Summary
Questo articolo descrive un protocollo per semplificare il processo e rendere meno costosa la preparazione del siero autologo condizionato (ACS). Non sono necessarie siringhe speciali o perle di vetro rivestite in superficie. Inoltre, l'ACS modificato (mACS) ha vantaggi competitivi rispetto al siero autologo convenzionale nella guarigione della ferita corneale degli occhi murini ex vivo.
Abstract
Le terapie topiche derivate dal sangue umano sono state un vantaggio per i medici negli ultimi decenni. Il siero autologo (AS) e il plasma ricco di piastrine (PRP) sono arricchiti in fattori di crescita epiteliotropici essenziali nella guarigione delle ferite corneali. A differenza dell'AS, il PRP si basa su un sistema di centrifugazione differenziale, producendo più fattori di crescita derivati dalle piastrine. Il siero autologo condizionato (ACS) non solo preserva la preparazione di AS e PRP, ma si concentra anche sulle proprietà immunomodulanti, che sono importanti nelle malattie infiammatorie.
La mancanza di protocolli standardizzati e gli elevati costi di preparazione sono limitazioni per l'applicazione clinica di ACS. Questo esperimento video dimostra una procedura operativa standard per la preparazione di colliri a siero autologo condizionato modificato (mACS). In primo luogo, il glicerolo è stato aggiunto nelle siringhe di eparina come stabilizzatore delle cellule del sangue durante l'incubazione ipossica. Per attivare le cellule del sangue, è stata avviata un'incubazione di 4 ore a 37 °C. Quindi, i campioni di sangue sono stati centrifugati a 3.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la filtrazione del surnatante attraverso un filtro da 0,22 μm, i colliri mACS sono stati completamente preparati.
Un tentativo di prova dell'effetto terapeutico del mACS ha dimostrato che può avere vantaggi competitivi rispetto alla SA convenzionale nella guarigione della ferita corneale negli occhi di topo ex vivo . L'AS utilizzato in questo studio è stato preparato in base agli studi pubblicati e alla pratica clinica nel nostro ospedale. Pertanto, l'efficacia del mACS sulle malattie della superficie oculare potrebbe essere valutata nella ricerca futura attraverso studi in vivo sugli animali e studi clinici.
Introduction
Gli effetti terapeutici del siero autologo (AS) nelle malattie dell'occhio secco sono stati segnalati per la prima volta nel 1980 da Fox et al.1. Si ritiene che sia la proprietà lubrificante che i componenti biochimici epiteliotropici essenziali nell'AS, imitando le lacrime naturali, favoriscano la proliferazione delle cellule epiteliali corneali. Negli ultimi decenni, diversi studi sono stati eseguiti su questa base. I componenti trofici includono il fattore di crescita epidermico (EGF), la vitamina A, il fattore di crescita trasformante β (TGF-β) e altre citochine. È interessante notare che il siero è ricco di TGF- β e vitamina A, che si ritiene svolgano un ruolo fondamentale nella proliferazione epidermica 2,3,4,5. Inoltre, nel trattamento di pazienti con malattie della superficie oculare, diversi studi hanno mostrato alcuni vantaggi del collirio AS negli esiti riferiti dai pazienti, altri parametri oggettivi dell'occhio secco 6,7 e risultati microscopici come la densità cellulare8. Gli studi di meta-analisi hanno rivelato che potrebbero esserci alcuni benefici nel migliorare le sindromi del paziente con il trattamento con collirio AS, ma mancano ancora risultati e osservazioni a lungo termine 9,10.
A differenza dell'AS, il plasma ricco di piastrine (PRP) deriva dall'aggiunta di un anticoagulante durante la preparazione, con ulteriore centrifugazione differenziale e attivazione chimica delle piastrine. Rispetto all'AS, numerose sostanze chimiche e fattori di crescita, come TGF-β, fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) ed EGF, sono presenti nel PRP. È stato anche applicato alle malattie della superficie oculare con benefici clinici nel sollievo dai sintomi11.
Il legame incrociato tra difetti epiteliali e infiammazione è complesso. In particolare, l'immunofisiopatologia è un altro problema importante nelle malattie della superficie oculare. Si ritiene che le citochine pro-infiammatorie, come IL-1β e IFN-γ, siano mediatori cardine nelle cascate infiammatorie12. Si aprono così nuove vie di trattamento basate sulla comprensione del meccanismo immunitario. Le strategie per fermare questo processo infiammatorio, compresa la produzione di antagonisti del recettore dell'interleuchina-1 (IL-1Ra) e altre citochine antinfiammatorie, possono anche svolgere un ruolo importante nelle malattie della superficie oculare13,14,15.
Dal 1998, Orthokine, un siero autologo condizionato commercializzato (ACS), è stato utilizzato clinicamente in pazienti ortopedici affetti da osteoartrite (OA), artrite reumatoide (RA) e disturbi spinali13. Rispetto a AS e PRP, il trattamento con perle di vetro rivestite chimicamente e l'incubazione ipossica per attivare i monociti sono le caratteristiche specifiche di ACS16. Teoricamente, più fattori anti-infiammatori possono essere secreti aggiungendo stress di sopravvivenza alle cellule, con conseguente maggiore concentrazione di componenti immunomodulanti essenziali, tra cui IL-1Ra. Sono stati riportati anche i migliori benefici terapeutici dell'ACS nell'OA, rispetto all'AS,17. Le malattie della superficie oculare condividono sfondi immunitari simili con le malattie infiammatorie ortopediche per alcuni aspetti. Pertanto, sulla base dei risultati positivi della terapia derivata dal sangue umano in campo ortopedico, l'ACS potrebbe avere vantaggi rispetto ai trattamenti convenzionali nella pratica clinica dalle proprietà epiteliotropiche e immunomodulanti. Sebbene l'ACS sia stato ampiamente utilizzato nelle malattie infiammatorie ortopediche, le sue applicazioni cliniche in oftalmologia devono ancora essere esplorate, il che può essere ostacolato dal suo costo elevato, dalla mancanza di supporto della letteratura e dalla mancanza di standardizzazione del processo di preparazione, con conseguente prestazioni diverse.
In questo articolo video, è stato dimostrato un metodo nuovo, economico e conveniente per generare l'ACS modificato (mACS), o plasma ricco di fattori di crescita (PRGF), producendo una soluzione colliria con un valore pratico comparabile agli ACS commercializzati. Le idee chiave di aggiungere anticoagulanti e innescare le cellule del sangue per secernere citochine antinfiammatorie mediante incubazione stressata sono state mantenute, ma a differenza dei metodi indotti chimicamente, come quelli basati su perle di vetro rivestite di CrSO4 e kit commerciali, lo stato di stress critico è fisicamente indotto dall'incubazione ipossica in questo metodo. Inoltre, il glicerolo è stato aggiunto per fornire ulteriori benefici, tra cui un aumento della stabilità della membrana delle cellule del sangue, il mantenimento di una corretta pressione del fluido extracellulare osmotico18 e un'appropriata fonte di nutrienti in condizioni ipossiche che evitano di sovraccaricare le cellule.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali all'inizio della sezione protocollo. Tutti i protocolli e le procedure sono stati eseguiti secondo la Dichiarazione di Helsinki e sono stati esaminati e approvati dal Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Tutti i volontari sono stati informati della natura di questo studio e hanno firmato un modulo di consenso informato prima della loro inclusione. I materiali di consumo richiesti per l'intera procedura sperimentale sono presentati in Figura 1 e Figura 2, nonché nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione dei materiali necessari per produrre colliri mACS
- Preparare 250 ml di soluzione di glicerolo al 10% e tenere a portata di mano un set per infusione con ali di farfalla da 21 G, una siringa da 3 ml senza ago e sei provette vacutainer da 10 mL contenenti eparina 158 unità USP pronte (Figura 1).
- Collegare l'ago per la raccolta del sangue da 21 G alla siringa da 3 ml e prelevare 3 ml di soluzione di glicerolo al 10% nella siringa preparata.
NOTA: Tutti i materiali devono essere sterilizzati prima dell'inserimento dell'ago. - Distribuire la soluzione di glicerolo al 10% nelle provette di vacutainer in sequenza, con circa 0,5 ml di soluzione di glicerolo al 10% in ciascuna (Figura 3A).
NOTA: A causa della pressione negativa nella provetta, l'ago deve uscire immediatamente dopo essere entrato per distribuire uniformemente 3 ml di soluzione di glicerolo alle sei provette. - Sterilizzare la pelle del paziente con tamponi di cotone sterili al 75% di alcol. Forare la vena superficiale degli arti superiori del paziente con l'ago per la raccolta del sangue da 18 G. Prelevare 60-70 ml di sangue venoso dalla vena superficiale in totale.
2. Preparazione per collirio mACS
- Iniettare sequenzialmente 10 ml di sangue venoso prelevato in ciascuna delle sei provette vacutainer (Figura 3B).
NOTA: Questo passaggio si basa sulla pressione negativa del vuoto per riempire i tubi. Per evitare la rottura delle cellule del sangue e l'emolisi, non applicare alcuna pressione positiva. - Collocare i sei tubi vacutainer nell'incubatore con una temperatura costante di 37 °C per 4 ore (figura 3C).
NOTA: Lo stato ipossico è mantenuto e stabilizzato dalla pressione negativa rimanente in un tubo sigillato che ha ricevuto glicerolo. - Rimuovere i tubi dall'incubatore dopo 4 ore e centrifugarli a 3.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
- A questo punto, preparare i materiali per l'estrazione di mACS, compresi i flaconi di collirio sterilizzati, una siringa da 3 ml con l'ago, un filtro da 0,22 μm, un ago da 18 G e un paio di guanti sterili (Figura 2).
NOTA: il tavolo operatorio deve essere pulito con alcool al 75% per garantire un ambiente asettico. Il surnatante, dopo centrifugazione, è già un semilavorato di mACS. - Posizionare i sei tubi sulla cremagliera e aprire i tappi dopo la centrifugazione completa (Figura 3D).
NOTA: la sterilità non è richiesta in questo passaggio. - Indossare guanti sterili ed estrarre il mACS uno per uno usando una siringa da 3 mL con un ago da 18 G.
NOTA: Fare attenzione a non disegnare lo strato inferiore di cellule del sangue durante questo passaggio (Figura 3E). - Estrarre l'ago, collegarlo al filtro da 0,22 μm e collegare l'ago per la raccolta del sangue da 23 G, 1,5 pollici con la siringa originale da 3 ml all'uscita sottostante (Figura 3F).
- Spingere delicatamente l'ago attraverso il filtro da 0,22 μm nei flaconi sterili di collirio preparati (Figura 3G).
- Ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutto il mACS è stato filtrato e conservato in flaconi di collirio (Figura 3H).
- Conservare il collirio mACS a 4 °C per un uso immediato; conservare a -20 °C per una conservazione a lungo termine.
NOTA: Non conservarli per più di 2 settimane a 4 °C o per più di 3 mesi a -20 °C 9,19.
3. Modello di guarigione ex vivo dell'epitelio corneale murino
NOTA: Il seguente modello animale ex vivo era basato sulla precedente esperienza di Hung et al. sulle lesioni meccaniche dell'epitelio corneale20. I seguenti passaggi devono essere eseguiti al microscopio per creare una ferita epiteliale corneale ben circoscritta e coerente.
- Anestetizzare i topi C57BL/6 con isoflurano al 3%-4%. Rientrare il pugno della biopsia cutanea sulla cornea centrale murina, lasciando un cerchio poco profondo sull'epitelio come margine uniforme della ferita.
NOTA: Sii delicato per evitare la rottura del bulbo oculare. - Debride l'epitelio corneale all'interno dell'area confermata fino allo strato di Bowman, con un dispositivo di rimozione dell'anello di ruggine corneale dotato di una bava di 0,5 mm.
- Per stabilire il modello animale ex vivo della ferita corneale meccanica, raccogliere il bulbo oculare e preparare bene la coltura.
- Eutanasia i topi prima; Quindi, premere delicatamente i bordi orbitali superiori e inferiori dei topi, introdurre la punta della pinza sullo spazio retrobulbare, e fuori il bulbo oculare e tenerlo per la pinza.
- Tagliare il nervo ottico e il tessuto molle periorbitale con le forbici corneali per isolare perfettamente il bulbo oculare.
- Preparare una piastra da 96 pozzetti con cera fusa al suo interno. Creare rapidamente un foro rotondo usando le punte delle pinze e quindi attendere la solidificazione.
- Preparare i mezzi da testare: 0,5% mACS, 0,5% AS per confronto, soluzione salina normale come controllo negativo e mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM).
NOTA: mACS si ottiene utilizzando il protocollo sopra menzionato. - Per la coltura ex vivo , posizionare il bulbo oculare raccolto sulla piastra da 96 pozzetti preparata. Aggiungere 200 μL di ciascun mezzo nella piastra a 96 pozzetti.
- Posizionare la piastra di coltura a 96 pozzetti nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2. Assicurarsi che i terreni di coltura vengano cambiati ogni 24 ore.
- Per confermare l'effetto sequenziale di guarigione della ferita, monitorare l'area epiteliale della ferita al microscopio ogni 8 ore mediante colorazione con fluoresceina.
- Sciogliere la fluoresceina sulla carta fluoresceina con soluzione salina normale.
- Lascia cadere il colorante alla fluoresceina sulla cornea centrale murina, quindi osservalo e documentalo al microscopio. Un risultato tipico è illustrato nella Figura 4.
NOTA: Una goccia (circa 0,05 ml) di colorante fluoresceina è sufficiente per l'osservazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 1 e la Figura 2 mostrano i materiali necessari per l'esperimento, mentre la Figura 3 mostra le fasi sequenziali e i prodotti intermedi di successo durante la preparazione del mACS. In primo luogo, 0,5 ml di soluzione di glicerolo al 10% sono stati aggiunti in ogni provetta sterile da 10 ml (Figura 3A). Quindi, 60-70 ml di sangue venoso sono stati ottenuti dal paziente e 10 ml di sangue sono stati iniettati in ciascuna provetta (Figura 3B). Il sangue del paziente deve essere sottoposto a esami di laboratorio approfonditi e regolari prima della preparazione per garantire che la qualità del sangue sia all'altezza. Il prodotto ematico di bassa qualità più comune è dovuto alla dislipidemia, che si traduce in uno strato superiore torbido di siero dopo la centrifugazione che è difficile da rimuovere; l'ulteriore preparazione del collirio non può essere continuata (Figura 5A).
Quindi, la provetta sigillata viene posta in un incubatore a 37 °C per 4 ore (figura 3C). Dopo l'incubazione e la centrifugazione, il campione potrebbe essere separato in uno strato superiore contenente il prodotto preliminare di mACS e uno strato inferiore di cellule del sangue (Figura 3D). Il fluido dello strato superiore è stato quindi raccolto. Le tecniche asettiche sono essenziali in seguito. Poiché il siero è un ambiente di riproduzione molto nutriente per i microrganismi, qualsiasi superficie che entra in contatto con l'ago deve essere prima disinfettata con alcol al 75% e durante il processo devono essere utilizzati guanti sterili. È importante sottolineare che il disturbo delle cellule del sangue dallo strato inferiore dovrebbe essere evitato quando si rimuove il surnatante (Figura 3E).
In questa fase, ci si aspetta che il surnatante sia chiaro o giallo pallido. Tuttavia, se si osserva un leggero colore rosso, potrebbe essersi verificata l'emolisi e la preparazione potrebbe non essere adatta per le fasi successive (Figura 5B). Il siero raccolto potrebbe essere nuovamente centrifugato per garantire che il surnatante sia privo di globuli rossi. Il siero è stato filtrato attraverso un filtro da 0,22 μm in un flacone sterile per collirio (Figure 3F,G). Il prodotto finale, collirio mACS, è stato quindi refrigerato o congelato il prima possibile, a seconda dello scopo (Figura 3H). I colliri non potevano essere conservati troppo a lungo a causa della loro ricchezza di nutrienti labili e della mancanza di conservanti.
Nel modello di guarigione superficiale ex vivo , il collirio mACS ha mostrato un risultato superiore nella guarigione delle ferite corneali rispetto al collirio AS. La raccolta dei bulbi oculari dei topi C57BL / 6 è stata effettuata dopo aver creato una ferita corneale concentrica mediante abrasione fisica al microscopio. Quindi, gli occhi dei topi sacrificati sono stati coltivati in quattro diversi media, tra cui soluzione salina normale pura, DMEM, 0,5% AS e 0,5% mACS.
Il mezzo AS utilizzato qui è stato preparato sulla base della letteratura21 e della pratica clinica nel Chang Gung Memorial Hospital Linkou. Il sangue venoso, 40 ml in totale, è stato aspirato in tubi vacutainer da volontari dopo la sterilizzazione della pelle. Nessun anticoagulante è stato aggiunto ai tubi. Il sangue è stato quindi conservato per 30 minuti a temperatura ambiente per garantire la completa coagulazione seguita da centrifugazione a 3.500 × g per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, l'AS puro occupava lo strato superiore dei tubi, che è stato diluito da BSS (soluzione irrigante sterile) allo 0,5% in questo modello animale ex vivo .
Le ferite corneali sono state osservate in sequenza in sei diversi punti temporali, vale a dire 0, 8, 16, 24, 32 e 48 ore. I risultati preliminari hanno mostrato che, a 16 ore, le ferite corneali guarivano più velocemente sotto il collirio mACS dello 0,5% rispetto agli altri gruppi. A 24 ore, i gruppi AS e DMEM allo 0,5% hanno avuto effetti terapeutici comparabili con il collirio mACS allo 0,5%. La guarigione delle ferite corneali, prossima al pieno recupero, è stata osservata a 32 ore, ad eccezione del normale gruppo salino (Figura 4).
Figura 1: Materiali necessari per aggiungere una soluzione di glicerolo al 10% nei tubi . (A) Set per infusione con ali di farfalla da 21 G. B) 250 ml di soluzione di glicerolo al 10%. (C) Sei provette vacutainer da 10 mL contenenti unità USP di eparina 158. (D) Siringa da 3,0 ml. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: I materiali per l'estrazione e la filtrazione del surnatante del campione di sangue . (A) Un filtro da 0,22 μm. (B) Un flacone di collirio sterilizzato da 5 ml. (C) Un paio di guanti sterili. (D) Una siringa da 3 mL con l'ago da 23 G. (E) Una siringa da 20 ml. (F) aghi da 18 G. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Procedure per la centrifugazione del sangue e preparazione per la produzione di colliri sierici autologhi modificati . (A) 0,5 ml di soluzione di glicerolo al 10% sono stati aggiunti in ciascuna provetta. (B) Il campione di sangue raccolto dal paziente è stato diviso equamente in sei provette (solo una mostrata nell'immagine). (C) Aspetto della provetta dopo essere stata collocata in un'incubatrice a 37 °C per 4 ore. (D) Gli strati di siero e di cellule del sangue dopo centrifugazione. E) Il residuo dopo l'aspirazione del surnatante. Si dovrebbe fare attenzione a non aspirare lo strato inferiore di cellule del sangue. (F) Il surnatante viene raccolto nella siringa da 3 mL e al di sotto di essa vengono inseriti un filtro da 0,22 μm e un ago da 23 G. (G) L'ago viene spinto delicatamente nel flacone sterile del collirio. H) Prodotto finale del collirio ACS modificato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Cambiamenti sequenziali delle ferite corneali (aree verdi nelle figure dopo la colorazione con fluoresceina) negli occhi murini in quattro diversi terreni di coltura nel tempo. Nessuna differenza significativa è stata osservata nel gruppo salino, mentre la guarigione delle ferite (frecce) nel tempo è stata osservata nei gruppi DMEM, 0,5% AS e 0,5% mACS. Nel gruppo mACS allo 0,5%, la guarigione della ferita (frecce) era significativamente più completa a 16 ore rispetto a quelli trattati con AS e DMEM. A 24 ore, i gruppi DMEM, 0,5% mACS e 0,5% AS hanno mostrato ulteriori effetti curativi (frecce), specialmente nel gruppo mACS. Il recupero quasi totale è stato osservato a 32 ore per tutti i gruppi, ad eccezione del gruppo salino. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Esempi di prodotti sanguigni poveri dopo centrifugazione . (A) Dislipidemia. I prodotti difettosi più comuni sono dovuti all'obesità o al diabete mellito, poiché il siero superiore contiene grassi e colesterolo elevati. b) Emolisi. Anche questo è un prodotto sub-ottimale comune. Il motivo principale può essere attribuito all'uso di aghi di piccolo calibro per il prelievo di sangue o all'uso di una forza esterna inappropriata nell'iniezione di prodotti sanguigni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questo studio, viene descritto un protocollo per la preparazione di mACS e viene ulteriormente dimostrato il beneficio del collirio mACS nella guarigione delle ferite dei modelli animali. La modifica cruciale di questo protocollo mACS è l'aggiunta di circa 0,5 ml di soluzione di glicerolo al 10% in ciascuna provetta, che crea condizioni ipossiche adeguate durante l'incubazione di 4 ore a 37 °C. Questa impostazione fornisce all'AS uno stress adeguato e sollecita le cellule a secernere i fattori di crescita necessari che aiutano la guarigione delle ferite. Il filtro da 0,22 μm può aiutare a eliminare le proteine macromolecolari, le cellule del sangue e le impurità, rendendo così il prodotto finale puro e meno adesivo.
Il sangue viene incubato per 4 ore a 37 °C e vengono eseguite ulteriori centrifugazioni e filtrazioni. Anche la massima attenzione alla sterilità durante la preparazione e la conservazione dei prodotti finali a una temperatura adeguata è fondamentale. L'alto contenuto di nutrienti nei prodotti sierici finali è un eccellente terreno di coltura per i batteri. Pertanto, la conservazione impropria o la contaminazione durante la preparazione possono rovinare il collirio. Il mACS contaminato può causare malattie come la congiuntivite o la cheratite infettiva.
Anche la qualità del sangue del paziente è importante; pertanto, sono necessari test di laboratorio prima della preparazione di mACS per garantire la sicurezza degli emoderivati. Durante il prelievo e durante l'utilizzo dei campioni di sangue del paziente, gli operatori devono essere consapevoli dell'emolisi. Qualsiasi pressione durante la preparazione può facilmente causare emolisi; Pertanto, la siringa deve essere tirata e spinta lentamente durante la raccolta del sangue. L'ipossia deve anche essere controllata per ottenere alte concentrazioni di fattori di crescita e citochine antinfiammatorie. Sulla base dell'esperienza e degli studi precedentemente pubblicati22,23, l'applicazione di un'incubazione ipossica di 4 ore è l'impostazione definitiva. Il glicerolo potrebbe fornire uno stress ipossico più adatto alla cellula, a causa dell'effetto di stabilizzazione e della corretta pressione del fluido extracellulare osmotico che può fornire18. Tuttavia, la concentrazione ottimale di glicerolo e il modo in cui è correlata con la concentrazione di citochine devono ancora essere controllati. In futuro, studi in vivo sugli animali sulla guarigione delle ferite e uno studio di controllo randomizzato su larga scala saranno garantiti per confermare la sua efficacia.
Finora, la ricerca si è concentrata principalmente sull'applicazione di prodotti sierici alle malattie della superficie oculare utilizzando AS tradizionale e l'emergente collirio PRP24,25,26,27. La SA tradizionale senza alcun anticoagulante e senza l'utilizzo di filtri durante la preparazione è ambra nella sua forma pura, ma spesso mette a disagio i pazienti a causa della sua adesività. Di conseguenza, viene solitamente utilizzato AS diluito (20% -50%), che riduce le concentrazioni dei nutrienti. Il PRP, tuttavia, è meno adesivo e di solito viene utilizzato nella sua forma pura (100%). Recenti rapporti di letteratura sottolineano per lo più che il PRP fornisce migliori effetti antinfiammatori e di guarigione delle ferite rispetto all'AS, principalmente grazie al suo ricco contenuto di citochine antinfiammatorie, fattori di crescita e alla sua capacità di attenuare l'infiammazione indotta daIL-1β 16,26. Uno studio randomizzato controllato condotto da García-Conca et al. ha già scoperto che l'applicazione del PRP nelle malattie dell'occhio secco iposecretorie gravi o moderate mostra risultati soddisfacenti28. Sebbene l'ACS, come miglioramento rispetto alla SA, sia stato raramente riportato nelle malattie infiammatorie e degenerative della superficie oculare, è stato ampiamente utilizzato nel trattamento dell'artrite degenerativa e della guarigione delle ferite in ortopedia 29,30,31. Il più comune ACS è stato prodotto e brevettato come kit commerciale13,32. mACS è stato progettato dopo aver regolato il processo di preparazione ACS per combinare i punti di forza di ACS e PRP. mACS può essere prodotto a un costo più economico perché non sono necessari reagenti speciali, come perle di vetro rivestite in CrSO4 o kit brevettati, necessari nella preparazione di ACS e PRP.
A parte la preoccupazione economica, il collirio mACS ha anche fornito risultati preliminari soddisfacenti in un esperimento ex vivo e potrebbe essere un'alternativa rivoluzionaria agli attuali colliri PRP emergenti. Da notare, ACS ha dimostrato risultati migliori rispetto alla maggior parte dei trattamenti consolidati nelle malattie infiammatorie articolari sia qualitativamente che quantitativamente a causa della sua capacità antinfiammatoria e dei migliori meccanismi di riparazione endogena17. Sebbene non vi siano prove in letteratura di effetti terapeutici dell'ACS in oftalmologia fino ad oggi, è ragionevole ipotizzare il potenziale nella sua applicazione a pazienti con difetti epiteliali corneali a causa del suo meccanismo antinfiammatorio e del successo in ortopedia33. Solo l'AS è stato confrontato con il mACS nel nostro studio ex vivo ; tuttavia, PRP e ACS prodotti tramite kit commerciali possono anche essere confrontati. La ricerca futura nell'analisi dei livelli sierici di citochine antinfiammatorie e fattori di crescita nella mACS sarebbe utile per confermare la sua somiglianza con ACS o PRP e la potenziale superiorità rispetto alla SA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tutti gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Ya-Lan Chien e Chia-Ying Lee per l'eccellente assistenza tecnica, e OnLine English company per l'edizione linguistica. Questo studio è stato finanziato in parte dal Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3L1491).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).
- Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. Serum growth factor analysis in dry eye syndrome. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).
- Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis. Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).
- Tsubota, K., et al. Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren's syndrome. The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).
- Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome. Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).
- Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).
- Jirsova, K., et al. The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment. Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).
- Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for dry eye. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).
- Wang, L., et al. Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).
- Soni, N. G., Jeng, B. H. Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases. The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).
- Solomon, A., et al. anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).
- Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction. Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).
- Bielory, B. P., Shah, S. P., O'Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. Emerging therapeutics for ocular surface disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).
- Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
- Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α. Tissue and Cell. 73, 101646 (2021).
- Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects. Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).
- Gull, M., Pasek, M. A. The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life. Catalysts. 11 (1), 86 (2021).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Hung, K. H., Yeh, L. K. Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (182), e63217 (2022).
- Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).
- Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114 (2010).
- Antebi, B., et al. Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265 (2018).
- Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects. BioMed Research International. 2022, 6600788 (2022).
- Diaz-Valle, D., et al. Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea. Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).
- Metheetrairut, C., et al. Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease. Scientific Reports. 12 (1), 8906 (2022).
- NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects. Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).
- Garcia-Conca, V., et al. Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma. Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).
- Gholian, S., et al. Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial. Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).
- Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review. Future Science OA. 8 (2), 776 (2022).
- Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review. Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).
- Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).
- Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study. Cureus. 14 (4), e24500 (2022).
