Summary
Cet article décrit un protocole visant à simplifier le processus et à rendre la préparation du sérum conditionné autologue (ACS) moins coûteuse. Aucune seringues spéciales ou perles de verre revêtues en surface n’est nécessaire. De plus, l’ACS modifié (mACS) présente des avantages concurrentiels par rapport au sérum autologue conventionnel dans la cicatrisation des plaies cornéennes des yeux murins ex vivo.
Abstract
Les thérapies topiques dérivées du sang humain ont été une aubaine pour les cliniciens au cours des dernières décennies. Le sérum autologue (SA) et le plasma riche en plaquettes (PRP) sont enrichis en facteurs de croissance épithéliotropes essentiels à la cicatrisation des plaies cornéennes. Contrairement à la SA, le PRP est basé sur un système de centrifugation différentielle, produisant davantage de facteurs de croissance dérivés des plaquettes. Le sérum conditionné autologue (ACS) préserve non seulement la préparation de la SA et du PRP, mais se concentre également sur les propriétés immunomodulatrices, qui sont importantes dans les maladies inflammatoires.
L’absence de protocoles normalisés et les coûts de préparation élevés sont des limites pour l’application clinique du SCA. Cette expérience vidéo démontre une procédure opératoire standard pour la préparation de gouttes ophtalmiques à sérum conditionné autologue modifié (mACS). Tout d’abord, le glycérol a été ajouté dans les seringues d’héparine comme stabilisateur des cellules sanguines pendant l’incubation hypoxique. Pour activer les cellules sanguines, une incubation de 4 h à 37 °C a été initiée. Ensuite, les échantillons de sang ont été centrifugés à 3 500 × g pendant 10 min à température ambiante. Après filtration du surnageant à travers un filtre de 0,22 μm, les gouttes ophtalmiques mACS ont été entièrement préparées.
Un essai provisoire de l’effet thérapeutique du mACS a montré qu’il pourrait avoir des avantages concurrentiels par rapport à la SA conventionnelle dans la cicatrisation des plaies cornéennes dans les yeux de souris ex vivo . La SA utilisée dans cette étude a été préparée en fonction des études publiées et de la pratique clinique dans notre hôpital. Par conséquent, l’efficacité du mACS sur les maladies de la surface oculaire pourrait être évaluée dans de futures recherches par le biais d’études in vivo sur des animaux et d’essais cliniques.
Introduction
Les effets thérapeutiques du sérum autologue (SA) dans les maladies de la sécheresse oculaire ont été signalés pour la première fois dans les années 1980 par Fox et coll.1. On pense que la propriété lubrifiante et les composants biochimiques épithéliotropes essentiels de la SA, imitant les larmes naturelles, favorisent la prolifération des cellules épithéliales cornéennes. Au cours des dernières décennies, plusieurs études ont été réalisées sur cette base. Les composants trophiques comprennent le facteur de croissance épidermique (EGF), la vitamine A, le facteur de croissance transformant β (TGF-β) et d’autres cytokines. Fait intéressant, le sérum est riche en TGF-β et en vitamine A, qui joueraient un rôle central dans la prolifération épidermique 2,3,4,5. En outre, lors du traitement de patients atteints de maladies de la surface oculaire, plusieurs études ont montré certains avantages des gouttes ophtalmiques SA dans les résultats rapportés par les patients, d’autres paramètres objectifs de sécheresse oculaire 6,7 et des résultats microscopiques tels que la densité cellulaire8. Les études de méta-analyse ont révélé qu’il pourrait y avoir certains avantages à améliorer les syndromes des patients avec le traitement par gouttes ophtalmiques SA, mais les résultats et les observations à long terme font encore défaut 9,10.
Contrairement à la SA, le plasma riche en plaquettes (PRP) est dérivé de l’ajout d’un anticoagulant pendant la préparation, avec une centrifugation différentielle supplémentaire et une activation chimique des plaquettes. Par rapport à la SA, de nombreux produits chimiques et facteurs de croissance, tels que le TGF-β, le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) et l’EGF, sont présents dans le PRP. Il a également été appliqué aux maladies de la surface oculaire avec des avantages cliniques dans le soulagement des symptômes11.
La réticulation entre les défauts épithéliaux et l’inflammation est complexe. Notamment, l’immunophysiopathologie est un autre problème important dans les maladies de la surface oculaire. Les cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-1β et l’IFN-γ, seraient des médiateurs essentiels dans les cascades inflammatoires12. De nouvelles pistes de traitement s’ouvrent ainsi à partir de la compréhension du mécanisme immunitaire. Les stratégies visant à arrêter ce processus inflammatoire, y compris la production d’antagoniste des récepteurs de l’interleukine-1 (IL-1Ra) et d’autres cytokines anti-inflammatoires, peuvent également jouer un rôle important dans les maladies de la surface oculaire13,14,15.
Depuis 1998, Orthokine, un sérum conditionné autologue commercialisé (SCA), est utilisé cliniquement chez les patients orthopédiques souffrant d’arthrose, de polyarthrite rhumatoïde (PR) et de troubles de la colonne vertébrale13. Par rapport à l’AS et au PRP, le traitement avec des billes de verre enduites chimiquement et l’incubation hypoxique pour activer les monocytes sont les caractéristiques spécifiques de l’ACS16. Théoriquement, plus de facteurs anti-inflammatoires peuvent être sécrétés en ajoutant un stress de survie aux cellules, ce qui entraîne une concentration plus élevée de composants immunomodulateurs essentiels, y compris l’IL-1Ra. L’amélioration des bénéfices thérapeutiques du SCA dans l’arthrose, par rapport à la SA, a également été rapportée17. Les maladies de la surface oculaire partagent des antécédents immunitaires similaires à ceux des maladies inflammatoires orthopédiques à certains égards. Par conséquent, sur la base des résultats positifs de la thérapie dérivée du sang humain dans le domaine orthopédique, ACS pourrait présenter des avantages par rapport aux traitements conventionnels en pratique clinique par des propriétés épithéliotropes et immunomodulatrices. Bien que le SCA ait été largement utilisé dans les maladies inflammatoires orthopédiques, ses applications cliniques en ophtalmologie doivent encore être explorées, ce qui peut être entravé par son coût élevé, le manque de support documentaire et le manque de normalisation du processus de préparation, ce qui entraîne des performances diverses.
Dans cet article vidéo, une méthode novatrice, rentable et pratique a été démontrée pour générer l’ACS modifié (mACS), ou plasma riche en facteurs de croissance (PRGF), produisant une solution de gouttes oculaires avec une valeur pratique comparable aux ACS commercialisés. Les idées clés de l’ajout d’anticoagulants et du déclenchement de la sécrétion de cytokines anti-inflammatoires par incubation stressée par les cellules sanguines ont été retenues, mais contrairement aux méthodes induites chimiquement, telles que celles basées sur des perles de verre enduites de CrSO4 et des kits commerciaux, le statut de stress critique est physiquement induit par l’incubation hypoxique dans cette méthode. De plus, le glycérol a été ajouté pour fournir des avantages supplémentaires, y compris une augmentation de la stabilité de la membrane des cellules sanguines, le maintien d’une pression de fluide extracellulaire osmotiqueappropriée 18 et une source appropriée de nutriments dans des conditions hypoxiques qui évitent de surcharger les cellules.
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Protocol
La recherche a été effectuée conformément aux lignes directrices institutionnelles au début de la section du protocole. Tous les protocoles et procédures ont été mis en œuvre conformément à la Déclaration d’Helsinki et ont été examinés et approuvés par le Comité d’examen institutionnel de la Fondation médicale Chang Gung. Tous les volontaires ont été informés de la nature de cette étude et ont signé un formulaire de consentement éclairé avant leur inclusion. Les consommables nécessaires à l’ensemble de la procédure expérimentale sont présentés à la figure 1 et à la figure 2, ainsi que dans le tableau des matériaux.
1. Préparation des matériaux nécessaires à la production de gouttes ophtalmiques mACS
- Préparer 250 mL de solution de glycérol à 10 % et conserver un ensemble de perfusion à ailes papillon de 21 g, une seringue de 3 mL sans aiguille et six tubes vacutainer de 10 ml contenant de l’héparine 158 unités USP (Figure 1).
- Connectez l’aiguille de prélèvement sanguin de 21 G à la seringue de 3 mL et retirez 3 mL de solution de glycérol à 10 % dans la seringue préparée.
REMARQUE : Tous les matériaux doivent être stérilisés avant l’insertion de l’aiguille. - Répartir la solution de glycérol à 10 % dans les tubes vacutainer en séquence, avec environ 0,5 mL de solution de glycérol à 10 % dans chacun (Figure 3A).
REMARQUE: En raison de la pression négative dans le tube à essai, l’aiguille doit sortir immédiatement après son entrée pour répartir uniformément 3 mL de solution de glycérol dans les six tubes à essai. - Stérilisez la peau du patient avec des cotons-tiges stériles à 75% d’alcool. Percez la veine superficielle des membres supérieurs du patient avec l’aiguille de prélèvement sanguin de 18 G. Prélever 60 à 70 mL de sang veineux de la veine superficielle au total.
2. Préparation pour les gouttes ophtalmiques mACS
- Injecter séquentiellement 10 mL du sang veineux prélevé dans chacun des six tubes vacutainer (figure 3B).
REMARQUE: Cette étape repose sur la pression négative du vide pour remplir les tubes. Pour éviter la perturbation des cellules sanguines et l’hémolyse, n’appliquez aucune pression positive. - Placer les six tubes vacutainer dans l’incubateur à température constante de 37 °C pendant 4 h (figure 3C).
REMARQUE: L’état hypoxique est maintenu et stabilisé par la pression négative restante dans un tube scellé qui a reçu du glycérol. - Sortez les tubes de l’incubateur après 4 h et centrifugez-les à 3 500 × g pendant 10 min à température ambiante.
- À ce stade, préparez le matériel pour l’extraction du mACS, y compris les flacons de gouttes ophtalmiques stérilisés, une seringue de 3 ml avec l’aiguille, un filtre de 0,22 μm, une aiguille de 18 g et une paire de gants stériles (figure 2).
REMARQUE: La table d’opération doit être essuyée avec de l’alcool à 75% pour assurer un environnement aseptique. Le surnageant, après centrifugation, est déjà un produit semi-fini de mACS. - Placez les six tubes sur la grille à tubes et ouvrez les bouchons après une centrifugation complète (Figure 3D).
REMARQUE: La stérilité n’est pas requise dans cette étape. - Mettez des gants stériles et retirez le mACS un par un à l’aide d’une seringue de 3 ml avec une aiguille de 18 g.
REMARQUE : Veillez à ne pas prélever la couche inférieure de cellules sanguines au cours de cette étape (Figure 3E). - Retirez l’aiguille, branchez-la au filtre de 0,22 μm et connectez l’aiguille de prélèvement sanguin de 23 G, 1,5 po avec la seringue originale de 3 mL à la sortie ci-dessous (Figure 3F).
- Poussez doucement l’aiguille à travers le filtre de 0,22 μm dans les flacons de gouttes ophtalmiques stériles préparés (Figure 3G).
- Répétez les étapes ci-dessus jusqu’à ce que tous les mACS aient été filtrés et stockés dans des flacons de gouttes ophtalmiques (Figure 3H).
- Conservez les gouttes ophtalmiques mACS à 4 °C pour une utilisation immédiate; conserver à -20 °C pour une conservation à long terme.
NOTE: Ne pas les conserver plus de 2 semaines à 4 °C ou plus de 3 mois à -20 °C 9,19.
3. Modèle de cicatrisation ex vivo de l’épithélium cornéen murin
NOTE: Le modèle animal ex vivo suivant était basé sur l’expérience antérieure de Hung et al. sur les lésions mécaniques de l’épithélium cornéen20. Les étapes suivantes doivent être effectuées au microscope pour créer une plaie épithéliale cornéenne bien circonscrite et cohérente.
- Anesthésier les souris C57BL/6 avec 3 % à 4 % d’isoflurane. Indenter le poinçon de biopsie cutanée sur la cornée centrale murine, en laissant un cercle peu profond sur l’épithélium comme une marge uniforme de la plaie.
REMARQUE: Soyez doux pour éviter la rupture du globe oculaire. - Débrider l’épithélium cornéen dans la zone confirmée jusqu’à la couche de Bowman, avec un dissolvant de l’anneau de rouille cornéenne équipé d’une bavure de 0,5 mm.
- Pour établir le modèle animal ex vivo de la plaie cornéenne mécanique, récoltez le globe oculaire et préparez bien la culture.
- Euthanasier les souris en premier; Ensuite, appuyez doucement sur les bords orbitaux supérieurs et inférieurs des souris, introduisez la pointe de la pince sur l’espace rétrobulbaire, puis sortez le globe oculaire et tenez-le par la pince.
- Coupez le nerf optique et les tissus mous périorbitaires avec des ciseaux cornéens pour isoler parfaitement le globe oculaire.
- Préparez une assiette de 96 puits avec de la cire fondue à l’intérieur. Créez rapidement un trou rond à l’aide des pointes des pinces, puis attendez la solidification.
- Préparer les milieux à tester : 0,5 % mACS, 0,5 % AS à titre de comparaison, solution saline normale comme témoin négatif et milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM).
REMARQUE: mACS est obtenu en utilisant le protocole mentionné ci-dessus. - Pour la culture ex vivo , placer le globe oculaire récolté sur la plaque préparée à 96 puits. Ajouter 200 μL de chaque milieu dans la plaque de 96 puits.
- Placer la plaque de culture de 96 puits dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO2. Assurez-vous que les milieux de culture sont changés toutes les 24 heures.
- Pour confirmer l’effet séquentiel de cicatrisation, surveiller la zone de la plaie épithéliale au microscope toutes les 8 heures par coloration à la fluorescéine.
- Dissoudre la fluorescéine sur le papier fluorescéine avec une solution saline normale.
- Déposez le colorant fluorescéine sur la cornée centrale murine, puis observez-le et documentez-le au microscope. Un résultat typique est illustré à la figure 4.
REMARQUE : Une goutte (environ 0,05 mL) de colorant fluorescéine suffit pour l’observation.
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Representative Results
Les figures 1 et 2 montrent les matériaux nécessaires à l’expérience, et la figure 3 montre les étapes séquentielles et les produits intermédiaires réussis lors de la préparation du mACS. Tout d’abord, 0,5 mL de solution de glycérol à 10 % a été ajouté dans chaque tube à essai stérile de 10 mL (figure 3A). Ensuite, 60 à 70 mL de sang veineux ont été obtenus du patient, et 10 mL de sang ont été injectés dans chaque tube (Figure 3B). Le sang du patient doit être soumis à des examens de laboratoire approfondis et réguliers avant la préparation afin de s’assurer que la qualité du sang est conforme aux normes. Le produit sanguin de mauvaise qualité le plus courant est dû à la dyslipidémie, qui se traduit par une couche supérieure trouble du sérum après centrifugation qui est difficile à enlever; la préparation ultérieure des gouttes ophtalmiques ne peut pas être poursuivie (Figure 5A).
Ensuite, le tube à essai scellé est placé dans un incubateur à 37 °C pendant 4 h (figure 3C). Après l’incubation et la centrifugation, l’échantillon pourrait être séparé en une couche supérieure contenant le produit préliminaire du mACS et une couche inférieure de cellules sanguines (Figure 3D). Le fluide de la couche supérieure a ensuite été recueilli. Les techniques aseptiques sont essentielles par la suite. Parce que le sérum est un environnement de reproduction très nutritif pour les micro-organismes, toute surface qui entre en contact avec l’aiguille doit d’abord être désinfectée avec de l’alcool à 75%, et des gants stériles doivent être utilisés pendant le processus. Il est important de noter que la perturbation des cellules sanguines de la couche inférieure doit être évitée lors de l’élimination du surnageant (Figure 3E).
À ce stade, on s’attend à ce que le surnageant soit clair ou jaune pâle. Cependant, si une légère couleur rouge est observée, une hémolyse peut s’être produite et la préparation peut ne pas convenir aux étapes suivantes (Figure 5B). Le sérum recueilli pourrait être centrifugé à nouveau pour s’assurer que le surnageant est exempt de globules rouges. Le sérum a été filtré à travers un filtre de 0,22 μm dans un flacon de gouttes ophtalmiques stérile (figures 3F, G). Le produit final, les gouttes ophtalmiques mACS, a ensuite été réfrigéré ou congelé dès que possible, selon l’usage (Figure 3H). Les gouttes ophtalmiques ne pouvaient pas être conservées trop longtemps en raison de leur richesse en nutriments labiles et du manque de conservateurs.
Dans le modèle de cicatrisation de surface ex vivo , le collyre mACS a montré un résultat supérieur dans la cicatrisation des plaies cornéennes par rapport au collyre SA. La récolte des globes oculaires de souris C57BL / 6 a été effectuée après la création d’une plaie cornéenne concentrique par abrasion physique au microscope. Ensuite, les yeux des souris sacrifiées ont été cultivés dans quatre milieux différents, y compris la solution saline normale pure, DMEM, 0,5% AS et 0,5% mACS.
Le milieu AS utilisé ici a été préparé sur la base de la littérature21 et de la pratique clinique de l’hôpital Chang Gung Memorial de Linkou. Le sang veineux, 40 ml au total, a été aspiré dans des tubes vacutainer de volontaires après stérilisation de la peau. Aucun anticoagulant n’a été ajouté aux tubes. Le sang a ensuite été stocké pendant 30 min à température ambiante pour assurer une coagulation complète suivie d’une centrifugation à 3 500 × g pendant 10 min. Après centrifugation, l’AS pur occupait la couche supérieure des tubes, qui a été diluée par BSS (solution irrigante stérile) à 0,5% dans ce modèle animal ex vivo .
Les plaies cornéennes ont été observées séquentiellement à six moments différents, à savoir 0, 8, 16, 24, 32 et 48 h. Les résultats préliminaires ont montré qu’à 16 h, les plaies cornéennes guérissaient plus rapidement sous le collyre mACS à 0,5% que les autres groupes. À 24 h, les groupes AS et DMEM à 0,5 % avaient des effets thérapeutiques comparables à ceux du collyre mACS à 0,5 %. Une cicatrisation des plaies cornéennes, proche de la guérison complète, a été observée à 32 h, sauf pour le groupe salin normal (Figure 4).
Figure 1 : Matériaux nécessaires pour ajouter une solution de glycérol à 10 % dans les tubes. (A) Kit de perfusion à ailes papillon de 21 g. (B) 250 mL de solution de glycérol à 10 %. (C) Six tubes vacutainer de 10 mL contenant de l’héparine 158 unités USP. (D) Seringue de 3,0 mL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Matériaux d’extraction et de filtration du surnageant de l’échantillon de sang. (A) Un filtre de 0,22 μm. (B) Un flacon de gouttes ophtalmiques stérilisé de 5 mL. (C) Une paire de gants stériles. (D) Une seringue de 3 mL avec l’aiguille de 23 G. (E) Une seringue de 20 mL. f) aiguilles de 18 g. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Procédures de centrifugation sanguine et préparation pour la production de gouttes ophtalmiques sériques autologues autologues modifiées. (A) 0,5 mL de solution de glycérol à 10 % a été ajouté dans chaque tube à essai. (B) L’échantillon de sang prélevé sur le patient a été divisé également en six tubes à essai (un seul montré sur l’image). (C) Aspect de la tube à essai après avoir été placé dans un incubateur à 37 °C pendant 4 h. (D) Les couches de sérum et de cellules sanguines après centrifugation. (E) Le résidu après aspiration du surnageant. Il faut faire attention à ne pas aspirer la couche inférieure de cellules sanguines. (F) Le surnageant est recueilli dans la seringue de 3 mL et un filtre de 0,22 μm et une aiguille de 23 G sont insérés en dessous. (G) L’aiguille est doucement enfoncée dans le flacon de gouttes ophtalmiques stérile. (H) Produit final des gouttes ophtalmiques ACS modifiées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Changements séquentiels des plaies cornéennes (zones vertes dans les figures après coloration à la fluorescéine) dans les yeux murins dans quatre milieux de culture différents au fil du temps. Aucune différence significative n’a été observée dans le groupe salin, tandis que la cicatrisation des plaies (flèches) au fil du temps a été observée dans les groupes DMEM, 0,5% SA et 0,5% mACS. Dans le groupe mACS à 0,5%, la cicatrisation (flèches) était significativement plus complète à 16 h que celles traitées par SA et DMEM. À 24 h, les groupes DMEM, 0,5% mACS et 0,5% AS ont montré d’autres effets curatifs (flèches), en particulier dans le groupe mACS. Une récupération presque totale a été observée à 32 heures pour tous les groupes, à l’exception du groupe salin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Exemples de produits sanguins de mauvaise qualité après centrifugation. (A) Dyslipidémie. Les produits défectueux les plus courants sont dus à l’obésité ou au diabète sucré, car le sérum supérieur contient beaucoup de graisses et de cholestérol. b) Hémolyse. Il s’agit également d’un produit sous-optimal courant. La raison principale peut être attribuée à l’utilisation d’aiguilles de petit calibre pour le prélèvement sanguin ou à l’utilisation d’une force externe inappropriée lors de l’injection de produits sanguins. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, un protocole pour la préparation du mACS est décrit et le bénéfice des gouttes ophtalmiques mACS dans la cicatrisation des plaies de modèles animaux est également démontré. La modification cruciale de ce protocole mACS est l’ajout d’environ 0,5 mL de solution de glycérol à 10% dans chaque tube à essai, ce qui crée des conditions hypoxiques appropriées pendant l’incubation de 4 heures à 37 °C. Ce réglage fournit à l’AS un stress approprié et incite les cellules à sécréter les facteurs de croissance nécessaires qui aident à la cicatrisation des plaies. Le filtre de 0,22 μm peut aider à éliminer les protéines macromoléculaires, les cellules sanguines et les impuretés, rendant ainsi le produit final pur et moins adhésif.
Le sang est incubé pendant 4 h à 37 °C, et une centrifugation et une filtration supplémentaires sont effectuées. Une attention stricte à la stérilité lors de la préparation et du stockage des produits finis à une température appropriée est également cruciale. La teneur élevée en nutriments des produits sériques finaux est un excellent milieu de culture pour les bactéries. Ainsi, un stockage inapproprié ou une contamination pendant la préparation peut gâcher les gouttes oculaires. Le mACS contaminé peut causer des maladies telles que la conjonctivite ou la kératite infectieuse.
La qualité du sang du patient est également importante; par conséquent, des tests de laboratoire sont nécessaires avant la préparation du mACS pour assurer la sécurité des produits sanguins. Lors du prélèvement et de l’utilisation des échantillons de sang du patient, les opérateurs doivent être conscients de l’hémolyse. Toute pression pendant la préparation peut facilement provoquer une hémolyse; Par conséquent, la seringue doit être tirée et poussée lentement pendant la collecte de sang. L’hypoxie doit également être contrôlée pour obtenir des concentrations élevées de facteurs de croissance et de cytokines anti-inflammatoires. Sur la base de l’expérience et des études publiées précédemment22,23, l’application d’une incubation hypoxique de 4 h est le cadre ultime. Le glycérol pourrait fournir un stress hypoxique plus approprié à la cellule, en raison de l’effet stabilisateur et de la pression de fluide extracellulaire osmotique appropriée qu’il peut fournir18. Cependant, la concentration optimale de glycérol et sa corrélation avec la concentration de cytokines doivent encore être vérifiées. À l’avenir, des études in vivo sur la cicatrisation des plaies chez les animaux et un essai contrôlé randomisé à plus grande échelle seront justifiés pour confirmer son efficacité.
Jusqu’à présent, la recherche s’est principalement concentrée sur l’application de produits sériques aux maladies de la surface oculaire en utilisant la SA traditionnelle et les gouttes ophtalmiques PRP émergentes24,25,26,27. La SA traditionnelle sans anticoagulant et n’utilisant aucun filtre pendant la préparation est ambrée dans sa forme pure, mais rend souvent les patients mal à l’aise en raison de son adhérence. En conséquence, l’AS dilué (20%-50%) est généralement utilisé, ce qui abaisse les concentrations des nutriments. Le PRP, cependant, est moins adhésif et généralement utilisé sous sa forme pure (100%). Les rapports de littérature récents soulignent principalement que le PRP offre de meilleurs effets anti-inflammatoires et cicatrisants que la SA, principalement en raison de sa riche teneur en cytokines anti-inflammatoires, facteurs de croissance et de sa capacité à atténuer l’inflammation induite par l’IL-1β16,26. Un essai contrôlé randomisé mené par García-Conca et al. a déjà révélé que l’application de PRP dans les maladies hyposécrétoires sévères ou modérées de la sécheresse oculaire donne des résultats satisfaisants28. Bien que le SCA, en tant qu’amélioration par rapport à la SA, ait rarement été signalé dans les maladies inflammatoires et dégénératives de la surface oculaire, il a été largement utilisé dans le traitement de l’arthrite dégénérative et la cicatrisation des plaies en orthopédie 29,30,31. L’ACS le plus courant a été fabriqué et breveté en kit commercial13,32. mACS a été conçu après avoir ajusté le processus de préparation de l’ACS pour combiner les forces de l’ACS et du PRP. mACS peut être produit à un coût plus économique car aucun réactif spécial n’est nécessaire, tel que les billes de verre revêtues de CrSO4 ou tout autre kit breveté, qui sont nécessaires à la préparation de l’ACS et du PRP.
Outre les préoccupations économiques, les gouttes ophtalmiques mACS ont également fourni des résultats préliminaires satisfaisants dans une expérience ex vivo et peuvent constituer une alternative révolutionnaire aux gouttes ophtalmiques PRP émergentes actuelles. Il convient de noter que le SCA a démontré de meilleurs résultats que la plupart des traitements établis dans les maladies articulaires inflammatoires, tant sur le plan qualitatif que quantitatif, en raison de sa capacité anti-inflammatoire et de ses mécanismes de réparation endogènesaméliorés 17. Bien qu’il n’existe aucune preuve documentaire des effets thérapeutiques du SCA en ophtalmologie à ce jour, il est raisonnable de supposer le potentiel de son application aux patients présentant des défauts épithéliaux cornéens en raison de son mécanisme anti-inflammatoire et du succès en orthopédie33. Seul la SA a été comparée au mACS dans notre étude ex vivo ; cependant, le PRP et l’ACS produits via des kits commerciaux peuvent également être comparés. Des recherches futures sur l’analyse des taux sériques de cytokines anti-inflammatoires et de facteurs de croissance dans le mACS seraient utiles pour confirmer sa similitude avec le SCA ou le PRP, et sa supériorité potentielle avec la SA.
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Disclosures
Tous les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Ya-Lan Chien et-Ying Lee pour leur excellente assistance technique, et OnLine English Company pour l’édition linguistique. Cette étude a été financée en partie par Chang Gung Medical Research Project (subvention n° CMRPG3L1491).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
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