Summary
Denne artikel beskriver en protokol, der skal forenkle processen og gøre fremstillingen af autologt konditioneret serum (ACS) billigere. Der kræves ingen specielle sprøjter eller overfladebelagte glasperler. Desuden har den modificerede ACS (mACS) konkurrencemæssige fordele i forhold til konventionelt autologt serum i hornhindesårheling af murine øjne ex vivo.
Abstract
Topiske terapier afledt af humant blod har været en velsignelse for klinikere i de seneste årtier. Autologt serum (AS) og blodpladerigt plasma (PRP) er beriget med epitheliotropiske vækstfaktorer, der er afgørende for hornhindesårheling. I modsætning til AS er PRP baseret på et differentielt centrifugeringssystem, hvilket giver flere blodpladeafledte vækstfaktorer. Autologt konditioneret serum (ACS) bevarer ikke kun fremstillingen af AS og PRP, men fokuserer også på immunmodulerende egenskaber, som er vigtige i inflammatoriske sygdomme.
Manglen på standardiserede protokoller og høje forberedelsesomkostninger er begrænsninger for den kliniske anvendelse af ACS. Dette videoeksperiment demonstrerer en standardprocedure til fremstilling af modificerede autologe konditionerede serumøjendråber (mACS). Først blev glycerol tilsat i heparinsprøjter som blodcellestabilisator under hypoxisk inkubation. For at aktivere blodcellerne blev en 4 timers inkubation ved 37 °C initieret. Derefter blev blodprøverne centrifugeret ved 3.500 × g i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter filtrering af supernatanten gennem et 0,22 μm filter var mACS øjendråberne fuldt klargjort.
En foreløbig afprøvning af den terapeutiske virkning af mACS viste, at det kan have konkurrencemæssige fordele i forhold til konventionel AS i hornhindesårheling i ex vivo museøjne. Den AS, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev udarbejdet i henhold til offentliggjorte undersøgelser og den kliniske praksis på vores hospital. Derfor kan effekten af mACS på øjenoverfladesygdomme evalueres i fremtidig forskning gennem in vivo dyreforsøg og kliniske forsøg.
Introduction
De terapeutiske virkninger af autologt serum (AS) i tørre øjensygdomme blev først rapporteret i 1980'erne af Fox et al.1. Det antages, at både smøreegenskaben og de essentielle epitheliotropiske biokemiske komponenter i AS, der efterligner naturlige tårer, gavner spredningen af hornhindepitelceller. I løbet af de sidste årtier er der udført flere undersøgelser på dette grundlag. Trofiske komponenter omfatter epidermal vækstfaktor (EGF), vitamin A, transformerende vækstfaktor β (TGF-β) og andre cytokiner. Interessant nok er serumet rig på TGF-β og vitamin A, som menes at spille en afgørende rolle i epidermal proliferation 2,3,4,5. Derudover har flere undersøgelser ved behandling af patienter med okulære overfladesygdomme vist nogle fordele ved AS-øjendråber i patientrapporterede resultater, andre objektive tørre øjenparametre 6,7 og mikroskopiske fund såsom celletæthed8. Metaanalyseundersøgelser viste, at der kan være nogle fordele ved at forbedre patientens syndromer med AS-øjendråberbehandling, men langsigtede resultater og observationer mangler stadig 9,10.
I modsætning til AS er blodpladerig plasma (PRP) afledt af tilsætning af et antikoagulant under fremstillingen med yderligere differentiel centrifugering og kemisk aktivering af blodpladerne. Sammenlignet med AS er der adskillige kemikalier og vækstfaktorer, såsom TGF-β, vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og EGF, til stede i PRP. Det er også blevet anvendt på okulære overfladesygdomme med kliniske fordele i symptomlindring11.
Tværforbindelsen mellem epiteldefekter og betændelse er kompleks. Især immunopatofysiologi er et andet vigtigt spørgsmål i okulære overfladesygdomme. Proinflammatoriske cytokiner, såsom IL-1β og IFN-γ, menes at være afgørende mediatorer i inflammatoriske kaskader12. Nye behandlingsveje åbnes således baseret på forståelse af immunmekanismen. Strategier til at stoppe denne inflammatoriske proces, herunder produktion af interleukin-1-receptorantagonist (IL-1Ra) og andre antiinflammatoriske cytokiner, kan også spille en vigtig rolle i okulære overfladesygdomme13,14,15.
Siden 1998 er ortokin, et kommercialiseret autologt konditioneret serum (ACS), blevet anvendt klinisk hos ortopædiske patienter, der lider af slidgigt (OA), reumatoid arthritis (RA) og rygsygdomme13. Sammenlignet med AS og PRP er behandling med kemisk overtrukne glasperler og hypoxisk inkubation for at aktivere monocytter de specifikke træk ved ACS16. Teoretisk set kan flere antiinflammatoriske faktorer udskilles ved at tilføje overlevelsesstress til cellerne, hvilket resulterer i en højere koncentration af essentielle immunmodulerende komponenter, herunder IL-1Ra. De forbedrede terapeutiske fordele ved ACS i OA sammenlignet med AS er også blevet rapporteret17. Okulære overfladesygdomme deler lignende immun baggrund med ortopædiske inflammatoriske sygdomme i nogle henseender. Baseret på de vellykkede resultater af human blodafledt terapi på det ortopædiske område kan ACS derfor have fordele i forhold til konventionelle behandlinger i klinisk praksis ved epitheliotropiske og immunmodulerende egenskaber. Selvom ACS har været meget udbredt i ortopædiske inflammatoriske sygdomme, skal dets kliniske anvendelser inden for oftalmologi stadig undersøges, hvilket kan hindres af dets høje omkostninger, mangel på litteraturstøtte og manglende standardisering af forberedelsesprocessen, hvilket resulterer i forskellig ydeevne.
I denne videoartikel blev en ny, omkostningseffektiv og bekvem metode demonstreret til at generere den modificerede ACS (mACS) eller plasma rig på vækstfaktorer (PRGF), der producerer en øjendråbeopløsning med en sammenlignelig praktisk værdi med kommercialiserede ACS'er. Nøgleideerne om at tilføje antikoagulantia og udløse blodcellerne til at udskille antiinflammatoriske cytokiner ved stresset inkubation blev bibeholdt, men i modsætning til de kemisk inducerede metoder, såsom dem, der er baseret på CrSO 4-coatede glasperler og kommercielle kits, induceres den kritiske stressstatus fysisk ved hypoxisk inkubation i denne metode. Desuden blev glycerol tilsat for at give ekstra fordele, herunder en stigning i stabiliteten af blodkarcellernes membran, vedligeholdelse af et korrekt osmotisk ekstracellulært væsketryk18 og en passende kilde til næringsstoffer under hypoxiske forhold, der undgår overbelastning af cellerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer i begyndelsen af protokolafsnittet. Alle protokoller og procedurer blev udført i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen og blev gennemgået og godkendt af Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Alle frivillige blev informeret om arten af denne undersøgelse og underskrev en informeret samtykkeformular, inden de blev optaget. De forbrugsstoffer, der kræves til hele forsøgsproceduren, er vist i figur 1 og figur 2 samt i materialetabellen.
1. Forberedelse af de materialer, der er nødvendige for at producere mACS øjendråber
- Forbered 250 ml 10% glycerolopløsning, og hav et infusionssæt på 21 G sommerfuglevinger, en 3 ml sprøjte uden nål og seks 10 ml vakutainerrør indeholdende heparin 158 USP-enheder klar (figur 1).
- Tilslut kanylen til 21 G blodopsamlingsnålen til 3 ml sprøjten, og træk 3 ml 10 % glycerolopløsning op i den klargjorte sprøjte.
BEMÆRK: Alle materialer skal steriliseres, før nålen indsættes. - Fordel 10% glycerolopløsningen i vacutainerrørene i rækkefølge med ca. 0,5 ml 10% glycerolopløsning i hver (figur 3A).
BEMÆRK: På grund af det negative tryk i reagensglasset skal nålen komme ud umiddelbart efter, at den er gået ind for jævnt at fordele 3 ml glycerolopløsning til de seks reagensglas. - Steriliser patientens hud med 75% alkoholsterile vatpinde. Punktering den overfladiske vene i patientens øvre lemmer med 18 G blodopsamlingsnålen. Træk 60-70 ml venøst blod fra den overfladiske vene i alt.
2. Forberedelse til mACS øjendråber
- Injicer sekventielt 10 ml af det udtrukne venøse blod i hvert af de seks vakutainerrør (figur 3B).
BEMÆRK: Dette trin er afhængig af vakuumets undertryk for at fylde rørene. For at undgå blodcelleforstyrrelser og hæmolyse må du ikke anvende noget positivt tryk. - De seks vakutainerrør anbringes i inkubatoren med en konstant temperatur på 37 °C i 4 timer (figur 3C).
BEMÆRK: Den hypoxiske status opretholdes og stabiliseres af det resterende undertryk i et forseglet rør, der modtog glycerol. - Fjern glassene fra inkubatoren efter 4 timer og centrifuger dem ved 3.500 × g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- På dette tidspunkt skal du forberede materialerne til mACS-ekstraktion, herunder de steriliserede øjendråbeflasker, en 3 ml sprøjte med nålen, et 0,22 μm filter, en 18 G nål og et par sterile handsker (figur 2).
BEMÆRK: Operationsbordet skal tørres af med 75% alkohol for at sikre et aseptisk miljø. Supernatanten er efter centrifugering allerede et halvfabrikat af mACS. - De seks glas anbringes på rørstativet, og hætterne åbnes efter fuldstændig centrifugering (figur 3D).
BEMÆRK: Sterilitet er ikke påkrævet i dette trin. - Tag sterile handsker på, og træk mACS ud en efter en ved hjælp af en 3 ml sprøjte med en 18 G kanyle.
BEMÆRK: Pas på ikke at trække det nedre blodcellelag under dette trin (figur 3E). - Træk kanylen ud, slut den til 0,22 μm filteret, og tilslut kanylen på 23 G, 1,5 i blodopsamling med den originale 3 ml sprøjte til udløbet nedenfor (figur 3F).
- Tryk forsigtigt nålen gennem 0,22 μm filteret ind i de tilberedte sterile øjendråbeflasker (figur 3G).
- Gentag ovenstående trin, indtil al mACS er filtreret og opbevaret i øjendråbeflasker (figur 3H).
- Opbevar mACS-øjendråberne ved 4 °C til øjeblikkelig brug; opbevares ved -20 °C til langtidskonservering.
BEMÆRK: Opbevar dem ikke i mere end 2 uger ved 4 °C eller i mere end 3 måneder ved -20 °C 9,19.
3. Ex vivo sårhelingsmodel af murin hornhindepitel
BEMÆRK: Følgende ex vivo dyremodel var baseret på tidligere erfaringer fra Hung et al. om mekaniske skader på hornhindepitelet20. Følgende trin skal udføres under mikroskopet for at skabe et velafgrænset og konsistent hornhindepitelsår.
- Bedøv C57BL/6-musene med 3%-4% isofluran. Indryk hudbiopsistansen over den murin centrale hornhinde, hvilket efterlader en lav cirkel på epitelet som en ensartet sårmargen.
BEMÆRK: Vær forsigtig for at undgå brud på øjeæblet. - Debride hornhindepitelet inden for det bekræftede område ned til Bowmans lag med en hornhinderustringfjerner udstyret med en 0,5 mm gratr.
- For at etablere ex vivo-dyremodellen for det mekaniske hornhindesår skal du høste øjeæblet og forberede kulturen godt.
- Aflive musene først; Tryk derefter forsigtigt på musenes overlegne og ringere orbitalfælge, introducer spidsen af tangen over retrobulbarrummet og ud af øjeæblet og hold det ved tangen.
- Skær synsnerven og periorbitalt blødt væv med hornhindesaks for at isolere øjeæblet perfekt.
- Forbered en 96-brøndplade med smeltet voks inde i den. Opret hurtigt et rundt hul ved hjælp af spidserne af tang, og vent derefter på størkning.
- Forbered mediet, der skal testes: 0,5% mACS, 0,5% AS til sammenligning, normal saltvand som negativ kontrol og Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM).
BEMÆRK: mACS opnås ved hjælp af ovennævnte protokol. - For ex vivo-kulturen placeres det høstede øjeæble på den forberedte 96-brøndplade. Der tilsættes 200 μL af hvert substrat i 96-brøndspladen.
- 96-brønds kulturpladen anbringes i inkubatoren ved 37 °C med 5 % CO2. Sørg for, at kulturmediet skiftes hver 24. time.
- For at bekræfte den sekventielle sårhelingseffekt skal du overvåge epitelsårområdet under mikroskopet hver 8. time ved fluoresceinfarvning.
- Fluoresceinet opløses på fluoresceinpapiret med normalt saltvand.
- Slip fluoresceinfarvestoffet på murinens centrale hornhinde, observer og dokumentér det derefter under et mikroskop. Et typisk resultat er vist i figur 4.
BEMÆRK: En dråbe (ca. 0,05 ml) fluoresceinfarvestof er nok til observationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 og figur 2 viser de materialer, der er nødvendige til eksperimentet, og figur 3 viser de sekventielle trin og de vellykkede midtprodukter under forberedelsen af mACS. Først blev 0,5 ml 10% glycerolopløsning tilsat i hvert 10 ml sterilt reagensglas (figur 3A). Derefter blev 60-70 ml venøst blod opnået fra patienten, og 10 ml blod blev injiceret i hvert rør (figur 3B). Patientens blod skal underkastes grundige, regelmæssige laboratorieundersøgelser før præparatet for at sikre, at blodets kvalitet er op til standard. Det mest almindelige blodprodukt af lav kvalitet skyldes dyslipidæmi, hvilket resulterer i et uklart øvre lag af serum efter centrifugering, der er vanskeligt at fjerne; Yderligere behandling af øjendråber kan ikke fortsættes (figur 5A).
Derefter anbringes det forseglede reagensglas i en inkubator ved 37 °C i 4 timer (figur 3C). Efter inkubation og centrifugering kunne prøven opdeles i et øvre lag indeholdende det foreløbige produkt af mACS og et lavere blodcellelag (figur 3D). Det øverste lag væske blev derefter opsamlet. Aseptiske teknikker er afgørende i det følgende. Fordi serummet er et meget nærende avlsmiljø for mikroorganismer, skal enhver overflade, der kommer i kontakt med nålen, først desinficeres med 75% alkohol, og sterile handsker skal bruges under processen. Det er vigtigt, at forstyrrelser af blodlegemerne fra det nederste lag undgås, når supernatanten fjernes (figur 3E).
På dette trin forventes det, at supernatanten er klar eller svagt gul. Men hvis der ses en let rød farve, kan hæmolyse have fundet sted, og præparatet er muligvis ikke egnet til de efterfølgende trin (figur 5B). Det opsamlede serum kan centrifugeres igen for at sikre, at supernatanten er fri for røde blodlegemer. Serummet blev filtreret gennem et 0,22 μm filter ind i en steril øjendråbeflaske (figur 3F,G). Det endelige produkt, mACS øjendråber, blev derefter nedkølet eller frosset så hurtigt som muligt, afhængigt af formålet (figur 3H). Øjendråberne kunne ikke opbevares for længe på grund af deres rigdom på labile næringsstoffer og manglen på konserveringsmidler.
I ex vivo-overfladehelingsmodellen viste mACS-øjendråben et overlegent resultat i hornhindesårheling sammenlignet med AS-øjendråben. Høstning af øjenæblerne fra C57BL/6-mus blev udført efter at have skabt et koncentrisk hornhindesår ved fysisk slid under mikroskopet. Derefter blev de ofrede museøjne dyrket i fire forskellige medier, herunder ren normal saltvand, DMEM, 0,5% AS og 0,5% mACS.
AS-mediet, der blev brugt her, blev udarbejdet baseret på litteraturen21 og den kliniske praksis i Chang Gung Memorial Hospital Linkou. Venøst blod, 40 ml i alt, blev trukket ind i vacutainerrør fra frivillige efter hudsterilisering. Der blev ikke tilsat antikoagulant til rørene. Blodet blev derefter opbevaret i 30 minutter ved stuetemperatur for at sikre fuldstændig koagulation efterfulgt af centrifugering ved 3.500 × g i 10 minutter. Efter centrifugering optog den rene AS det øverste lag af rørene, som blev fortyndet af BSS (steril vandingsopløsning) til 0,5% i denne ex vivo dyremodel.
Hornhindesår blev sekventielt observeret på seks forskellige tidspunkter, nemlig 0, 8, 16, 24, 32 og 48 timer. De foreløbige resultater viste, at hornhindesårene efter 16 timer helede hurtigere under 0,5% mACS øjendråben end de andre grupper. Ved 24 timer havde 0,5% AS- og DMEM-grupperne sammenlignelige terapeutiske virkninger med 0,5% mACS øjendråben. Heling af hornhindesårene, tæt på fuld bedring, blev observeret ved 32 timer, bortset fra den normale saltvandsgruppe (figur 4).
Figur 1: Materialer, der er nødvendige for at tilsætte 10% glycerolopløsning i rørene . A) 21 G infusionssæt med sommerfuglevinger. B) 250 ml 10% glycerolopløsning. (C) Seks 10 ml vacutainerrør indeholdende heparin 158 USP-enheder. (D) 3,0 ml sprøjte. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Materialer til ekstraktion og filtrering af blodprøvens supernatant . (A) Et 0,22 μm filter. (B) En 5 ml steriliseret øjendråbeflaske. (C) Et par sterile handsker. (D) En 3 ml sprøjte med 23 G kanylen. (E) En 20 ml sprøjte. F) 18 G nåle. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Procedurer for blodcentrifugering og forberedelse til fremstilling af modificerede autologe konditionerede serumøjendråber . (A) 0,5 ml 10% glycerolopløsning blev tilsat i hvert reagensglas. (B) Blodprøven fra patienten blev opdelt ligeligt i seks reagensglas (kun et vist på billedet). C) Reagensglassets udseende efter anbringelse i en 37 °C inkubator i 4 timer. D) Serum- og blodcellelagene efter centrifugering. E) Remanensen efter opsugning af supernatanten. Man bør være forsigtig med ikke at aspirere det nedre blodcellelag. (F) Supernatanten opsamles i 3 ml sprøjten, og der indsættes et 0,22 μm filter og en 23 G kanyle under den. (G) Kanylen skubbes forsigtigt ind i den sterile øjendråbeflaske. H) Slutprodukt af de modificerede ACS-øjendråber. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sekventielle ændringer af hornhindesår (grønne områder i figurerne efter fluoresceinfarvning) i murine øjne i fire forskellige kulturmedier over tid. Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i saltvandsgruppen, mens sårheling (pile) over tid blev observeret i DMEM-, 0,5% AS- og 0,5% mACS-grupperne. I 0,5% mACS-gruppen var sårhelingen (pilene) signifikant mere komplet efter 16 timer end dem, der blev behandlet med AS og DMEM. Ved 24 timer viste DMEM-, 0,5% mACS- og 0,5% AS-grupperne yderligere helbredende virkninger (pile), især i mACS-gruppen. Næsten total genopretning blev observeret ved 32 timer for alle grupper, undtagen saltvandsgruppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Eksempler på dårlige blodprodukter efter centrifugering . (A) Dyslipidæmi. De mest almindelige defekte produkter skyldes fedme eller diabetes mellitus, da det øvre serum indeholder højt fedtindhold og kolesterol. B) Hæmolyse. Dette er også et almindeligt suboptimalt produkt. Hovedårsagen kan tilskrives brug af små borenåle til blodtrækning eller anvendelse af uhensigtsmæssig ekstern kraft ved injektion af blodprodukter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse beskrives en protokol til fremstilling af mACS, og fordelen ved mACS øjendråber i sårheling af dyremodeller vises yderligere. Den afgørende ændring af denne mACS-protokol er tilsætning af ca. 0,5 ml 10% glycerolopløsning i hvert reagensglas, hvilket skaber passende hypoxiske forhold under 4 timers inkubation ved 37 °C. Denne indstilling giver AS korrekt stress og beder celler om at udskille de nødvendige vækstfaktorer, der hjælper sårheling. 0,22 μm filteret kan hjælpe med at eliminere de makromolekylære proteiner, blodlegemer og urenheder og dermed gøre slutproduktet rent og mindre klæbende.
Blodet inkuberes i 4 timer ved 37 °C, og der udføres yderligere centrifugering og filtrering. Streng opmærksomhed på sterilitet under tilberedning og opbevaring af slutprodukterne ved en passende temperatur er også afgørende. Det høje næringsindhold i de endelige serumprodukter er et fremragende dyrkningsmedium for bakterierne. Således kan forkert opbevaring eller forurening under forberedelsen ødelægge øjendråberne. Forurenet mACS kan forårsage sygdomme som konjunktivitis eller infektiøs keratitis.
Kvaliteten af patientens blod er også vigtig; derfor er laboratorieundersøgelser nødvendige før fremstilling af mACS for at sikre blodprodukternes sikkerhed. Under tegning og ved betjening af patientens blodprøver skal operatørerne være opmærksomme på hæmolyse. Ethvert tryk under forberedelsen kan let forårsage hæmolyse; Derfor skal sprøjten trækkes og skubbes langsomt under blodindsamling. Hypoxi bør også kontrolleres for at opnå høje koncentrationer af vækstfaktorer og antiinflammatoriske cytokiner. Baseret på erfaring og tidligere offentliggjorte undersøgelser22,23 er anvendelsen af en 4 timers hypoxisk inkubation den ultimative indstilling. Glycerol kunne give mere passende hypoxisk stress til cellen på grund af stabiliseringseffekten og det korrekte osmotiske ekstracellulære væsketryk, det kan give18. Den optimale koncentration af glycerol, og hvordan den korrelerer med cytokinkoncentrationen, skal dog stadig kontrolleres. I fremtiden vil in vivo dyreforsøg med sårheling og et større randomiseret kontrolforsøg være berettiget for at bekræfte dets effektivitet.
Indtil videre har forskningen primært fokuseret på at anvende serumprodukter til okulære overfladesygdomme ved hjælp af traditionelle AS og de nye PRP-øjendråber24,25,26,27. Traditionel AS uden antikoagulant og uden brug af filter under tilberedning er rav i sin rene form, men gør ofte patienter ubehagelige på grund af dets klæbeevne. Som følge heraf anvendes normalt fortyndet AS (20% -50%), hvilket sænker koncentrationerne af næringsstofferne. PRP er imidlertid mindre klæbende og anvendes normalt i sin rene form (100%). Nylige litteraturrapporter påpeger for det meste, at PRP giver bedre antiinflammatoriske og sårhelende virkninger end AS, hovedsageligt på grund af dets rige indhold i antiinflammatoriske cytokiner, vækstfaktorer og dets evne til at dæmpe IL-1β-induceret inflammation16,26. Et randomiseret kontrolleret forsøg udført af García-Conca et al. har allerede vist, at anvendelsen af PRP ved alvorlige eller moderate hyposekretoriske tørre øjensygdomme viser tilfredsstillende resultater28. Selvom ACS, som en forbedring i forhold til AS, sjældent er blevet rapporteret i inflammatoriske og degenerative okulære overfladesygdomme, har det været meget udbredt til behandling af degenerativ arthritis og sårheling i ortopædi 29,30,31. Den mest almindelige ACS er fremstillet og patenteret som et kommercielt sæt13,32. mACS blev designet efter justering af processen med ACS-forberedelse for at kombinere styrkerne fra både ACS og PRP. mACS kan produceres til en mere økonomisk pris, fordi der ikke er behov for specielle reagenser, såsom CrSO4-belagte glasperler eller patenterede sæt, som er nødvendige til fremstilling af både ACS og PRP.
Bortset fra den økonomiske bekymring gav mACS-øjendråberne også tilfredsstillende foreløbige resultater i et ex vivo-eksperiment og kan være et revolutionerende alternativ til de nuværende, nye PRP-øjendråber. Det skal bemærkes, at ACS har vist bedre resultater end de fleste etablerede behandlinger i inflammatoriske ledsygdomme både kvalitativt og kvantitativt på grund af dets antiinflammatoriske evne og forbedrede endogene reparationsmekanismer17. Selv om der ikke er nogen litteraturbevis for terapeutiske virkninger af ACS i oftalmologi til dato, er det rimeligt at antage potentialet i dets anvendelse på patienter med hornhindepiteldefekter på grund af dets antiinflammatoriske mekanisme og succesen inden for ortopædi33. Kun AS blev sammenlignet med mACS i vores ex vivo-undersøgelse ; PRP og ACS fremstillet ved hjælp af kommercielle sæt kan dog også sammenlignes. Fremtidig forskning i analyse af serumniveauerne af antiinflammatoriske cytokiner og vækstfaktorer i mACS ville være nyttig til at bekræfte dens lighed med ACS eller PRP og potentiel overlegenhed i forhold til AS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ya-Lan Chien og Chia-Ying Lee for fremragende teknisk assistance og OnLine English Company for den sproglige udgave. Denne undersøgelse blev delvist finansieret af Chang Gung Medical Research Project (bevillingsnr. CMRPG3L1491).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).
- Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. Serum growth factor analysis in dry eye syndrome. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).
- Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis. Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).
- Tsubota, K., et al. Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren's syndrome. The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).
- Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome. Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).
- Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).
- Jirsova, K., et al. The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment. Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).
- Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for dry eye. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).
- Wang, L., et al. Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).
- Soni, N. G., Jeng, B. H. Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases. The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).
- Solomon, A., et al. anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).
- Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction. Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).
- Bielory, B. P., Shah, S. P., O'Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. Emerging therapeutics for ocular surface disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).
- Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
- Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α. Tissue and Cell. 73, 101646 (2021).
- Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects. Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).
- Gull, M., Pasek, M. A. The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life. Catalysts. 11 (1), 86 (2021).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Hung, K. H., Yeh, L. K. Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (182), e63217 (2022).
- Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).
- Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114 (2010).
- Antebi, B., et al. Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265 (2018).
- Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects. BioMed Research International. 2022, 6600788 (2022).
- Diaz-Valle, D., et al. Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea. Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).
- Metheetrairut, C., et al. Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease. Scientific Reports. 12 (1), 8906 (2022).
- NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects. Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).
- Garcia-Conca, V., et al. Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma. Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).
- Gholian, S., et al. Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial. Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).
- Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review. Future Science OA. 8 (2), 776 (2022).
- Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review. Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).
- Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).
- Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study. Cureus. 14 (4), e24500 (2022).
