Summary
Presentamos un protocolo para visualizar directamente las actividades metabólicas en células reguladas por aminoácidos utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada con sonda de óxido de deuterio (agua pesada D2O) (DO-SRS), que se integra con microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones (2PEF).
Abstract
Los aminoácidos aromáticos esenciales (AAA) son componentes básicos para sintetizar nuevas biomasas en las células y mantener las funciones biológicas normales. Por ejemplo, un suministro abundante de AAA es importante para que las células cancerosas mantengan su rápido crecimiento y división. Con esto, existe una creciente demanda de un enfoque de imagen altamente específico y no invasivo con una preparación mínima de la muestra para visualizar directamente cómo las células aprovechan los AAA para su metabolismo in situ. Aquí, desarrollamos una plataforma de imágenes ópticas que combina el sondeo de óxido de deuterio (D2O) con la dispersión Raman estimulada (DO-SRS) e integra DO-SRS con fluorescencia de excitación de dos fotones (2PEF) en un solo microscopio para visualizar directamente las actividades metabólicas de las células HeLa bajo regulación AAA. En conjunto, la plataforma DO-SRS proporciona una alta resolución espacial y especificidad de proteínas y lípidos recién sintetizados en unidades celulares HeLa individuales. Además, la modalidad 2PEF puede detectar señales de autofluorescencia de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavina de forma libre de marcas. El sistema de imágenes descrito aquí es compatible con modelos in vitro e in vivo , lo que es flexible para varios experimentos. El flujo de trabajo general de este protocolo incluye el cultivo celular, la preparación de los medios de cultivo, la sincronización celular, la fijación celular y la obtención de imágenes de muestras con las modalidades DO-SRS y 2PEF.
Introduction
Al ser aminoácidos aromáticos esenciales (AAA), la fenilalanina (Phe) y el triptófano (Tryp) pueden ser absorbidos por el cuerpo humano para sintetizar nuevas moléculas para mantener las funciones biológicas normales1. La Phe es necesaria para la síntesis de proteínas, melanina y tirosina, mientras que Tryp es necesaria para la síntesis de melatonina, serotonina y niacina 2,3. Sin embargo, el consumo excesivo de estos AAA puede aumentar la diana de la vía de la rapamicina (mTOR) en los mamíferos, inhibir la proteína quinasa activada por AMP e interferir con el metabolismo mitocondrial, alterando colectivamente la biosíntesis de macromoléculas y conduciendo a la producción de precursores malignos, como las especies reactivas de oxígeno (ROS) en células sanas 4,5,6. La visualización directa de la dinámica metabólica alterada bajo un exceso de regulación de AAA es esencial para comprender el papel de los AAA en la promoción del desarrollo del cáncer y el crecimiento de células sanas 7,8,9.
Los estudios tradicionales de AAA se basan en la cromatografía de gases (GC)10. Otros métodos, como la resonancia magnética (RM), tienen resoluciones espaciales limitadas, lo que dificulta la realización de análisis celulares y subcelulares de muestras biológicas11. Recientemente, se ha desarrollado la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) para dilucidar el papel de los AAA en la síntesis de lípidos y proteínas en la proliferación del cáncer con biomarcadores no invasivos12,13,14. Sin embargo, esta técnica todavía adolece de profundidades de imagen poco profundas, poca resolución espacial y una amplia preparación de la muestra. A nivel celular, los isótopos estables no tóxicos, como el nitrógeno-15 y el carbono-13, se pueden rastrear con imágenes de isótopos múltiples y espectrometría de masas de iones secundarios a nanoescala para comprender su incorporación en macromoléculas. Sin embargo, estos métodos son destructivos para las muestras biológicas vivas15,16. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es otra técnica poderosa que puede visualizar la dinámica metabólica17. Por otro lado, la lentitud de la exploración durante las imágenes AFM puede provocar una distorsión de la imagen del resultado debido a la deriva térmica.
Desarrollamos una modalidad de imagen biortogonal no invasiva mediante el acoplamiento de la microscopía de dispersión Raman estimulada por sonda de óxido de deuterio (D2O) y la microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones sin marcaje (2PEF). Esta modalidad logra una alta resolución espacial y especificidad química al tomar imágenes de muestras biológicas 18,19,20,21,22,23,24. Este protocolo presenta las aplicaciones de DO-SRS y 2PEF para examinar la dinámica metabólica de los lípidos, las proteínas y los cambios en la proporción redox durante la progresión del cáncer. Dado que elD2Oes una forma isotópica estable del agua, las biomoléculas celulares pueden marcarse con deuterio (D) debido a su rápida compensación con el agua corporal total en las células, formando enlaces carbono-deuterio (C-D) a través del intercambio enzimático21. Los enlaces C-D en macromoléculas recién sintetizadas, incluidos lípidos, proteínas, ADN/ARN y carbohidratos, se pueden detectar en la región silenciosa celular del espectro Raman 20,21,22,25,26,27. Con dos pulsos láser sincronizados, los enlaces C-D de lípidos y proteínas recién sintetizados se pueden mostrar en células individuales a través de imágenes hiperespectrales (HSI) sin extraerlos ni marcarlos con agentes citotóxicos. Además, la microscopía SRS tiene la capacidad de construir modelos tridimensionales (3D) de regiones seleccionadas de interés en muestras biológicas mediante la captura y combinación de un conjunto de imágenes transversales22,26. Con imágenes hiperespectrales y volumétricas en 3D, DO-SRS puede obtener distribuciones espaciales de macromoléculas recién sintetizadas en células individuales, junto con el tipo de orgánulos que facilitan el proceso de promoción del crecimiento del cáncer bajo la regulación AAA22. Además, utilizando 2PEF, podemos obtener señales de autofluorescencia de flavina y nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) con alta resolución, profundidad de penetración profunda y daño de bajo nivel en muestras biológicas21,23,24. Las señales de autofluorescencia de flavina y NADH se han utilizado para caracterizar la homeostasis redox y la peroxidación lipídica en células cancerosas22,26. Como tal, el acoplamiento de DO-SRS y 2PEF no solo proporciona un análisis subcelular de la dinámica metabólica regulada por AAA en células cancerosas con alta distribución espacial, información de especificidad química y preparación mínima de muestras, sino que el método también reduce la necesidad de extraer o marcar moléculas endógenas con reactivos tóxicos. En este protocolo, primero presentamos los procedimientos de preparación deD2Oy aminoácidos, así como el cultivo de células cancerosas. A continuación, se muestran los protocolos de imagen DO-SRS y 2PEF. Finalmente, presentamos los resultados representativos de las imágenes SRS y 2PEF, que demuestran los cambios metabólicos regulados por AAA de lípidos y proteínas, y los cambios en la relación redox en las células cancerosas. En la Figura 1 se destaca una ilustración detallada del proceso.
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Protocol
1. Preparación de los medios
- Prepare 10 mL de control y exceso de AAA en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 50% de D2O.
- Para el medio de control, mida y mezcle 10 mg de polvo de DMEM con 4,7 ml de agua bidestilada (ddH2O) en un tubo cónico de 15 ml. El polvo de DMEM contiene todos los aminoácidos en concentraciones estándar. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada. Añadir 4,7 mL deD2O, 0,5 mL de suero fetal bovino (5% FBS) y 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%). Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada.
- Para el medio de tratamiento 15x Phe, mida y mezcle 10 mg de polvo de DMEM con 4,7 ml de ddH2O, 0,5 ml de FBS (5%) y 0,1 ml de penicilina/estreptomicina (1%) en un tubo cónico de 15 ml. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada. Añadir el exceso de polvo de Phe a una concentración de 924 mg/L al medio. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada.
- Para el medio de tratamiento 15x Tryp, mida y mezcle 10 mg de polvo de DMEM con 4,7 ml de ddH2O, 0,5 ml de FBS (5%) y 0,1 ml de penicilina/estreptomicina (1%) en un tubo cónico de 15 ml. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada. Añadir el exceso de polvo de Tryp a una concentración de 224 mg/L al medio. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada.
- Añadir metionina y treonina a 30,0 mg/mL y 95,0 mg/mL, respectivamente, a todos los tubos cónicos de los pasos anteriores. Vórtice completamente e invierta el tubo. No es necesario añadir piruvato de sodio a los medios de cultivo.
- Filtre los medios de control y tratamiento con un filtro de jeringa de 25 mm con filtros de membrana de polietersulfona de 0,22 μm.
- Selle todos los tubos cónicos contenidos en medios con parafilm y guárdelos a 4 °C durante un máximo de 3 semanas. Antes de tratar las células con medios, caliente todos los medios a 37 °C.
NOTA: Los reactivos en polvo y líquidos deben medirse y combinarse en función del volumen total de medios de tratamiento y control.
2. Preparación de la muestra celular
- Mantener las células de cáncer de cuello uterino (HeLa) en un matraz de cultivo (es decir, T10, T25, etc.) utilizando DMEM estándar suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C y 5% de dióxido de carbono (CO2).
- Sub-cultivo de las células HeLa en una proporción de división de 1:10 hasta alcanzar el 80% o más de viabilidad celular.
- Una vez que las células alcancen el 80% o más de confluencia, proceda a sembrar 2 x 10 5 células por pocillo en una placa de 24 pocillos utilizando DMEM suplementado con0,5 % de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina.
- Antes de la siembra celular, prepare una placa de 24 pocillos con cubreobjetos redondos esterilizados, de poli-d-lisina, recubiertos de laminina, de 12 mm de diámetro. Sumerja los cubreobjetos en etanol al 70% y séquelos suavemente con toallitas sin pelusa. Coloque los cubreobjetos limpios en los pocillos apropiados de la placa.
- Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia en el paso 2.2, lávelas una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x sin iones de magnesio y calcio.
- Añadir tripsina al 0,25% para disociar las células adherentes del matraz e incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 3 min.
- Añadir DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, y recoger las células por centrifugación a 300 x g a temperatura ambiente (RT) durante 3 min.
- Resuspender las células en DMEM suplementado con 0,5% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina.
- Cuente las células usando un hemocitómetro, un microscopio óptico y azul de tripán, y siembre una densidad de 2 x 105 células por pocillo de una placa de 24 pocillos. Alternativamente, se puede utilizar un contador de células automatizado para contar las células.
- Regrese las células a la incubadora a 37 °C y 5% de CO2, y agite suavemente la placa para distribuir las células de manera uniforme.
- Después de 8 h, sustituya el medio de cultivo antiguo por un 50% de D 2 O/exceso de Phe o un 50 % de D2O/exceso de medios Tryp. Devolver las células a la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 36 h.
- Después de 36 h, fije las células en portaobjetos de microscopio.
- Antes de la fijación, prepare los portaobjetos del microscopio con espaciadores de imagen de 9 mm de diámetro y coloque 15 μL de PBS 1x suplementado con iones de calcio y magnesio.
- Enjuague las células con 1x PBS suplementado con iones de calcio y magnesio.
- Agregue 0,5 ml de solución de paraformaldehído (PFA) al 4% libre de metanol y deje la placa debajo de la cubierta de bioseguridad durante aproximadamente 15 minutos.
- Aspire la solución de PFA y enjuague con 1x PBS suplementado con iones de calcio y magnesio dos veces.
- Agregue 1.5 mL de 1x PBS suplementado con iones de calcio y magnesio en cada pocillo.
- Use pinzas estériles para agarrar suavemente los cubreobjetos de cada pocillo. Invierta y coloque el lado que contiene la célula de los cubreobjetos en los espaciadores de imagen para entrar en contacto con el PBS preparado en el paso 2.5.1. Asegúrese de que el lado que no contiene células esté expuesto al aire.
- Con un esmalte de uñas transparente, selle la capa exterior del cubreobjetos con el espaciador de imágenes.
- Guarde los portaobjetos del microscopio a 4 °C cuando no esté tomando imágenes.
3. Medición de espectroscopía Raman espontánea (Figura 2)
- Utilice un microscopio Raman confocal para obtener espectros Raman espontáneos (Figura 2A).
- Encienda el láser girando la llave a la posición ON .
- Haga doble clic en el icono del software LabSpec6 para abrir el software de adquisición.
- Cargue la muestra biológica en el portamuestras directamente debajo de la lente del objetivo.
- En el software, haga clic en el icono de la cámara para encender la cámara de video.
- Ajuste el plano de enfoque para identificar una región de interés con la lente del objetivo de 50x. Mueva el joystick para controlar la traslación del cepillo de la platina XY y gire el joystick para cambiar la profundidad de enfoque.
- Después de elegir la posición para la medición, cambie a la lente del objetivo de 100x con 40 mW de potencia de excitación. Haga clic en el icono rojo Detener para apagar la cámara de video.
- Seleccione una rejilla de 1800 líneas/mm y ajuste el rango de adquisición de 400 cm-1 a 3.150 cm-1.
- Establezca el Tiempo de adquisición en 90 s, la Acumulación en 3 y la Agrupación en 4 para obtener el menor ruido y el espectro más preciso.
NOTA: Estos parámetros de imagen se pueden optimizar para que se ajusten al experimento. - Haga clic en el icono de flecha para activar la visualización en tiempo real.
- Ajuste el desplazamiento Raman (cm-1) a un valor de elección para ajustar con precisión el plano de enfoque.
NOTA: En este experimento, el láser Raman se enfocó en las gotas de lípidos, que contenían una alta concentración de enlaces CH2 . Por lo tanto, se seleccionó para ello un desplazamiento Raman de 2.850 cm-1 que coincidiera con los modos de estiramiento del enlace CH2 . - Ajuste el plano de enfoque con el joystick para optimizar la mejor relación señal-ruido.
- Después de elegir el plano de enfoque, haga clic en el icono rojo Detener para una visualización en tiempo real.
- Seleccione el icono Círculo para iniciar la adquisición del espectro.
- Una vez tomada la región celular, utilice el mismo plano de enfoque para medir el fondo con PBS. Reste el espectro de fondo de cada espectro objetivo subcelular utilizando una aplicación de software de computadora separada, como Origin (Figura 1B).
4. Experimentos de imagen con 2PEF y SRS
NOTA: Las descripciones detalladas de la alineación láser SRS se pueden encontrar en un informe anterior28. Este protocolo se centra en el funcionamiento de un sistema multimodal de imágenes SRS y 2PEF (Figura 2C, D).
- Haga clic en Iniciar para calentar el láser.
- Siga el orden para encender los interruptores principales de la unidad de control y el monitor: 1) presione el interruptor principal de la caja de control IX3-CBH en On, 2) presione el interruptor principal del controlador del panel táctil en On, 3) presione el interruptor principal del adaptador de CA de la fuente de alimentación para LD OBIS 6 Laser Remote conectado al combinador láser principal FV31-SCOMB en Ony 4) presione el interruptor principal del adaptador de CA de la fuente de alimentación para el control remoto láser LD OBIS 6 conectado al combinador láser secundario FV31-SCOMB a On.
- Presione los interruptores principales del detector de fotodiodos de Si y encienda el amplificador de bloqueo.
- Establezca el haz de Stokes en 1.031 nm, el ancho de pulso en 6 ps y la velocidad de repetición en 80 MHz.
- Acoplado al microscopio, configure el sistema picoEmerald suministrado con el haz de bomba sincronizado con una longitud de onda sintonizable de 720-990 nm, un ancho de pulso de 5-6 ps y una tasa de repetición de 80 MHz. La potencia de excitación media tanto de la bomba como de Stokes es de 450 mW. Optimice la potencia de excitación para minimizar el fotodaño de la muestra.
- Utilice un condensador de aceite de alta apertura numérica (NA) (es decir, 1,4 NA) para recoger los Stokes y bombear los haces donde se monta la muestra emitiendo unas gotas en el condensador.
- Monte la muestra en el aceite y coloque una gota de agua grande en la parte superior del portaobjetos del microscopio donde se fija la muestra. Esto es para la lente del objetivo de inmersión en agua.
- Ajuste el amplificador de bloqueo a 20 MHz. Procese la imagen ahora usando el módulo de software de súper resolución.
- Seleccione 512 píxeles x 512 píxeles y 80 μs/píxel para el tiempo de permanencia.
- Una vez que la región celular deseada esté enfocada correctamente, adquiera la imagen. Utilizando el software de adquisición del microscopio, guarde las imágenes como un archivo gráfico .oir de Olympus.
- Adquiere una imagen de fondo a 1.900 cm-1 y resta de todas las imágenes celulares.
- Para realizar la obtención de imágenes de 2PEF, utilice el mismo láser de picosegundos sintonizable y establezca la autofluorescencia sin etiquetas de flavina y NADH en 800 nm y 780 nm, respectivamente.
- Utilice un cubo de filtro de 460 nm/515 nm para recoger la emisión retrodispersada de autofluorescencia de flavina y NADH.
- Ajuste el tiempo de permanencia a 8 μs/píxel y el tamaño de píxel a 512 píxeles x 512 píxeles. Ajuste el parámetro de potencia del obturador láser a 150 mW.
- Para la reconstrucción de imágenes en 3D, ajuste la pérdida Raman estimulada a 2.850 cm-1 (797 nm).
- Una vez que se hayan identificado las células individuales deseadas, registre el láser para escanear desde el plano de enfoque superior para detectar las capas superior e inferior de esas células.
NOTA: Los modelos 3D se generan y guardan como archivos .oir.
5. Análisis de espectros e imágenes
- Análisis de espectros
- Utilice el software Origin u otras aplicaciones relevantes para restar el espectro de fondo de todos los espectros objetivo subcelulares.
- Utilice las operaciones de modelado matemático de MATLAB para procesar los espectros Raman con las funciones integradas del software. Python también se puede utilizar para el procesamiento de espectros.
- El preprocesamiento espectral comienza con la conversión de los archivos en una matriz. Los espectros se interpolan en cada centímetro recíproco.
- Para la validación, grafique los datos sin procesar. Realice la corrección de la línea de base en los espectros sin procesar mediante la función integrada msbackadj en MATLAB. En resumen, la función integrada estima los puntos de línea base en los valores de unidad de separación identificados por los usuarios y devuelve la distancia entre ventanas adyacentes. A partir de los puntos de la línea base, estime y dibuje una línea de regresión. Aplique Suavizado para suavizar la línea de regresión y restar la línea de base de cada espectro sin formato individual.
- Realice la normalización mínima-máxima dividiendo la intensidad Raman de la proteína a 2.930 cm-1 por la intensidad de cada desplazamiento Raman. La señal de 2.930 cm-1 suele ser la intensidad más alta del espectro Raman. Con esta normalización, el valor máximo se transforma en un 1, mientras que el valor mínimo se transforma en un 0. Todos los demás valores se transforman en un decimal entre 0 y 1.
- Promedie los espectros individuales de la misma condición en un solo espectro para reducir el ruido.
- Una vez procesado, utilice aplicaciones, como Origin, para mostrar todos los espectros simultáneamente. Los picos que se muestran en los espectros representan un enlace químico específico o un grupo funcional.
- Análisis de imágenes 3D de gotas lipídicas
- Utilice el software FIJI-ImageJ para procesar todas las imágenes 3D
- Realice las funciones Filtros de paso de banda y Suavizado para las pilas de imágenes 3D.
- Para el análisis de imágenes en 3D, asigne cada gota de lípido a una puntuación esférica calculada midiendo la distancia entre su centro de masa y la superficie. Compara cada partitura esférica con una partitura esférica de una esfera perfecta en el mismo plano euclidiano. Deseche las gotas de lípidos con puntuaciones esféricas bajas y evalúe las gotas de lípidos restantes para determinar su volumen y recuentos.
- Analice el volumen y los recuentos de gotas de lípidos entre diferentes tratamientos para determinar la significación estadística en una aplicación de software estadístico adecuada. En este caso, se utilizó GraphPad Prism.
- Análisis de imágenes hiperespectrales 2D
- Utilice el software FIJI-ImageJ para procesar todas las imágenes hiperespectrales 2D.
- Seleccione el canal 2.930 cm-1 para crear una imagen de máscara que contenga valores 0 y 1. Asigne el fondo a 0 y la región celular a 1.
- Reste el canal de proteína marcado con deuterio (2.175 cm-1) al canal de fondo (1.900 cm-1) para eliminar los efectos fluorescentes.
- Divida el canal proteico resultante marcado con deuterio por el canal proteico (2.930 cm-1) para obtener imágenes radiométricas de la tasa de recambio proteico.
- A continuación, multiplique la imagen de máscara realizada en el paso 5.3.2 por las imágenes radiométricas para eliminar los ruidos de fondo restantes. Como resultado, se genera un fondo oscuro en cada imagen radiométrica.
- Utilice la herramienta Selección a mano alzada en FIJI-ImageJ para segmentar y calcular manualmente las intensidades de píxeles que se muestran en celdas individuales. Las intensidades de píxeles corresponden a las concentraciones del enlace químico que se está visualizando.
- Analice las intensidades de píxeles para determinar la significación estadística en una aplicación de software estadístico adecuada. En este caso, se utilizó GraphPad Prism. Repita este análisis con el análisis radiométrico restante.
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Representative Results
La adición de un exceso de AAA a concentraciones de 15x a los medios de cultivo celular que contienen D2O al 50% produjo distintas bandas C-D Raman de lípidos y proteínas recién sintetizados en células HeLa (Figura 2B). Los experimentos anteriores se realizaron con diferentes niveles de concentración, como 2x y 5x, y aunque no se presentan los datos, la concentración de 15x produjo las bandas C-D Raman más distintivas de lípidos y proteínas recién sintetizados. Específicamente, al investigar las gotas de lípidos (LD), notamos que tanto 15x Phe como 15x Tryp indujeron nuevos lípidos sintetizados y señales de proteínas a 2.143 cm-1 y 2.172 cm-1, respectivamente. Posteriormente, se utilizó DO-SRS para visualizar la distribución espacial de las señales C-D en células individuales (Figura 3). Con ImageJ, las intensidades de píxeles de las celdas individuales se segmentaron y calcularon manualmente, como lo indican los bordes blancos punteados en la Figura 3A. Las células de control muestran bandas moderadas de lípidos y proteínas C-D; sin embargo, el Phe 15x y el Tryp 15x muestran bandas de lípidos y proteínas C-D más fuertes. El análisis cuantitativo indica que el exceso de AAA puede aumentar la síntesis de lípidos en un 10%-17%, pero regular a la baja la síntesis de proteínas en un 10% (Figura 3C, D). Los resultados infieren la posibilidad de una falta de autofagia que acumula lípidos recién sintetizados, promueve la disfunción mitocondrial e induce un desequilibrio oxidativo bajo exceso de regulación AAA7.
Se adquirieron imágenes multimodales de SRS y 2PEF sin marcaje de lípidos insaturados (~3.011 cm-1), lípidos saturados (~2.880 cm-1) y NADH, flavina para comprender los efectos de los AAA en el metabolismo del cáncer. Del mismo modo, las intensidades de píxeles de las celdas individuales se segmentaron manualmente y se calcularon utilizando ImageJ, como se indica en los bordes blancos punteados de la Figura 3B. El análisis radiométrico de las células tratadas con AAA muestra un aumento del 10% en los lípidos insaturados/lípidos saturados y un aumento del 50% en Flavin/Flavina + NADH (Figura 3E,F). En la cadena de transporte de electrones de las mitocondrias, las ROS se pueden generar a partir de la transferencia de electrones de NADH y FADH2 a especies de oxígeno molecular. La acumulación de ROS en muchas células cancerosas da lugar a un desequilibrio oxidativo que oxida los ácidos grasos insaturados, promueve la síntesis de ácidos grasos saturados y agota las señales de autofluorescencia del NADH. Por lo tanto, el aumento observado de Flavin/Flavina + NADH es un indicador de ROS acumulado que reduce las señales de autofluorescencia de NADH. En respuesta al desequilibrio oxidativo, las células HeLa pueden regular al alza su síntesis de lípidos insaturados para reemplazar a los oxidados. Esta respuesta no se observa en otras líneas celulares cancerosas29, lo que significa la heterogeneidad metabólica de las células cancerosas bajo una dieta excesiva de AAA30.
Además de las imágenes multimodales, la SRS puede reconstruir imágenes 3D sin etiquetas de las LD en células HeLa de control y tratadas con AAA. En resumen, la microscopía genera un conjunto de imágenes transversales a lo largo de una región de interés seleccionada. En este estudio, la pérdida Raman estimulada (SRL) se ajustó a 2.845 cm-1 y se escaneó desde la capa superior hasta la capa inferior con un tamaño de paso de 1 μm (Figura 4A). Los análisis cuantitativos de las gotas lipídicas en 3D revelan que las LD redujeron su tamaño, pero aumentaron su número en las células tratadas con AAA en comparación con el control (Figura 4B, C). El aumento de la presencia de aminoácidos hidrofóbicos voluminosos, como Tryp y Phe, puede afectar la función de las proteínas de recubrimiento de LD. Esto, en última instancia, reduce la lipólisis, que acumula numerosas LD pequeñas. Los resultados de las imágenes volumétricas 3D SRS sin etiquetas de este estudio corroboran con estudios previos al visualizar que el exceso de células tratadas con AAA exhibe numerosas LD más pequeñas31,32.
Figura 1: Ilustración de la adquisición y análisis de imágenes con DO-SRS y 2PEF. (A) Una reconstrucción y análisis de imágenes en 3D para adquirir el número de gotas de lípidos, el volumen y la puntuación esférica. (B) Imágenes hiperespectrales y análisis de lípidos marcados con deuterio (CDL; 2.145 cm-1), lípidos (2.845 cm-1), proteínas marcadas con deuterio (CDP; 2.175 cm-1), proteínas (2.940 cm-1), lípidos insaturados (3.011cm-1), lípidos saturados (2.880 cm-1), NADH y Flavin. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración física de la espectroscopia Raman espontánea y la microscopía de dispersión Raman estimulada. (A) Configuración de espectroscopía Raman espontánea utilizada para este estudio. (B) Ejemplo de espectros Raman espontáneos para etiqueta de CD (rojo), sin etiqueta de CD (negro), grupo de control (azul, línea continua), grupo tratado con Phe 15x (rojo, línea punteada) y grupo tratado con Tryp 15x (rosa, línea punteada). (C) Diagrama esquemático de la configuración de microscopía de dispersión Raman estimulada utilizada para esta investigación. (D) Configuración de microscopía de dispersión Raman estimulada utilizada como plataforma DO-SRS y 2PEF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Visualización de la dinámica metabólica en células HeLa mediante microscopía DO-SRS y 2PEF. (A) Lípidos marcados con deuterio (2.145 cm-1), lípidos (2.845 cm-1), proteínas marcadas con deuterio (2.175 cm-1), proteínas (2.940 cm-1) visualizadas en células HeLa bajo control (Ctrl), 15x fenilalanina (15x Phe) y 15x triptófano (15x Tryp) con la plataforma DO-SRS. La tasa de recambio lipídico y la tasa de recambio proteico se calcularon como 
y 
. Las imágenes sin procesar fueron primero sustraídas por la señal PBS para eliminar la intensidad de fondo y enmascaradas para eliminar la intensidad fuera de las celdas usando ImageJ. Para el análisis radiométrico se realizó una división por píxeles. (B) Canales de NADH y Flavina visualizados con microscopía 2PEF, y lípidos insaturados (3.011 cm-1) y lípidos saturados (2.880 cm-1) visualizados con microscopía SRS sin marcaje. La relación redox óptica y la relación de saturación se calcularon con 
y 
. (C-F) Cuantificación de intensidades radiométricas para cada célula HeLa bajo control, 15x Phe y 15x Tryp. La diferencia estadística se utilizó para comparar las condiciones de exceso de AAA con las condiciones de control. p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05 se calcularon a partir de una prueba de ANOVA de dos vías. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Visualización de la distribución 3D de las gotas de lípidos de una sola célula HeLa utilizando un microscopio SRS sin marcas. (A) Proyección del volumen de las gotas lipídicas SRS 3D en células HeLa bajo condiciones de control y exceso de AAA. El umbral se definió antes del análisis, revelando la distribución de la señal de las gotas lipídicas. (B,C) Cuantificación del volumen y los recuentos de gotas lipídicas dentro de las células HeLa individuales en condiciones de grupo control y exceso de AAA mediante la prueba de ANOVA de dos vías. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las imágenes DO-SRS y 2PEF se han aplicado para investigar la dinámica metabólica en varios modelos ex vivo, incluyendo Drosophila y tejidos humanos 21,22,23,24,26,27,33. La modalidad de imagen utilizada en este estudio integra DO-SRS y microscopía 2PEF, que puede superar a otros métodos de imagen específicos de la molécula al eliminar la necesidad de extracción o marcaje de la molécula con reactivos citotóxicos y requerir una preparación mínima de la muestra. En concreto, la microscopía DO-SRS nos permite sondear la lipogénesis de novo y la síntesis de proteínas en animales y células y visualizar su dinámica metabólica in situ23,27,34. El 2PEF captura las señales de autofluorescencia de biomoléculas naturales, como la flavina y el NADH, en muestras biológicas35,36. La profundidad de penetración de la imagen de SRS puede alcanzar hasta 200-500 μm en muestras de menor dispersión37. Con métodos de limpieza de tejidos como la urea, la profundidad de penetración puede aumentar más de diez veces37. El acoplamiento de SRS con 2PEF nos permite obtener imágenes de fluoróforos endógenos como Flavin y NADH en muestras biológicas, lo que elimina aún más la necesidad de biomarcadores exógenos para la detección. 2PEF puede alcanzar una profundidad de penetración de 500 μm38. En comparación con otras modalidades de obtención de imágenes multiplex, como la microscopía de fluorescencia confocal multicolor de fotón único, tanto DO-SRS como 2PEF pueden lograr una profundidad de penetración significativamente mayor sin biomarcadores exógenos citotóxicos.
Para aumentar la resolución espacial de DO-SRS y 2PEF, desarrollamos una herramienta de posprocesamiento de imágenes de deconvolución de puntillismo (A-PoD) basada en estimación de momento adaptativo (Adam)34. A-PoD puede convertir imágenes DO-SRS y 2PEF limitadas por difracción en imágenes superresueltas sin necesidad de mejoras de hardware. Además, el espectro Raman contiene muchos modos de vibración química específicos que se pueden aprovechar para aumentar el número de moléculas detectables. Aprovechando esta ventaja, nuestro laboratorio ha generado además un método de emparejamiento de referencias penalizado (PRF) para distinguir múltiples especies de lípidos en modelos celulares y tisulares36. Estos dos desarrollos técnicos abren nuevas vías para estudiar con más detalle los procesos biológicos a nivel celular y subcelular, que se han utilizado para caracterizar los cambios metabólicos en el cerebro, el cáncer y los procesos de envejecimiento26,27,35.
Una de las principales limitaciones de este protocolo es la concentración y el tiempo de incubación de muestras celulares con D2O para producir bandas Raman C-D distintas y cuantificables. Las líneas celulares más robustas y metabólicamente activas, como las células HeLa, pueden incorporar átomos de deuterio en macromoléculas recién sintetizadas a un ritmo más rápido que las líneas celulares de mamíferos no enfermos, como las células de riñón embrionario humano (HEK), lo que conduce a varias intensidades de C-D observadas para la misma concentración y tiempo de incubación con D2O en dos líneas celulares diferentes21. Además, la administración deD2O a una concentración del 80% o superior durante 48 h puede introducir toxicidad en las muestras celulares. Es necesario un experimento de optimización para identificar la concentración óptima deD2Oy el tiempo de incubación para lograr los resultados deseables.
Un aspecto crítico del protocolo es la integración de las imágenes DO-SRS y 2PEF. Normalmente, las modalidades DO-SRS y 2PEF comparten el mismo láser de excitación de picosegundos, ya que su estrecho ancho de banda puede optimizarse con señales SRS y 2PEF. Aunque nuestra tecnología es de fabricación propia, esta plataforma está disponible comercialmente39. Se requieren equipos adicionales, como dos pulsos láser sincronizados con un modulador, un detector de fotodiodos, un amplificador de bloqueo y los esfuerzos conjuntos de un microscopio de barrido para detectar la señal Raman. D2O se puede comprar fácilmente a proveedores de biotecnología. Por lo tanto, los investigadores pueden acceder a esta tecnología muy fácilmente.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Yajuan Li y Anthony Fung por su apoyo técnico, y al laboratorio Fraley por la línea celular. Agradecemos los fondos iniciales de UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 y Hellman Fellow Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
References
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