Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Formulering og karakterisering av bioaktivt middel som inneholder nanodisker

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65145
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

Summary

Her beskriver vi produksjon og karakterisering av bioaktive stoffer som inneholder nanodisker. Amfotericin B nanodisker er tatt som et eksempel for å beskrive protokollen på en trinnvis måte.

Abstract

Begrepet nanodisk refererer til en diskret type nanopartikkel som består av et dobbeltlagsdannende lipid, et stillasprotein og et integrert bioaktivt middel. Nanodisker er organisert som et diskformet lipid-dobbeltlag hvis omkrets er omskrevet av stillasproteinet, vanligvis et medlem av den utskiftbare apolipoproteinfamilien. Tallrike hydrofobe bioaktive midler har blitt effektivt solubilisert i nanodisker ved deres integrering i det hydrofobe miljøet til partikkelens lipid-dobbeltlag, noe som gir en stort sett homogen populasjon av partikler i området 10-20 nm i diameter. Formuleringen av nanodisker krever et presist forhold mellom individuelle komponenter, en passende sekvensiell tilsetning av hver komponent, etterfulgt av badsonikering av formuleringsblandingen. Det amfipatiske stillasproteinet kontakter spontant og omorganiserer det dispergerte dobbeltlaget som danner lipid / bioaktiv middelblanding for å danne en diskret, homogen populasjon av nanodiskpartikler. Under denne prosessen går reaksjonsblandingen fra et ugjennomsiktig, uklart utseende til en klargjort prøve som, når den er fullt optimalisert, ikke gir noe utfelling ved sentrifugering. Karakteriseringsstudier involverer bestemmelse av bioaktiv agensoppløselighetseffektivitet, elektronmikroskopi, gelfiltreringskromatografi, ultrafiolett synlig (UV / Vis) absorbansspektroskopi og / eller fluorescensspektroskopi. Dette følges normalt av en undersøkelse av biologisk aktivitet ved hjelp av dyrkede celler eller mus. Når det gjelder nanodisker som har et antibiotika (dvs. makrolidpolyenantibiotikumet amfotericin B), kan deres evne til å hemme veksten av gjær eller sopp som en funksjon av konsentrasjon eller tid måles. Den relative enkle formuleringen, allsidigheten med hensyn til komponentdeler, nanoskala partikkelstørrelse, iboende stabilitet og vandig oppløselighet tillater myriade in vitro og in vivo applikasjoner av nanodiskteknologi. I denne artikkelen beskriver vi en generell metodikk for å formulere og karakterisere nanodisker som inneholder amfotericin B som det hydrofobe bioaktive middelet.

Introduction

Begynnende diskoidale lipoproteiner med høy tetthet (HDL) er naturlig forekommende forfedre til den langt mer omfattende sfæriske HDL som er tilstede i det menneskelige sirkulasjonssystemet. Disse gryende partiklene, også referert til som pre-ß HDL, har unike og karakteristiske strukturelle egenskaper1. Faktisk, i stedet for å eksistere som en sfærisk partikkel, er begynnende HDL diskformet. Omfattende strukturelle karakteriseringsstudier på naturlige og rekonstituerte diskoidale HDL har avslørt at de består av et fosfolipid-dobbeltlag hvis omkrets er omskrevet av et amfipatisk utskiftbart apolipoprotein (apo), slik som apoA-I. I human lipoproteinmetabolisme påløper sirkulerende begynnende HDL lipider fra perifere celler og modnes til sfæriske HDL i en prosess som er avhengig av viktige proteinmediatorer, inkludert ATP-bindende kassetttransportør A1 og lecitin: kolesterolacyltransferse2. Denne prosessen representerer en kritisk komponent i den omvendte kolesteroltransportveien som anses å være beskyttende mot hjertesykdom. Bevæpnet med denne kunnskapen og evnen til å rekonstituere diskoide HDL, har forskere ansatt disse partiklene som et terapeutisk inngrep for å behandle aterosklerose3. I hovedsak fremmer infusjon av rekonstituert HDL (rHDL) hos pasienter kolesterolutstrømning fra plakkavleiringer og returnerer det til leveren for omdannelse til gallsyrer og utskillelse fra kroppen. Flere bioteknologi/farmasøytiske selskaper følger denne behandlingsstrategien4.

Samtidig har evnen til å generere disse partiklene i laboratoriet utløst en mengde forskningsaktiviteter som har ført til nye applikasjoner og ny teknologi. En fremtredende applikasjon innebærer bruk av rHDL-partikler som en miniatyrmembran for å huse transmembranproteiner i et innfødt-lignende miljø5. Hittil har hundrevis av proteiner blitt vellykket inkorporert i diskoidal rHDL, og forskning har vist at disse proteinene beholder både innfødt konformasjon og biologisk aktivitet som reseptorer, enzymer, transportører, etc. Disse partiklene, referert til som "nanodiscs", har også vist seg å være mottagelige for strukturell karakterisering, ofte ved høy oppløsning6. Denne tilnærmingen til undersøkelser av transmembranproteiner er anerkjent som overlegen studier med vaskemiddelmiceller eller liposomer, og som et resultat utvikler seg raskt. Det er viktig å erkjenne at to forskjellige metoder har blitt rapportert som er i stand til å danne en rHDL. "Kolatdialyse" -metoden13 er populær for applikasjoner relatert til inkorporering av transmembranproteiner i rHDL-dobbeltlaget5. I hovedsak innebærer denne formuleringsmetoden å blande et dobbeltlag som danner fosfolipid, et stillasprotein og transmembranproteinet av interesse i en buffer som inneholder vaskemiddelet natriumkolat (eller natriumdeoksykolat; micelle molekylvekt [MW] på 4,200 Da). Vaskemiddelet løser effektivt de forskjellige reaksjonskomponentene, slik at prøven kan dialyseres mot buffer som mangler vaskemiddel. Under dialysetrinnet, når vaskemiddelet fjernes fra prøven, dannes det spontant en rHDL. Når denne tilnærmingen brukes til å fange et transmembranprotein av interesse, har produktpartiklene blitt kalt nanodiscs5. Forsøk på å bruke denne metoden til å inkorporere småmolekylære hydrofobe bioaktive midler (MW <1000 Da) har imidlertid stort sett vært mislykket. I motsetning til transmembranproteiner, er bioaktive midler med små molekyler i stand til å unnslippe fra dialyseposen sammen med vaskemiddelet, noe som reduserer innlemmelseseffektiviteten i rHDL. Dette problemet ble løst ved å utelate vaskemidler fra formuleringsblandingen14. I stedet blir komponentene tilsatt til en vandig buffer sekvensielt, som begynner med dobbeltlaget som danner lipid, og danner et stabilt bioaktivt middel som inneholder rHDL, referert til som en nanodisk. Andre har brukt rHDL for inkorporering og transport av in vivo bildebehandlingsmidler7. Mer nylig har spesialisert rHDL bestående av et apolipoproteinstillas og den anioniske glycerofosfolipiden, kardiolipin, blitt brukt i ligandbindingsstudier. Disse partiklene gir en plattform for studier av interaksjonen mellom kardiolipin og forskjellige vannløselige ligander, inkludert kalsium, cytokrom c og anticancermidlet doksorubicin8.

Fokus for denne studien er på formuleringen av rHDL som har et stabilt innlemmet hydrofobt bioaktivt middel (dvs. nanodisk). Evnen til disse midlene til å integrere seg i lipidmiljøet av diskoidale rHDL-partikler gir dem effektivt vandig oppløselighet. Som sådan har nanodisker potensialet for in vivo terapeutiske applikasjoner. Ved formulering av nanodisker er det nødvendig med spesifikke inkubasjons- / reaksjonsbetingelser for å lykkes med å inkorporere diskrete hydrofobe bioaktive stoffer i produktpartikkelen, og målet med denne rapporten er å gi detaljert praktisk informasjon som kan brukes som en grunnleggende mal for å skape nye nanodiskpartikler for spesifikke applikasjoner. I sammenheng med dette manuskriptet er begrepene nanodisc og nanodisk derfor ikke utskiftbare. Mens nanodisc refererer til en rHDL formulert for å inneholde et transmembranprotein innebygd i lipid-dobbeltlag5, refererer begrepet nanodisk til en rHDL formulert for å innlemme lavmolekylære (< 1,000 Da) hydrofobe bioaktive midler, slik som amfotericin B14.

En rekke metoder er tilgjengelige for oppkjøp av egnede stillasproteiner. Det er mulig å kjøpe stillasproteiner fra produsenter [f.eks. apoA-I (SRP4693) eller apoE4 (A3234)], men kostnaden kan være en begrensende faktor. En foretrukket tilnærming er å uttrykke rekombinante stillasproteiner i Escherichia coli. Protokoller publiseres for humant apoA-I9, apoE410, samt insekthemolymfeproteinet apolipophorin-III11. For formålet med forsøkene beskrevet her ble rekombinant humant apoE4 N-terminal (NT) domene (aminosyrer 1-183) brukt. Nukleotidsekvensen som koder for human apoE4-NT ble syntetisert og satt inn i en pET-22b (+) ekspresjonsvektor rett ved siden av den vektorkodede pelB-ledersekvensen. Denne konstruksjonen fører til uttrykket av et pelB-ledersekvens-apoE4-NT-fusjonsprotein. Etter proteinsyntese leder bakteriell pelB-ledersekvens det nylig syntetiserte proteinet til det periplasmatiske rommet hvor lederpeptidase spalter pelB-sekvensen. Det resulterende apoE4-NT-proteinet, uten sekvensmerker eller haler, unnslipper deretter bakteriene og akkumuleres i kulturmediet11,12, noe som forenkler nedstrømsbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transformasjon, ekspresjon og rensing av stillasproteinkomponent

  1. BL21 bakteriell transformasjon med apoE4-NT som inneholder plasmid
    1. Tine et rør med BL21 (DE3) kompetente celler på is i 10 minutter.
    2. Når all isen har smeltet, blander du forsiktig og forsiktig 50 μL av cellene inn i et transformasjonsrør på is.
    3. Tilsett 5 μL inneholdende 50 ng plasmid-DNA (for sekvens, se tilleggstabell 1) til celleblandingen. Knips forsiktig på røret fire eller fem ganger for å blande. Ikke virvel.
    4. Legg blandingen på is i 30 min.
    5. Varm opp blandingen ved nøyaktig 42 °C i 10 s.
    6. Legges på is i 5 min.
    7. Pipette 950 mikrol S.O.C. medium inn i slangen ved romtemperatur.
    8. Plasser røret i en 37 °C risteinkubator i 60 minutter med oscillasjon satt til 250 o / min.
    9. Bland cellene grundig ved å flikke og invertere, og spred deretter 100 μL celleoppløsning på en 20 ml Luria Broth + Agar valgplate behandlet med ampicillin i en konsentrasjon på 0,1 mg / ml.
    10. Inkuber over natten ved 37 °C, eller til synlige kolonier har vokst.
  2. Bruk en elektronisk pipettor, overfør 25 ml sterilt, NZCYM medium til en steril 250 ml konisk kolbe ved romtemperatur og tilsett ampicillin til en endelig arbeidskonsentrasjon på 0,1 mg/ml.
  3. Bruk en steril inokulasjonssløyfe til å overføre en enkelt koloni fra valgplaten som inneholder den passende transformerte bakteriestammen og tilsette direkte til kolben som inneholder 25 ml NZCYM media + ampicillin.
  4. Plasser 25 ml NZCYM frøkulturkolbe i en 37 °C ristende inkubator med orbital oscillasjon satt til 250 o / min.
    MERK: Det anbefales at denne frøkulturen dyrkes over natten for å nå en passende bakteriell konsentrasjon (~ 1,5-2,0 optiske tetthetsenheter), målt ved hjelp av et spektrofotometer satt til bølgelengde = 600 nm.
  5. Overfør 250 ml sterilt NZCYM-medium til fire 1-liters forvirrede kolber og tilsett ampicillinantibiotika til en arbeidskonsentrasjon på 0,1 mg/ml.
  6. Under sterile forhold, overfør 5 ml mettet frøkultur til hver av de fire 250 ml kulturen som inneholder kolber og sett i en 37 ° C ristende inkubator med orbital oscillasjon satt til 250 rpm.
    MERK: På dette tidspunktet vil kulturen bli referert til som en ekspansjonskultur og eksponentiell vekst vil bli overvåket ved hjelp av et UV1800-spektrofotometer. Veksten får fortsette til kulturens optiske tetthet ved 600 nm (OD600) når en verdi mellom 0, 6-0, 8.
  7. Når ekspansjonskulturen har nådd den ønskede OD600-verdien på 0,6-0,8, tilsett 59,6 mg isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) til hver 250 ml kultur som inneholder kolbe for en endelig konsentrasjon på 1 mM for å indusere proteinuttrykk. På dette punktet omtales ekspansjonskulturen som uttrykkskulturen. Begynn uttrykk for en periode på 5 timer.
  8. På slutten av 5 timers uttrykksperiode, fjern de fire kolbene fra risteinkubatoren og pipetten 125 ml i seks 250 ml sentrifugeflasker (750 ml totalt).
  9. Balanser hver sentrifugeflaske for å sikre at totalmassen er innenfor ±0,5 mg fra hverandre.
    MERK: Dette trinnet er viktig for å sikre sikker drift av sentrifugeenheten.
  10. Forbered sentrifugeenheten ved først å vri strømbryteren til på-posisjon. Klikk på knappen merket "Set/Actual" og juster parametrene til "JA-14", "9,400 x g", 20,00 min og 4 °C ved hjelp av de tilhørende skivene.
  11. Legg de seks balanserte sentrifugeflaskene i en sentrifugerotor av passende størrelse og plasser dem i sentrifugen for å sikre at eventuelle spesifikke sikkerhetsparametere følges.
    MERK: Fortsett dette trinnet til all bakteriell cellekultur er sentrifugert og supernatanter samlet.
  12. Filtrer den isolerte bakterielle supernatanten gjennom en vakuumfiltrering eller tilsvarende apparat utstyrt med et 0,45 mikron filter for å fjerne gjenværende rusk.
  13. Heparinrensing av det rekombinante apoE4-NT stillasproteinet
    MERK: Prosedyren for kolonnerensing utføres ved romtemperatur.
    1. Balansere heparinkolonnen med høy felle ved å påføre 10 kolonnevolumer (50 ml) med 10 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,2 og eluere med en hastighet på 5 ml/min.
    2. Påfør apoE4-NT-beriket medium på kolonnen med en hastighet på 2,5 ml / min til hele 1 L-volumet av medium er påført, og forkast gjennomstrømningen.
    3. Vask kolonnen med 10 kolonnevolum (50 ml) på 10 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,2, og kast gjennomstrømningen.
    4. Eluer det ønskede apoE4-NT-proteinet ved å påføre tre kolonnevolumer (15 ml) elueringsbuffer (10 mM natriumfosfatbuffer + 1,5 M NaCl, pH 7,2) på kolonnen og samle eluatet.
  14. Dialyse av apoE4-NT eluat
    1. Forbered en del av dialyseslangen (dimensjoner på dialyseslangen som ble brukt var 22 cm lange, 12 mm indre diameter og 10 000 MWCO) ved grundig bløtlegging i destillert avionisert (ddi) vann i 10 minutter.
    2. Forbered 1 liter fosfatbufret saltvann (PBS) (10 mM natriumfosfat + 150 mM NaCl, pH 7,2) i et 1 l plastbeger eller tilsvarende.
    3. Bruk en dialyseslangeklemme til å klemme den ene enden av den gjennomvåte dialyseslangen, slik at klemmen er sikret og at ingen væske kan slippe ut.
    4. Sett en smal nakketrakt inn i den åpne enden av dialyseslangen og hell 15 ml apoE4-NT-eluat inn i dialyseslangen.
      MERK: Det er viktig å se etter eventuelle lekkasjer på dette trinnet.
    5. Fjern trakten og klem enden av dialyseslangen med en annen dialyseslangeklemme.
    6. Plasser en skumdialyseflottør på en av de forseglede endene av dialyseslangen og plasser den monterte dialyseslangen i begeret som inneholder 1 liter PBS-buffer.
    7. Plasser en magnetisk rørestang i bunnen av begeret og juster omrøringskontrollen til "lav", slik at det ikke dannes en virvel.
    8. Etter at dialysen er avsluttet, dekanter retentatet i et 50 ml konisk rør og oppbevares ved -20 °C.
      MERK: Det anbefales at denne dialysen utføres ved 4 °C over natten.

2. Formulering av bioaktivt middel som inneholder nanodisker

  1. Fremstilling av fosfolipidalikot
    1. Vei 5 mg av et egnet fosfolipid (f.eks. dimyristoylfosfatidylkolin [DMPC]) og overfør til et glassreagensrør.
    2. Oppløs 5 mg fosfolipid ved å tilsette 300 μL CHCl 3 og 100 μLCH3OH for et totalt forhold på3: 1 v / v.
    3. Fordamp det organiske løsningsmidlet ved å plassere glassreagensrøret under en mild strøm avN2-gass i 10-15 minutter, slik at en tynn film av tørket fosfolipid dannes langs veggene i den nederste delen av røret.
  2. Lyofilisering av fosfolipidalikoter
    1. Forbered fosfolipidalikoter for lyofilisering ved å dekke glassreagensrøråpningen med parafilm.
    2. Perforer parafilmen med en 24 G nål ca. 10-15 ganger.
    3. Plasser de perforerte alikotene i en passende lyofiliseringsbeholder og sørg for at gummilokket er forseglet riktig.
    4. Fest lyofiliseringsbeholderen til vakuummanifolden plassert på toppen av lyofiliseringsmaskinen og sørg for at alle de andre ventilene er lukket tett.
    5. Slå på lyofiliseringsmaskinen ved å vri strømbryteren og trykke på vakuuminitialiseringsknappen.
    6. Etter at systemet har nådd totalt vakuum, klikker du på kjøleinitialiseringsknappen for å starte frysetørkingsprosessen.
      MERK: Det anbefales at prøver får lov til å lyofilisere over natten.
  3. Formulering av amfotericin-B (amp-B) nanodisker
    1. Pipette 0,45 ml PBS til lyofilisert fosfolipidalikot og virvel i ~30 s for å spre lipidet.
      MERK: Den resulterende prøven vil virke ugjennomsiktig og uklar.
    2. Pipette 50 μL av en 20 mg/ml ampB oppløsning (20 mg ampB oppløst i 1 ml dimetylsulfoksid [DMSO], lagret ved -20 °C i lukket ravkar) i den dispergerte fosfolipidprøven og virvelen.
      MERK: Ved valg av et løsningsmiddel som skal brukes ved fremstilling av en stamløsning av det hydrofobe bioaktive middel, er de to overordnede hensynene 1) løseligheten av det bioaktive middel og 2) blandbarheten av løsningsmidlet med den vandige bufferen som brukes i formuleringen. Mens DMSO ofte brukes 15,16,17,18,19, har dimetylformamid 20,21 eller tetrahydrofuran 22 også blitt brukt 23.
    3. Pipette 0,5 ml apoE4-NT stillasprotein (konsentrasjon av ~4 mg/ml) til glassreagensrøret som inneholder dispergert fosfolipid og ampB. Det endelige volumet av prøven skal være ca. 1 ml.
    4. Bad sonicate prøven ved 24 ° C til løsningen klargjør (vanligvis 10-15 min).
  4. Nanodisk sentrifugering
    1. Overfør den klargjorte ampB-nanodiskløsningen til et sterilt 1,7 ml mikrosentrifugerør.
    2. Plasser røret i en mikrosentrifugerrotor på bordplaten med tilsetning av et balanserør plassert rett motsatt.
    3. Stram rotorhetten og lukk sentrifugelokket.
    4. Programmer sentrifugen til å spinne i 10 minutter ved ~ 11 000 x g ved hjelp av de tilsvarende hjulene på forsiden av mikrosentrifugeenheten.
      MERK: På dette tidspunktet kan en pellet være synlig. Denne pelleten består av ikke-inkorporert fosfolipid og/eller ampB.
    5. Fjern supernatanten og overfør den til et annet rent 1,7 ml mikrosentrifugerør.
  5. Dialyse av ampB-nanodisk prøve
    1. Forbered en del av dialyseslangen (dimensjoner på dialyseslangen som ble brukt var 3 cm lange, 16 mm indre diameter og 10 000 MWCO) ved grundig bløtlegging i ddi-vann i 10 minutter.
    2. Klargjør en 1 l PBS-bufferløsning (10 mM natriumfosfat + 150 mM NaCl, pH 7,2) i et 1 l plastbeger eller tilsvarende.
    3. Bruk en dialyseslangeklemme til å klemme den ene enden av den gjennomvåte dialyseslangen, slik at klemmen er sikret og at ingen væske kan slippe ut.
    4. Sett inn en smal nakketrakt i den åpne enden av dialyseslangen og overfør ampB-nanodiskprøven inn i dialyseslangen.
    5. Fjern trakten og klem enden av dialyseslangen med en annen dialyseslangeklemme.
    6. Plasser en skumdialyseflottør på en av de forseglede endene av dialyseslangen og plasser den monterte dialyseslangen i begeret som inneholder 1 liter PBS-buffer.
    7. Plasser en magnetisk rørestang i bunnen av begeret og juster omrøringskontrollen til "lav", slik at det ikke dannes en virvel. La dialysen fortsette over natten ved 4 °C.

3. Spektralanalyse av ampB-nanodiskprøver

  1. Initialisering av spektrofotometer etterfulgt av automatisk blank
    1. Slå på spektrofotometeret ved å vri strømbryteren og koble til en tilsvarende støttecomputer ved å trykke på knappen merket "PC Control".
    2. På støttedatamaskinen åpner du programvaren merket "UVProbe 2.61" og kobler til spektrofotometeret ved å klikke på knappen merket "Koble" nederst i venstre hjørne.
    3. Klikk på knappen merket Spectrum på den øverste verktøylinjen i UVProbe-programvaren.
    4. Klikk på knappen merket Metode på den øverste verktøylinjen.
    5. Klikk på kategorien Måling og skriv inn "500" i Start-tekstboksen under "Bølgelengdeområde (nm)" og "300" i tekstboksen "Slutt".
    6. Klikk på rullegardinmenyen ved siden av fanen merket Skannehastighet og sett den til Middels.
    7. Forbered en prøveblank ved å overføre 1 ml DMSO til to kvartskuvetter (QS 1.000).
    8. Last begge kyvettene inn i de respektive prøveportene på spektrofotometeret, klikk Autoblank, og registrer et spektrum fra 300-500 nm ved å klikke Start nederst i venstre hjørne.
  2. Forberedelse og spektralanalyse av ampB-standard
    1. Forbered 20 μg/ml ampB standard ved å fjerne kyvetten fra den fremre prøvetaksporten og tilsette 20 μL av en 1 mg/ml ampB stamløsning (20 μg ampB totalt).
    2. Sett kyvetten tilbake i prøveporten på spektrofotometeret og klikk Start for å registrere prøveabsorbansen.
    3. Fjern kyvetten fra prøveporten og dekanter væskeinnholdet i en passende merket avfallsbeholder.
    4. Skyll kyvetten grundig med tre vasker avionisert vann etterfulgt av tre vasker med 70% etanol.
  3. Fremstilling og spektralanalyse av forstyrret ampB-nanodiskprøve
    1. Forbered en forstyrret ampB-nanodiskprøve (inneholdende 20 μg / ml som ampB) ved å pipetere 20 μL av en 1 mg / ml ampB-nanodiskbestand i 1 ml DMSO. Inkuber i minst 1 min før du registrerer spekteret.
    2. Sett kyvetten inn i den fremre prøvetakingsporten på spektrofotometeret og klikk Start for å registrere prøveabsorbansen.
  4. Forberedelse og spektralanalyse av et PBS-bufferemne
    1. Forbered et PBS-bufferemne ved å overføre 1 ml PBS-buffer til to kvartskuvetter (QS 1.000).
    2. Legg kyvettene i de respektive prøveportene på spektrofotometeret, klikk Autoblank, og registrer spekteret fra 300-500 nm.
  5. Forberedelse og spektralanalyse av en ikke-forstyrret ampB-nanodiskprøve
    1. Forbered en ikke-forstyrret ampB-nanodiskprøve (inneholdende 20 μg / ml som ampB) ved å fjerne kyvetten fra den fremre prøveporten og introdusere 20 μL av en 1 mg / ml ampB-nanodiskprøve i PBS-bufferen.
    2. Legg kyvetten tilbake i prøveporten på spektrofotometeret, klikk på Start og registrer prøvespekteret.
      MERK: Alt kjemisk avfall skal kastes i en passende merket avfallsbeholder i henhold til aksepterte retningslinjer.

4. Analyse av gjærlevedyktighetsanalyse

MERK: Gjær levedyktighetsanalyser ble utført for å evaluere den biologiske aktiviteten til ampB og avgjøre om prosessen med formulering eller inkorporering i nanodisker, påvirket gjærveksthemmingsaktiviteten.

  1. Formuler to ampB-nanodiskprøver (sluttvolum = 1 ml) for å inneholde 1 mg ampB per 5 mg DMPC og 0,1 mg ampB per 5 mg DMPC etter den tidligere beskrevne metoden (2.3-2.4.1).
    MERK: For å lage en 1 mg/ml og 0,1 mg/ml ampB per 5 mg DMPC, pipette henholdsvis 50 μL og 5 μL av en 20 mg/ml ampB i DMSO i hvert prøveglass.
  2. Fremstilling av en mettet gjærkultur
    1. Overfør 25 ml sterilt gjærekstrakt-pepton-druesukker (YPD) medium til et sterilt 50 ml konisk rør.
    2. Bruk en steril inokulasjonssløyfe til å overføre en enkelt Saccharomyces cerevisiae (BY4741)-koloni til 25 ml YPD-medium.
    3. Dyrk gjæren i en ristende inkubator satt til 30 ° C, med oscillasjon satt til 200 o / min i 18 timer.
  3. Fremstilling av individuelle veksthemmingsanalyseprøver
    1. Overfør 5 ml sterilt YPD-medium til 30 sterile 13 ml dyrkningsrør.
    2. Behandle tre sett med kulturrør ved å legge til 20, 10 og 5 μL av 1 mg / ml ampB-nanodiskprøven, som representerer henholdsvis 20, 10 og 5 μg ampB.
    3. Behandle tre sett med kulturrør ved å legge til 20, 10 og 5 μl av 0,1 mg / ml ampB-nanodiskprøven, som representerer henholdsvis 2, 1 og 0,5 μg ampB.
    4. Behandle fire sett med kulturrør ved å legge til 20 μL PBS, DMSO, kontroll rHDL (ingen ampB) eller 20 μg ampB i DMSO.
      MERK: Hvert sett med kulturrør representerer en uavhengig replikasjon. Derfor resulterer følgende metoder i en samlet n-verdi på n = 3.
  4. Initialisering av gjærlevedyktighetsanalyse
    1. Start eksperimentet ved å inokulere hver prøve med 100 μL (2% vol / vol) av den mettede gjærkulturen
    2. Dyrk gjæren ved hjelp av en ristende inkubator satt til 30 ° C, med oscillasjon satt til 200 o / min i maksimalt 18 timer.
  5. Gjær levedyktighet målinger
    1. Slå på spektrofotometeret ved å vri strømbryteren, klikk deretter på knappen merket Go To WL og sett verdien til 600 nm.
    2. Overfør 1 ml sterilt YPD-medium til to plastkyvetter, legg i de respektive prøveportene på spektrofotometeret og klikk på Autoblank.
    3. Overfør 1 ml av hver prøve til en plastkuvette, sørg for å bytte kyvetter hver gang og legg kyvetten inn i den fremre prøvetakoporten på spektrofotometeret.
    4. Mål og registrer hver prøves optiske tetthet ved 600 nm og kast hver brukt kyvette i en riktig merket beholder for biologisk farlig avfall.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bioaktivt middel nanodisk formuleringsprosess
I den beskrevne ampB-nanodiskformuleringsprosedyren anses reaksjonen som fullført når prøveutseendet overgår fra uklart til klart (figur 1). Denne endringen indikerer at nanodisker har dannet seg og at det bioaktive stoffet har blitt solubilisert. Ofte absorberer bioaktive midler lys i det synlige bølgelengdeområdet (f.eks. ampB, curcumin, lutein, koenzym Q10), og i disse tilfellene vedtar prøven fargen på det bioaktive stoffet. Når prøveavklaringen er fullført (vanligvis 5-20 min badsonikering), overføres prøven til et 1,7 ml mikrosentrifugerør og sentrifugeres ved 11.000 x g i 5 minutter for å pelletere uoppløselig materiale. Fraværet av en synlig pellet kan betraktes som sterke bevis på at det bioaktive stoffet er inkorporert i nanodiskene. På den annen side indikerer utseendet til en pellet at delvis eller ingen inkorporering av bioaktivt middel har skjedd. Hvis det er nødvendig eller nyttig, kan kontrollformuleringer som bare inneholder det dobbeltlagsdannende lipid- og stillasproteinet utføres parallelt, og omfanget av klargjøring av begge prøvene sammenlignes visuelt og kvantitativt ved hjelp av et spektrofotometer. I alle fall, etter sentrifugering av et bioaktivt middel som inneholder nanodisker, blir prøven dialysert mot PBS, eller en annen passende buffer, for å fjerne spor av løsningsmiddel.

Analyse av oppløselig effekt av bioaktive midler
For å illustrere hvordan prøveabsorbans kan brukes til å bestemme oppløselighetseffektiviteten, kan ampB-nanodisker brukes. I utgangspunktet samles et spektrum av ampB i DMSO. Dette oppnås ved å tilsette 20 μL fra en 1 mg/ml stamløsning av ampB (i DMSO) til en kyvette inneholdende 980 μl DMSO. Spekteret registreres deretter i det synlige bølgelengdeområdet fra 300-500 nm på et UV/Vis-spektrofotometer (figur 2). Dette spekteret, oppnådd i DMSO-løsningsmiddel, gir tre karakteristiske absorbansmaksima ved 372 nm, 392 nm og 415 nm, topper som indikerer ampB. Deretter samles et absorbansspektrum av ampB-nanodisker i PBS. For å oppnå dette spektret tilsettes 20 μL ampB-nanodisker i PBS til 980 μL PBS, og spektret registreres. Dette spekteret forventes å være ganske annerledes, med en enkelt stor absorbanstopp ved en kortere bølgelengde, fra spekteret observert i DMSO25. Dette resultatet skyldes det faktum at i PBS forblir ampB-nanodiskpartikkelstrukturen intakt, med individuelle ampB-molekyler begrenset og begrenset til det indre av det hydrofobe miljøet i nanodisk-dobbeltlaget. Fordi ampB-molekyler i prøven er i nærheten av andre ampB-molekyler, kan høyere ordens komplekser / strukturer dannes, noe som resulterer i en dramatisk endring i spektralegenskapene til ampB. For direkte å sammenligne spektrene av ampB formulert i nanodisker versus lagerforsterker, tilsettes en 20 μL alikot av dialyserte ampB-nanodisker (i PBS) til 980 μL DMSO. I dette tilfellet fører DMSO-løsningsmidlet til forstyrrelse av nanodiskpartikkelstrukturen, slik at ampB integrert i lipid-dobbeltlaget av nanodiskprøven frigjøres og blir fritt løselig i DMSO-løsningsmidlet. Absorbansspekteret til denne prøven skal virke svært likt, om ikke identisk, med spekteret av stamforsterker beskrevet ovenfor. Dette resultatet gir direkte bevis på at ampB er tilstede og at dets kjemiske egenskaper ikke har blitt endret av prosessen med nanodiskformulering. I dette tilfellet forventes det at de samme tre absorbansmaksima vil bli detektert.

Biologisk aktivitet av ampB-nanodisker
For å vurdere den biologiske aktiviteten til ampB-nanodisker ble gjærveksthemmingsanalyser utført. Gjærstammen BY4741 (en etterkommer av S. cerevisiae S288C-stammen) ble benyttet. Etter behandling ble den optiske tettheten av hver gjærprøve målt ved 600 nm på et UV-1800 UV/Vis-spektrofotometer (figur 3). Inkluderingen av tre kontrollprøver (PBS, DMSO og rHDL) viste at andre nanodiskkomponenter enn ampB ikke har noen merkbar effekt på gjærvekst. Den positive kontrollen (20 μg ampB i DMSO) bekreftet at ampB er en effektiv hemmer av gjærvekst. Når ampB-nanodisker ble testet, ble det oppnådd bevis på ampB-konsentrasjonsavhengig veksthemmingsaktivitet. Dermed tillater sekvestrering av ampB i lipidmiljøet av nanodiskpartikler økt vandig bufferoppløselighet, med oppbevaring av potent biologisk aktivitet.

Figure 1
Figur 1: Effekt av badsonikering på nanodiskformulering og prøveutseende. En ampB-nanodisk (ampB-ND) prøve ble fremstilt ved å dispergere 5 mg DMPC i 0,75 ml PBS, tilsatt 1 mg ampB til prøven fra en 20 mg / ml stamløsning i DMSO, etterfulgt av tilsetning av 2 mg stillasprotein i 0,5 ml PBS (fra en 4 mg / ml stamløsning). (A) DMPC-spredning i PBS. (B) DMPC-dispersjon i PBS etter tilsetning av 1 mg ampB. (C) nanodiskoppløsning som inneholder DMPC, ampB og stillasprotein etter badsonikering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: UV/Vis-absorbansspektroskopi av ampB-prøver. (A) ampB i DMSO. (B) ampB-nanodisker (ampB-ND) i PBS. (C) ampB-nanodisker i DMSO. Spektra ble samlet inn på et UV/Vis-spektrometer. AmpB-innholdet i ampB-nanodiskprøver kan bestemmes ved å overføre en kjent alikot til en løsning av DMSO og måle absorbans ved 416 nm (ampB-ekstinksjonskoeffisient ved 416 nm = 1,24 x 105 M-1 cm-1). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Effekt av ampB på vekst av S. cerevisiae. Gjær ble dyrket ved 30 °C i fravær og tilstedeværelse av ampB. Kontrollprøver som manglet ampB inkluderte PBS alene og rHDL. Som en positiv kontroll ble ampB administrert i DMSO. Testformuleringer inkluderte ampB-nanodisker (ampB-ND) ved de angitte konsentrasjonene av ampB. Etter inkubasjon ble individuelle optiske tetthetsverdier bestemt ved 600 nm. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av en toveis ANOVA-multippel sammenligning med en Tukeys post hoc-test. Rapporterte verdier er gjennomsnittet ± standardfeil (n = 3), representativt for tre uavhengige eksperimenter. NS = ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Bioaktivt middel Molekulær vekt (Da) Løsemiddel Referanse
Amfotericin B 924.1 DMSO 15
All-trans retinsyre 300.4 DMSO 16
Curcumin 368.4 DMSO 17
Nutlin 3a 581.5 DMSO 21
Koenzym Q10 863.3 Dimetylformamid 20
Lutein 568.9 Tetrahydrofuran 22
Sfingadien 297.5 DMSO 19
Docetaksel 1 807.9 - 23
10-hydroxycamptothecin 364.4 DMSO 18
Simvastatin1 418.5 - 24
1 Utvalgt bioaktivt middel løsningsmiddel ble tørket med fosfolipid i stedet for å bli tilsatt til dispergert fosfolipid i buffer.

Tabell 1: Bioaktive midler vellykket innlemmet i nanodisker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Formulering av et bioaktivt middel som inneholder nanodisker gir en praktisk metode for å oppløse ellers uoppløselige hydrofobe forbindelser. Fordi produktets bioaktive middel nanodisker er fullt oppløselige i vandige medier, gir de en nyttig leveringsmetode for et bredt spekter av hydrofobe molekyler (tabell 1). Disse inkluderer små molekyler, naturlige og syntetiske stoffer, fytokjemikalier, hormoner, etc. Formuleringsstrategien følger vanligvis en standardprotokoll som må ta hensyn til løselighetsegenskapene til det bioaktive stoffet i organiske løsningsmidler. I tillegg til å velge et egnet organisk oppløsningsmiddel for å oppløse det bioaktive middel, kreves ytterligere to parametere, som oppnår en ~20 mg/ml stamløsning og blandbarhet av løsningsmidlet med vandige oppløsninger. Dette er nødvendig fordi det gjør det mulig å tilsette en betydelig mengde bioaktivt middel til formuleringsblandingen samtidig som overflødig organisk løsningsmiddel ikke innføres. Blandbarhet er viktig fordi faseseparasjon vil forhindre inkorporering av bioaktivt middel i produktets nanodisk.

Ved å introdusere det bioaktive middelet umiddelbart etter at det dannes fosfolipiddispersjon i den valgte bufferen, kan disse komponentene interagere med hverandre før stillasproteinet tilsettes. Før og umiddelbart etter tilsetning av stillasprotein, vises prøven som en ugjennomsiktig suspensjon. Men når de tre komponentene (fosfolipid, bioaktivt middel og stillasprotein, i et 5/1/2 w / w / w-forhold) blir tilsatt, og prøven blir utsatt for badsonikering ved riktig temperatur i tilstrekkelig periode, endres utseendet fra uklart til klart. Hvis det bioaktive stoffet er farget, vil den klargjorte prøven ta på seg den fargen. Dermed er det enkelt å oppdage nanodiskdannelse ved visuell inspeksjon.

Selv om DMPC er praktisk og ofte brukt som fosfolipid av valg for mange applikasjoner, med visse bioaktive midler, motstår dette fosfolipidet nanodiskformulering. For eksempel ble koenzym Q10 nanodisker dannet bare når eggfosfatidylkolin (PC) ble brukt19, og på samme måte for xantofyllet, lutein22. Således, mens DMPC ofte er fosfolipid av valget, er dette ikke universelt. Årsaken til at koenzym Q10 og lutein foretrekker egg-PC kan skyldes deres utvidede hydrofobe regioner, en preferanse for tolags som har umettede fettsyrer eller en annen faktor. Når egg-PC er ansatt, økes temperaturen på sonikering til 45 ° C under sonikering for å oppnå full prøveavklaring. Når de er formulert, sentrifugeres bioaktive middelholdige nanodisker for å fjerne uoppløselig materiale. Det skal imidlertid bemerkes at normalt et bunnfall ikke dannes når optimale forhold er bestemt og fulgt. Deretter dialyseres prøven mot buffer over natten for å fjerne den lille mengden organisk løsningsmiddel som ble tilsatt til formuleringsblandingen sammen med det bioaktive middelet. Etter dialyse kan produktets nanodisk lagres ved 4 °C i lengre perioder. Hvis det inkorporerte bioaktive middelet er utsatt for oksidasjon, bør nanodiskprøven lagres i en lukket beholder under N2 gass.

Ulike metoder har blitt brukt for å karakterisere og validere at nanodisker faktisk har dannet. Den kanskje mest presise metoden er elektronmikroskopi26,27. Denne teknikken gir informasjon om partikkelmorfologi, diameter og populasjonsstørrelse heterogenitet. Denne metoden anses som endelig for nanodiskdannelse. En beslektet metode, atomkraftmikroskopi, har også blitt brukt til å undersøke egenskapene til bioaktive middelholdige nanodisker 17,24,28. For praktiske formål er imidlertid rask proteinvæskekromatografi (FPLC) gelfiltreringskromatografi praktisk og vanligvis tilstrekkelig til å karakterisere størrelsen (~ 200 000 Da) og homogeniteten til en gitt bioaktiv agent nanodiskprøve20,22. Når det er fastslått at nanodisker med bioaktivt middel har dannet seg, er det også viktig og nyttig å bestemme oppløselighetseffektiviteten til det bioaktive stoffet. Hvis det bioaktive stoffet har karakteristiske absorbansegenskaper ved en gitt bølgelengde, representerer UV/Vis-absorbansspektroskopi en praktisk metode. En potensielt kompliserende faktor er stillasproteinabsorbans ved 280 nm. Men hvis et gitt bioaktivt middel absorberer ved en annen bølgelengde, er dette ikke et problem. Hvis en utryddelseskoeffisient er kjent for det bioaktive middel av interesse, er det mulig å nøyaktig bestemme mengden bioaktivt middel oppløselig i nanodisker. Ellers kan en standardkurve avledet fra spektra av kjente mengder av det bioaktive stoffet i et passende løsningsmiddel brukes. Alternative metoder inkluderer fluorescensspektroskopi17,22 eller høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) analyse20,24.

Den grunnleggende formuleringsprosessen beskrevet for bioaktivt middel som inneholder nanodisker, er egnet til et bredt spekter av applikasjoner. For eksempel har nanodisker som har kontrastmidler blitt brukt i medisinske bildebehandlingsstudier for å diagnostisere og vurdere sykdomsprogresjonen29. En annen tilnærming er å integrere lipidmodifiserte proteiner i dobbeltlaget av nanodisker. For eksempel innlemmet Lalefar et al. vellykket "Wnt" -proteinet i nanodisker ved innsetting av sin kovalent bundne oljesyredel30. Wnt nanodisker ble senere vist å utgjøre et vannløselig Wnt-transportkjøretøy som er i stand til å fremme ex vivo ekspansjon av hematopoietiske stamceller. I en annen studie konstruerte Crosby et al. et stillasproteinkimærer bestående av apoA-I smeltet sammen til et enkeltkjedevariabelt antistofffragment (scFv) rettet mot B-celleoverflateantigenet CD2031. Etterfølgende formulering av curcumin nanodisker med α-CD20 scFv · apoA-I som stillaskomponenten ga målretting til B-celler, og derved forbedret levering av bioaktivt middel. Denne strategien gir en ny tilnærming for å minimere toksisitet forbundet med kjemoterapeutiske midler ved å lede dem spesifikt til målcelletypen. I et annet eksempel ble det syntetiske kationiske lipidet 1,2-dimyristoyl-3-trimetylammonium-propanklorid (DMTAP) inkorporert i dobbeltlaget av nanodisker32. Denne formuleringsstrategien ga effektivt positiv ladningskarakter til nanodiskens dobbeltlagsoverflate og fremmet dermed en stabil bindingsinteraksjon med kort forstyrrende (si) RNA. siRNA-berikede DMTAP-nanodisker ble deretter vist å ha biologisk aktivitet i målgen-knockdown-studier. I enda et eksempel har nanodisker blitt formulert med kardiolipin som eneste fosfolipidkomponent. Denne unike anioniske glycerofosfolipid er kjent for å binde forskjellige ligander, inkludert det divalente mineralkalsium, hemoprotein cytokrom c, antracyklin anti-kreft agent doxorubicin, og andre33,34,35,36. Kardiolipin nanodisker har blitt brukt til å karakterisere disse bindingsinteraksjonene i detalj ved å utnytte oppløselighetsegenskapene til nanodisker, deres nanoskalastørrelse og tilstedeværelsen av et tilgjengelig kardiolipin dobbeltlag8. Basert på disse, og andre applikasjoner, er det tydelig at nanodiskteknologi er en allsidig plattform for en rekke applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra National Institutes of Health (R37 HL-64159).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Cayman Chemical Company 11636 ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin Fisher Scientific BP17925 Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid GenScript N/A Transformation
Baffled Flask New Brunswick Scientific N/A Expansion & Expression
BL21 competent E coli New England Biolabs C2527I Transformation
Centrifuge bottles Nalgene 3140-0250 Expression
Chloroform Fisher Scientific G607-4 ND Formulation
DMSO Sigma Aldrich 472301 Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine Avanti Lipids 850345P ND Formulation
Erlenmeyer flask Bellco Biotechnology N/A Expansion & Expression
Falcon Tubes Sarstedt Ag & Co D51588 Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes VWR 47729-570 ND Formulation
GraphPad (Software) Dotmatics N/A Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath VWR N/A ND Formulaton
Heating and Nitrogen module Thermo Scientific TS-18822 ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL) GE Healthcare 17-0407-03 Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside  Fisher Scientific BP1755 Expression
J-25 Centrifuge Beckman Coulter J325-IM-2 Expression
JA-14 Rotor Beckman Coulter 339247 Expression
Lyophilizer Labconco 7755030 ND Formulation
Methanol Fisher Scientific A452-4 ND Formulation
Nitrogen gas Praxair UN1066 ND Formulation
NZCYM media RPI Research Products N7200-1000.0 Expansion & Expression
Pet-22B vector GenScript N/A Transformation
Petri dish Fisher Scientific FB0875718 Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes Fisher Brand 14385 928A Spectral Analysis
Shaking Incubator New Brunswick Scientific M1344-0004 Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys Thermo Scientific 66430 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 68100 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 88243 Purification
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Purification
Sodium Phosphate dibasic Fisher Scientific S374-500 Purification
Sodium Phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500 Purification
Spectra/POR Weighted Closures Spectrum Medical Industries 132736 Purification
Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 220-92961-01 spectral analysis
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 366816 ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software) Shimadzu N/A Spectral Analysis
Vacuum filter Millipore 9004-70-0 Expression & Purification
Vacuum pump GAST Manufacturing Inc DOA-P704-AA Expression & Purification
Vortex Fisher Scientific 12-812 ND Formulation
Yeast N/A BY4741 Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose BD 242820 Yeast Viability Assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704 (2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065 (2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).

Tags

Denne måneden i JoVE nanodisker amfotericin B fosfolipid apolipoprotein rekonstituert høy tetthet lipoprotein bioaktivt middel
Formulering og karakterisering av bioaktivt middel som inneholder nanodisker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I.,… More

Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I., Swackhamer, M., Karo, M., Lockhart, R., Ryan, R. O. Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks. J. Vis. Exp. (193), e65145, doi:10.3791/65145 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter