Summary
Denne artikkelen beskriver en protokoll for å forenkle prosessen og gjøre fremstillingen av autologt betinget serum (ACS) billigere. Ingen spesielle sprøyter eller overflatebelagte glassperler er nødvendig. Videre har den modifiserte ACS (mACS) konkurransefortrinn i forhold til konvensjonelt autologt serum i hornhinnen sårheling av murine øyne ex vivo.
Abstract
Humane blodavledede topiske terapier har vært en velsignelse for klinikere de siste tiårene. Autologt serum (AS) og blodplaterikt plasma (PRP) er beriket i epiteliotrope vekstfaktorer som er essensielle i sårtilheling av hornhinnen. I motsetning til AS er PRP basert på et differensialsentrifugeringssystem, noe som gir flere blodplateavledede vekstfaktorer. Autologt betinget serum (ACS) bevarer ikke bare preparatet av AS og PRP, men fokuserer også på immunmodulerende egenskaper, som er viktige i inflammatoriske sykdommer.
Mangelen på standardiserte protokoller og høye forberedelseskostnader er begrensninger for den kliniske anvendelsen av ACS. Dette videoeksperimentet demonstrerer en standard operasjonsprosedyre for fremstilling av modifiserte autologe betingede serum (mACS) øyedråper. Først ble glyserol tilsatt heparinsprøyter som blodcellestabilisator under hypoksisk inkubasjon. For å aktivere blodcellene ble det startet en 4 timers inkubasjon ved 37 °C. Deretter ble blodprøvene sentrifugert ved 3 500 × g i 10 min ved romtemperatur. Etter filtrering av supernatanten gjennom et 0,22 μm filter ble mACS øyedråper fullstendig forberedt.
En tentativ utprøving av den terapeutiske effekten av mACS viste at det kan ha konkurransefortrinn i forhold til konvensjonell AS i hornhinnen sårheling i ex vivo museøyne. AS brukt i denne studien er utarbeidet i henhold til publiserte studier og klinisk praksis ved vårt sykehus. Derfor kan effekten av mACS på øyeoverflatesykdommer evalueres i fremtidig forskning gjennom in vivo dyreforsøk og kliniske studier.
Introduction
De terapeutiske effektene av autologt serum (AS) i tørre øyesykdommer ble først rapportert på 1980-tallet av Fox et al.1. Det antas at både smøreegenskapen og de essensielle epiteliotrope biokjemiske komponentene i AS, som etterligner naturlige tårer, fordeler spredning av hornhinneepitelceller. I løpet av de siste tiårene har flere studier blitt utført på dette grunnlaget. Trofiske komponenter inkluderer epidermal vekstfaktor (EGF), vitamin A, transformerende vekstfaktor β (TGF-β) og andre cytokiner. Interessant nok er serumet rikt på TGF-β og vitamin A, som antas å spille en sentral rolle i epidermal proliferasjon 2,3,4,5. I tillegg, ved behandling av pasienter med okulære overflatesykdommer, har flere studier vist noen fordeler med AS øyedråper i pasientrapporterte utfall, andre objektive tørre øyeparametere 6,7 og mikroskopiske funn som celletetthet8. Meta-analysestudier viste at det kan være noen fordeler ved å forbedre pasientens syndromer med AS øyedråper behandling, men langsiktige resultater og observasjoner mangler fortsatt 9,10.
I motsetning til AS er blodplaterikt plasma (PRP) avledet fra tilsetning av et antikoagulant under preparatet, med ytterligere differensialsentrifugering og kjemisk aktivering av blodplatene. Sammenlignet med AS er mange kjemikalier og vekstfaktorer, som TGF- β, vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) og EGF, tilstede i PRP. Det har også blitt brukt på okulære overflatesykdommer med kliniske fordeler i symptomlindring11.
Tverrbindingen mellom epiteldefekter og inflammasjon er kompleks. Spesielt er immunpatofysiologi et annet viktig problem i okulære overflatesykdommer. Proinflammatoriske cytokiner, som IL-1β og IFN-γ, antas å være sentrale mediatorer i inflammatoriske kaskader12. Nye behandlingsveier åpnes dermed basert på forståelse av immunmekanismen. Strategier for å stoppe denne inflammatoriske prosessen, inkludert produksjon av interleukin-1-reseptorantagonist (IL-1Ra) og andre antiinflammatoriske cytokiner, kan også spille en viktig rolle i okulære overflatesykdommer13,14,15.
Siden 1998 har Orthokine, et kommersialisert autologt betinget serum (ACS), blitt brukt klinisk hos ortopediske pasienter som lider av slitasjegikt (OA), revmatoid artritt (RA) og rygglidelser13. Sammenlignet med AS og PRP er behandling med kjemisk belagte glassperler og hypoksisk inkubasjon for å aktivere monocytter de spesifikke egenskapene til ACS16. Teoretisk sett kan flere antiinflammatoriske faktorer utskilles ved å legge overlevelsesstress til cellene, noe som resulterer i en høyere konsentrasjon av essensielle immunmodulerende komponenter, inkludert IL-1Ra. De forbedrede terapeutiske fordelene med ACS i OA, sammenlignet med AS, har også blitt rapportert17. Okulære overflatesykdommer deler lignende immunbakgrunn med ortopediske inflammatoriske sykdommer i noen henseender. Derfor, basert på de vellykkede resultatene av human blodavledet terapi i det ortopediske feltet, kan ACS ha fordeler i forhold til konvensjonelle behandlinger i klinisk praksis ved epiteliotrope og immunmodulerende egenskaper. Selv om ACS har blitt mye brukt i ortopediske inflammatoriske sykdommer, må dets kliniske anvendelser i oftalmologi fortsatt utforskes, noe som kan hindres av høye kostnader, mangel på litteraturstøtte og mangel på standardisering av preparatprosessen, noe som resulterer i mangfoldig ytelse.
I denne videoartikkelen ble det vist en ny, kostnadseffektiv og praktisk metode for å generere modifisert ACS (mACS), eller plasma rik på vekstfaktorer (PRGF), som produserer en øyedråpeløsning med en sammenlignbar praktisk verdi for kommersialiserte ACS. Nøkkelideene om å tilsette antikoagulantia og utløse blodcellene til å utskille antiinflammatoriske cytokiner ved stresset inkubasjon ble beholdt, men i motsetning til de kjemisk induserte metodene, som de som er basert på CrSO 4-belagte glassperler og kommersielle sett, blir den kritiske stressstatusen fysisk indusert av hypoksisk inkubasjon i denne metoden. Videre ble glyserol tilsatt for å gi ekstra fordeler, inkludert en økning i stabiliteten til membranen i blodceller, vedlikehold av et riktig osmotisk ekstracellulært væsketrykk18 og en passende kilde til næringsstoffer under hypoksiske forhold som unngår overbelastning av cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer i begynnelsen av protokolldelen. Alle protokoller og prosedyrer ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonen og ble gjennomgått og godkjent av Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Alle frivillige ble informert om innholdet i denne studien og signerte et informert samtykkeskjema før de ble inkludert. Forbruksvarer som kreves for hele eksperimentell prosedyre er presentert i figur 1 og figur 2, samt i materialfortegnelsen.
1. Forberedelse av materialene som trengs for å produsere mACS øyedråper
- Klargjør 250 ml 10 % glyseroloppløsning og ha et 21 G sommerfuglvinget infusjonssett, en 3 ml sprøyte uten nål og seks 10 ml vakanserør inneholdende heparin 158 USP-enheter klare (figur 1).
- Koble 21 G blodoppsamlingsnålen til 3 ml sprøyten og trekk opp 3 ml 10 % glyseroloppløsning i den klargjorte sprøyten.
MERK: Alle materialer må steriliseres før nålen settes inn. - Fordel 10% glyseroloppløsningen i vakutainerrørene i rekkefølge, med ca. 0,5 ml 10% glyseroloppløsning i hver (figur 3A).
MERK: På grunn av det negative trykket i reagensrøret, må nålen komme ut umiddelbart etter at den går inn for jevnt å fordele 3 ml glyseroloppløsning til de seks reagensrørene. - Steriliser pasientens hud med 75% alkohol, sterile bomullspinner. Punkter overfladisk vene i pasientens øvre lemmer med 18 G blodoppsamlingsnål. Trekk 60-70 ml venøst blod fra overfladisk vene totalt.
2. Forberedelse for mACS øyedråper
- Injiser sekvensielt 10 ml av det opptrukne venøse blodet i hver av de seks vakansene (figur 3B).
MERK: Dette trinnet er avhengig av det negative trykket i vakuumet for å fylle rørene. For å unngå forstyrrelser i blodceller og hemolyse, må du ikke bruke noe positivt trykk. - Plasser de seks vakutainerrørene i inkubatoren med en konstant temperatur på 37 °C i 4 timer (figur 3C).
MERK: Den hypoksiske statusen opprettholdes og stabiliseres av det gjenværende negative trykket i et forseglet rør som mottok glyserol. - Fjern rørene fra inkubatoren etter 4 timer og sentrifuge dem ved 3.500 × g i 10 minutter ved romtemperatur.
- På dette tidspunktet klargjør du materialene for mACS-ekstraksjon, inkludert de steriliserte øyedråpeflaskene, en 3 ml sprøyte med nålen, et 0,22 μm filter, en 18 G nål og et par sterile hansker (figur 2).
MERK: Operasjonsbordet bør tørkes av med 75 % alkohol for å sikre et aseptisk miljø. Supernatanten, etter sentrifugering, er allerede et halvfabrikat av mACS. - Plasser de seks rørene på rørstativet og åpne lokkene etter fullstendig sentrifugering (figur 3D).
MERK: Sterilitet er ikke nødvendig i dette trinnet. - Ta på sterile hansker og trekk ut mACS én etter én ved hjelp av en 3 ml sprøyte med en 18 G kanyle.
MERK: Vær forsiktig så du ikke tegner det nedre blodcellelaget under dette trinnet (figur 3E). - Trekk kanylen ut, koble den til 0,22 μm filteret og koble 23 G, 1,5 i blodoppsamlingsnålen med den originale 3 ml sprøyten til utløpet nedenfor (figur 3F).
- Trykk nålen forsiktig gjennom 0,22 mikrom filteret og inn i de klargjorte sterile øyedråpeflaskene (figur 3G).
- Gjenta trinnene ovenfor til alle mACS er filtrert og lagret i øyedråpeflasker (figur 3H).
- Oppbevar mACS øyedråper ved 4 °C for umiddelbar bruk; oppbevares ved -20 °C for langtidskonservering.
MERK: Ikke oppbevar dem i mer enn 2 uker ved 4 °C eller i mer enn 3 måneder ved -20 °C 9,19.
3. Ex vivo sårhelingsmodell av murine hornhinneepitel
MERK: Følgende ex vivo dyremodell var basert på tidligere erfaring fra Hung et al. på mekaniske skader på hornhinneepitelet20. Følgende trinn bør utføres under mikroskopet for å skape et godt omskrevet og konsistent hornhinneepitelial sår.
- Bedøv C57BL/6-musene med 3%-4% isofluran. Rykk inn hudbiopsistansen over den murine sentrale hornhinnen, og etterlater en grunne sirkel på epitelet som en jevn sårmargin.
MERK: Vær forsiktig for å unngå øyebollbrudd. - Debrid hornhinneepitelet innenfor det bekreftede området ned til Bowmans lag, med en hornhinne rustringfjerner utstyrt med en 0,5 mm burr.
- For å etablere ex vivo dyremodellen av det mekaniske hornhinnen såret, høst øyebollet og forberede kulturen godt.
- Avlive musene først; Trykk deretter forsiktig på musens overlegne og nedre orbitalfelger, før spissen av tangen over retrobulbarrommet, og ut øyebollet og hold det ved tangen.
- Klipp optisk nerve og periorbitalt mykt vev med hornhinnen saks for å isolere øyebollet perfekt.
- Forbered en plate med 96 brønner med smeltet voks inni. Lag raskt et rundt hull ved hjelp av tangspissene, og vent deretter på størkning.
- Forbered mediet som skal testes: 0,5% mACS, 0,5% AS for sammenligning, normalt saltvann som negativ kontroll, og Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM).
MERK: mACS oppnås ved hjelp av protokollen nevnt ovenfor. - For ex vivo-kulturen , plasser det høstede øyeeplet på den forberedte 96-brønnplaten. Tilsett 200 μL av hvert medium i 96-brønnplaten.
- Plasser kulturplaten med 96 brønner i inkubatoren ved 37 °C med 5 % CO2. Sørg for at kulturmediene skiftes hver 24.
- For å bekrefte den sekvensielle sårhelingseffekten, må du overvåke epitelsårområdet under mikroskopet hver 8. time ved fluoresceinfarging.
- Løs fluoresceinet på fluoresceinpapiret med vanlig saltvann.
- Slipp fluoresceinfargestoffet på murine sentrale hornhinnen, observer og dokumenter det under et mikroskop. Et typisk resultat er vist i figur 4.
MERK: En dråpe (ca. 0,05 ml) fluoresceinfargestoff er nok til observasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 og figur 2 viser materialene som trengs for eksperimentet, og figur 3 viser sekvensielle trinn og vellykkede mellomprodukter under fremstilling av mACS. Først ble 0,5 ml 10 % glyseroloppløsning tilsatt i hvert 10 ml sterilt reagensrør (figur 3A). Deretter fikk pasienten 60-70 ml venøst blod, og injiserte 10 ml blod i hvert rør (figur 3B). Pasientens blod må underkastes grundige, regelmessige laboratorieundersøkelser før preparatet for å sikre at blodets kvalitet er opp til standard. Det vanligste blodproduktet av lav kvalitet skyldes dyslipidemi, noe som resulterer i et overskyet øvre lag av serum etter sentrifugering som er vanskelig å fjerne; Videre klargjøring av øyedråper kan ikke fortsettes (figur 5A).
Deretter plasseres det forseglede reagensrøret i en inkubator ved 37 °C i 4 timer (figur 3C). Etter inkubering og sentrifugering kunne prøven separeres i et øvre lag som inneholdt det foreløpige produktet av mACS og et nedre blodcellelag (figur 3D). Den øvre lagvæsken ble deretter samlet. Aseptiske teknikker er avgjørende heretter. Fordi serumet er et svært næringsrikt avlsmiljø for mikroorganismer, må alle overflater som kommer i kontakt med nålen desinfiseres med 75% alkohol først, og sterile hansker må brukes under prosessen. Det er viktig å merke seg at forstyrrelser i blodcellene fra det nedre laget bør unngås ved fjerning av supernatanten (figur 3E).
På dette trinnet forventes det at supernatanten er klar eller svakt gul. Imidlertid, hvis en liten rød farge sees, kan hemolyse ha oppstått, og preparatet kan ikke være egnet for de påfølgende trinnene (figur 5B). Det oppsamlede serumet kan sentrifugeres igjen for å sikre at supernatanten er fri for røde blodlegemer. Serumet ble filtrert gjennom et 0,22 μm filter til en steril øyedråpeflaske (figur 3F,G). Det endelige produktet, mACS øyedråper, ble deretter nedkjølt eller frosset så snart som mulig, avhengig av formålet (figur 3H). Øyedråpene kunne ikke lagres for lenge på grunn av deres rikdom i labile næringsstoffer og mangel på konserveringsmidler.
I ex vivo overflatehelingsmodellen viste mACS øyedråpe et overlegent utfall i hornhinnen sårheling sammenlignet med AS øyedråpe. Høsting av øyebollene til C57BL/6-mus ble gjort etter å ha skapt et konsentrisk hornhinnesår ved fysisk slitasje under mikroskopet. Deretter ble de ofrede musøynene dyrket i fire forskjellige medier, inkludert ren normal saltvann, DMEM, 0.5% AS og 0.5% mACS.
AS-mediet som ble brukt her ble utarbeidet basert på litteratur21 og klinisk praksis i Chang Gung Memorial Hospital Linkou. Venøst blod, totalt 40 ml, ble trukket inn i vakanserør fra frivillige etter hudsterilisering. Det ble ikke tilsatt antikoagulant til tubene. Blodet ble deretter lagret i 30 minutter ved romtemperatur for å sikre fullstendig koagulering etterfulgt av sentrifugering ved 3.500 × g i 10 minutter. Etter sentrifugering okkuperte den rene AS det øvre laget av rørene, som ble fortynnet av BSS (steril vanningsløsning) til 0,5% i denne ex vivo dyremodellen.
Hornhinnesår ble sekvensielt observert på seks forskjellige tidspunkter, nemlig 0, 8, 16, 24, 32 og 48 timer. De foreløpige resultatene viste at hornhinnenes sår ved 16 timer helbredet raskere under 0, 5% mACS øyedråpe enn de andre gruppene. Ved 24 timer hadde 0,5 % AS- og DMEM-gruppene sammenlignbare terapeutiske effekter med 0,5 % mACS øyedråper. Tilheling av hornhinnesårene, tilnærmet full restitusjon, ble observert ved 32 timer, med unntak av den normale saltvannsgruppen (figur 4).
Figur 1: Materialer som trengs for å tilsette 10% glyseroloppløsning i rørene . (A) 21 G butterfly-winged infusjonssett. (B) 250 ml 10% glyseroloppløsning. (C) Seks 10 ml vacutainerrør som inneholder heparin 158 USP-enheter. (D) 3,0 ml sprøyte. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Materialene for ekstraksjon og filtrering av supernatanten av blodprøven . (A) Et 0,22 μm filter. (B) En 5 ml sterilisert øyedråpeflaske. (C) Et par sterile hansker. (D) En 3 ml sprøyte med 23 G kanylen. (E) En sprøyte på 20 ml. (F) 18 G kanyler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Prosedyrer for blodsentrifugering og klargjøring for produksjon av modifiserte autologe betingede serumøyedråper . (A) 0,5 ml 10 % glyseroloppløsning ble tilsatt i hvert reagensrør. (B) Blodprøven som ble tatt fra pasienten ble delt likt i seks reagensrør (bare ett vist på bildet). (C) Utseende av reagensrøret etter å ha blitt plassert i en 37 ° C inkubator i 4 timer. (D) Serum- og blodcellelagene etter sentrifugering. (E) Resten etter aspirasjon av supernatanten. Man bør være forsiktig så man ikke aspirerer det nedre blodcellelaget. (F) Supernatanten samles opp i 3 ml sprøyten og et 0,22 μm filter og 23 G kanyle settes inn under den. (G) Nålen trykkes forsiktig inn i den sterile øyedråpeflasken. (H) Sluttprodukt av modifiserte ACS øyedråper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Sekvensielle forandringer av hornhinnesår (grønne områder i figurene etter fluoresceinfarging) i murine øyne i fire ulike kulturmedier over tid. Ingen signifikant forskjell ble observert i saltvannsgruppen, mens sårtilheling (piler) over tid ble observert i DMEM, 0,5 % AS og 0,5 % mACS-gruppene. I 0,5 % mACS-gruppen var sårhelingen (pilene) signifikant mer komplett ved 16 timer enn de som ble behandlet med AS og DMEM. Ved 24 timer viste DMEM, 0,5% mACS og 0,5% AS-gruppene ytterligere helbredende effekter (piler), spesielt i mACS-gruppen. Nesten total restitusjon ble observert ved 32 timer for alle grupper, bortsett fra saltvannsgruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempler på dårlige blodprodukter etter sentrifugering . (A) Dyslipidemi. De vanligste defekte produktene skyldes fedme eller diabetes mellitus, da øvre serum inneholder høyt fett og kolesterol. (B) Hemolyse. Dette er også et vanlig suboptimalt produkt. Hovedårsaken kan tilskrives bruk av små borenåler for blodtegning eller bruk av upassende ekstern kraft ved injeksjon av blodprodukter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien er en protokoll for fremstilling av mACS beskrevet og fordelen med mACS øyedråper i sårheling av dyremodeller er videre vist. Den avgjørende modifikasjonen av denne mACS-protokollen er tilsetningen av ca. 0,5 ml 10% glyseroloppløsning i hvert reagensrør, noe som skaper passende hypoksiske forhold under 4-timers inkubasjonen ved 37 °C. Denne innstillingen gir AS-et riktig stress og ber cellene om å utskille de nødvendige vekstfaktorene som hjelper sårheling. 0,22 μm filteret kan bidra til å eliminere makromolekylære proteiner, blodceller og urenheter, og dermed gjøre sluttproduktet rent og mindre klebende.
Blodet inkuberes i 4 timer ved 37 °C, og videre sentrifugering og filtrering utføres. Streng oppmerksomhet på sterilitet under forberedelse og lagring av sluttproduktene ved riktig temperatur er også avgjørende. Det høye næringsinnholdet i de endelige serumproduktene er et utmerket kulturmedium for bakteriene. Dermed kan feil lagring eller forurensning under forberedelsen ødelegge øyedråpene. Forurenset mACS kan forårsake sykdommer som konjunktivitt eller infeksiøs keratitt.
Kvaliteten på pasientens blod er også viktig; derfor er det nødvendig med laboratorietester før tilberedning av mACS for å sikre sikkerheten til blodprodukter. Under tegning og ved drift av pasientens blodprøver, bør operatørene være oppmerksomme på hemolyse. Eventuelt trykk under forberedelsen kan lett forårsake hemolyse; Derfor bør sprøyten trekkes og skyves sakte under blodoppsamling. Hypoksi bør også kontrolleres for å oppnå høye konsentrasjoner av vekstfaktorer og antiinflammatoriske cytokiner. Basert på erfaring og tidligere publiserte studier22,23, er anvendelsen av en 4 timers hypoksisk inkubasjon den ultimate innstillingen. Glyserol kan gi mer egnet hypoksisk stress til cellen, på grunn av stabiliseringseffekten og riktig osmotisk ekstracellulært væsketrykk det kan gi18. Imidlertid må den optimale konsentrasjonen av glyserol og hvordan den korrelerer med cytokinkonsentrasjonen fortsatt kontrolleres. I fremtiden vil in vivo dyrestudier av sårheling og en større randomisert kontrollstudie være berettiget for å bekrefte effekten.
Så langt har forskningen hovedsakelig fokusert på å bruke serumprodukter til okulære overflatesykdommer ved bruk av tradisjonell AS og de nye PRP-øyedråpene24,25,26,27. Tradisjonell AS uten antikoagulant og uten bruk av filter under tilberedning er rav i ren form, men gjør ofte pasientene ubehagelige på grunn av klebeevnen. Som et resultat brukes vanligvis fortynnet AS (20% -50%), noe som senker konsentrasjonen av næringsstoffene. PRP er imidlertid mindre lim og brukes vanligvis i ren form (100%). Nylige litteraturrapporter peker for det meste på at PRP gir bedre antiinflammatoriske og sårhelende effekter enn AS, hovedsakelig på grunn av dets rike innhold i antiinflammatoriske cytokiner, vekstfaktorer og dets evne til å dempe IL-1β-indusert betennelse16,26. En randomisert kontrollert studie utført av García-Conca et al. har allerede funnet at anvendelsen av PRP ved alvorlige eller moderate hyposekretoriske tørre øyesykdommer viser tilfredsstillende resultater28. Selv om ACS, som en forbedring i forhold til AS, sjelden har blitt rapportert i inflammatoriske og degenerative okulære overflatesykdommer, har den blitt mye brukt i behandlingen av degenerativ leddgikt og sårheling i ortopedi 29,30,31. Den vanligste ACS er produsert og patentert som et kommersielt sett13,32. mACS ble designet etter justering av prosessen med ACS-forberedelse for å kombinere styrken til både ACS og PRP. mACS kan produseres til en mer økonomisk kostnad fordi det ikke er behov for spesielle reagenser, for eksempel CrSO 4-belagte glassperler eller patenterte sett, som er nødvendige for fremstilling av både ACS og PRP.
Bortsett fra den økonomiske bekymringen, ga mACS øyedråper også tilfredsstillende foreløpige resultater i et ex vivo-eksperiment , og kan være et revolusjonerende alternativ til de nåværende, fremvoksende PRP-øyedråpene. Merk at ACS har vist bedre resultater enn de fleste etablerte behandlinger i inflammatoriske leddsykdommer både kvalitativt og kvantitativt på grunn av sin antiinflammatoriske evne og forbedrede endogene reparasjonsmekanismer17. Selv om det ikke foreligger litteraturbevis for terapeutiske effekter av ACS i oftalmologi til dags dato, er det rimelig å anta potensialet i anvendelsen på pasienter med hornhinneepiteldefekter på grunn av dets antiinflammatoriske mekanisme og suksessen i ortopedi33. Kun AS ble sammenlignet med mACS i vår ex vivo studie; Imidlertid kan PRP og ACS produsert via kommersielle sett også sammenlignes. Fremtidig forskning i å analysere serumnivåene av antiinflammatoriske cytokiner og vekstfaktorer i mACS vil være nyttig for å bekrefte dens likhet med ACS eller PRP, og potensiell overlegenhet til AS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ya-Lan Chien og Chia-Ying Lee for utmerket teknisk assistanse, og OnLine engelsk selskap for den språklige utgaven. Denne studien ble delvis finansiert av Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3L1491).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).
- Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. Serum growth factor analysis in dry eye syndrome. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).
- Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis. Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).
- Tsubota, K., et al. Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren's syndrome. The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).
- Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome. Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).
- Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).
- Jirsova, K., et al. The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment. Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).
- Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for dry eye. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).
- Wang, L., et al. Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).
- Soni, N. G., Jeng, B. H. Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases. The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).
- Solomon, A., et al. anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).
- Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction. Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).
- Bielory, B. P., Shah, S. P., O'Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. Emerging therapeutics for ocular surface disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).
- Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
- Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α. Tissue and Cell. 73, 101646 (2021).
- Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects. Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).
- Gull, M., Pasek, M. A. The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life. Catalysts. 11 (1), 86 (2021).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Hung, K. H., Yeh, L. K. Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (182), e63217 (2022).
- Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).
- Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114 (2010).
- Antebi, B., et al. Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265 (2018).
- Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects. BioMed Research International. 2022, 6600788 (2022).
- Diaz-Valle, D., et al. Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea. Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).
- Metheetrairut, C., et al. Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease. Scientific Reports. 12 (1), 8906 (2022).
- NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects. Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).
- Garcia-Conca, V., et al. Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma. Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).
- Gholian, S., et al. Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial. Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).
- Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review. Future Science OA. 8 (2), 776 (2022).
- Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review. Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).
- Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).
- Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study. Cureus. 14 (4), e24500 (2022).
