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Biochemistry

नैनोडिस्क युक्त बायोएक्टिव एजेंट का निर्माण और लक्षण वर्णन

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65145
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

Summary

यहां, हम नैनोडिस्क युक्त बायोएक्टिव एजेंटों के उत्पादन और लक्षण वर्णन का वर्णन करते हैं। एम्फोटेरिसिन बी नैनोडिस्क को चरणबद्ध तरीके से प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक उदाहरण के रूप में लिया जाता है।

Abstract

नैनोडिस्क शब्द एक असतत प्रकार के नैनोपार्टिकल को संदर्भित करता है जिसमें एक बाइलेयर बनाने वाला लिपिड, एक पाड़ प्रोटीन और एक एकीकृत बायोएक्टिव एजेंट शामिल होता है। नैनोडिस्क को डिस्क के आकार के लिपिड बाइलेयर के रूप में व्यवस्थित किया जाता है जिसका परिमाप पाड़ प्रोटीन द्वारा सीमित होता है, आमतौर पर विनिमय योग्य एपोलिपोप्रोटीन परिवार का सदस्य होता है। कई हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंटों को कण के लिपिड बाइलेयर के हाइड्रोफोबिक वातावरण में उनके एकीकरण द्वारा नैनोडिस्क में कुशलतापूर्वक घुलनशील किया गया है, जिससे व्यास में 10-20 एनएम की सीमा में कणों की काफी हद तक समरूप आबादी उत्पन्न होती है। नैनोडिस्क के निर्माण के लिए अलग-अलग घटकों के सटीक अनुपात की आवश्यकता होती है, प्रत्येक घटक का एक उपयुक्त अनुक्रमिक जोड़, इसके बाद फॉर्मूलेशन मिश्रण का स्नान सोनिकेशन होता है। एम्फीपैथिक पाड़ प्रोटीन अनायास लिपिड / बायोएक्टिव एजेंट मिश्रण बनाने वाले बिखरे हुए बाईलेयर से संपर्क करता है और नैनोडिस्क कणों की एक असतत, सजातीय आबादी बनाने के लिए पुनर्गठित करता है। इस प्रक्रिया के दौरान, प्रतिक्रिया मिश्रण एक अपारदर्शी, टर्बिड उपस्थिति से एक स्पष्ट नमूने में बदल जाता है, जो पूरी तरह से अनुकूलित होने पर, सेंट्रीफ्यूजेशन पर कोई अवक्षेप उत्पन्न नहीं करता है। लक्षण वर्णन अध्ययनों में बायोएक्टिव एजेंट घुलनशीलता दक्षता, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी, पराबैंगनी दृश्यमान (यूवी / विस) अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी और / या प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का निर्धारण शामिल है। यह आम तौर पर सुसंस्कृत कोशिकाओं या चूहों का उपयोग करके जैविक गतिविधि की जांच के बाद होता है। एंटीबायोटिक (यानी, मैक्रोलाइड पॉलीएन एंटीबायोटिक एम्फोटेरिसिन बी) को परेशान करने वाले नैनोडिस्क के मामले में, एकाग्रता या समय के कार्य के रूप में खमीर या कवक के विकास को रोकने की उनकी क्षमता को मापा जा सकता है। सूत्रीकरण की सापेक्ष आसानी, घटक भागों के संबंध में बहुमुखी प्रतिभा, नैनोस्केल कण आकार, अंतर्निहित स्थिरता, और जलीय घुलनशीलता नैनोडिस्क प्रौद्योगिकी के विट्रो और विवो अनुप्रयोगों में असंख्य की अनुमति देती है। वर्तमान लेख में, हम हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंट के रूप में एम्फोटेरिसिन बी युक्त नैनोडिस्क तैयार करने और चिह्नित करने के लिए एक सामान्य पद्धति का वर्णन करते हैं।

Introduction

नवजात डिस्कोइडल उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल) स्वाभाविक रूप से मानव संचार प्रणाली में मौजूद कहीं अधिक प्रचुर मात्रा में गोलाकार एचडीएल के पूर्वज हैं। इन नवजात कणों, जिन्हें प्री-बी एचडीएल भी कहा जाता है, में अद्वितीय और विशिष्टसंरचनात्मक गुण होते हैं। दरअसल, एक गोलाकार कण के रूप में मौजूद होने के बजाय, नवजात एचडीएल डिस्क के आकार के होते हैं। प्राकृतिक और पुनर्गठित डिस्कोइडल एचडीएल पर व्यापक संरचनात्मक लक्षण वर्णन अध्ययनों से पता चला है कि वे एक फॉस्फोलिपिड बाइलेयर से युक्त होते हैं जिनकी परिधि एक एम्फीपैथिक विनिमय योग्य एपोलिपोप्रोटीन (एपीओ) द्वारा सीमित होती है, जैसे कि एपीओए-आई। मानव लिपोप्रोटीन चयापचय में, परिसंचारी नवजात एचडीएल परिधीय कोशिकाओं से लिपिड प्राप्त करते हैं और एक प्रक्रिया में गोलाकार एचडीएल में परिपक्व होते हैं जो एटीपी बाइंडिंग कैसेट ट्रांसपोर्टर ए 1 और लेसिथिन: कोलेस्ट्रॉल एसाइलट्रांसफर्स2 सहित प्रमुख प्रोटीन मध्यस्थों पर निर्भर होता है। यह प्रक्रिया रिवर्स कोलेस्ट्रॉल परिवहन मार्ग के एक महत्वपूर्ण घटक का प्रतिनिधित्व करती है जिसे हृदय रोग के खिलाफ सुरक्षात्मक माना जाता है। इस ज्ञान और डिस्कोइडल एचडीएल के पुनर्गठन की क्षमता से लैस, शोधकर्ताओं ने एथेरोस्क्लेरोसिस 3 के इलाज के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप के रूप में इन कणों को नियोजित कियाहै। संक्षेप में, रोगियों में पुनर्गठित एचडीएल (आरएचडीएल) का जलसेक पट्टिका जमा से कोलेस्ट्रॉल एफ्लक्स को बढ़ावा देता है और पित्त एसिड में रूपांतरण और शरीर से उत्सर्जन के लिए इसे यकृत में लौटाता है। कई जैव प्रौद्योगिकी/फार्मास्युटिकल कंपनियां इसउपचार रणनीति का अनुसरण कर रही हैं।

साथ ही, प्रयोगशाला में इन कणों को उत्पन्न करने की क्षमता ने अनुसंधान गतिविधियों की झड़ी लगा दी है जिसने नए अनुप्रयोगों और नई प्रौद्योगिकियों को जन्म दिया है। एक प्रमुख अनुप्रयोग में देशी जैसे वातावरण में ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को घर देने के लिए लघु झिल्ली के रूप में आरएचडीएलकणों का उपयोग शामिल है। आज तक, सैकड़ों प्रोटीनों को सफलतापूर्वक डिस्कोइडल आरएचडीएल में शामिल किया गया है, और अनुसंधान से पता चला है कि ये प्रोटीन रिसेप्टर्स, एंजाइम, ट्रांसपोर्टर्स आदि के रूप में देशी रचना और जैविक गतिविधि दोनों को बनाए रखते हैं। इन कणों, जिन्हें "नैनोडिस्क" के रूप में जाना जाता है, को संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए उत्तरदायी दिखाया गया है, अक्सर उच्च रिज़ॉल्यूशन6 पर। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन की जांच के लिए इस दृष्टिकोण को डिटर्जेंट मिसेल या लिपोसोम के साथ अध्ययन से बेहतर माना जाता है और परिणामस्वरूप, तेजी से आगे बढ़ रहा है। यह पहचानना महत्वपूर्ण है कि दो अलग-अलग तरीकों की सूचना दी गई है जो एक आरएचडीएल बनाने में सक्षम हैं। "चोलेट डायलिसिस" विधि13 आरएचडीएल बाइलेयर5 में ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के समावेश से संबंधित अनुप्रयोगों के लिए लोकप्रिय है। अनिवार्य रूप से, सूत्रीकरण की इस विधि में डिटर्जेंट सोडियम कोलेट (या सोडियम डीऑक्सीकोलेट; मिसेल आणविक भार [एमडब्ल्यू] 4,200 डीए) युक्त बफर में फॉस्फोलिपिड, एक पाड़ प्रोटीन और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन बनाने वाले एक बाईलेयर को मिलाना शामिल है। डिटर्जेंट प्रभावी रूप से विभिन्न प्रतिक्रिया घटकों को घुलनशील करता है, जिससे नमूने को डिटर्जेंट की कमी वाले बफर के खिलाफ डायलाइज्ड करने की अनुमति मिलती है। डायलिसिस चरण के दौरान, जैसे ही डिटर्जेंट को नमूने से हटा दिया जाता है, एक आरएचडीएल अनायास बनता है। जब इस दृष्टिकोण का उपयोग रुचि के ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को फंसाने के लिए किया जाता है, तो उत्पाद कणों को नैनोडिस्क5 कहा जाता है। छोटे अणु हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंटों (एमडब्ल्यू <1,000 डीए) को शामिल करने के लिए इस विधि का उपयोग करने के प्रयास, हालांकि, काफी हद तक असफल रहे हैं। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के विपरीत, छोटे अणु बायोएक्टिव एजेंट डिटर्जेंट के साथ डायलिसिस बैग से बचने में सक्षम होते हैं, जिससे आरएचडीएल में उनकी निगमन दक्षता बहुत कम हो जाती है। इस समस्या को फॉर्मूलेशन मिश्रण14 से डिटर्जेंट को छोड़कर हल किया गया था। इसके बजाय, घटकों को क्रमिक रूप से एक जलीय बफर में जोड़ा जाता है, जो लिपिड बनाने वाले बाईलेयर से शुरू होता है, जो आरएचडीएल युक्त एक स्थिर बायोएक्टिव एजेंट बनाता है, जिसे नैनोडिस्क कहा जाता है। दूसरों ने विवो इमेजिंग एजेंटों 7 में निगमन और परिवहन के लिए आरएचडीएल का उपयोगकिया है। हाल ही में, विशेष आरएचडीएल में एक एपोलिपोप्रोटीन पाड़ और आयनिक ग्लाइसेरोफॉस्फोलिपिड, कार्डियोलिपिन शामिल हैं, को लिगैंड बाइंडिंग अध्ययनों में नियोजित किया गया है। ये कण कैल्शियम, साइटोक्रोम सी और एंटीकैंसर एजेंट डॉक्सोर्यूबिसिन8 सहित विभिन्न पानी घुलनशील लिगेंड के साथ कार्डियोलिपिन की बातचीत के अध्ययन के लिए एक मंच प्रदान करते हैं।

वर्तमान अध्ययन का ध्यान आरएचडीएल के निर्माण पर है जिसमें एक स्थिर रूप से शामिल हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंट (यानी नैनोडिस्क) है। डिस्कोइडल आरएचडीएल कणों के लिपिड परिवेश में एकीकृत करने के लिए इन एजेंटों की क्षमता प्रभावी रूप से उन्हें जलीय घुलनशीलता प्रदान करती है। जैसे, नैनोडिस्क में विवो चिकित्सीय अनुप्रयोगों में क्षमता है। नैनोडिस्क तैयार करते समय, उत्पाद कण में असतत हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंटों को सफलतापूर्वक शामिल करने के लिए विशिष्ट इनक्यूबेशन / प्रतिक्रिया स्थितियों की आवश्यकता होती है, और इस रिपोर्ट का लक्ष्य विस्तृत व्यावहारिक जानकारी प्रदान करना है जिसे विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए नए नैनोडिस्क कणबनाने के लिए एक मूलभूत टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जा सकता है। इस प्रकार, इस पांडुलिपि के संदर्भ में नैनोडिस्क और नैनोडिस्क शब्द विनिमेय नहीं हैं। जबकि नैनोडिस्क एक आरएचडीएल को संदर्भित करता है जो इसके लिपिड बाइलेयर5 में एम्बेडेड एक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को शामिल करने के लिए तैयार किया जाता है, नैनोडिस्क शब्द कम आणविक भार (< 1,000 डीए) हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंटों को शामिल करने के लिए तैयार किए गए आरएचडीएल को संदर्भित करता है, जैसे एम्फोटेरिसिन बी14।

उपयुक्त पाड़ प्रोटीन के अधिग्रहण के लिए विभिन्न प्रकार के तरीके उपलब्ध हैं। निर्माताओं से पाड़ प्रोटीन खरीदना संभव है [जैसे एपीओए-आई (एसआरपी 4693) या एपीओई 4 (ए 3234)], हालांकि, लागत एक सीमित कारक हो सकती है। एक पसंदीदा दृष्टिकोण एस्चेरिचिया कोलाई में पुनः संयोजक पाड़ प्रोटीन को व्यक्त करना है। प्रोटोकॉल मानव एपीओए -1 9, एपीओई 410, साथ ही कीट हेमोलिम्फ प्रोटीन एपोलिपोफोरिन -3 11 के लिए प्रकाशित किए गए हैं। यहां वर्णित प्रयोगों के उद्देश्य के लिए, पुनः संयोजक मानव एपीओई 4 एन-टर्मिनल (एनटी) डोमेन (एमिनो एसिड 1-183) का उपयोग किया गया था। मानव एपीओई 4-एनटी को एन्कोडिंग करने वाले न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को संश्लेषित किया गया था और वेक्टर-एन्कोडेड पेलबी लीडर अनुक्रम से सीधे सटे पीईटी -22 बी (+) अभिव्यक्ति वेक्टर में डाला गया था। यह निर्माण एक पीईएलबी लीडर अनुक्रम-एपीओई 4-एनटी संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति की ओर जाता है। प्रोटीन संश्लेषण के बाद, बैक्टीरियल पेलबी लीडर अनुक्रम नए संश्लेषित प्रोटीन को पेरिप्लाज्मिक स्पेस में निर्देशित करता है जहां लीडर पेप्टिडेस पेलबी अनुक्रम को छोड़ देता है। परिणामी एपीओई 4-एनटी प्रोटीन, जिसमें कोई अनुक्रम टैग या पूंछ नहीं है, बाद में बैक्टीरिया से बच जाता है और कल्चर माध्यम11,12 में जमा होता है, डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण को सरल बनाता है।

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Protocol

1. पाड़ प्रोटीन घटक का परिवर्तन, अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण

  1. प्लास्मिड युक्त एपीओई 4-एनटी के साथ बीएल 21 जीवाणु परिवर्तन
    1. बर्फ पर बीएल 21 (डीई 3) सक्षम कोशिकाओं की एक ट्यूब को 10 मिनट के लिए पिघलाएं।
    2. एक बार जब सभी बर्फ पिघल जाती है, तो धीरे से और सावधानी से 50 μL कोशिकाओं को बर्फ पर एक परिवर्तन ट्यूब में मिलाएं।
    3. सेल मिश्रण में प्लास्मिड डीएनए के 50 एनजी युक्त 5 μL जोड़ें (अनुक्रम के लिए, पूरक तालिका 1 देखें)। मिश्रण करने के लिए ट्यूब को चार या पांच बार सावधानीपूर्वक फ्लिक करें। भंवर मत करो।
    4. मिश्रण को 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
    5. 10 सेकंड के लिए मिश्रण को ठीक 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    6. 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
    7. कमरे के तापमान पर ट्यूब में एस.ओ.सी. माध्यम का पिपेट 950 μL।
    8. ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस हिलाने वाले इनक्यूबेटर में 60 मिनट के लिए रखें, जिसमें दोलन 250 आरपीएम पर सेट है।
    9. कोशिकाओं को फ्लिक करके और इनवर्ट करके अच्छी तरह से मिलाएं, फिर 100 μL सेल समाधान को 20 एमएल लुरिया ब्रोथ + आगर चयन प्लेट पर फैलाएं, जिसे एम्पीसिलीन के साथ 0.1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर इलाज किया जाता है।
    10. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर, या जब तक दिखाई देने वाली कॉलोनियां विकसित नहीं हो जातीं, तब तक इनक्यूबेट करें।
  2. एक इलेक्ट्रॉनिक पाइपेटर का उपयोग करके, कमरे के तापमान पर बाँझ, एनजेडसीवाईएम माध्यम के 25 एमएल को बाँझ 250 एमएल शंक्वाकार फ्लास्क में स्थानांतरित करें और एम्पीसिलीन को 0.1 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम कार्यशील एकाग्रता में जोड़ें।
  3. बाँझ टीकाकरण लूप का उपयोग करके, उचित रूप से रूपांतरित जीवाणु तनाव वाले चयन प्लेट से एक व्यक्तिगत कॉलोनी को स्थानांतरित करें और सीधे 25 एमएल एनजेडसीवाईएम मीडिया + एम्पीसिलीन युक्त फ्लास्क में जोड़ें।
  4. एनजेडसीवाईएम बीज संवर्धन फ्लास्क के 25 एमएल को 250 आरपीएम पर कक्षीय दोलन सेट के साथ 37 डिग्री सेल्सियस हिलाने वाले इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि इस बीज संस्कृति को एक उपयुक्त जीवाणु एकाग्रता (~ 1.5-2.0 ऑप्टिकल घनत्व इकाइयों) तक पहुंचने के लिए रात भर उगाया जाए, जैसा कि तरंग दैर्ध्य = 600 एनएम पर सेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर सेट का उपयोग करके मापा जाता है।
  5. बाँझ एनजेडसीवाईएम माध्यम के 250 एमएल को चार 1 एल चकरा फ्लास्क में स्थानांतरित करें और 0.1 मिलीग्राम / एमएल की कार्यशील एकाग्रता में एम्पीसिलीन एंटीबायोटिक जोड़ें।
  6. बाँझ परिस्थितियों में, फ्लास्क युक्त चार 250 एमएल कल्चर में से प्रत्येक में 5 एमएल संतृप्त बीज संस्कृति को स्थानांतरित करें और 250 आरपीएम पर कक्षीय दोलन सेट के साथ 37 डिग्री सेल्सियस हिलाने वाले इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: इस बिंदु पर, संस्कृति को एक विस्तार संस्कृति के रूप में संदर्भित किया जाएगा और यूवी 1800 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके घातीय विकास की निगरानी की जाएगी। विकास को तब तक आगे बढ़ने की अनुमति है जब तक कि 600 एनएम (ओडी600) पर संस्कृति ऑप्टिकल घनत्व 0.6-0.8 के बीच के मूल्य तक नहीं पहुंच जाता है।
  7. एक बार जब विस्तार संस्कृति0.6-0.8 के वांछित ओडी 600 मूल्य तक पहुंच जाती है, तो प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 1 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए फ्लास्क युक्त प्रत्येक 250 मिलीलीटर संस्कृति में 59.6 मिलीग्राम आइसोप्रोपिल β-डी-1-थियोगलैक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी) जोड़ें। इस बिंदु पर, विस्तार संस्कृति को अभिव्यक्ति संस्कृति के रूप में जाना जाता है। 5 घंटे की अवधि के लिए अभिव्यक्ति शुरू करें।
  8. 5 घंटे की अभिव्यक्ति अवधि के अंत में, हिलने वाले इनक्यूबेटर से चार फ्लास्क को हटा दें और 125 एमएल को छह 250 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज बोतलों (750 एमएल कुल) में बदल दें।
  9. यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक सेंट्रीफ्यूज बोतल को संतुलित करें कि कुल द्रव्यमान एक दूसरे के ±0.5 मिलीग्राम के भीतर है।
    नोट: सेंट्रीफ्यूज डिवाइस के सुरक्षित संचालन को सुनिश्चित करने के लिए यह कदम आवश्यक है।
  10. सबसे पहले पावर स्विच को ऑन पोजीशन पर फ्लिप करके सेंट्रीफ्यूज डिवाइस तैयार करें। "सेट / वास्तविक" लेबल वाले बटन पर क्लिक करें और संबंधित डायल का उपयोग करके पैरामीटर को "जेए -14", "9,400 एक्स जी", 20.00 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस में समायोजित करें।
  11. छह संतुलित सेंट्रीफ्यूज बोतलों को उचित आकार के सेंट्रीफ्यूज रोटर में लोड करें और किसी भी विशिष्ट सुरक्षा मापदंडों का पालन सुनिश्चित करते हुए सेंट्रीफ्यूज में रखें।
    नोट: इस चरण को तब तक जारी रखें जब तक कि सभी बैक्टीरियल सेल कल्चर सेंट्रीफ्यूज्ड और सुपरनैटेंट एकत्र नहीं हो जाते।
  12. किसी भी अवशिष्ट मलबे को हटाने के लिए वैक्यूम निस्पंदन या समकक्ष उपकरण के माध्यम से पृथक जीवाणु सतह पर तैरने वाले को फ़िल्टर करें।
  13. पुनः संयोजक एपीओई 4-एनटी पाड़ प्रोटीन का हेपरिन शुद्धिकरण
    नोट: कॉलम शुद्धिकरण प्रक्रिया कमरे के तापमान पर आयोजित की जाती है।
    1. 10 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.2 के 10 कॉलम वॉल्यूम (50 एमएल) को लागू करके हाई-ट्रैप हेपरिन कॉलम को बराबर करें, और 5 एमएल / मिनट की दर से एल्यूटिंग करें।
    2. 2.5 एमएल /मिनट की दर से कॉलम पर एपीओई 4-एनटी समृद्ध माध्यम लागू करें जब तक कि माध्यम की पूरी 1 एल मात्रा लागू न हो जाए और प्रवाह को छोड़ दें।
    3. कॉलम को 10 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.2 के 10 कॉलम वॉल्यूम (50 एमएल) के साथ धोएं, और प्रवाह को छोड़ दें।
    4. कॉलम में क्षालन बफर (10 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर + 1.5 एम एनएसीएल, पीएच 7.2) के तीन कॉलम वॉल्यूम (15 एमएल) को लागू करके वांछित एपीओई 4-एनटी प्रोटीन का उपयोग करें और एलुएट एकत्र करें।
  14. एपीओई 4-एनटी एलुएट का डायलिसिस
    1. 10 मिनट के लिए आसुत विआयनीकृत (डीडीआई) पानी में अच्छी तरह से भिगोकर डायलिसिस ट्यूबिंग का एक खंड तैयार करें (डायलिसिस ट्यूबिंग के आयाम लंबाई में 22 सेमी, 12 मिमी आंतरिक व्यास और 10,000 एमडब्ल्यूसीओ थे)।
    2. 1 एल प्लास्टिक बीकर या समकक्ष में 1 एल फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (10 एमएम सोडियम फॉस्फेट + 150 एमएम एनएसीएल, पीएच 7.2) तैयार करें।
    3. डायलिसिस ट्यूबिंग क्लैंप का उपयोग करके, भिगोए हुए डायलिसिस ट्यूबिंग के एक छोर को दबाएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि क्लैंप सुरक्षित है और कोई तरल बच नहीं सकता है।
    4. डायलिसिस ट्यूबिंग के खुले छोर में एक संकीर्ण गर्दन की फ़नल डालें और डायलिसिस ट्यूबिंग में 15 एमएल एपीओई 4-एनटी एलुएट डालें।
      नोट: इस चरण में किसी भी लीक की जांच करना अनिवार्य है।
    5. फ़नल को हटा दें और डायलिसिस ट्यूब क्लैंप के साथ डायलिसिस ट्यूबिंग के अंत को दबाएं।
    6. डायलिसिस ट्यूबिंग के सील सिरों में से एक पर एक फोम डायलिसिस फ्लोट रखें और इकट्ठे डायलिसिस ट्यूबिंग को पीबीएस बफर के 1 एल वाले बीकर में रखें।
    7. बीकर के तल में एक चुंबकीय हलचल पट्टी रखें और सरगर्मी नियंत्रण को "कम" में समायोजित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि भंवर का गठन नहीं हुआ है।
    8. डायलिसिस समाप्त होने के बाद, रिटेनेट को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में विभाजित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि यह डायलिसिस रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जाए।

2. नैनोडिस्क युक्त बायोएक्टिव एजेंट का निर्माण

  1. फॉस्फोलिपिड एलिकोट की तैयारी
    1. एक उपयुक्त फॉस्फोलिपिड के 5 मिलीग्राम वजन करें (उदाहरण के लिए, डाइमिरिस्टोइलफॉस्फेटिडिलकोलाइन [डीएमपीसी]) और एक ग्लास टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. 3: 1 v/v के कुल अनुपात के लिए CHCl 3 के 300 μL और CH3OH के 100 μL को जोड़कर 5 मिलीग्राम फॉस्फोलिपिड को भंग करें।
    3. ग्लास टेस्ट ट्यूब को 10-15 मिनट के लिए एन2 गैस की कोमल धारा के नीचे रखकर कार्बनिक विलायक को वाष्पित करें, जैसे कि ट्यूब के निचले हिस्से की दीवारों के साथ सूखे फॉस्फोलिपिड की एक पतली फिल्म बनती है।
  2. फॉस्फोलिपिड एलिकोट का लियोफिलाइजेशन
    1. पैराफिल्म के साथ खोलने वाले ग्लास टेस्ट ट्यूब को कवर करके लियोफिलाइजेशन के लिए फॉस्फोलिपिड एलिकोट तैयार करें।
    2. लगभग 10-15 बार 24 ग्राम सुई का उपयोग करके पैराफिल्म को पार करें।
    3. छिद्रित एलिकोट को एक उपयुक्त लियोफिलाइजेशन कंटेनर में रखें और सुनिश्चित करें कि रबर का ढक्कन सही ढंग से सील किया गया है।
    4. लियोफिलाइजेशन मशीन के शीर्ष पर स्थित वैक्यूम मैनिफोल्ड से लियोफिलाइजेशन कंटेनर संलग्न करें और सुनिश्चित करें कि अन्य सभी वाल्व कसकर बंद हैं।
    5. पावर स्विच को फ्लिप करके और वैक्यूम इनिशियलाइजेशन बटन दबाकर लियोफिलाइजेशन मशीन चालू करें।
    6. सिस्टम के कुल वैक्यूम तक पहुंचने के बाद, फ्रीज सुखाने की प्रक्रिया शुरू करने के लिए प्रशीतन आरंभ बटन पर क्लिक करें।
      नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि नमूने को रात भर लियोफिलाइज़ करने की अनुमति दी जाए।
  3. एम्फोटेरिसिन-बी (एएमपी-बी) नैनोडिस्क का निर्माण
    1. लिपिड को फैलाने के लिए पीबीएस के पिपेट 0.45 एमएल को लियोफिलाइज्ड फॉस्फोलिपिड एलिकोट और भंवर को ~ 30 सेकंड के लिए।
      नोट: परिणामी नमूना अपारदर्शी और मैलापन दिखाई देगा।
    2. 20 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक एएमपीबी घोल का पिपेट 50 μL (20 मिलीग्राम एम्पीबी 1 एमएल डाइमिथाइल सल्फोक्साइड [डीएमएसओ] में घुल जाता है, जिसे एक बंद एम्बर पोत में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है) छितरी हुई फॉस्फोलिपिड नमूने और भंवर में।
      नोट: हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंट के स्टॉक समाधान को तैयार करने में उपयोग करने के लिए विलायक का चयन करते समय, दो अतिव्यापी विचार हैं 1) बायोएक्टिव एजेंट की घुलनशीलता और 2) फॉर्मूलेशन में उपयोग किए जाने वाले जलीय बफर के साथ विलायक की गलतता। जबकि डीएमएसओ का उपयोग अक्सर 15,16,17,18,19 किया जाता है, डाइमिथाइलफॉर्मामाइड 20,21 या टेट्राहाइड्रोफ्यूरान22 को भी सफलतापूर्वकनियोजित किया गया है।
    3. फैले हुए फॉस्फोलिपिड और एएमपीबी युक्त ग्लास टेस्ट ट्यूब में 0.5 एमएल एपीओई 4-एनटी पाड़ प्रोटीन (~ 4 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता) का पिपेट। नमूने की अंतिम मात्रा लगभग 1 एमएल होनी चाहिए।
    4. समाधान स्पष्ट होने तक नमूने को 24 डिग्री सेल्सियस पर स्नान करें (आमतौर पर 10-15 मिनट)।
  4. नैनोडिस्क सेंट्रीफ्यूजेशन
    1. स्पष्ट एएमपीबी-नैनोडिस्क समाधान को बाँझ 1.7 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. ट्यूब को टेबलटॉप माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज रोटर में रखें, जिसमें सीधे सामने रखी बैलेंस ट्यूब शामिल है।
    3. रोटर कैप को कसें और सेंट्रीफ्यूज ढक्कन बंद करें।
    4. माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज इकाई के सामने स्थित संबंधित डायल का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूज को ~ 11,000 x g पर 10 मिनट के लिए स्पिन करने के लिए प्रोग्राम करें।
      नोट: इस बिंदु पर, एक गोली दिखाई दे सकती है। इस गोली में अनिगमित फॉस्फोलिपिड और / या एएमपीबी होते हैं।
    5. सुपरनैटेंट को निकालें और इसे एक और साफ 1.7 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. ampB-नैनोडिस्क नमूने का डायलिसिस
    1. 10 मिनट के लिए डीडीआई पानी में अच्छी तरह से भिगोकर डायलिसिस ट्यूबिंग का एक खंड तैयार करें (डायलिसिस ट्यूबिंग के आयाम लंबाई में 3 सेमी, 16 मिमी आंतरिक व्यास और 10,000 एमडब्ल्यूसीओ थे)।
    2. 1 एल प्लास्टिक बीकर या समकक्ष में 1 एल पीबीएस बफर समाधान (10 एमएम सोडियम फॉस्फेट + 150 एमएम एनएसीएल, पीएच 7.2) तैयार करें।
    3. डायलिसिस ट्यूबिंग क्लैंप का उपयोग करके, भिगोए हुए डायलिसिस ट्यूबिंग के एक छोर को दबाएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि क्लैंप सुरक्षित है और कोई तरल बच नहीं सकता है।
    4. डायलिसिस ट्यूबिंग के खुले छोर में एक संकीर्ण गर्दन की फ़नल डालें और डायलिसिस ट्यूबिंग में एएमपीबी-नैनोडिस्क नमूने को स्थानांतरित करें।
    5. फ़नल को हटा दें और डायलिसिस ट्यूब क्लैंप के साथ डायलिसिस ट्यूबिंग के अंत को दबाएं।
    6. डायलिसिस ट्यूबिंग के सील सिरों में से एक पर एक फोम डायलिसिस फ्लोट रखें और इकट्ठे डायलिसिस ट्यूबिंग को पीबीएस बफर के 1 एल वाले बीकर में रखें।
    7. बीकर के तल में एक चुंबकीय हलचल पट्टी रखें और सरगर्मी नियंत्रण को "कम" में समायोजित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि भंवर का गठन नहीं हुआ है। डायलिसिस को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जारी रखने की अनुमति दें।

3. एएमपीबी-नैनोडिस्क नमूनों का वर्णक्रमीय विश्लेषण

  1. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर आरंभीकरण के बाद ऑटो रिक्त
    1. पावर स्विच को फ्लिप करके स्पेक्ट्रोफोटोमीटर चालू करें और "पीसी कंट्रोल" लेबल वाले बटन को दबाकर संबंधित समर्थन कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
    2. समर्थन कंप्यूटर पर, "यूवीप्रोब 2.61" लेबल वाले सॉफ़्टवेयर को खोलें और नीचे बाएं कोने में "कनेक्ट" लेबल बटन पर क्लिक करके स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से कनेक्ट करें।
    3. UVProbe सॉफ़्टवेयर के भीतर शीर्ष उपकरण पट्टी पर स्पेक्ट्रम लेबल बटन क्लिक करें।
    4. शीर्ष उपकरण पट्टी पर विधि लेबल बटन क्लिक करें।
    5. मापन टैब पर क्लिक करें और "तरंगदैर्ध्य रेंज (एनएम)" के तहत स्थित स्टार्ट टेक्स्टबॉक्स में "500" और "एंड" टेक्स्टबॉक्स में "300" इनपुट करें।
    6. स्कैन स्पीड लेबल वाले टैब के बगल में स्थित ड्रॉप-डाउन मेनू पर क्लिक करें और इसे मध्यम पर सेट करें।
    7. डीएमएसओ के 1 मिलीलीटर को दो क्वार्ट्ज क्यूवेट (क्यूएस 1.000) में स्थानांतरित करके एक नमूना खाली तैयार करें।
    8. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के संबंधित नमूना बंदरगाहों में दोनों क्यूवेट लोड करें, ऑटोब्लैंक पर क्लिक करें, और निचले बाएं कोने में स्टार्ट पर क्लिक करके 300-500 एनएम से स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करें।
  2. एएमपीबी मानक की तैयारी और वर्णक्रमीय विश्लेषण
    1. सामने के नमूना पोर्ट से क्यूवेट को हटाकर और 1 मिलीग्राम / एमएल एएमपीबी स्टॉक समाधान (एएमपीबी कुल का 20 μg) के 20 μL जोड़कर 20 μg / mL ampB मानक तैयार करें।
    2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के नमूना पोर्ट में क्यूवेट को वापस लोड करें और नमूना अवशोषण रिकॉर्ड करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें।
    3. नमूना पोर्ट से क्यूवेट निकालें और तरल सामग्री को उचित रूप से लेबल किए गए अपशिष्ट कंटेनर में डिकैंट करें।
    4. प्यूवेट को 70% इथेनॉल के साथ तीन धोने के बाद विआयनीकृत पानी के तीन धोने के साथ अच्छी तरह से धो लें।
  3. बाधित एएमपीबी-नैनोडिस्क नमूने की तैयारी और वर्णक्रमीय विश्लेषण
    1. डीएमएसओ के 1 एमएल में 1 मिलीग्राम/एमएल एएमपीबी-नैनोडिस्क स्टॉक के 20 μL को पाइप करके एक बाधित ampB-नैनोडिस्क नमूना (जिसमें ampB के रूप में 20 μg/mL होता है) तैयार करें। स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करने से पहले कम से कम 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के सामने के नमूना पोर्ट में क्यूवेट लोड करें और नमूना अवशोषण रिकॉर्ड करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें।
  4. पीबीएस बफर रिक्त की तैयारी और वर्णक्रमीय विश्लेषण
    1. पीबीएस बफर के 1 एमएल को दो क्वार्ट्ज क्यूवेट (क्यूएस 1.000) में स्थानांतरित करके एक पीबीएस बफर रिक्त तैयार करें।
    2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के संबंधित नमूना बंदरगाहों में क्यूवेट लोड करें, ऑटोब्लैंक पर क्लिक करें, और 300-500 एनएम से स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करें।
  5. एक गैर-बाधित ampB-नैनोडिस्क नमूने की तैयारी और वर्णक्रमीय विश्लेषण
    1. सामने के नमूना पोर्ट से क्यूवेट को हटाकर और पीबीएस बफर में 1 मिलीग्राम / एमएल एएमपीबी-नैनोडिस्क नमूने के 20 μL को पेश करके एक गैर-बाधित ampB-नैनोडिस्क नमूना (20 μg / mL को ampB के रूप में शामिल करके) तैयार करें।
    2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के नमूना पोर्ट में क्यूवेट को वापस लोड करें, स्टार्ट पर क्लिक करें, और नमूना स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करें।
      नोट: सभी रासायनिक कचरे को स्वीकृत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए उचित रूप से लेबल किए गए अपशिष्ट कंटेनर में निपटाया जाना चाहिए।

4. खमीर व्यवहार्यता परख विश्लेषण

नोट: एएमपीबी की जैविक गतिविधि का मूल्यांकन करने और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या नैनोडिस्क में निर्माण या समावेश की प्रक्रिया ने इसकी खमीर विकास निषेध गतिविधि को प्रभावित किया है, खमीर व्यवहार्यता परख का प्रदर्शन किया गया था।

  1. पहले वर्णित विधि (2.3-2.4.1) का पालन करते हुए डीएमपीसी के प्रति 5 मिलीग्राम में 1 मिलीग्राम एएमपीबी और डीएमपीसी के प्रति 5 मिलीग्राम में 0.1 मिलीग्राम एएमपीबी शामिल करने के लिए दो एएमपीबी-नैनोडिस्क नमूने (अंतिम मात्रा = 1 एमएल) तैयार करें।
    नोट: प्रत्येक नमूना शीशी में डीएमएसओ स्टॉक में 20 मिलीग्राम / एमएल एएमबी के 5 मिलीग्राम प्रति लीटर, पिपेट 50 μL और 5 μL प्रति 5 mgl प्रति 5B बनाने के लिए।
  2. एक संतृप्त खमीर संस्कृति की तैयारी
    1. बाँझ खमीर निकालने-पेप्टोन-डेक्सट्रोज (वाईपीडी) माध्यम के 25 एमएल को बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. वाईपीडी माध्यम के 25 एमएल में एकल सैकरोमाइसेस सेरेविसिया (बीवाई 4741) कॉलोनी को स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ टीकाकरण लूप का उपयोग करें।
    3. खमीर को 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में कल्चर करें, जिसमें दोलन 18 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर सेट होता है।
  3. व्यक्तिगत विकास निषेध परख नमूने तैयार करना
    1. बाँझ वाईपीडी माध्यम के 5 एमएल को 30 बाँझ 13 एमएल कल्चर ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    2. 1 mg/mL ampB-नैनोडिस्क नमूने के 20, 10, और 5 μL जोड़कर कल्चर ट्यूबों के तीन सेटों का इलाज करें, जो क्रमशः 20, 10, और 5 μg ampB का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    3. 0.1 mg/mL ampB-नैनोडिस्क नमूने के 20, 10, और 5 μl जोड़कर कल्चर ट्यूबों के तीन सेटों का इलाज करें, जो क्रमशः 2, 1, और 0.5 μg ampB का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    4. डीएमएसओ में पीबीएस, डीएमएसओ, नियंत्रण आरएचडीएल (कोई एएमपीबी नहीं), या 20 μg ampB जोड़कर संस्कृति ट्यूबों के चार सेटों का इलाज करें।
      नोट: संस्कृति ट्यूबों का प्रत्येक सेट एक स्वतंत्र प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए, इस विधियों का पालन करने से n = 3 का समग्र n मान होता है।
  4. खमीर व्यवहार्यता परख आरंभ
    1. संतृप्त खमीर संस्कृति के 100 μL (2% vol/vol) के साथ प्रत्येक नमूने को टीका लगाकर प्रयोग शुरू करें
    2. एक हिलने वाले इनक्यूबेटर का उपयोग करके खमीर को कल्चर करें, जो 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट होता है, जिसमें दोलन अधिकतम 18 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर सेट होता है।
  5. खमीर व्यवहार्यता माप
    1. पावर स्विच को फ्लिप करके स्पेक्ट्रोफोटोमीटर चालू करें, फिर गो टू डब्ल्यूएल लेबल वाले बटन पर क्लिक करें और मान को 600 एनएम पर सेट करें।
    2. बाँझ वाईपीडी माध्यम के 1 एमएल को दो प्लास्टिक क्यूवेट में स्थानांतरित करें, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर संबंधित नमूना बंदरगाहों में लोड करें, और ऑटोब्लैंक पर क्लिक करें।
    3. प्रत्येक नमूने के 1 एमएल को प्लास्टिक क्यूवेट में स्थानांतरित करें, हर बार क्यूवेट बदलना सुनिश्चित करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के सामने के नमूना पोर्ट में क्यूवेट लोड करें।
    4. प्रत्येक नमूने के ऑप्टिकल घनत्व को 600 एनएम पर मापें और रिकॉर्ड करें और प्रत्येक खर्च किए गए क्यूवेट को एक उचित रूप से लेबल किए गए बायोहाजार्ड अपशिष्ट कंटेनर में निपटाएं।

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Representative Results

बायोएक्टिव एजेंट नैनोडिस्क फॉर्मूलेशन प्रक्रिया
वर्णित एएमपीबी-नैनोडिस्क फॉर्मूलेशन प्रक्रिया में, प्रतिक्रिया को पूरा माना जाता है जब नमूना उपस्थिति टर्बिड से स्पष्ट हो जाती है (चित्रा 1)। यह परिवर्तन इंगित करता है कि नैनोडिस्क का गठन हुआ है और बायोएक्टिव एजेंट को घुलनशील किया गया है। अक्सर, बायोएक्टिव एजेंट दृश्य तरंग दैर्ध्य क्षेत्र (जैसे, एएमबी, कर्क्यूमिन, ल्यूटिन, कोएंजाइम क्यू10) में प्रकाश को अवशोषित करते हैं और, इन मामलों में, नमूना बायोएक्टिव एजेंट के रंग को अपनाता है। एक बार नमूना स्पष्टीकरण पूरा हो जाने के बाद (आमतौर पर स्नान सोनिकेशन के 5-20 मिनट), नमूना को 1.7 मिलीलीटर माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है और 5 मिनट के लिए 11,000 x g पर पेलेट अघुलनशील सामग्री में सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। एक दृश्यमान गोली की अनुपस्थिति को मजबूत सबूत माना जा सकता है कि बायोएक्टिव एजेंट को नैनोडिस्क में शामिल किया गया है। दूसरी ओर, एक गोली की उपस्थिति इंगित करती है कि आंशिक या कोई बायोएक्टिव एजेंट निगमन नहीं हुआ है। यदि आवश्यक या उपयोगी हो, तो केवल लिपिड और पाड़ प्रोटीन बनाने वाले बाईलेयर युक्त नियंत्रण योगों को समानांतर में किया जा सकता है, और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके नेत्रहीन और मात्रात्मक रूप से तुलना में दोनों नमूनों के स्पष्टीकरण की सीमा। किसी भी मामले में, नैनोडिस्क युक्त बायोएक्टिव एजेंट के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, विलायक के निशान को हटाने के लिए नमूना पीबीएस, या किसी अन्य उपयुक्त बफर के खिलाफ डायलाइज किया जाता है।

बायोएक्टिव एजेंट घुलनशीलता दक्षता का विश्लेषण
यह समझाने के लिए कि घुलनशीलता दक्षता निर्धारित करने के लिए नमूना अवशोषण का उपयोग कैसे किया जा सकता है, एएमपीबी-नैनोडिस्क का उपयोग किया जा सकता है। प्रारंभ में, डीएमएसओ में एएमपीबी का एक स्पेक्ट्रम एकत्र किया जाता है। यह एएमपीबी (डीएमएसओ में) के 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान से 980 μl DMSO युक्त एक क्यूवेट में 20 μL जोड़कर प्राप्त किया जाता है। स्पेक्ट्रम को तब यूवी / विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (चित्रा 2) पर 300-500 एनएम से दृश्य तरंग दैर्ध्य सीमा में दर्ज किया जाता है। डीएमएसओ विलायक में प्राप्त यह स्पेक्ट्रम, 372 एनएम, 392 एनएम और 415 एनएम पर तीन विशिष्ट अवशोषण मैक्सिमा उत्पन्न करता है, जो एएमपीबी का संकेत देता है। इसके बाद, पीबीएस में एएमपीबी-नैनोडिस्क का एक अवशोषण स्पेक्ट्रम एकत्र किया जाता है। इस स्पेक्ट्रम को प्राप्त करने के लिए, पीबीएस में 20 μL ampB-नैनोडिस्क को PBS के 980 μL में जोड़ा जाता है, और स्पेक्ट्रम दर्ज किया जाता है। डीएमएसओ25 में देखे गए स्पेक्ट्रम से कम तरंग दैर्ध्य पर एकल प्रमुख अवशोषण शिखर के साथ यह स्पेक्ट्रम काफी अलग होने की उम्मीद है। यह परिणाम इस तथ्य के कारण है कि, पीबीएस में, एएमपीबी-नैनोडिस्क कण संरचना बरकरार रहती है, जिसमें व्यक्तिगत एएमपीबी अणु नैनोडिस्क बाइलेयर के हाइड्रोफोबिक वातावरण के इंटीरियर तक सीमित और विवश होते हैं। चूंकि नमूने में एएमबी अणु अन्य एएमपीबी अणुओं के निकट निकटता में हैं, इसलिए उच्च क्रम परिसर / संरचनाएं बन सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप एएमपीबी के वर्णक्रमीय गुणों में नाटकीय परिवर्तन हो सकता है। नैनोडिस्क बनाम स्टॉक एएमपीबी में तैयार किए गए एएमबी के स्पेक्ट्रा की सीधे तुलना करने के लिए, डायलाइज्ड एएमपीबी-नैनोडिस्क (पीबीएस में) का 20 आरएल एलिकोट डीएमएसओ के 980 μL में जोड़ा जाता है। इस मामले में, डीएमएसओ विलायक नैनोडिस्क कण संरचना के विघटन की ओर जाता है, जैसे कि नैनोडिस्क नमूने के लिपिड बाइलेयर में एकीकृत एएमपीबी मुक्त हो जाता है और डीएमएसओ विलायक में स्वतंत्र रूप से घुलनशील हो जाता है। इस नमूने का अवशोषण स्पेक्ट्रम ऊपर वर्णित स्टॉक एएमपीबी के स्पेक्ट्रम के समान नहीं होने पर बहुत समान दिखाई देना चाहिए। यह परिणाम प्रत्यक्ष प्रमाण प्रदान करता है कि एएमबी मौजूद है और नैनोडिस्क फॉर्मूलेशन की प्रक्रिया से इसके रासायनिक गुणों को नहीं बदला गया है। इस मामले में, यह अनुमान लगाया जाता है कि एक ही तीन अवशोषण मैक्सिमा का पता लगाया जाएगा।

एएमपीबी-नैनोडिस्क की जैविक गतिविधि
एएमपीबी-नैनोडिस्क की जैविक गतिविधि का आकलन करने के लिए, खमीर विकास निषेध परख का प्रदर्शन किया गया था। खमीर तनाव BY4741 ( S. Cerevisiae S288C तनाव का वंशज) नियोजित किया गया था। उपचार के बाद, प्रत्येक खमीर नमूने का ऑप्टिकल घनत्व यूवी -1800 यूवी / विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (चित्रा 3) पर 600 एनएम पर मापा गया था। तीन नियंत्रण नमूनों (पीबीएस, डीएमएसओ और आरएचडीएल) को शामिल करने से पता चला कि एएमपीबी के अलावा नैनोडिस्क घटकों का खमीर विकास पर कोई समझदार प्रभाव नहीं है। सकारात्मक नियंत्रण (डीएमएसओ में एएमपीबी के 20 μg) ने पुष्टि की कि ampB खमीर विकास का एक कुशल अवरोधक है। जब एएमबी-नैनोडिस्क का परीक्षण किया गया, तो एएमबी एकाग्रता-निर्भर विकास निषेध गतिविधि के सबूत प्राप्त किए गए। इस प्रकार, नैनोडिस्क कणों के लिपिड परिवेश में एएमपीबी का पृथक्करण शक्तिशाली जैविक गतिविधि के प्रतिधारण के साथ जलीय बफर घुलनशीलता में वृद्धि की अनुमति देता है।

Figure 1
चित्रा 1: नैनोडिस्क फॉर्मूलेशन और नमूना उपस्थिति पर स्नान सोनिकेशन का प्रभाव। एक एएमपीबी-नैनोडिस्क (एएमपीबी-एनडी) नमूना 0.75 एमएल पीबीएस में 5 मिलीग्राम डीएमपीसी को फैलाकर तैयार किया गया था, डीएमएसओ में 20 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान से नमूने में 1 मिलीग्राम एएमपीबी जोड़ा गया था, इसके बाद पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर (4 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान से) में 2 मिलीग्राम पाड़ प्रोटीन जोड़ा गया था। (ए) पीबीएस में डीएमपीसी फैलाव। (बी) 1 मिलीग्राम एएमपीबी को जोड़ने के बाद पीबीएस में डीएमपीसी फैलाव। (सी) स्नान सोनिकेशन के बाद डीएमपीसी, एएमपीबी और पाड़ प्रोटीन युक्त नैनोडिस्क समाधान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: डीएमएसओ में एएमपीबी नमूनों की यूवी /विस अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी। (बी) पीबीएस में एएमपीबी-नैनोडिस्क (एएमपीबी-एनडी)। (सी) डीएमएसओ में एएमबी-नैनोडिस्क। स्पेक्ट्रा को यूवी / विस स्पेक्ट्रोमीटर पर एकत्र किया गया था। एएमपीबी-नैनोडिस्क नमूनों की एएमपीबी सामग्री को डीएमएसओ के समाधान में एक ज्ञात एलिकोट को स्थानांतरित करके और 416 एनएम पर अवशोषण को मापकर निर्धारित किया जा सकता है (416 एनएम पर एएमपीबी विलोपन गुणांक = 1.24 x 105 एम -1 सेमी -1)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: एस सेरेविसिया के विकास पर एएमपीबी का प्रभाव। एएमबी की अनुपस्थिति और उपस्थिति में खमीर को 30 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत किया गया था। एएमबी की कमी वाले नियंत्रण नमूनों में अकेले पीबीएस और आरएचडीएल शामिल थे। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एएमबी को डीएमएसओ में प्रशासित किया गया था। परीक्षण योगों में एएमपीबी की संकेतित सांद्रता पर एएमपीबी-नैनोडिस्क (एएमपीबी-एनडी) शामिल थे। इनक्यूबेशन बाद, व्यक्तिगत नमूना ऑप्टिकल घनत्व मान 600 एनएम पर निर्धारित किए गए थे। सांख्यिकीय महत्व को टुकी के पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ दो-तरफा एनोवा मल्टीपल तुलना का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। रिपोर्ट किए गए मान मानक त्रुटि (एन = 3) ± माध्य हैं, जो तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बायोएक्टिव एजेंट आणविक भार (दा) विलायक संदर्भ
एम्फोटेरिसिन बी 924.1 DMSO 15
ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड 300.4 DMSO 16
कर्क्यूमिन 368.4 DMSO 17
Nutlin 3a 581.5 DMSO 21
Coenzyme Q10 863.3 डाइमिथाइलफॉर्मामाइड 20
लूटिन 568.9 टेट्राहाइड्रोफ्यूरान 22
Sphingadiene 297.5 DMSO 19
Docetaxel 1 807.9 - 23
10-हाइड्रॉक्सीकैंप्टोथेसिन 364.4 DMSO 18
सिमवास्टेटिन1 418.5 - 24
चयनित बायोएक्टिव एजेंट विलायक को बफर में बिखरे हुए फॉस्फोलिपिड में जोड़ने के बजाय फॉस्फोलिपिड के साथ सुखाया गया था।

तालिका 1: बायोएक्टिव एजेंटों को सफलतापूर्वक नैनोडिस्क में शामिल किया गया।

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Discussion

नैनोडिस्क युक्त बायोएक्टिव एजेंट का निर्माण अन्यथा अघुलनशील हाइड्रोफोबिक यौगिकों को घुलनशील करने के लिए एक सुविधाजनक विधि प्रदान करता है। क्योंकि उत्पाद बायोएक्टिव एजेंट नैनोडिस्क जलीय मीडिया में पूरी तरह से घुलनशील हैं, वे हाइड्रोफोबिक अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक उपयोगी वितरण विधि प्रदान करते हैं (तालिका 1)। इनमें छोटे अणु, प्राकृतिक और सिंथेटिक दवाएं, फाइटोन्यूट्रिएंट्स, हार्मोन आदि शामिल हैं। सूत्रीकरण रणनीति आमतौर पर एक मानक प्रोटोकॉल का पालन करती है जिसे कार्बनिक सॉल्वैंट्स में बायोएक्टिव एजेंट के घुलनशीलता गुणों को ध्यान में रखना चाहिए। बायोएक्टिव एजेंट को भंग करने के लिए एक उपयुक्त कार्बनिक विलायक का चयन करने के अलावा, दो अतिरिक्त मापदंडों, ~ 20 मिलीग्राम / मिलीलीटर स्टॉक समाधान और जलीय घोल के साथ विलायक की गलतता प्राप्त करने की आवश्यकता होती है। यह आवश्यक है क्योंकि यह अतिरिक्त कार्बनिक विलायक पेश नहीं करते हुए फॉर्मूलेशन मिश्रण में बायोएक्टिव एजेंट की एक महत्वपूर्ण मात्रा को जोड़ने की अनुमति देता है। गलतता महत्वपूर्ण है क्योंकि चरण पृथक्करण उत्पाद नैनोडिस्क में बायोएक्टिव एजेंट निगमन को रोक देगा।

पसंद के बफर में फॉस्फोलिपिड फैलाव बनाने वाले बाईलेयर के तुरंत बाद बायोएक्टिव एजेंट का परिचय इन घटकों को पाड़ प्रोटीन जोड़ने से पहले एक दूसरे के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है। पाड़ प्रोटीन जोड़ने से पहले, और उसके तुरंत बाद, नमूना एक अपारदर्शी निलंबन के रूप में दिखाई देता है। हालांकि, एक बार तीन घटकों (फॉस्फोलिपिड, बायोएक्टिव एजेंट, और पाड़ प्रोटीन, 5/1/2 डब्ल्यू / डब्ल्यू अनुपात पर) को जोड़ा जाता है, और नमूना को पर्याप्त अवधि के लिए सही तापमान पर स्नान सोनिकेशन के अधीन किया जाता है, तो इसकी उपस्थिति टर्बिड से साफ हो जाती है। यदि बायोएक्टिव एजेंट रंगीन है, तो स्पष्ट नमूना उस रंग को लेगा। इस प्रकार, दृश्य निरीक्षण द्वारा नैनोडिस्क गठन का पता लगाना आसान है।

यद्यपि डीएमपीसी सुविधाजनक है और अक्सर कुछ बायोएक्टिव एजेंटों के साथ कई अनुप्रयोगों के लिए पसंद के फॉस्फोलिपिड के रूप में उपयोग किया जाता है, यह फॉस्फोलिपिड नैनोडिस्क फॉर्मूलेशन का विरोध करता है। उदाहरण के लिए, कोएंजाइम क्यू10 नैनोडिस्क का गठन केवल तब होता है जब अंडे फॉस्फेटिडिलकोलाइन (पीसी) का उपयोग19 के लिए किया जाता है, और इसी तरह ज़ैंथोफिल, ल्यूटिन22 के लिए भी। इस प्रकार, जबकि डीएमपीसी अक्सर पसंद का फॉस्फोलिपिड होता है, यह सार्वभौमिक नहीं है। कोएंजाइम क्यू10 और ल्यूटिन अंडे पीसी को पसंद करते हैं, इसका कारण उनके विस्तारित हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों के कारण हो सकता है, असंतृप्त फैटी एसिड या कुछ अन्य कारक रखने वाले बाइलेयर के लिए प्राथमिकता। जब अंडे के पीसी को नियोजित किया जाता है, तो पूर्ण नमूना स्पष्टीकरण प्राप्त करने के लिए सोनिकेशन के दौरान सोनिकेशन का तापमान 45 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाया जाता है। एक बार तैयार होने के बाद, अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए बायोएक्टिव एजेंट युक्त नैनोडिस्क को सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आम तौर पर इष्टतम स्थितियों को निर्धारित करने और पालन करने के बाद एक अवक्षेप नहीं बनता है। इसके बाद, बायोएक्टिव एजेंट के साथ फॉर्मूलेशन मिश्रण में जोड़े गए कार्बनिक विलायक की थोड़ी मात्रा को हटाने के लिए रात भर बफर के खिलाफ नमूना डायलाइज किया जाता है। डायलिसिस के बाद, उत्पाद नैनोडिस्क को विस्तारित अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। यदि शामिल बायोएक्टिव एजेंट ऑक्सीकरण के लिए अतिसंवेदनशील है, तो नैनोडिस्क नमूना एन2 गैस के तहत एक बंद पोत में संग्रहीत किया जाना चाहिए।

विभिन्न तरीकों का उपयोग यह चिह्नित करने और मान्य करने के लिए किया गया है कि नैनोडिस्क वास्तव में बने हैं। शायद सबसे सटीक विधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 26,27 है। यह तकनीक कण आकृति विज्ञान, व्यास और जनसंख्या आकार विषमता के बारे में जानकारी प्रदान करती है। इस विधि को नैनोडिस्क गठन के लिए निश्चित माना जाता है। बायोएक्टिव एजेंट युक्त नैनोडिस्क 17,24,28 के गुणों की जांच के लिए एक संबंधित विधि, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का भी उपयोग किया गया है। व्यावहारिक उद्देश्यों के लिए, हालांकि, फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी सुविधाजनक है और आमतौर पर किसी दिए गए बायोएक्टिव एजेंट नैनोडिस्क नमूने 20,22 के आकार (~200,000 डीए) और समरूपता को चिह्नित करने के लिए पर्याप्त है। एक बार जब यह निर्धारित हो जाता है कि बायोएक्टिव एजेंट नैनोडिस्क का गठन हुआ है, तो बायोएक्टिव एजेंट की घुलनशीलता दक्षता निर्धारित करना भी महत्वपूर्ण और उपयोगी है। यदि बायोएक्टिव एजेंट में किसी दिए गए तरंग दैर्ध्य पर विशिष्ट अवशोषण गुण होते हैं, तो यूवी / विस अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी एक सुविधाजनक विधि का प्रतिनिधित्व करता है। एक संभावित जटिल कारक 280 एनएम पर पाड़ प्रोटीन अवशोषण है। हालांकि, यदि कोई दिया गया बायोएक्टिव एजेंट एक अलग तरंग दैर्ध्य पर अवशोषित होता है, तो यह कोई समस्या नहीं है। यदि एक विलोपन गुणांक को रुचि के बायोएक्टिव एजेंट के लिए जाना जाता है, तो नैनोडिस्क में बायोएक्टिव एजेंट घुलनशील की मात्रा को सटीक रूप से निर्धारित करना संभव है। अन्यथा, एक उपयुक्त विलायक में बायोएक्टिव एजेंट की ज्ञात मात्रा के स्पेक्ट्रा से प्राप्त एक मानक वक्र का उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक तरीकों में फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी17,22 या उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) विश्लेषण20,24 शामिल हैं।

नैनोडिस्क युक्त बायोएक्टिव एजेंट के लिए वर्णित मूल सूत्रीकरण प्रक्रिया अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्तरदायी है। उदाहरण के लिए, रोग की प्रगति का निदान और आकलन करने के लिए चिकित्सा इमेजिंग अध्ययनों में कंट्रास्ट एजेंटों को परेशान करने वाले नैनोडिस्क का उपयोग किया गयाहै। एक अन्य दृष्टिकोण लिपिड संशोधित प्रोटीन को नैनोडिस्क के बाइलेयर में एकीकृत करना है। उदाहरण के लिए, लालेफर एट अल ने सफलतापूर्वक "डब्ल्यूएनटी" प्रोटीन को इसके सहसंयोजक रूप से बंधे ओलिक एसिड मोइटी30 के सम्मिलन के माध्यम से नैनोडिस्क में शामिल किया। डब्ल्यूएनटी नैनोडिस्क को बाद में एक पानी में घुलनशील डब्ल्यूएनटी परिवहन वाहन का गठन करने के लिए दिखाया गया था जो हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं के पूर्व विवो विस्तार को बढ़ावा देने में सक्षम था। एक अन्य अध्ययन में, क्रॉस्बी एट अल ने बी सेल सतह एंटीजन सीडी 2031 के खिलाफ निर्देशित एकल श्रृंखला चर एंटीबॉडी टुकड़े (एससीएफवी) से जुड़े एपीओए-आई से युक्त एक पाड़ प्रोटीन चिमेरा का निर्माण किया। बी कोशिकाओं को लक्षित करने वाले पाड़ घटक के रूप में α-सीडी 20 एससीएफवीओए-आई के साथ कर्क्यूमिन नैनोडिस्क का निर्माण, जिससे बायोएक्टिव एजेंट डिलीवरी में वृद्धि हुई। यह रणनीति विशेष रूप से लक्ष्य सेल प्रकार के लिए निर्देशित करके कीमोथेरेपी एजेंटों से जुड़ी विषाक्तता को कम करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करती है। एक अन्य उदाहरण में, सिंथेटिक धनिक लिपिड 1,2-डाइमिरिस्तोयल-3-ट्राइमेथिलमोनियम-प्रोपेन क्लोराइड (डीएमटीएपी) को नैनोडिस्क32 के बाइलेयर में शामिल किया गया था। इस सूत्रीकरण रणनीति ने प्रभावी रूप से नैनोडिस्क बाइलेयर सतह को सकारात्मक चार्ज चरित्र प्रदान किया और इस प्रकार, लघु हस्तक्षेप (एसआई) आरएनए के साथ एक स्थिर बाध्यकारी बातचीत को बढ़ावा दिया। सीआरएनए-समृद्ध डीएमटीएपी-नैनोडिस्क को तब लक्ष्य जीन वध अध्ययनों में जैविक गतिविधि के लिए दिखाया गया था। एक और उदाहरण में, एकमात्र फॉस्फोलिपिड घटक के रूप में कार्डियोलिपिन के साथ नैनोडिस्क तैयार किए गए हैं। यह अद्वितीय आयनिक ग्लाइसेरोफॉस्फोलिपिड विभिन्न लिगेंड को बांधने के लिए जाना जाता है, जिसमें द्विसंयोजक खनिज कैल्शियम, हेमोप्रोटीन साइटोक्रोम सी, एंथ्रासाइक्लिन एंटी-कैंसर एजेंट डॉक्सोर्यूबिसिन और अन्य 33,34,35,36 शामिल हैं। कार्डियोलिपिन नैनोडिस्क का उपयोग नैनोडिस्क के घुलनशीलता गुणों, उनके नैनोस्केल आकार और एक सुलभ कार्डियोलिपिन बाइलेयर 8 की उपस्थिति का लाभ उठाकर इन बाध्यकारी इंटरैक्शन को विस्तार से चिह्नित करने के लिए किया गयाहै। इन और अन्य अनुप्रयोगों के आधार पर, यह स्पष्ट है कि नैनोडिस्क तकनीक अनुप्रयोगों की भीड़ के लिए एक बहुमुखी मंच है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (आर 37 एचएल -64159) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Cayman Chemical Company 11636 ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin Fisher Scientific BP17925 Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid GenScript N/A Transformation
Baffled Flask New Brunswick Scientific N/A Expansion & Expression
BL21 competent E coli New England Biolabs C2527I Transformation
Centrifuge bottles Nalgene 3140-0250 Expression
Chloroform Fisher Scientific G607-4 ND Formulation
DMSO Sigma Aldrich 472301 Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine Avanti Lipids 850345P ND Formulation
Erlenmeyer flask Bellco Biotechnology N/A Expansion & Expression
Falcon Tubes Sarstedt Ag & Co D51588 Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes VWR 47729-570 ND Formulation
GraphPad (Software) Dotmatics N/A Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath VWR N/A ND Formulaton
Heating and Nitrogen module Thermo Scientific TS-18822 ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL) GE Healthcare 17-0407-03 Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside  Fisher Scientific BP1755 Expression
J-25 Centrifuge Beckman Coulter J325-IM-2 Expression
JA-14 Rotor Beckman Coulter 339247 Expression
Lyophilizer Labconco 7755030 ND Formulation
Methanol Fisher Scientific A452-4 ND Formulation
Nitrogen gas Praxair UN1066 ND Formulation
NZCYM media RPI Research Products N7200-1000.0 Expansion & Expression
Pet-22B vector GenScript N/A Transformation
Petri dish Fisher Scientific FB0875718 Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes Fisher Brand 14385 928A Spectral Analysis
Shaking Incubator New Brunswick Scientific M1344-0004 Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys Thermo Scientific 66430 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 68100 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 88243 Purification
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Purification
Sodium Phosphate dibasic Fisher Scientific S374-500 Purification
Sodium Phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500 Purification
Spectra/POR Weighted Closures Spectrum Medical Industries 132736 Purification
Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 220-92961-01 spectral analysis
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 366816 ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software) Shimadzu N/A Spectral Analysis
Vacuum filter Millipore 9004-70-0 Expression & Purification
Vacuum pump GAST Manufacturing Inc DOA-P704-AA Expression & Purification
Vortex Fisher Scientific 12-812 ND Formulation
Yeast N/A BY4741 Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose BD 242820 Yeast Viability Assay

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References

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Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I., Swackhamer, M., Karo, M., Lockhart, R., Ryan, R. O. Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks. J. Vis. Exp. (193), e65145, doi:10.3791/65145 (2023).

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