Summary
تبشر جدوى وفعالية طرق scRNA-seq عالية الإنتاجية بعصر الخلية الواحدة في أبحاث النبات. يظهر هنا إجراء قوي وكامل لعزل أنواع معينة من خلايا جذر Arabidopsis thaliana وبناء مكتبة النسخ اللاحقة وتحليلها.
Abstract
في الكائنات الحية متعددة الخلايا، يمكن أن تكون البرمجة التنموية والاستجابات البيئية متباينة للغاية في أنواع الخلايا المختلفة أو حتى داخل الخلايا، وهو ما يعرف بعدم التجانس الخلوي. في السنوات الأخيرة ، أصبح عزل الخلية الواحدة ونوع الخلية جنبا إلى جنب مع تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) أدوات مهمة لدراسة العمليات البيولوجية بدقة خلية واحدة. ومع ذلك، فإن عزل الخلايا النباتية أكثر صعوبة نسبيا بسبب وجود جدران الخلايا النباتية، وهو ما يحد من تطبيق نهج الخلية الواحدة في النباتات. يصف هذا البروتوكول إجراء قويا لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) القائم على عزل الخلية الواحدة ونوع الخلية مع الخلايا النباتية ، وهو مناسب للتحليل متعدد الأوميكس المصب والدراسات الأخرى. باستخدام خطوط علامات الفلورسنت الجذرية Arabidopsis ، نوضح كيف يتم عزل أنواع معينة من الخلايا ، مثل خلايا pericycle ذات قطب الخشب ، والخلايا الأولية للجذر الجانبي ، وخلايا غطاء الجذر الجانبي ، وخلايا القشرة ، وخلايا الأديم الباطن. علاوة على ذلك ، يتم أيضا توفير طريقة فعالة لتحليل النسخ النهائي باستخدام Smart-seq2. يمكن تكييف طريقة عزل الخلايا وتقنيات تحليل النسخ مع أنواع الخلايا والأنواع النباتية الأخرى ولها إمكانات تطبيق واسعة في علوم النبات.
Introduction
الخلايا هي الوحدة الأساسية لجميع الكائنات الحية وتؤدي وظائف هيكلية وفسيولوجية. على الرغم من أن الخلايا في الكائنات متعددة الخلايا تظهر تزامنا واضحا ، إلا أن الخلايا من أنواع مختلفة وخلايا فردية تظهر اختلافات في نسخها أثناء التطور والاستجابات البيئية. يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية عالي الإنتاجية (scRNA-seq) قوة غير مسبوقة لفهم عدم التجانس الخلوي. ساهم تطبيق scRNA-seq في علوم النبات في بناء أطلس الخلايا النباتية1 بنجاح ، وقد تم استخدامه لتحديد الأصناف الخلوية النادرة في الأنسجة النباتية2 ، وقدم نظرة ثاقبة لتكوين أنواع الخلايا في الأنسجة النباتية ، وتم استخدامه لتحديد الهوية الخلوية والوظائف المهمة المستخدمة أثناء تطوير النبات وتمايزه. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن استنتاج مسارات النمو الزماني المكاني في الأنسجة النباتية1،2،3 لاكتشاف جينات علامة جديدة4 ودراسة وظائف عوامل النسخ المهمة5 باستخدام scRNA-seq من أجل الكشف عن الحفظ التطوري لنفس نوع الخلية في النباتات المختلفة 3. تعد الضغوط اللاأحيائية من بين أهم التأثيرات البيئية على نمو النبات وتطوره. من خلال استكشاف التغييرات في تكوين أنواع الخلايا في الأنسجة النباتية في ظل ظروف معالجة مختلفة من خلال تسلسل النسخ أحادي الخلية ، يمكن للمرء أيضا حل آلية الاستجابة للإجهاد اللاأحيائي6.
تعتمد إمكانية حل عدم تجانس النسخ بين أنواع الخلايا باستخدام تسلسل scRNA على طريقة عزل الخلية ومنصة التسلسل. فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لعزل مجموعة فرعية من الخلايا من أجل scRNA-seq بناء على تشتت الضوء وخصائص مضان الخلايا. وقد أدى تطوير خطوط علامات الفلورسنت بواسطة التكنولوجيا المحورة وراثيا إلى تحسن كبير في كفاءة عزل الخلايا بواسطة نظام مراقبة الأصولالميدانية 7. إن إجراء scRNA-seq باستخدام Smart-seq28 يعزز القدرة على تشريح عدم التجانس الخلوي. تتمتع طريقة Smart-seq2 بحساسية جيدة للكشف عن الجينات ويمكنها اكتشاف الجينات حتى مع إدخال نسخة منخفضة9. بالإضافة إلى جمع نوع الخلية السائبة ، توفر أجهزة فرز الخلايا الحديثة تنسيق فرز فهرس أحادي الخلية ، مما يسمح بتحليل النسخ بدقة خلية واحدة باستخدام Smart-seq210 أو طرق RNA-seq متعددة الإرسال الأخرى ، مثل CEL-seq211. يمكن استخدام الفرز أحادي الخلية أو نوع الخلية للعديد من التطبيقات النهائية الأخرى ، مثل الدراسات المتوازية متعددة الأوميكس12،13. يظهر هنا بروتوكول قوي ومتعدد الاستخدامات لعزل أنواع الخلايا النباتية، مثل خلايا البريسيكل ذات القطب الزاكيل، وخلايا غطاء الجذر الجانبي، والخلايا الأولية للجذر الجانبي، وخلايا القشرة، وخلايا الأديم الباطن من جذور خطوط خلايا علامة أرابيدوبسيس ثاليانا بواسطة FACS. يتضمن البروتوكول أيضا إنشاء مكتبة Smart-seq2 لتحليل النسخ النهائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تحسين البروتوكول التالي لبذور A. thaliana من النوع البري (WT) بدون خطوط مضان وعلامات فلورية لأنواع الخلايا الجذرية التالية: خلايا pericycle قطب نسيج الخشب (J0121) ، والخلايا الأولية للجذر الجانبي ، وخلايا غطاء الجذر الجانبي (J3411) ، وخلايا الأدمة الداخلية والقشرة (J0571) (الشكل 1A). تم الحصول على جميع خطوط العلامات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد) ، باستثناء خط علامة خلية بدء الجذر الجانبي ، والذي تم إنشاؤه عن طريق إدخال بنية GFP مدفوعة بمحفز GATA23 في نبات أرابيدوبسيس من النوع البري بعد تقرير نشرسابقا 14.
1. تحضير المواد النباتية
- تعقيم بذور A. thaliana WT وبذور خط علامة الفلورسنت عن طريق احتضان البذور في مبيض بنسبة 20٪ في حاضنة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- شطف البذور في الماء المقطر المزدوج (ddH2O) ثلاث إلى خمس مرات. نفذ هذه الخطوة على مقعد نظيف معقمة.
- قم بطلاء بذور خط WT والمراسل على وسط Murashige و Skoog (MS) بنصف قوة مع 0.8٪ أجار (وزن / حجم) 15. قم بزراعة النباتات عموديا لمدة 5 أيام (16 ساعة ضوء عند 23 درجة مئوية) بعد التقسيم الطبقي لمدة يومين عند 4 درجات مئوية.
2. البروتوبلاستينج
- تحضير المحاليل البروتوبية 2,5 ، المشار إليها باسم الحل أ والمحلول ب (انظر جدول المواد).
- تحضير المحلول A الذي يحتوي على 400 مللي مول مانيتول ، 0.05٪ BSA ، 20 مللي مول MES (درجة الحموضة 5.7) ، 10 مللي مول CaCl2 ، و 20 مللي مول KCl (انظر جدول المواد). قم بتخزين المحلول أ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
- قم بإعداد المحلول B بإضافة 1٪ (w / v) السليولاز R10 ، 1٪ (w / v) السليولاز RS ، 1٪ (w / v) هيميسيلولاز ، 0.5٪ (w / v) pectolyase ، و 1٪ (w / v) macerozyme R10 في حصة جديدة من المحلول A. قم بتخزين المحلول B عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- قم بإذابة المحلول (أ) والمحلول (ب) برفق على الجليد قبل بدء التجربة.
- اقطع الجذور باستخدام شفرة أو مقص نظيف ، واقطع الجذور إلى قطع ~ 0.5 سم. اغمر الجذور في 1.5 مل من المحلول B متبوعا بدوران لطيف (عند حوالي 18 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5-2 ساعة.
- قم بتصفية البروتوبلاستيدات الجذرية من خلال شبكة مصفاة 40 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
- شطف شبكة مصفاة مع 1-2 مل من محلول A.
- الجمع بين السوائل من الخطوة 2.4 والخطوة 2.5 ، وأجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500-600 ميكرولتر من المحلول أ ، ثم ضعها على الثلج على الفور.
- انقل محلول الخلية المعاد تعليقه إلى أنبوب اختبار جديد سعة 5 مل لفرز الخلايا.
3. فرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACS)
- قم بتشغيل وإنهاء خطوات إعداد الجهاز على آلة الفرز (انظر جدول المواد). حدد قنوات التألق ، واستخدم مصنع WT (بدون مضان) كعنصر تحكم لتحديد خط الأساس للتألق الذاتي ، واضبط بوابة الفرز بناء على شدة التألق ومفردات FSC / SSC (الشكل 2).
- أضف 500 ميكرولتر من المحلول A (الخطوة 2.1.1) إلى أنبوب تجميع سعة 1.5 مل لمنع تلف الخلايا. اجمع 2000-3000 خلية لكل أنبوب.
- بعد الفرز ، ضع العينات على الفور على الجليد ، وطرد مركزي أنبوب التجميع الذي يحتوي على الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
- خذ 2 ميكرولتر من الخلايا المصنفة ، وتحقق من مضان باستخدام مجهر مضان (انظر جدول المواد).
- قم بتخزين الخلايا التي تم فرزها في -80 درجة مئوية ، أو استخدمها على الفور لبناء المكتبة (الخطوة 4).
- لفرز فهرس الخلية الواحدة ، ضع لوحة 96 بئرا في المحول. قم بمعايرة موضع اللوحة بحيث تسقط القطرة في الفتحة المركزية للوحة. حدد وضع الفرز أحادي الخلية عند الفرز ، وأدخل العدد المستهدف للخلايا التي تم فرزها ك 1 ، وابدأ الفرز.
4. إعداد مكتبة smart-seq2
- نتيجة للكمية المنخفضة للغاية من المدخلات ، قم بإجراء إنشاء مكتبة RNA-seq من نوع خلية واحدة في بيئة خالية من التلوث. قبل البدء في التجربة ، قم بتنظيف المقعد باستخدام مطهر سطحي8 (انظر جدول المواد) و 75٪ إيثانول.
- تحضير محلول التحلل (الخليط أ) (الجدول 1) عن طريق الجمع بين 0.33 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 ، و 0.55 ميكرولتر من مثبط RNase ، و 0.22 ميكرولتر من 0.1 M DTT (انظر جدول المواد).
- أضف 1 ميكرولتر من الخليط أ إلى العينة التي تم فرزها ، وطحنها بمدقة معقمة. حجم العينة المفضل هو ≤0.5 ميكرولتر ؛ استخدم الماء الخالي من RNase لتعويض الحجم إلى 14 ميكرولتر. انقل كل عينة خلية مفردة إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل رقيق الجدران سعة 0.2 مل.
- تحضير الخليط B الذي يحتوي على 0.44 ميكرولتر من أوليجو dT30VN للنسخ العكسي (RT) التمهيدي للتفاعل (100 ميكرومتر) و 4.4 ميكرولتر من dNTPs (10 mM) (الجدول 2) (انظر جدول المواد).
- أضف 4.4 ميكرولتر من الخليط B إلى 14 ميكرولتر من العينة في كل أنبوب ، ماصة بلطف لخلط العينة ، واحتضان العينة عند 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد الحضانة ، ضع العينات على الفور على الجليد لتهجين oligo-dT إلى ذيل poly A.
- تحضير خليط تفاعل النسخ العكسي (الخليط C) (الجدول 3) (انظر جدول المواد). أضف 21.6 ميكرولتر من الخليط C إلى كل أنبوب يحتوي على العينات. قم بتشغيل برنامج RT على أداة PCR شائعة (الجدول 4).
- قم بإجراء تفاعل التضخيم المسبق على الجليد. تحضير الخليط D عن طريق الجمع بين 44 ميكرولتر من 2x PCR مزيج البلمرة و 0.88 ميكرولتر من IS PCR التمهيدي (10 ميكرومتر) (الجدول 5) (انظر جدول المواد). أضف 40.8 ميكرولتر من الخليط D إلى 40 ميكرولتر من منتج تفاعل RT ، وقم بتشغيل برنامج التضخيم المسبق (الجدول 6).
- تنقية منتجات تفاعل التضخيم المسبق باستخدام حبات Ampure XP (انظر جدول المواد). أضف 48 ميكرولتر من الخرز (نسبة 0.6: 1) إلى كل عينة من الخطوة 4.7 ، وامزج العينات برفق عن طريق الماصة.
- احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ضع الأنابيب سعة 1.5 مل التي تحتوي على العينات على حامل فصل مغناطيسي لمدة 5 دقائق. تخلص بعناية من المادة الطافية من العينات دون إزعاج الخرز.
- اغسل الخرزات عن طريق تعليقها في 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ ، وضع العينات على حامل الفصل المغناطيسي (انظر جدول المواد) لمدة 3 دقائق أخرى قبل التخلص من المادة الطافية المحتوية على الإيثانول.
- جفف العينات في الهواء لمدة 10 دقائق ، وقم بتغطية الأنبوب لمنع التلوث والتلوث المتبادل أثناء التجفيف بالهواء.
- أعد تعليق الخرزات في 20 ميكرولتر من ddH2O ، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، ثم ضعها على حامل الفصل المغناطيسي لمدة 5 دقائق.
- تقوم ماصة بإخراج 18 ميكرولتر من المادة الطافية من كل أنبوب ، ونقل العينات إلى أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 1.5 مل. استخدم 1 ميكرولتر من العينة لتقييم جودة cDNA باستخدام مجموعة تقدير كمية الحمض النووي ، وتحديد توزيع حجم كل مكتبة مسبقة باستخدام محلل شظايا (انظر جدول المواد) ، وتخزين العينة المتبقية عند -20 درجة مئوية.
- أنشئ مكتبة cDNA8 لتسلسل Illumina 16 من منتج ما قبل المكتبة للخطوة4.13 باستخدام مجموعة إعداد مكتبة التسلسل (انظر جدول المواد).
- تنقية المكتبات (من الخطوة 4.14) باستخدام حبات Ampure XP ، وتحديد المكتبات المنقاة ، وتحديد توزيع حجم كل مكتبة باتباع الخطوة 4.13.
ملاحظة: قم بتجميع نانومول متساو لكل مكتبة ، مما يضمن عدم وجود أي منها على نفس المجموعة من فهرس Illumina. خلاف ذلك ، يمكن تجميع المكتبات بنسبة بناء على إخراج التسلسل المطلوب وتسلسلها معا على نفس الممر من جهاز تسلسل Illumina. بشكل عام ، يوفر تسلسل كل مكتبة على عمق 4-6 جيجابايت ، مما ينتج عنه >10 ملايين قراءة محددة ، تغطية 20x-30x لجينوم Arabidopsis . أعماق التسلسل المنخفضة مقبولة أيضا ولكنها قد تؤثر على أهمية تحليل التعبير التفاضلي.
5. تحليل بيانات RNA-seq
- قم بقص القراءات الخام باستخدام Trim-Galore17 متبوعا بتعيين الجينوم المرجعي باستخدام hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2) ، وقم بإزالة الأجزاء المكررة من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
- إجراء معالجة العد الخام والتحليل اللاحق للجينات المعبر عنها تفاضليا (DEG) باستخدام DESeq220 باستخدام ثلاث نسخ بيولوجية على الأقل لكل عينة. قم بإجراء تجميع للتعبير الجيني باستخدام حزمة Pheatmap ، وتصور في خريطة حرارية للتعبير.
ملاحظة: تم حساب قيم RPKM (قراءات لكل كيلوقاعدة لكل مليون قراءة معينة) للجينات و TEs (العناصر القابلة للنقل) باستخدام Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) وتصورها في متصفح الجينوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عزل البروتوبلاست
هذا البروتوكول فعال لفرز البروتوبلاست لخطوط علامة الجذر الفلورية A. thaliana. تم تطوير خطوط العلامات هذه عن طريق اندماج البروتينات الفلورية مع الجينات المعبر عنها على وجه التحديد في أنواع الخلايا المستهدفة ، أو باستخدام خطوط مصيدة المحسن (الشكل 1). تم تشريح العديد من الأنسجة والأعضاء إلى أنواع خلايا تعبر عن علامات فلورية محددة في النباتات والمحاصيل النموذجية.
محتوى FACS والخلايا التي تم فرزها ومراقبة الجودة للمكتبة
باستخدام نبات من النوع البري كبوابات تحكم وضبط مثل التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) ، حددنا مجموعة كبيرة من الخلايا ذات الأهمية وخط أساس للتألق الذاتي ونجحنا في فرز الخلايا المميزة الخاصة بالتألق (الشكل 2). تم تحديد جودة مكتبات التسلسل النهائي (من الخطوة 4.15) من خلال تحليل توزيع حجم الجزء. يوضح الشكل 3A-D النتائج التمثيلية لمكتبة RNA-seq لحوالي 2000 خلية بريسيكلة نسيج الخشب ، وخلايا الجذر البدائية الجانبية ، وخلايا الجلد الباطن / القشرة ، وخلايا غطاء الجذر الجانبي.
تحليل أنماط التعبير
يمكن تقييم جودة بيانات التسلسل من إجراءات تحليل متعددة ، مثل عمق التسلسل ومعدل التعيين وتقارير fastQC. يمكن إثبات دقة وحساسية بيانات التسلسل من خلال وجود سلسلة من الجينات المخصبة من نوع الخلية ، والتي يمكن تحديدها من تحليل DEG بين أنواع الخلايا المعزولة والأنسجة بأكملها. يمكن تحديد الجينات ذات مستويات التعبير الأعلى بشكل ملحوظ في أنواع معينة من الخلايا على أنها جينات غنية من نوع الخلية. وفي الوقت نفسه ، يمكن مقارنة وجهات نظر متصفح الجينوم لكل نوع من أنواع الخلايا جنبا إلى جنب لإظهار مستويات التعبير عن جينات العلامة المعروفة واختبار ما إذا كان يمكن إعادة بناء نمط التعبير لجينات العلامة في بيانات تعبير نوع الخلية. على سبيل المثال ، تم تجميع الجينات المخصبة في أي من أنواع خلايا الجذر الأربعة وعرضها في خريطة حرارية ، والتي أظهرت خصوصية التعبير الجيني بين أنواع الخلايا المختلفة (الشكل 4). تم فحص YUCCA3 و MYB36 و WOX5 و PFA1 ، وكانت أنماط التعبير كما هو متوقع وفقا للتقارير السابقة21،22،23،24. تتوفر خطوط أنابيب تحليل البيانات وبيانات التسلسل الخام التمثيلية في مستودع عام (github.com/gaolabsjtu/root_cell_types_RNAseq).
الشكل 1: خط علامة نوع الخلية المحدد لإعداد الجذر والبروتوبلاست . (أ، يسار) مقدمة خط مصيدة محسن والصور. (أ، يمين) خط علامة نوع الخلية المحدد للجذر. (ب) صورة لتحضير البلاستيدات الأولية قبل الفرز. تمثل أشرطة المقياس للخلية المؤسسة للجذر الجانبي ، والدراجة الهوائية ، والجلد الباطن / القشرة ، وغطاء الجذر الجانبي ، والبلاستيدات البروتوبلاستية 25 ميكرومتر ، و 100 ميكرومتر ، و 100 ميكرومتر ، و 75 ميكرومتر ، و 20 ميكرومتر ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إنشاء FACS لأنواع معينة من الخلايا الجذرية. مثال على تجربة نظام مراقبة الأصول الميدانية: (أ) السكان الرئيسيون الذين يستخدمون SSC و FSC. (ب) البوابات الإيجابية ل GFP (+) و GFP السلبية (-) ؛ ج: صور الحقل الساطع، (د) الصور الفلورية للخلايا المصنفة. يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توزيع حجم مكتبات تسلسل Smart-seq2. توزيعات حجم الشظايا التمثيلية لمكتبات التسلسل (من الخطوة 4.15) المتولدة من خلايا pericycle قطب نسيج الخشب (A) ، وخلايا الجذر البدائية الجانبية (B) ، وخلايا الأدمة الباطنة / القشرة (C) وخلايا غطاء الجذر الجانبي (D). (ه) مكتبة صغيرة الحجم مع قمم dimer التمهيدي / المحول ، والتي لا يزال من الممكن تسلسلها بعد اختيار الحجم. (و) مكتبة ذات توزيع غير طبيعي للحجم ، مما يشير إلى عدم نجاح إعداد المكتبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل الجينات المخصبة بنوع الخلية. تم إجراء تحليل DEG بين كل نوع خلية والجذر بأكمله. تم تحديد الجينات ذات التنظيم الزائد بأكثر من أربعة أضعاف في كل نوع من أنواع الخلايا على أنها جينات غنية بنوع الخلية. تم دمج هذه الجينات وتجميعها وتصورها في مخطط خريطة الحرارة (اللوحة العلوية). تضمنت الجينات المخصبة بنوع الخلية العديد من جينات العلامات المعروفة. تم اختيار جينات العلامات النموذجية مثل YUCCA3 و MYB36 و WOX5 و PFA1 لتظهر في متصفح الجينوم (اللوحة السفلية). الاختصارات: LRP = الجذر الجانبي البدائي. إندو / كور = الأدمة الباطنة / القشرة. LRC = غطاء الجذر الجانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مكونات | الحجم (ميكرولتر) |
| 10٪ تريتون X-100 | 0.33 |
| مثبطات RNase | 0.55 |
| DTT (0.1 م) | 0.22 |
الجدول 1: مكونات التفاعل لتحضير المخزن المؤقت لتحلل الخلية (الخليط أ).
| مكونات | الحجم (ميكرولتر) |
| Oligo-dT30VN (100 ميكرومتر) | 0.44 |
| dNTPs (10 مللي مول) | 4.4 |
الجدول 2: مكونات التفاعل لتحضير الخليط B.
| مكونات | الحجم (ميكرولتر) |
| مخزن مؤقت SuperScript IV (5x) | 8.8 |
| البيتين (5 م) | 8.8 |
| DTT (0.1 م) | 2.2 |
| MgCl2 (1 م) | 0.264 |
| TSO (100 ميكرومتر) | 0.44 |
| إنزيم النسخ العكسي SuperScript IV (200 وحدة / ميكرولتر) | 2.2 |
| مثبطات RNase | 1.1 |
الجدول 3: مكونات التفاعل لتحضير خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (الخليط C).
| دور | درجة الحرارة (°C) | الوقت |
| 1 | 50 | 90 دقيقة |
| 2-11 | 55 | 2 دقيقة |
| 50 | 2 دقيقة | |
| 12 | 70 | 15 دقيقة |
| 13 | 4 | ∞ |
الجدول 4: إعدادات تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT) لتوليف cDNA من mRNA.
| مكونات | الحجم (ميكرولتر) |
| كابا هاي فاي هوت ستارت ريدي ميكس (2x) | 44 |
| IS PCR التمهيدي (10 ميكرومتر) | 0.88 |
الجدول 5: مكونات التفاعل لتحضير خليط تفاعل التضخيم المسبق (الخليط D).
| دور | درجة الحرارة (°C) | الوقت |
| 1 | 98 | 5 دقائق |
| 2-13 | 98 | 20 ثانية |
| 67 | 30 ثانية | |
| 72 | 3 دقائق | |
| 14 | 72 | 5 دقائق |
| 15 | 4 | ∞ |
الجدول 6: إعدادات برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل لتفاعل التضخيم المسبق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن للبروتوكول المستند إلى Smart-seq2 إنشاء مكتبات تسلسل موثوقة من عدة مئات من الخلايا8. جودة المواد الأولية ضرورية لدقة تحليل النسخ. FACS هو أداة قوية لإعداد الخلايا ذات الأهمية ، ولكن يجب تحسين هذا الإجراء ، وخاصة خطوة protoplasting ، لتطبيقات النبات. يمكن أيضا استخدام التشريح المجهري لالتقاط الليزر (LCM) أو خلايا التشريح اليدوي كمدخل25,26 ، لذلك يمكن استخدام البروتوكول المقدم هنا في مجموعة متنوعة من الأنواع النباتية وأنواع الخلايا مع أو بدون جينات علامة معروفة.
تحضير المواد النباتية
في بيولوجيا نمو النبات ، يستخدم FACS عادة لعزل مجموعات الخلايا المخصبة التي تعبر عن علامة الفلورسنت. النباتات التي تعبر عن مثل هذه العلامة هي البروتوبلاستيدات ، ويتم فرز البروتوبلاستيدات في النهاية إلى مجموعات فرعية نقية بناء على التعبير عن العلامة الخاصة بنوع الخلية. لذلك ، يجب أن تكون إشارة علامة الفلورسنت قوية ومحددة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على الباحث التحقق من العلامات التي يمكن فرزها مسبقا. يعتمد عدد البذور المطلوبة على مستوى التعبير ، ومكان التعبير عن العلامة ، وعدد الخلايا اللازمة للتطبيقات النهائية ، وعدد النسخ المتماثلة التي يتم فرزها. إذا كان التعبير في نوع خلية واحدة به عدد قليل جدا من الخلايا لكل نبات ، فعادة ما تكون هناك حاجة إلى عدد أكبر من النباتات مما لو تم التعبير عن العلامة في عدد أكبر من الخلايا. من الأفضل تحديد عدد البذور المطلوبة لخطوط العلامات الفردية تجريبيا. من المفيد بشكل خاص إجراء تجارب أولية مع كل خط علامة لتحسين نافذة الفرز ومعرفة عدد الخلايا التي ستنتج عن عدد ثابت من النباتات. إذا كانت المادة التجريبية عبارة عن جذور ، لمنع الجذور من الغرق في الآجار ولتسهيل قطع الجذور النظيفة ، يمكن وضع شبكة ذات حجم مناسب ومعقمة على الآجار المحتوي على الوسط قبل طلاء البذور. يساعد التقسيم الطبقي بدرجة حرارة منخفضة على إنبات البذور وتطورها ، لذلك نقترح تقسيم البذور إلى طبقات عند 4 °C لمدة 2 أيام بعد التعقيم أو الطلاء ثم زراعة النباتات عموديا.
البروتوبلاستيد و FACS
Protoplasting والفرز 5-6 أيام بعد التقسيم الطبقي تعمل بشكل جيد. يجب ترشيح المحلول A والمحلول B باستخدام مصفاة 0.22 ميكرومتر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تخزين المحلول B عند -20 درجة مئوية على مدى فترات زمنية أطول يقلل من كفاءة الإنزيمات. قبل البدء ، يجب إذابة المحلول (أ) والمحلول (ب) برفق على الجليد ، والذي يستغرق حوالي 20 دقيقة. يجب عدم اهتزاز المحلول (ب) ، لأن الاهتزاز يمكن أن يعطل الإنزيمات ويمكن أن يتسبب في تكوين فقاعات مفرطة. يمكن أن يؤدي غسل شبكة المصفاة بالمحلول A عدة مرات إلى زيادة عدد الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.5. كما هو موضح في الخطوة 2.6 ، لا ينبغي استنشاق المادة الطافية بالكامل ، لأن البروتوبلاست في الأسفل بالقرب من الحبيبات ولا يمكن رؤيتها. قبل الفرز ، من الأفضل التأكد من أن تركيز البروتوبلاست حوالي 10 5-10 6 خلايا / مل لتحقيق كفاءة فرز أفضل. عند إعداد تجربة جديدة ، يلزم نفس النسيج من مصنع WT كعنصر تحكم لإعداد بوابة الفرز. في الخطوة 3.1 ، يوصى باختيار قنوات التألق (على سبيل المثال ، PE و FITC) أولا واستخدام عينة تحكم لتحديد السكان الرئيسيين وفقا ل SSC و FSC. بالإضافة إلى ذلك ، يقترح ضبط موضع البوابة عن طريق تغيير جهد قناة التألق للتأكد من أن إشارة التحكم تقع على يسار البوابة (أي أن المجموعة السالبة تقع أقل من 103). يجب أن يقتصر وقت الفرز على 30 دقيقة أو أقل من 60 دقيقة لمنع التغيرات في التعبير الجيني ، والتي قد تحدث بسبب البروتوبلاستينج أو الفرز. بعد الفرز ، يجب جمع عدد صغير من الخلايا التي تم فرزها وفحصها بحثا عن مضان (الخطوة 3.4). يجب إزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت من المادة الطافية لتجنب أي تأثير على بناء مكتبة المصب (الخطوة 3.3).
بناء مكتبة RNA-seq
لبناء مكتبة RNA-seq ، نوصي باستخدام الخلايا مباشرة بعد الفرز لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي. لا ينصح بالبدء بعدد كبير جدا من الخلايا ، لأن هذا قد يؤدي إلى مكتبة ذات جودة رديئة بسبب ردود الفعل غير الكافية. يعتمد عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الخطوة 4.7 والخطوة 4.14 على كمية إدخال الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الدهني. يمكن زيادة عدد الدورات عندما يكون هناك مدخلات أقل أو خفضها عندما يكون هناك المزيد من المدخلات. لذلك ، يوصى بأخذ بعض العينات المختلطة من الخطوة 4.7 والخطوة 4.14 لتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي بنفس إجراء التضخيم ثم تحديد العدد النهائي للدورات بناء على نتائج qPCR قبل التضخيم الرسمي للمكتبة / المكتبة الأولية. بالإضافة إلى ذلك ، قبل خطوة التنقية 4.8 ، يجب موازنة حبات Ampure XP في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل ثم دوامة جيدة. لا ينبغي زيادة حجم الخرز في خطوة التنقية فوق نسبة 0.8: 1. خلاف ذلك ، سيؤدي ذلك إلى زيادة ترحيل dimers التمهيدي. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على المرء تجنب الإفراط في تجفيف الخرز في الخطوة 4.11 لمنع التعليق الصعب. يجب أن يكون متوسط حجم المكتبة التمهيدية المؤهلة حوالي 1.5-2 كيلو بايت وكمية صغيرة من الأجزاء القصيرة (<500 نقطة أساس). تعد توزيعات الحجم غير الطبيعية أو قمم دايمر التمهيدي / المحول صغير الحجم في المكتبات مؤشرات على الجودة الرديئة ، ويجب التخلص من هذه العينات أو الخضوع لجولات أخرى من تنقية الخرز (الخطوة 4.15) (الشكل 3E-F).
القيود
يمكن تطبيق هذا البروتوكول لعزل الخلايا عن الأنسجة النباتية الأخرى والأنواع النباتية الأخرى. ومع ذلك ، فإن عملية عزل الخلايا تعتمد بشكل كبير على إعداد البروتوبلاست. يصعب عزل بعض أنواع الخلايا ، مثل خلايا الأوعية الدموية والخلايا الجنسية الأنثوية ، والتي تقع في داخل الأنسجة و / أو قليلة العدد. بالنسبة للخلايا التي يصعب تحضير البروتوبلاستيدات لها ، يعد فرز النوى المنشط بالفلورة (FANS)27 طريقة اختيارية يمكن استخدامها. وفي الوقت نفسه ، يعتمد استخدام هذا البروتوكول للحصول على أنواع محددة من الخلايا بواسطة FACS على توافر خطوط علامات الفلورسنت. عدم وجود مثل هذه الخطوط الواقية يحد من استخدام هذه الأساليب في المحاصيل ونباتات البستنة. سيكشف تطبيق تقنية RNA-seq أحادية الخلية عالية الإنتاجية في المحاصيل عن جينات واسمات جديدة خاصة بنوع الخلية ، والتي يمكن استخدامها بشكل أكبر لتطوير خطوط علامات من نوع الخلية وتوسيع قدرة التطبيق لدراسات RNA-seq من نوع الخلية القائمة على FACS ودراسات الأوميكس المتعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
أنشأنا هذا البروتوكول في منشأة متعددة الخلايا أحادية الخلية تابعة لكلية الزراعة والبيولوجيا ، جامعة شنغهاي جياو تونغ ، وتم دعمنا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 32070608) ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ (المنحة رقم 20PJ1405800) ، وجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم المنحة Agri-X20200202 ، 2019TPB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript IV buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| Test tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
- Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M.
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
