצרים הסופיים בטמפרטורה נאותה היא גם קריטית. תכולת החומרים המזינים הגבוהה במוצרי הסרום הסופיים היא מדיום תרבית מצוין עבור החיידקים. לכן, אחסון לא נכון או זיהום במהלך ההכנה עלול לקלקל את טיפות העיניים. mACS מזוהם עלול לגרום למחלות כגון דלקת הלחמית או קרטיטיס זיהומית.

איכות הדם של המטופל חשובה גם היא; לכן, בדיקות מעבדה נדרשים לפני הכנת mACS כדי להבטיח את הבטיחות של מוצרי הדם. במהלך הציור ובעת הפעלת דגימות הדם של המטופל, המפעילים צריכים להיות מודעים להמוליזה. כל לחץ במהלך ההכנה יכול בקלות לגרום המוליזה; לכן, מזרק צריך להיות משוך ודחף לאט במהלך איסוף הדם. היפוקסיה צריכה להיות מבוקרת גם כדי להשיג ריכוזים גבוהים של גורמי גדילה וציטוקינים אנטי דלקתיים. בהתבסס על ניסיון ומחקרים שפורסמו בעבר22,23, היישום של דגירה היפוקסית 4 שעות הוא ההגדרה האולטימטיבית. גליצרול יכול לספק לחץ היפוקסי מתאים יותר לתא, בשל אפקט הייצוב ולחץ הנוזל החוץ תאי האוסמוטי הנכון שהוא יכול לספק18. עם זאת, הריכוז האופטימלי של גליצרול וכיצד הוא מתואם עם ריכוז הציטוקינים עדיין צריך להיבדק. בעתיד, מחקרים בבעלי חיים in vivo של ריפוי פצעים וניסוי בקרה אקראי בקנה מידה גדול יותר יהיו מוצדקים כדי לאשר את יעילותו.

עד כה, המחקר התמקד בעיקר ביישום מוצרי סרום למחלות פני העין באמצעות AS מסורתי וטיפות עיניים PRP מתפתחות 24,25,26,27. AS מסורתי ללא כל נוגד קרישה וללא שימוש בפילטר במהלך ההכנה הוא ענבר בצורתו הטהורה, אך לעתים קרובות גורם לחולים אי נוחות בשל ההדבקה שלו. כתוצאה מכך, AS מדולל (20%-50%) משמש בדרך כלל, אשר מוריד את הריכוזים של החומרים המזינים. PRP, לעומת זאת, הוא פחות דבק ומשמש בדרך כלל בצורתו הטהורה (100%). דוחות ספרות עדכניים מצביעים בעיקר על כך ש- PRP מספק השפעות אנטי דלקתיות וריפוי פצעים טובות יותר מאשר AS, בעיקר בשל תכולתו העשירה בציטוקינים אנטי דלקתיים, גורמי גדילה ויכולתו להחליש דלקת הנגרמת על ידי IL-1β16,26. ניסוי אקראי ומבוקר שנערך על ידי García-Conca et al. כבר מצא כי היישום של PRP במחלות עיניים יבשות חמורות או בינוניות מראה תוצאות משביעות רצון28. למרות ACS, כשיפור לעומת AS, דווח לעתים רחוקות במחלות דלקתיות וניווניות של פני העין, הוא נמצא בשימוש נרחב בטיפול בדלקת מפרקים ניוונית וריפוי פצעים באורתופדיה 29,30,31. ה-ACS הנפוץ ביותר יוצר ונרשם כפטנט כערכה מסחרית13,32. mACS תוכנן לאחר התאמת תהליך הכנת ACS כדי לשלב את נקודות החוזק של ACS ו- PRP. ניתן לייצר mACS בעלות חסכונית יותר מכיוון שאין צורך בריאגנטים מיוחדים, כגון חרוזי זכוכית מצופים CrSO4 או כל ערכות מוגנות בפטנט, הדרושות להכנת ACS ו- PRP.

מלבד הדאגה הכלכלית, טיפות העיניים mACS סיפקו גם תוצאות ראשוניות משביעות רצון בניסוי ex vivo , ועשויות להוות חלופה מהפכנית לטיפות העיניים PRP הנוכחיות והמתפתחות. יש לציין כי ACS הדגים תוצאות טובות יותר מרוב הטיפולים המבוססים במחלות מפרקים דלקתיות הן מבחינה איכותית והן מבחינה כמותית בשל יכולתו האנטי דלקתית ומנגנוני תיקון אנדוגניים משופרים17. למרות שאין עדויות בספרות להשפעות טיפוליות של ACS ברפואת עיניים עד כה, סביר להניח את הפוטנציאל ביישומו בחולים עם פגמים אפיתל בקרנית בשל המנגנון האנטי דלקתי שלו וההצלחה באורתופדיה33. רק AS הושווה עם mACS במחקר ex vivo שלנו; עם זאת, ניתן להשוות גם PRP ו- ACS המיוצרים באמצעות ערכות מסחריות. מחקר עתידי בניתוח רמות הציטוקינים האנטי דלקתיים וגורמי הגדילה בסרום ב-mACS יהיה שימושי באישור הדמיון שלו ל-ACS או PRP, ולעליונות פוטנציאלית שלו ל-AS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

המחברים מודים ל-Ya-Lan Chien ול-Chia-Ying Lee על הסיוע הטכני המצוין, ול-OnLine English Company על המהדורה הלשונית. מחקר זה מומן בחלקו על ידי פרויקט המחקר הרפואי צ'אנג גונג (מענק מס' CMRPG3L1491).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 96-well culture plate Merck KGaA, Germany CLS3997
Barraquer lid speculum katena K1-5355 15 mm
Barraquer needle holder Katena K6-3310 without lock 
Barron Vacuum Punch 8.0 mm katena K20-2108 for cutting filter paper
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units Becton,Dickinson and Company, US 367880 At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination
BD 21 G butterfly-winged infusion set Becton,Dickinson and Company, US 367281 For even distribution of glycerol solution
C57BL/6 mice  National Laboratory Animal Center RMRC11005 for mouse model
Castroviejo forceps 0.12 mm katena  K5-2500
Centrifuge Eppendorf, Germany 5811000428 3,500 x g for 10 min
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle Cheng Yi Chemical, Taiwan CP405141 Must be sterile and as the storage container for the final product
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX CHI-675 for debridement of the corneal epithelium
Dulbecco's modified minimal essential medium Merck KGaA, Germany D6429
Filter paper  Toyo Roshi Kaisha,Ltd. 1.11
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P OPTITECH OPTFL100 staining for corneal epithelial defect 
Incubator Firstek, Taiwan S300S 37 °C for 4 h
Kanam sterile gloves Kanam Latex Industries, India EN455 For aseptic operation
Merck 0.22 µm filter Merck KGaA, Germany PR05359 At least 2 filters for mACS filtration
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan 19496 To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells
Normal saline TAIWAN BIOTECH CO., LTD. 100-120-1101
Skin biopsy punch 2mm STIEFEL 22650
Stereomicroscope Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA SV11 microscope for surgery
Terumo 18 G needle Terumo, Taiwan SMACF0120-18BX 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation
Terumo 20.0 mL syringe Terumo, Taiwan MDSS20ES Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation.
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle Terumo, Taiwan MDSS03S2325 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles.
Westcott Tenotomy Scissors Medium katena K4-3004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
  2. Noble, B. A., et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).
  3. Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. Serum growth factor analysis in dry eye syndrome. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).
  4. Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis. Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).
  5. Tsubota, K., et al. Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren's syndrome. The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).
  6. Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome. Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).
  7. Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).
  8. Jirsova, K., et al. The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment. Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).
  9. Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for dry eye. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).
  10. Wang, L., et al. Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).
  11. Soni, N. G., Jeng, B. H. Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases. The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).
  12. Solomon, A., et al. anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).
  13. Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction. Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).
  14. Bielory, B. P., Shah, S. P., O'Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. Emerging therapeutics for ocular surface disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).
  15. Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
  16. Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α. Tissue and Cell. 73, 101646 (2021).
  17. Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects. Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).
  18. Gull, M., Pasek, M. A. The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life. Catalysts. 11 (1), 86 (2021).
  19. Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
  20. Hung, K. H., Yeh, L. K. Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (182), e63217 (2022).
  21. Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).
  22. Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114 (2010).
  23. Antebi, B., et al. Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265 (2018).
  24. Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects. BioMed Research International. 2022, 6600788 (2022).
  25. Diaz-Valle, D., et al. Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea. Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).
  26. Metheetrairut, C., et al. Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease. Scientific Reports. 12 (1), 8906 (2022).
  27. NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects. Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).
  28. Garcia-Conca, V., et al. Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma. Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).
  29. Gholian, S., et al. Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial. Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).
  30. Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review. Future Science OA. 8 (2), 776 (2022).
  31. Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review. Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).
  32. Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).
  33. Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study. Cureus. 14 (4), e24500 (2022).

Tags

רפואה גיליון 193 סרום מותנה אוטולוגי שונה פלזמה עשירה בטסיות סרום אוטולוגי מוצרים שמקורם בדם ריפוי פצעים הכנה
ייצור סרום מותנה אוטולוגי מותאם והערכת <em>Ex Vivo</em> של פוטנציאל הריפוי שלו באפיתל הקרנית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsiung, C., Liu, Y. T., Su, C. Y.,… More

Hsiung, C., Liu, Y. T., Su, C. Y., Hsiung, C. C., Hung, K. H., Yeh, L. K. Production of Modified Autologous Conditioned Serum and Ex Vivo Assessment of Its Healing Potential in Murine Corneal Epithelium. J. Vis. Exp. (193), e64911, doi:10.3791/64911 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter