Summary
本文介绍了一种简化工艺并使自体条件反射血清（ACS）制备成本更低的方案。无需特殊的注射器或表面涂层玻璃珠。此外，改良的ACS（mACS）在鼠眼离体角膜伤口愈合方面比传统自 体血清具有竞争优势。
Abstract
近几十年来，人类血液来源的局部疗法一直是临床医生的福音。自体血清 （AS） 和富血小板血浆 （PRP） 富含对角膜伤口愈合至关重要的促上皮生长因子。与AS不同，PRP基于差异离心系统，产生更多的血小板衍生生长因子。自体条件血清（ACS）不仅保留了AS和PRP的制备，而且还专注于免疫调节特性，这在炎症性疾病中很重要。
缺乏标准化的方案和高昂的制备成本是ACS临床应用的局限性。该视频实验演示了制备改良自体条件血清（mACS）滴眼液的标准操作程序。首先，在缺氧孵育期间将甘油作为血细胞稳定剂加入肝素注射器中。为了激活血细胞，在37°C下开始孵育4小时。然后，将血液样品在室温下以3，500× g 离心10分钟。通过0.22μm过滤器过滤上清液后，充分制备mACS滴眼液。
对mACS治疗效果的初步试验表明，在离 体 小鼠眼睛的角膜伤口愈合方面，mACS可能比传统AS具有竞争优势。本研究中使用的AS是根据已发表的研究和我院的临床实践制备的。因此，mACS对眼表疾病的疗效可以在未来的研究中通过 体内 动物研究和临床试验来评估。
Introduction
自体血清（AS）对干眼症的治疗效果最早由Fox等人在1980年代报道1。据信，AS中的润滑性能和必需的上皮生化成分，模仿天然泪液，有利于角膜上皮细胞的增殖。在过去的几十年里，已经在此基础上进行了几项研究。营养成分包括表皮生长因子（EGF）、维生素A、转化生长因子β（TGF-β）和其它细胞因子。有趣的是，血清富含TGF-β和维生素A，它们被认为在表皮增殖中起着关键作用2，3，4，5。此外，在治疗眼表疾病患者时，多项研究表明AS滴眼液在患者报告的结果，其他客观干眼参数6，7和微观发现（如细胞密度8）中具有一些优势。荟萃分析研究表明，AS滴眼液治疗可能有一些改善患者综合征的益处，但长期结果和观察结果仍然缺乏9，10。
与AS不同，富血小板血浆（PRP）是通过在制备过程中添加抗凝剂，进一步差异离心和血小板化学活化而获得的。与AS相比，PRP中存在许多化学物质和生长因子，例如TGF-β，血管内皮生长因子（VEGF）和EGF。它也已被应用于眼表疾病，在缓解症状方面具有临床益处11。
上皮缺损和炎症之间的交联很复杂。值得注意的是，免疫病理生理学是眼表疾病的另一个重要问题。促炎细胞因子，如IL-1β和IFN-γ，被认为是炎症级联反应的关键介质12。因此，基于对免疫机制的理解，开辟了新的治疗途径。阻止这种炎症过程的策略，包括白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）和其他抗炎细胞因子的产生，也可能在眼表疾病中发挥重要作用13，14，15。
自 1998 年以来，Orthokine 是一种商业化的自体条件血清 （ACS），已在临床上用于患有骨关节炎 （OA）、类风湿性关节炎 （RA） 和脊柱疾病的骨科患者13。与AS和PRP相比，ACS16的特点是用化学涂层玻璃珠处理和缺氧孵育以激活单核细胞。从理论上讲，通过向细胞增加生存压力可以分泌更多的抗炎因子，导致更高浓度的必需免疫调节成分，包括IL-1Ra。据报道，与AS相比，ACS在OA中的治疗益处有所改善17。在某些方面，眼表疾病与骨科炎症性疾病具有相似的免疫背景。因此，基于人血源性治疗在骨科领域的成功结果，ACS在临床上皮细胞增效性和免疫调节特性方面可能优于常规治疗。虽然ACS已广泛应用于骨科炎症性疾病，但其在眼科的临床应用仍有待探索，可能因其成本高、缺乏文献支持、制备工艺缺乏规范等原因而受到阻碍，导致性能参差不齐。
在本视频文章中，展示了一种新颖、经济高效且方便的方法来生成修饰的 ACS （mACS） 或富含生长因子的血浆 （PRGF），从而生产出与商业化 ACS 具有相当实用价值的滴眼液。保留了添加抗凝剂和通过应激孵育触发血细胞分泌抗炎细胞因子的关键思想，但与化学诱导的方法（例如基于CrSO4涂层玻璃珠和商用试剂盒的方法）不同，该方法的临界应激状态是由缺氧孵育物理诱导的。此外，添加甘油以提供额外的益处，包括增加血细胞膜的稳定性，维持适当的渗透细胞外液压力18，以及在缺氧条件下避免细胞过度压力的适当营养来源。
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Protocol
该研究是根据协议部分开头的机构指南进行的。所有协议和程序均根据《赫尔辛基宣言》进行，并由长庚医学基金会机构审查委员会审查和批准。所有志愿者都被告知这项研究的性质，并在纳入之前签署了一份知情同意书。整个实验过程所需的耗材如图 1 和 图2以及 材料表所示。
1. 制备生产mACS滴眼液所需的材料
- 准备 250 mL 的 10% 甘油溶液，并准备好 21 G 蝶翼输液器、没有针头的 3 mL 注射器和六个含有肝素 158 USP 单位的 10 mL 真空管（图 1）。
- 将21 G采血针头连接到3 mL注射器，并将3 mL 10%甘油溶液撤回到制备的注射器中。
注意：在插入针头之前，必须对所有材料进行消毒。 - 将 10% 甘油溶液按顺序分配到真空管中，每个溶液中含有约 0.5 mL 的 10% 甘油溶液（图 3A）。
注意：由于试管中的负压，针头在进入后必须立即取出，以将3 mL甘油溶液均匀分布到六个试管中。 - 用75%酒精无菌棉签对患者的皮肤进行消毒。用18G采血针刺穿患者上肢的浅静脉。总共从浅静脉抽取 60-70 mL 静脉血。
2. mACS滴眼液的准备
- 依次将 10 mL 抽取的静脉血注入六个真空管中的每一个（图 3B）。
注意：此步骤依靠真空的负压来填充管子。为避免血细胞破碎和溶血，请勿施加任何正压。 - 将六个真空管置于恒温为37°C的培养箱中4小时（图3C）。
注意：缺氧状态通过接受甘油的密封管中的剩余负压来维持和稳定。 - 4小时后从培养箱中取出试管，并在室温下以3，500× g 离心10分钟。
- 此时，准备用于mACS提取的材料，包括灭菌的滴眼液瓶，带针头的3 mL注射器，0.22 μm过滤器，18 G针头和一副无菌手套（图2）。
注意：手术台应用75%的酒精擦拭，以确保无菌环境。离心后的上清液已经是mACS的半成品。 - 将六个试管放在试管架上，并在完全离心后打开盖子（图3D）。
注意：此步骤不需要无菌。 - 戴上无菌手套，使用带有 18 G 针头的 3 mL 注射器逐个拉出 mACS。
注意：在此步骤中注意不要绘制下层血细胞层（图3E）。 - 拉出针头，将其连接到0.22μm过滤器，然后将23 G，1.5 in采血针头与原始的3 mL注射器连接到下面的出口（图3F）。
- 将针头轻轻地通过0.22μm过滤器推入准备好的无菌滴眼液瓶中（图3G）。
- 重复上述步骤，直到所有mACS都被过滤并储存在眼药水瓶中（图3H）。
- 将mACS滴眼液储存在4°C下立即使用;储存在-20°C以长期保存。
注意：不要在4°C下保存超过2周或在-20°C下保存超过3个月9，19。
3. 小鼠角膜上皮离 体 伤口愈合模型
注：以下离 体 动物模型基于Hung等人关于角膜上皮20机械损伤的先前经验。应在显微镜下执行以下步骤，以形成边界清晰且一致的角膜上皮伤口。
- 用3%-4%异氟醚麻醉C57BL / 6小鼠。将皮肤活检打孔压在小鼠中央角膜上，在上皮上留下一个浅圆圈，作为均匀的伤口边缘。
注意：要轻柔，以免眼球破裂。 - 在确认区域内清创角膜上皮直至Bowman层，使用配备0.5毫米毛刺的角膜锈环去除器。
- 建立机械角膜伤口的 离体 动物模型，收获眼球并做好培养准备。
- 首先对小鼠实施安乐死;然后，轻轻按压小鼠的上眶和下眶边缘，将镊子的尖端引入球后空间，然后伸出眼球并用镊子握住它。
- 用角膜剪刀切割视神经和眶周软组织，以完美隔离眼球。
- 准备一个 96 孔板，里面有融化的蜡。使用镊子的尖端快速创建一个圆孔，然后等待凝固。
- 准备要测试的培养基：0.5%mACS，0.5%AS进行比较，生理盐水作为阴性对照，以及Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）。
注意：mACS是使用上述协议获得的。 - 对于 离体 培养，将收获的眼球放在准备好的 96 孔板上。将 200 μL 每种培养基加入 96 孔板中。
- 将96孔培养板放入37°C的培养箱中，并加入5%CO2。确保每24小时更换一次培养基。
- 为了确认顺序伤口愈合效果，通过荧光素染色每8小时在显微镜下监测上皮伤口区域。
- 用生理盐水将荧光素溶解在荧光素纸上。
- 将荧光素染料滴在小鼠中央角膜上，然后在显微镜下观察并记录下来。典型结果如图 4所示。
注意：一滴（约0.05毫升）荧光素染料足以进行观察。
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Representative Results
图1和图2显示了实验所需的材料，图3显示了mACS制备过程中的顺序步骤和成功的中间产品。首先，将0.5mL的10%甘油溶液加入到每个10mL无菌试管中（图3A）。然后，从患者获得60-70mL静脉血，并将10mL血液注射到每个管中（图3B）。在制备之前，必须对患者的血液进行彻底、定期的实验室检查，以确保血液质量达到标准。最常见的低质量血液制品是由于血脂异常，导致离心后上层血清浑浊，难以去除;眼药水的进一步制备不能继续（图5A）。
然后，将密封的试管置于37°C的培养箱中4小时（图3C）。孵育和离心后，可以将样品分离成包含mACS初步产物的上层和下层血细胞层（图3D）。然后收集上层流体。无菌技术在以后是必不可少的。由于血清是微生物非常有营养的滋生环境，任何与针头接触的表面都必须首先用75%的酒精消毒，并且在此过程中必须使用无菌手套。重要的是，去除上清液时应避免下层血细胞的干扰（图3E）。
在该步骤中，预计上清液是澄清的或淡黄色的。但是，如果看到轻微的红色，则可能发生溶血，并且该制剂可能不适合后续步骤（图5B）。收集的血清可以再次离心，以确保上清液不含红细胞。将血清通过0.22μm过滤器过滤到无菌滴眼液瓶中（图3F，G）。然后将最终产品mACS滴眼液尽快冷藏或冷冻，具体取决于目的（图3H）。眼药水不能储存太久，因为它们富含不稳定的营养物质和缺乏防腐剂。
在 离体 表面愈合模型中，与AS滴眼液相比，mACS滴眼液在角膜伤口愈合方面显示出更好的结果。在显微镜下通过物理磨损形成同心角膜伤口后，收获C57BL / 6小鼠的眼球。然后，将处死的小鼠眼睛培养在四种不同的培养基中，包括纯生理盐水，DMEM，0.5%AS和0.5%mACS。
这里使用的AS培养基是根据文献21 和林口长庚纪念医院的临床实践制备的。皮肤灭菌后，将总共40毫升的静脉血从志愿者吸入真空管中。没有向管中加入抗凝剂。然后将血液在室温下储存30分钟以确保完全凝固，然后以3，500× g 离心10分钟。离心后，纯AS占据试管的上层，在该 离体 动物模型中用BSS（无菌冲洗液）将其稀释至0.5%。
依次在6个不同时间点观察角膜伤口，即0、8、16、24、32和48 h。初步结果表明，在16 h时，在0.5%mACS滴眼液下角膜伤口愈合速度比其他组快。在24小时，0.5%AS和DMEM组与0.5%mACS滴眼液具有相当的治疗效果。在32小时观察到角膜伤口愈合，接近完全恢复，除了生理盐水组（图4）。
图 1：将 10% 甘油溶液添加到试管中所需的材料 。 （A） 21 G 蝶翼输液器。（B） 250 mL 10% 甘油溶液。（C） 六个含有肝素 158 USP 单位的 10 mL 真空管。（D） 3.0毫升注射器。 请点击此处查看此图的大图。
图2：用于提取和过滤血液样品上清液的材料 。 （A） 0.22 μm 过滤器。（B） 一个 5 mL 灭菌滴眼液瓶。（C） 一副无菌手套。（D） 装有 23 G 针头的 3 mL 注射器。（E） 一个20毫升注射器。（F） 18 克针。 请点击此处查看此图的大图。
图3：血液离心程序和生产改良自体条件血清滴眼液的制备 。 （A）向每个试管中加入0.5mL的10%甘油溶液。（B）从患者收集的血液样本平均分为六个试管（图中仅显示一个）。（C）将试管置于37°C培养箱中4小时后的外观。 （D）离心后的血清和血细胞层。（E）吸出上清液后的残留物。应注意不要吸入下层血细胞层。（F）将上清液收集在3mL注射器中，并在其下方插入0.22μm过滤器和23G针头。（G）将针头轻轻推入无菌滴眼液瓶中。（H）改良的ACS滴眼液的最终产品。 请点击此处查看此图的大图。
图4：四种不同培养基中鼠眼角膜伤口（荧光素染色后图中的绿色区域）随时间的顺序变化。 盐水组未观察到显著差异，而DMEM、0.5%AS组和0.5%mACS组随时间推移观察到伤口愈合（箭头）。在0.5%mACS组中，伤口愈合（箭头）在16小时时明显比用AS和DMEM治疗的伤口愈合更完全。在24小时，DMEM，0.5%mACS和0.5%AS组显示出进一步的愈合效果（箭头），特别是在mACS组中。除盐水组外，所有组在32小时均观察到接近完全恢复。 请点击此处查看此图的大图。
图5：离心后血液制品不良的例子 。 （A）血脂异常。最常见的缺陷产品是由于肥胖或糖尿病，因为上层血清含有高脂肪和胆固醇。（b）溶血。这也是一个常见的次优产品。主要原因可归因于使用小口径针头抽血或在注射血液制品时使用不适当的外力。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在本研究中，描述了制备mACS的方案，并进一步显示了mACS滴眼液在动物模型伤口愈合中的益处。该mACS方案的关键修改是在每个试管中加入约0.5mL的10%甘油溶液，这在37°C孵育4小时期间产生合适的缺氧条件。 此设置为AS提供适当的压力，并促使细胞分泌有助于伤口愈合的必要生长因子。0.22 μm 过滤器可以帮助消除大分子蛋白质、血细胞和杂质，从而使最终产品纯净且粘附更少。
将血液在37°C孵育4小时，并进行进一步离心和过滤。在适当温度下制备和储存最终产品的过程中，严格注意无菌性也至关重要。最终血清产品中的高营养成分是细菌的极佳培养基。因此，制备过程中储存不当或污染可能会损坏滴眼液。受污染的mACS可引起结膜炎或感染性角膜炎等疾病。
患者血液的质量也很重要;因此，在制备mACS之前需要进行实验室测试，以确保血液制品的安全性。在抽取和操作患者的血液样本时，操作人员应注意溶血。制备过程中的任何压力都容易引起溶血;因此，在采血过程中应缓慢拉动和推动注射器。还应控制缺氧以获得高浓度的生长因子和抗炎细胞因子。根据经验和先前发表的研究22，23，应用4小时缺氧孵育是最终设置。甘油可以为细胞提供更合适的缺氧应激，因为它可以提供稳定作用和适当的渗透细胞外液压力18。然而，仍然需要检查甘油的最佳浓度及其与细胞因子浓度的关系。将来，将有必要对伤口愈合进行体内动物研究和更大规模的随机对照 试验，以 确认其有效性。
到目前为止，研究主要集中在使用传统AS和新兴的PRP滴眼液将血清产品应用于眼表疾病24，25，26，27。在制备过程中不使用任何抗凝剂且不使用过滤器的传统AS是纯琥珀色，但由于其粘附性，经常使患者感到不舒服。因此，通常使用稀释的AS（20%-50%），这会降低营养素的浓度。然而，PRP的粘性较低，通常以纯形式使用（100%）。最近的文献报道大多指出，PRP比AS提供更好的抗炎和伤口愈合效果，主要是由于其丰富的抗炎细胞因子，生长因子含量，以及其减轻IL-1β诱导的炎症的能力16，26。García-Conca等人进行的一项随机对照试验已经发现，PRP在严重或中度分泌不足性干眼症中的应用显示出令人满意的结果28。尽管ACS作为AS的改善，在炎症和退行性眼表疾病中很少有报道，但它已被广泛用于治疗退行性关节炎和骨科伤口愈合29，30，31。最常见的ACS已作为商业套件13，32制造并获得专利。mACS是在调整ACS制备过程后设计的，结合了ACS和PRP的优势。mACS可以以更经济的成本生产，因为不需要特殊试剂，例如CrSO4涂层玻璃珠或任何专利试剂盒，这些都是制备ACS和PRP所必需的。
除了经济问题外，mACS滴眼液在 离体 实验中也提供了令人满意的初步结果，并且可能是当前新兴的PRP滴眼液的革命性替代品。值得注意的是，ACS在定性和定量上都显示出比大多数已建立的炎症性关节疾病治疗方法更好的结果，因为它具有抗炎能力和改进的内源性修复机制17。尽管迄今为止没有文献证据表明ACS在眼科中的治疗效果，但由于其抗炎机制和在骨科中的成功，可以合理地假设其应用于角膜上皮缺陷患者的潜力33。在我们的 离体 研究中，只有AS与mACS进行了比较;但是，也可以比较通过商业试剂盒 生产的 PRP和ACS。未来分析mACS中抗炎细胞因子和生长因子的血清水平的研究将有助于确认其与ACS或PRP的相似性，以及与AS的潜在优越性。
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Disclosures
所有作者都声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢Ya-Lan Chien和Chia-Ying Lee的出色技术援助，以及OnLine英语公司的语言版本。这项研究部分由长庚医学研究项目（批准号CMRPG3L1491）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
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