Summary
Aqui, descrevemos a produção e caracterização de agentes bioativos contendo nanodiscos. Os nanodiscos de anfotericina B são tomados como exemplo para descrever o protocolo de forma escalonada.
Abstract
O termo nanodisco refere-se a um tipo discreto de nanopartícula composto por uma bicamada formando lipídio, uma proteína de andaime e um agente bioativo integrado. Os nanodiscos são organizados como uma bicamada lipídica em forma de disco cujo perímetro é circunscrito pela proteína do andaime, geralmente um membro da família das apolipoproteínas trocáveis. Numerosos agentes bioativos hidrofóbicos têm sido eficientemente solubilizados em nanodiscos por sua integração no meio hidrofóbico da bicamada lipídica da partícula, produzindo uma população amplamente homogênea de partículas na faixa de 10-20 nm de diâmetro. A formulação de nanodiscos requer uma proporção precisa de componentes individuais, uma adição sequencial apropriada de cada componente, seguida de sonicação em banho da mistura de formulação. A proteína do arcabouço anfipático entra em contato espontaneamente e reorganiza a bicamada dispersa formando mistura lipídico/agente bioativo para formar uma população discreta e homogênea de partículas de nanodisco. Durante esse processo, a mistura de reação faz a transição de uma aparência opaca e turva para uma amostra clarificada que, quando totalmente otimizada, não produz precipitado após a centrifugação. Estudos de caracterização envolvem a determinação da eficiência de solubilização de agentes bioativos, microscopia eletrônica, cromatografia de filtração em gel, espectroscopia de absorbância no ultravioleta visível (UV/Vis) e/ou espectroscopia de fluorescência. Isto é normalmente seguido por uma investigação da actividade biológica utilizando células cultivadas ou ratinhos. No caso de nanodiscos que abrigam um antibiótico (isto é, o antibiótico polieno macrolídeo anfotericina B), sua capacidade de inibir o crescimento de leveduras ou fungos em função da concentração ou do tempo pode ser medida. A relativa facilidade de formulação, versatilidade em relação às partes componentes, tamanho de partícula em nanoescala, estabilidade inerente e solubilidade aquosa permitem inúmeras aplicações in vitro e in vivo da tecnologia de nanodiscos. No presente artigo, descrevemos uma metodologia geral para formulação e caracterização de nanodiscos contendo anfotericina B como agente bioativo hidrofóbico.
Introduction
As lipoproteínas discoidais nascentes de alta densidade (HDLs) são progenitores naturais da HDL esférica muito mais abundante presente no sistema circulatório humano. Essas partículas nascentes, também chamadas de HDL pré-ß, possuem propriedades estruturais únicas e distintas1. De fato, em vez de existir como uma partícula esferoidal, as HDLs nascentes são em forma de disco. Extensos estudos de caracterização estrutural das HDLs discoidais naturais e reconstituídas têm revelado que elas são compostas por uma bicamada fosfolipídica cujo perímetro é circunscrito por uma apolipoproteína anfipática trocável (apo), como a apoA-I. No metabolismo das lipoproteínas humanas, as HDLs nascentes circulantes acumulam lipídios das células periféricas e amadurecem em HDLs esféricas em um processo que é dependente de mediadores proteicos chave, incluindo o transportador de de ligação de ATP A1 e lecitina:colesterol aciltransferse2. Esse processo representa um componente crítico da via de transporte reverso do colesterol, considerada protetora contra doenças cardíacas. Munidos desse conhecimento e da capacidade de reconstituir HDLs discoidais, pesquisadores têm empregado essas partículas como intervenção terapêutica no tratamento da aterosclerose3. Em essência, a infusão de HDL reconstituído (rHDL) em pacientes promove o efluxo de colesterol dos depósitos de placa e o devolve ao fígado para conversão em ácidos biliares e excreção do corpo. Várias empresas biotecnológicas/farmacêuticas estão adotando essa estratégia de tratamento4.
Ao mesmo tempo, a capacidade de gerar essas partículas em laboratório desencadeou uma enxurrada de atividades de pesquisa que levaram a novas aplicações e novas tecnologias. Uma aplicação proeminente envolve o uso de partículas de rHDL como membrana em miniatura para abrigar proteínas transmembrana em um ambiente nativo5. Até o momento, centenas de proteínas foram incorporadas com sucesso no rHDL discoidal, e a pesquisa demonstrou que essas proteínas retêm tanto a conformação nativa quanto a atividade biológica como receptores, enzimas, transportadores, etc. Essas partículas, denominadas "nanodiscos", também têm se mostrado passíveis de caracterização estrutural, muitas vezes em alta resolução6. Essa abordagem para investigações de proteínas transmembrana é reconhecida como superior aos estudos com micelas ou lipossomas em detergente e, como resultado, está avançando rapidamente. É importante reconhecer que dois métodos distintos têm sido relatados que são capazes de formar uma rHDL. O método de "diálise por colato"13 é popular para aplicações relacionadas à incorporação de proteínas transmembrana na bicamada rHDL5. Essencialmente, este método de formulação envolve a mistura de uma bicamada formando fosfolipídio, uma proteína de andaime e a proteína transmembrana de interesse em um tampão contendo o detergente colato de sódio (ou desoxicolato de sódio; peso molecular da micela [PM] de 4.200 Da). O detergente solubiliza eficazmente os diferentes componentes da reação, permitindo que a amostra seja dialisada contra tampão sem detergente. Durante a etapa de diálise, à medida que o detergente é retirado da amostra, forma-se espontaneamente um HDLr. Quando essa abordagem é usada para aprisionar uma proteína transmembrana de interesse, as partículas do produto têm sido denominadas nanodiscos5. Tentativas de usar esse método para incorporar agentes bioativos hidrofóbicos de pequenas moléculas (MW <1.000 Da), no entanto, têm sido em grande parte malsucedidas. Ao contrário das proteínas transmembrana, os agentes bioativos de pequenas moléculas são capazes de escapar da bolsa de diálise junto com o detergente, diminuindo consideravelmente sua eficiência de incorporação nas rHDLs. Esse problema foi resolvido com a omissão de detergentes da mistura da formulação14. Em vez disso, os componentes são adicionados a um tampão aquoso sequencialmente, começando com a bicamada formando lipídio, formando um agente bioativo estável contendo rHDL, referido como um nanodisco. Outros utilizaram a rHDL para incorporação e transporte de imagiologia in vivo 7. Mais recentemente, a rHDL especializada composta por um arcabouço apolipoprotéico e o glicerofosfolipídeo aniônico, cardiolipina, tem sido empregada em estudos de ligação de ligantes. Essas partículas fornecem uma plataforma para estudos da interação da cardiolipina com vários ligantes solúveis em água, incluindo cálcio, citocromo c e o agente anticâncer doxorrubicina8.
O foco do presente estudo está na formulação de rHDL que possuam um agente bioativo hidrofóbico incorporado de forma estável (i.e. nanodisco). A capacidade desses agentes de se integrarem ao meio lipídico das partículas de rHDL discoidal lhes confere solubilidade aquosa. Como tal, os nanodiscos têm potencial para aplicações terapêuticas in vivo . Ao formular nanodiscos, condições específicas de incubação/reação são necessárias para incorporar com sucesso agentes bioativos hidrofóbicos discretos na partícula do produto, e o objetivo deste relatório é fornecer informações práticas detalhadas que podem ser usadas como um modelo fundamental para a criação de novas partículas de nanodiscos para aplicações específicas. Assim, no contexto deste manuscrito os termos nanodisco e nanodisco não são intercambiáveis. Enquanto nanodisco refere-se a um rHDL formulado para conter uma proteína transmembrana embutida em sua bicamada lipídica5, o termo nanodisco refere-se a um rHDL formulado para incorporar agentes bioativos hidrofóbicos de baixo peso molecular (< 1.000 Da), como a anfotericina B14.
Uma variedade de métodos está disponível para a aquisição de proteínas adequadas do arcabouço. É possível comprar proteínas de andaimes de fabricantes [por exemplo, apoA-I (SRP4693) ou apoE4 (A3234)], no entanto, o custo pode ser um fator limitante. Uma abordagem preferida é expressar proteínas recombinantes do arcabouço em Escherichia coli. São publicados protocolos para apoA-I9, apoE410 e apolipoforina-III humana e para a proteína de hemolinfa de insetos apolipoforina-III11. Para os experimentos aqui descritos, foi utilizado o domínio N-terminal (NT) humano recombinante da apoE4 (aminoácidos 1-183). A sequência de nucleotídeos que codifica apoE4-NT humana foi sintetizada e inserida em um vetor de expressão pET-22b (+) diretamente adjacente à sequência líder pelB codificada vetorialmente. Este construto leva à expressão de uma proteína de fusão da sequência líder da pelB-apoE4-NT. Após a síntese proteica, a sequência líder da pelB bacteriana direciona a proteína recém-sintetizada para o espaço periplasmático, onde a peptidase líder cliva a sequência da pelB. A proteína apoE4-NT resultante, sem tags de sequência ou caudas, posteriormente escapa da bactéria e se acumula no meio de cultura11,12, simplificando o processamento a jusante.
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Protocol
1. Transformação, expressão e purificação do componente proteico do andaime
- Transformação bacteriana BL21 com apoE4-NT contendo plasmídeo
- Descongelar um tubo de células competentes BL21 (DE3) no gelo por 10 min.
- Depois que todo o gelo derreter, misture suave e cuidadosamente pipetar 50 μL das células em um tubo de transformação sobre gelo.
- Adicionar 5 μL contendo 50 ng de ADN plasmidial (para sequência, ver quadro suplementar 1) à mistura celular. Agite cuidadosamente o tubo quatro ou cinco vezes para misturar. Não vórtice.
- Coloque a mistura no gelo por 30 min.
- Choque térmico da mistura exatamente a 42 °C por 10 s.
- Coloque no gelo por 5 min.
- Pipetar 950 μL de meio S.O.C. para o tubo à temperatura ambiente.
- Coloque o tubo em uma incubadora de agitação de 37 °C por 60 min com oscilação regulada para 250 rpm.
- Misture bem as células agitando e invertendo, depois espalhe 100 μL de solução celular em uma placa de seleção de 20 mL de Caldo Luria + Agar tratada com ampicilina na concentração de 0,1 mg/mL.
- Incubar durante a noite a 37 °C, ou até que as colónias visíveis tenham crescido.
- Usando um pipetador eletrônico, transferir 25 mL de meio NZCYM estéril para um balão cônico estéril de 250 mL à temperatura ambiente e adicionar ampicilina a uma concentração final de trabalho de 0,1 mg/mL.
- Usando uma alça de inoculação estéril, transferir uma colônia individual da placa de seleção contendo a cepa bacteriana adequadamente transformada e adicionar diretamente ao frasco contendo 25 mL de meio NZCYM + ampicilina.
- Colocar os 25 mL do frasco de cultura de sementes NZCYM em uma incubadora de agitação de 37 °C com oscilação orbital regulada para 250 rpm.
NOTA: Recomenda-se que esta cultura de sementes seja cultivada durante a noite para atingir uma concentração bacteriana adequada (~1,5-2,0 unidades de densidade óptica), medida usando um espectrofotômetro ajustado para comprimento de onda = 600 nm. - Transferir 250 mL de meio NZCYM estéril para quatro frascos defletores de 1 L e adicionar antibiótico ampicilina a uma concentração de trabalho de 0,1 mg/mL.
- Em condições estéreis, transferir 5 mL de cultura de sementes saturadas para cada um dos quatro frascos contendo 250 mL de cultura e colocar em uma incubadora de agitação de 37 °C com oscilação orbital regulada para 250 rpm.
NOTA: Neste ponto, a cultura será referida como uma cultura de expansão e o crescimento exponencial será monitorado usando um espectrofotômetro UV1800. O crescimento é permitido até que a densidade óptica de cultura a 600 nm (OD600) atinja um valor entre 0,6-0,8. - Uma vez que a cultura de expansão tenha atingido o valor desejado de OD600 de 0,6-0,8, adicionar 59,6 mg de isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a cada 250 ml de cultura contendo frasco para uma concentração final de 1 mM para induzir a expressão proteica. Nesse ponto, a cultura de expansão é referida como a expressão cultura. Iniciar expressão por um período de 5 h.
- Ao final do período de expressão de 5 h, retirar os quatro frascos da incubadora de agitação e pipetar 125 mL em seis frascos de centrífuga de 250 ml (total de 750 mL).
- Equilibre cada frasco de centrífuga para garantir que a massa total esteja dentro de ±0,5 mg um do outro.
NOTA: Esta etapa é essencial para garantir a operação segura do dispositivo centrífugo. - Prepare o dispositivo centrífugo primeiro virando o interruptor de alimentação para a posição ligada. Clique no botão "Set/Actual" e ajuste os parâmetros para "JA-14", "9,400 x g", 20,00 min e 4 °C usando os mostradores correspondentes.
- Coloque as seis garrafas de centrífuga balanceadas em um rotor centrífugo de tamanho adequado e coloque na centrífuga, garantindo que todos os parâmetros de segurança específicos sejam seguidos.
NOTA: Continue esta etapa até que toda a cultura de células bacterianas tenha sido centrifugada e sobrenadantes coletados. - Filtrar o sobrenadante bacteriano isolado através de um filtração a vácuo ou de um aparelho equivalente equipado com um filtro de 0,45 mícrons para remover quaisquer detritos residuais.
- Purificação da heparina da proteína do arcabouço apoE4-NT recombinante
NOTA: O procedimento de purificação da coluna é realizado à temperatura ambiente.- Equilibrar a coluna de heparina Hi-trap aplicando 10 volumes de coluna (50 mL) de tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,2, e eluír a uma taxa de 5 mL/min.
- Aplicar o meio enriquecido com apoE4-NT na coluna a uma taxa de 2,5 mL/min até que todo o volume de 1 L de meio tenha sido aplicado e descartar o fluxo.
- Lavar a coluna com 10 volumes de coluna (50 mL) de tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,2, e descartar o fluxo.
- Eluir a proteína apoE4-NT desejada aplicando três volumes de coluna (15 mL) de tampão de eluição (tampão fosfato de sódio 10 mM + NaCl 1,5 M, pH 7,2) na coluna e coletar o eluato.
- Diálise do eluato de apoE4-NT
- Preparar uma seção de tubulação de diálise (as dimensões da tubulação de diálise usadas foram 22 cm de comprimento, 12 mm de diâmetro interno e 10.000 MWCO) de molho em água destilada deionizada (ddi) por 10 min.
- Preparar 1 L de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (fosfato de sódio 10 mM + NaCl 150 mM, pH 7,2) num copo de plástico de 1 L ou equivalente.
- Usando uma braçadeira de tubo de diálise, prenda uma extremidade da tubulação de diálise encharcada, garantindo que a pinça esteja presa e nenhum líquido possa escapar.
- Insira um funil de pescoço estreito na extremidade aberta do tubo de diálise e despeje os 15 mL de eluato de apoE4-NT no tubo de diálise.
NOTA: É imprescindível verificar se há vazamentos nesta etapa. - Retire o funil e prenda a extremidade do tubo de diálise com outra pinça do tubo de diálise.
- Coloque um flutuador de diálise de espuma em uma das extremidades seladas do tubo de diálise e coloque o tubo de diálise montado no copo contendo 1 L de tampão PBS.
- Coloque uma barra de agitação magnética no fundo do copo e ajuste o controle de agitação para "baixo", garantindo que um vórtice não seja formado.
- Após a conclusão da diálise, decantar o retentado em um tubo cônico de 50 mL e armazenar a -20 °C.
NOTA: Recomenda-se que esta diálise seja realizada a 4 °C durante a noite.
2. Formulação de agente bioativo contendo nanodiscos
- Preparação de alíquota fosfolipídica
- Pesar 5 mg de um fosfolipídeo apropriado (por exemplo, dimiristoilfosfatidilcolina [DMPC]) e transferir para um tubo de ensaio de vidro.
- Dissolver os 5 mg de fosfolipídeo adicionando 300 μL de CHCl 3 e 100 μL de CH 3 OH para umaproporção total de3:1 v/v.
- Evaporar o solvente orgânico colocando o tubo de ensaio de vidro sob uma corrente suave de gás N2 por 10-15 min, de modo que uma fina película de fosfolipídio seco se forme ao longo das paredes da porção inferior do tubo.
- Liofilização de alíquotas fosfolipídicas
- Preparar alíquotas fosfolipídicas para liofilização cobrindo a abertura do tubo de ensaio de vidro com parafilme.
- Perfurar o parafilme usando uma agulha 24G aproximadamente 10-15 vezes.
- Coloque as alíquotas perfuradas em um recipiente de liofilização apropriado e verifique se a tampa de borracha está selada corretamente.
- Conecte o recipiente de liofilização ao coletor de vácuo localizado na parte superior da máquina de liofilização e certifique-se de que todas as outras válvulas estejam bem fechadas.
- Ligue a máquina de liofilização acionando o botão liga/desliga e pressionando o botão de inicialização a vácuo.
- Depois que o sistema atingir o vácuo total, clique no botão de inicialização da refrigeração para iniciar o processo de liofilização.
NOTA: Recomenda-se que as amostras sejam deixadas liofilizar durante a noite.
- Formulação de nanodiscos de anfotericina B (amp-B)
- Pipetar 0,45 mL de PBS para a alíquota fosfolipídica liofilizada e vórtice por ~30 s para dispersar o lipídio.
NOTA: A amostra resultante aparecerá opaca e turva. - Pipetar 50 μL de uma solução-mãe ampB de 20 mg/mL (20 mg de ampB dissolvido em 1 mL de dimetilsulfóxido [DMSO], armazenado a -20 °C em um recipiente âmbar fechado) para a amostra de fosfolipídios dispersa e vórtice.
NOTA: Ao selecionar um solvente a ser usado na preparação de uma solução-estoque do agente bioativo hidrofóbico, as duas considerações gerais são 1) a solubilidade do agente bioativo e 2) a miscibilidade do solvente com o tampão aquoso usado na formulação. Enquanto o DMSO é frequentemente utilizado 15,16,17,18,19, a dimetilformamida 20,21 ou o tetraidrofurano 22 também têm sido empregados com sucesso 23. - Pipetar 0,5 mL de proteína do arcabouço apoE4-NT (concentração de ~4 mg/mL) para o tubo de ensaio de vidro contendo o fosfolipídeo disperso e ampB. O volume final da amostra deve ser de aproximadamente 1 mL.
- Banho sonicar a amostra a 24 °C até que a solução se esclareça (geralmente 10-15 min).
- Pipetar 0,45 mL de PBS para a alíquota fosfolipídica liofilizada e vórtice por ~30 s para dispersar o lipídio.
- Centrifugação em nanodiscos
- Transfira a solução clarificada de nanodisco de ampB para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 mL.
- Coloque o tubo em um rotor de microcentrífuga de mesa com a adição de um tubo de equilíbrio colocado diretamente em frente.
- Aperte a tampa do rotor e feche a tampa da centrífuga.
- Programe a centrífuga para girar por 10 min a ~11.000 x g usando os mostradores correspondentes localizados na parte frontal da unidade de microcentrífuga.
NOTA: Neste ponto, uma pastilha pode estar visível. Este pellet consiste em fosfolipídio não incorporado e/ou ampB. - Retire o sobrenadante e transfira-o para outro tubo microcentrífugo limpo de 1,7 mL.
- Diálise de amostra de nanodisco ampB
- Preparar uma seção de tubo de diálise (as dimensões da tubulação de diálise usadas foram 3 cm de comprimento, 16 mm de diâmetro interno e 10.000 MWCO) imersão completa em água ddi por 10 min.
- Preparar uma solução tampão PBS de 1 L (fosfato de sódio 10 mM + NaCl 150 mM, pH 7,2) num copo de plástico de 1 L ou equivalente.
- Usando uma braçadeira de tubo de diálise, prenda uma extremidade da tubulação de diálise encharcada, garantindo que a pinça esteja presa e nenhum líquido possa escapar.
- Insira um funil de pescoço estreito na extremidade aberta do tubo de diálise e transfira a amostra de nanodisco de ampB para o tubo de diálise.
- Retire o funil e prenda a extremidade do tubo de diálise com outra pinça do tubo de diálise.
- Coloque um flutuador de diálise de espuma em uma das extremidades seladas do tubo de diálise e coloque o tubo de diálise montado no copo contendo o 1 L de tampão PBS.
- Coloque uma barra de agitação magnética no fundo do copo e ajuste o controle de agitação para "baixo", garantindo que um vórtice não seja formado. Permitir que a diálise continue durante a noite a 4 °C.
3. Análise espectral de amostras de nanodiscos ampB
- Inicialização do espectrofotômetro seguida de auto blank
- Ligue o espectrofotômetro acionando o botão liga/desliga e conecte-se a um computador de suporte correspondente pressionando o botão "PC Control".
- No computador de suporte, abra o software rotulado "UVProbe 2.61" e conecte-se ao espectrofotômetro clicando no botão "Conectar" no canto inferior esquerdo.
- Clique no botão Spectrum na barra de ferramentas superior dentro do software UVProbe.
- Clique no botão denominado Método na barra de ferramentas superior.
- Clique na guia Medição e insira "500" na caixa de texto Iniciar localizada em "Faixa de comprimento de onda (nm)" e "300" na caixa de texto "Fim".
- Clique no menu suspenso ao lado da guia chamada Velocidade de varredura e defina-a como Média.
- Preparar uma amostra em branco transferindo 1 ml de DMSO para duas cubetas de quartzo (QS 1.000).
- Carregue ambas as cubetas nas respectivas portas de amostra do espectrofotômetro, clique em Autoblank e registre um espectro de 300 a 500 nm clicando em Iniciar no canto inferior esquerdo.
- Preparação e análise espectral do padrão ampB
- Preparar 20 μg/ml ampB padrão retirando a cubeta da porta frontal da amostra e adicionando 20 μL de uma solução-mãe de 1 mg/ml ampB (20 μg de ampB total).
- Coloque a cubeta de volta na porta de amostra do espectrofotômetro e clique em Iniciar para registrar a absorbância da amostra.
- Retire a cubeta da porta de amostra e decante o conteúdo líquido para um recipiente de resíduos devidamente rotulado.
- Enxaguar bem a cubeta com três lavagens de água deionizada seguidas de três lavagens com etanol 70%.
- Preparação e análise espectral de amostra de nanodisco ampB-rompida
- Preparar uma amostra de nanodisco ampB-rompido (contendo 20 μg/mL como ampB) pipetando 20 μL de um estoque de nanodisco ampB-nanodisco de 1 mg/mL em 1 mL de DMSO. Incubar por pelo menos 1 min antes de registrar o espectro.
- Coloque a cubeta na porta frontal da amostra do espectrofotômetro e clique em Iniciar para registrar a absorvância da amostra.
- Preparação e análise espectral de um tampão PBS em branco
- Prepare um tampão PBS em branco transferindo 1 mL de tampão PBS para duas cubetas de quartzo (QS 1.000).
- Carregue as cubetas nas respectivas portas de amostra do espectrofotômetro, clique em Autoblank e registre o espectro de 300-500 nm.
- Preparação e análise espectral de uma amostra de nanodisco ampB, não perturbada
- Preparar uma amostra de nanodisco de ampB, sem interrupções (contendo 20 μg/mL como ampB), removendo a cubeta da porta frontal da amostra e introduzindo 20 μL de uma amostra de nanodisco ampB-1 mg/mL no tampão PBS.
- Coloque a cubeta de volta na porta de amostra do espectrofotômetro, clique em Iniciar e registre o espectro da amostra.
NOTA: Todos os resíduos químicos devem ser descartados em um recipiente de resíduos devidamente rotulado seguindo as diretrizes aceitas.
4. Análise do ensaio de viabilidade de leveduras
NOTA: Ensaios de viabilidade de leveduras foram realizados com o objetivo de avaliar a atividade biológica de ampB e determinar se o processo de formulação ou incorporação em nanodiscos, afetou sua atividade de inibição do crescimento de leveduras.
- Formular duas amostras de ampB-nanodisco (volume final = 1 mL) para conter 1 mg de ampB por 5 mg de DMPC e 0,1 mg de ampB por 5 mg de DMPC seguindo o método descrito anteriormente (2.3-2.4.1).
NOTA: Para fazer um ampB de 1 mg/mL e 0,1 mg/mL por 5 mg de DMPC, pipetar 50 μL e 5 μL, respectivamente, de um estoque de 20 mg/mL ampB em DMSO em cada frasco para injetáveis de amostra. - Preparo de uma cultura de levedura saturada
- Transfira 25 mL de extrato de levedura-peptona-dextrose estéril (YPD) em um tubo cônico estéril de 50 mL.
- Use uma alça de inoculação estéril para transferir uma única colônia de Saccharomyces cerevisiae (BY4741) para os 25 mL de meio YPD.
- Cultivar a levedura em estufa de agitação regulada a 30 °C, com oscilação regulada para 200 rpm por 18 h.
- Preparação de amostras individuais de ensaio de inibição do crescimento
- Transferir 5 mL de meio YPD estéril para 30 tubos de cultura estéreis de 13 mL.
- Tratar três conjuntos de tubos de cultura adicionando 20, 10 e 5 μL da amostra de 1 mg/mL de ampB-nanodisco, representando 20, 10 e 5 μg de ampB, respectivamente.
- Tratar três conjuntos de tubos de cultura adicionando 20, 10 e 5 μl da amostra de nanodisco ampB-0,1 mg/mL, representando 2, 1 e 0,5 μg de ampB, respectivamente.
- Tratar quatro conjuntos de tubos de cultura adicionando 20 μL de PBS, DMSO, rHDL de controle (sem ampB), ou 20 μg de ampB em DMSO.
Observação : cada conjunto de tubos de cultura representa uma réplica independente. Portanto, seguir esse método resulta em um valor n global de n = 3.
- Inicialização do ensaio de viabilidade de levedura
- Iniciar o experimento inoculando cada amostra com 100 μL (2% vol/vol) da cultura de levedura saturada
- Cultivar a levedura em estufa de agitação regulada para 30 °C, com oscilação regulada para 200 rpm por no máximo 18 h.
- Medidas de viabilidade de leveduras
- Ligue o espectrofotômetro girando o botão liga/desliga e, em seguida, clique no botão rotulado Ir para WL e defina o valor como 600 nm.
- Transfira 1 mL de meio YPD estéril para duas cubetas plásticas, carregue nas respectivas portas de amostra no espectrofotômetro e clique em Autoblank.
- Transfira 1 mL de cada amostra para uma cubeta de plástico, certificando-se de trocar as cubetas de cada vez e carregue a cubeta na porta frontal da amostra do espectrofotômetro.
- Meça e registre a densidade óptica de cada amostra a 600 nm e descarte cada cubeta gasta em um recipiente de resíduos de risco biológico devidamente rotulado.
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Representative Results
Processo de formulação de nanodiscos de agentes bioativos
No procedimento de formulação de ampB-nanodisco descrito, a reação é considerada completa quando a aparência da amostra transita de turva para clara (Figura 1). Essa alteração indica que nanodiscos se formaram e que o agente bioativo foi solubilizado. Muitas vezes, os agentes bioativos absorvem luz na região do comprimento de onda visível (por exemplo, ampB, curcumina, luteína, coenzima Q10) e, nesses casos, a amostra adota a cor do agente bioativo. Uma vez que a clarificação da amostra esteja completa (geralmente 5-20 min de sonicação em banho), a amostra é transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml e centrifugada a 11.000 x g por 5 min para material insolúvel em pellets. A ausência de um pellet visível pode ser considerada uma forte evidência de que o agente bioativo foi incorporado nos nanodiscos. Por outro lado, o aparecimento de um pellet indica que ocorreu incorporação parcial ou nenhuma de agente bioativo. Se necessário ou útil, formulações controle contendo a bicamada formadora de lipídio e proteína do arcabouço só podem ser realizadas em paralelo, e a extensão de clarificação de ambas as amostras comparada visual e quantitativamente usando um espectrofotômetro. Em qualquer caso, após a centrifugação de um agente bioativo contendo nanodiscos, a amostra é dialisada contra PBS, ou outro tampão apropriado, para remover vestígios de solvente.
Análise da eficiência de solubilização de agentes bioativos
Para ilustrar como a absorbância da amostra pode ser usada para determinar a eficiência de solubilização, nanodiscos ampB podem ser usados. Inicialmente, um espectro de ampB é coletado no DMSO. Isto é conseguido adicionando 20 μL de uma solução-mãe de 1 mg/mL de ampB (em DMSO) a uma cubeta contendo 980 μl de DMSO. O espectro é então registrado na faixa de comprimento de onda visível de 300-500 nm em um espectrofotômetro UV/Vis (Figura 2). Este espectro, obtido em solvente DMSO, produz três máximos de absorbância distintos em 372 nm, 392 nm e 415 nm, picos indicativos de ampB. Posteriormente, um espectro de absorbância de nanodiscos ampB em PBS é coletado. Para obter esse espectro, 20 μL de nanodiscos ampB em PBS são adicionados a 980 μL de PBS, e o espectro registrado. Espera-se que este espectro seja bastante diferente, com um único pico de absorbância maior em um comprimento de onda mais curto, do espectro observado no DMSO25. Esse resultado se deve ao fato de que, em PBS, a estrutura de partículas ampB-nanodisco permanece intacta, com moléculas individuais de ampB confinadas e restritas ao interior do meio hidrofóbico da bicamada do nanodisco. Como as moléculas de ampB na amostra estão próximas de outras moléculas de ampB, complexos/estruturas de ordem superior podem se formar, resultando em uma mudança dramática nas propriedades espectrais de ampB. Para comparar diretamente os espectros de ampB formulados em nanodiscos versus ampB de estoque, uma alíquota de 20 μL de nanodiscos de ampB dialisados (em PBS) é adicionada a 980 μL de DMSO. Neste caso, o solvente DMSO leva à ruptura da estrutura de partículas do nanodisco, de tal forma que o ampB integrado na bicamada lipídica da amostra de nanodisco é liberado e torna-se livremente solúvel no solvente DMSO. O espectro de absorbância desta amostra deve parecer muito semelhante, se não idêntico, ao espectro de ampB de reserva acima descrito. Este resultado fornece evidências diretas de que a ampB está presente e que suas propriedades químicas não foram alteradas pelo processo de formulação de nanodiscos. Neste caso, prevê-se que os mesmos três máximos de absorbância sejam detectados.
Atividade biológica de nanodiscos ampB-
Para avaliar a atividade biológica dos nanodiscos de ampB, ensaios de inibição do crescimento de leveduras foram realizados. A linhagem de levedura BY4741 (descendente da cepa S288C de S. cerevisiae ) foi empregada. Após o tratamento, a densidade óptica de cada amostra de levedura foi medida a 600 nm em espectrofotômetro UV-1800 UV/Vis (Figura 3). A inclusão de três amostras controle (PBS, DMSO e rHDL) demonstrou que outros componentes do nanodisco além da ampB não têm efeito perceptível sobre o crescimento da levedura. O controle positivo (20 μg de ampB em DMSO) confirmou que ampB é um eficiente inibidor do crescimento de leveduras. Quando nanodiscos de ampB foram testados, evidências de atividade de inibição de crescimento dependente da concentração de ampB foram obtidas. Assim, o sequestro de ampB no meio lipídico das partículas do nanodisco permite o aumento da solubilidade do tampão aquoso, com retenção de potente atividade biológica.
Figura 1: Efeito da sonicação em banho na formulação do nanodisco e na aparência da amostra. Uma amostra de ampB-nanodisco (ampB-ND) foi preparada dispersando 5 mg de DMPC em 0,75 mL de PBS, adicionando 1 mg de ampB à amostra de uma solução estoque de 20 mg/mL em DMSO, seguido pela adição de 2 mg de proteína de andaime em 0,5 ml de PBS (a partir de uma solução estoque de 4 mg/ml). (A) Dispersão de DMPC em PBS. (B) dispersão de DMPC em PBS após a adição de 1 mg de ampB. (C) solução de nanodisco contendo DMPC, ampB e proteína de andaime após sonicação em banho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Espectroscopia de absorbância UV/Vis de amostras de ampB. (A) ampB em DMSO. (B) nanodiscos ampB (ampB-ND) em PBS. (C) nanodiscos ampB em DMSO. Os espectros foram coletados em espectrômetro UV/Vis. O conteúdo de ampB das amostras de ampB-nanodisco pode ser determinado transferindo-se uma alíquota conhecida para uma solução de DMSO e medindo-se a absorbância a 416 nm (coeficiente de extinção ampB a 416 nm = 1,24 x 105 M-1 cm-1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeito da ampB no crescimento de S. cerevisiae. Leveduras foram cultivadas a 30 °C na ausência e presença de ampB. As amostras-controle sem ampB incluíram PBS isoladamente e rHDL. Como controle positivo, a ampB foi administrada no DMSO. As formulações de teste incluíram nanodiscos ampB (ampB-ND) nas concentrações indicadas de ampB. Após a incubação, os valores individuais de densidade óptica da amostra foram determinados em 600 nm. A significância estatística foi determinada por meio de uma ANOVA de comparação múltipla two-way com um teste post hoc de Tukey. Os valores relatados são a média ± o erro padrão (n = 3), representativos de três experimentos independentes. ns = não significante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Agente bioativo | Peso Molecular (Da) | Solvente | Referência |
| Anfotericina B | 924.1 | DMSO | 15 |
| Ácido trans-retinóico | 300.4 | DMSO | 16 |
| Curcumina | 368.4 | DMSO | 17 |
| Nutlin 3a | 581.5 | DMSO | 21 |
| Coenzima Q10 | 863.3 | Dimetilformamida | 20 |
| Luteína | 568.9 | Tetrahidrofurano | 22 |
| Esfingadieno | 297.5 | DMSO | 19 |
| Docetaxel 1 | 807.9 | - | 23 |
| 10-hidroxicamptotecina | 364.4 | DMSO | 18 |
| Sinvastatina1 | 418.5 | - | 24 |
| 1 O solvente do agente bioativo selecionado foi seco com fosfolipídio em vez de ser adicionado ao fosfolipídio disperso em tampão. | |||
Tabela 1: Agentes bioativos incorporados com sucesso em nanodiscos.
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Discussion
A formulação de um agente bioativo contendo nanodiscos fornece um método conveniente para solubilizar compostos hidrofóbicos insolúveis. Como os nanodiscos do agente bioativo do produto são totalmente solúveis em meio aquoso, eles fornecem um método de liberação útil para uma ampla gama de moléculas hidrofóbicas (Tabela 1). Estes incluem pequenas moléculas, drogas naturais e sintéticas, fitonutrientes, hormônios, etc. A estratégia de formulação geralmente segue um protocolo padrão que deve levar em consideração as propriedades de solubilidade do agente bioativo em solventes orgânicos. Além de selecionar um solvente orgânico apropriado para dissolver o agente bioativo, dois parâmetros adicionais, alcançando uma solução estoque de ~20 mg/ml e miscibilidade do solvente com soluções aquosas, são necessários. Isso é necessário porque permite que uma quantidade significativa de agente bioativo seja adicionada à mistura da formulação, sem introduzir excesso de solvente orgânico. A miscibilidade é importante porque a separação de fases impedirá a incorporação do agente bioativo no nanodisco do produto.
A introdução do agente bioativo imediatamente após a dispersão fosfolipídica formadora de bicamada no tampão de escolha permite que esses componentes interajam entre si antes da adição da proteína do arcabouço. Antes e imediatamente após a adição de proteína do andaime, a amostra aparece como uma suspensão opaca. No entanto, uma vez que os três componentes (fosfolipídio, agente bioativo e proteína do andaime, na proporção de 5/1/2 p/p/p) são adicionados e a amostra é submetida à sonicação em banho na temperatura correta por um período suficiente, sua aparência muda de turva para clara. Se o agente bioativo for colorido, a amostra clarificada assumirá essa cor. Assim, é fácil detectar a formação de nanodiscos por inspeção visual.
Embora o DMPC seja conveniente e frequentemente usado como fosfolipídio de escolha para muitas aplicações, com certos agentes bioativos, este fosfolipídeo resiste à formulação de nanodiscos. Por exemplo, nanodiscos de coenzima Q10 formaram-se apenas quando se utilizou fosfatidilcolina (PC) do ovo19, e da mesma forma para a xantofila, luteína22. Assim, enquanto o DMPC é muitas vezes o fosfolipídio de escolha, este não é universal. A razão pela qual a coenzima Q10 e a luteína preferem o PC do ovo pode ser devido às suas regiões hidrofóbicas estendidas, uma preferência por bicamadas que possuem ácidos graxos insaturados ou algum outro fator. Quando o ovo PC é empregado, a temperatura de sonicação é elevada para 45 °C durante a sonicação para obter a clarificação completa da amostra. Uma vez formulados, nanodiscos contendo agentes bioativos são centrifugados para remover material insolúvel. Deve-se notar, no entanto, que normalmente um precipitado não se forma uma vez que as condições ideais são determinadas e seguidas. Posteriormente, a amostra é dialisada contra tampão durante a noite para remover a pequena quantidade de solvente orgânico que foi adicionada à mistura de formulação juntamente com o agente bioativo. Após a diálise, o nanodisco do produto pode ser armazenado a 4 °C por longos períodos. Se o agente bioativo incorporado for suscetível à oxidação, a amostra de nanodisco deve ser armazenada em um recipiente fechado sob gás N2 .
Vários métodos têm sido usados para caracterizar e validar que os nanodiscos realmente se formaram. Talvez o método mais preciso seja a microscopia eletrônica26,27. Esta técnica fornece informações sobre a morfologia das partículas, diâmetro e heterogeneidade de tamanho populacional. Este método é considerado definitivo para a formação de nanodiscos. Um método relacionado, a microscopia de força atômica, também tem sido utilizado para investigar as propriedades de nanodiscos contendo agentes bioativos 17,24,28. Para fins práticos, no entanto, a cromatografia de filtração em gel por cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) é conveniente e tipicamente suficiente para caracterizar o tamanho (~200.000 Da) e a homogeneidade de uma dada amostra de nanodisco de agente bioativo20,22. Uma vez determinado que nanodiscos de agentes bioativos se formaram, também é importante e útil determinar a eficiência de solubilização do agente bioativo. Se o agente bioativo tem propriedades de absorbância características em um determinado comprimento de onda, então a espectroscopia de absorbância UV/Vis representa um método conveniente. Um fator potencialmente complicador é a absorbância da proteína do arcabouço a 280 nm. No entanto, se um determinado agente bioativo absorve em um comprimento de onda diferente, então isso não é um problema. Se um coeficiente de extinção é conhecido para o agente bioativo de interesse, então é possível determinar com precisão a quantidade de agente bioativo solubilizado em nanodiscos. Caso contrário, uma curva padrão derivada de espectros de quantidades conhecidas do agente bioativo em um solvente apropriado pode ser usada. Métodos alternativos incluem espectroscopia de fluorescência17,22 ou cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)20,24.
O processo básico de formulação descrito para agentes bioativos contendo nanodiscos é passível de uma ampla gama de aplicações. Por exemplo, nanodiscos contendo agentes de contraste têm sido usados em estudos de imagem médica para diagnosticar e avaliar a progressão da doença29. Outra abordagem é integrar proteínas modificadas por lipídios na bicamada de nanodiscos. Por exemplo, Lalefar e col. incorporaram com sucesso a proteína "Wnt" em nanodiscos através da inserção de sua porção de ácido oleico ligada covalentemente30. Posteriormente, nanodiscos de Wnt constituíram um veículo de transporte de Wnt solúvel em água capaz de promover expansão ex vivo de células-tronco hematopoéticas. Crosby e col. construíram uma quimera de proteína scaffold composta de apoA-I fusionada a um fragmento de anticorpo variável de cadeia única (scFv) direcionado contra o antígeno de superfície de células B CD2031. Formulação subsequente de nanodiscos de curcumina com α-CD20 scFv·apoA-I como o componente do andaime conferiu direcionamento para as células B, aumentando assim a entrega de agentes bioativos. Essa estratégia fornece uma nova abordagem para minimizar a toxicidade associada aos agentes quimioterápicos, direcionando-os especificamente para o tipo de célula-alvo. Em outro exemplo, o lipídio catiônico sintético cloreto de 1,2-dimiristoil-3-trimetilamônio-propano (DMTAP) foi incorporado à bicamada dos nanodiscos32. Essa estratégia de formulação efetivamente conferiu caráter de carga positiva à superfície da bicamada do nanodisco e, assim, promoveu uma interação de ligação estável com RNA de interferência curta (si). Nanodiscos de DMTAP enriquecidos com siRNA foram então mostrados para possuir atividade biológica em estudos de knockdown de genes alvo. Em outro exemplo, nanodiscos foram formulados com cardiolipina como único componente fosfolipídico. Este único glicerofosfolipídeo aniônico é conhecido por se ligar a vários ligantes, incluindo o mineral divalente cálcio, a hemoproteína citocromo c, o agente anticâncer antraciclina doxorrubicina e outros33,34,35,36. Nanodiscos de cardiolipina têm sido usados para caracterizar essas interações de ligação em detalhes, aproveitando as propriedades de solubilidade dos nanodiscos, seu tamanho em nanoescala e a presença de uma bicamada de cardiolipina acessível8. Com base nessas e em outras aplicações, fica evidente que a tecnologia de nanodiscos é uma plataforma versátil para uma infinidade de aplicações.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do National Institutes of Health (R37 HL-64159).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Cayman Chemical Company | 11636 | ND Formulation & Standard Preparation |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP17925 | Transformation & Expansion |
| ApoE4-NT Plasmid | GenScript | N/A | Transformation |
| Baffled Flask | New Brunswick Scientific | N/A | Expansion & Expression |
| BL21 competent E coli | New England Biolabs | C2527I | Transformation |
| Centrifuge bottles | Nalgene | 3140-0250 | Expression |
| Chloroform | Fisher Scientific | G607-4 | ND Formulation |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | Standard Prepartation |
| Dymyristoylphosphatidylcholine | Avanti Lipids | 850345P | ND Formulation |
| Erlenmeyer flask | Bellco Biotechnology | N/A | Expansion & Expression |
| Falcon Tubes | Sarstedt Ag & Co | D51588 | Yeast Viability Assay |
| Glass borosilicate tubes | VWR | 47729-570 | ND Formulation |
| GraphPad (Software) | Dotmatics | N/A | Yeast Viability Assay |
| Heated Sonication Bath | VWR | N/A | ND Formulaton |
| Heating and Nitrogen module | Thermo Scientific | TS-18822 | ND Formulation |
| HiTrap Heparin HP (5 mL) | GE Healthcare | 17-0407-03 | Purification |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755 | Expression |
| J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | J325-IM-2 | Expression |
| JA-14 Rotor | Beckman Coulter | 339247 | Expression |
| Lyophilizer | Labconco | 7755030 | ND Formulation |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | ND Formulation |
| Nitrogen gas | Praxair | UN1066 | ND Formulation |
| NZCYM media | RPI Research Products | N7200-1000.0 | Expansion & Expression |
| Pet-22B vector | GenScript | N/A | Transformation |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875718 | Transformation & Expansion |
| Quartz Cuvettes | Fisher Brand | 14385 928A | Spectral Analysis |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | M1344-0004 | Transformation, Expansion, & Expression |
| Slide-A-Lyzer Buoys | Thermo Scientific | 66430 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 68100 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88243 | Purification |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Purification |
| Sodium Phosphate dibasic | Fisher Scientific | S374-500 | Purification |
| Sodium Phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | Purification |
| Spectra/POR Weighted Closures | Spectrum Medical Industries | 132736 | Purification |
| Spectrophotometer | Shimadzu UV-1800 | 220-92961-01 | spectral analysis |
| Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | ND Formulation |
| UVProbe 2.61 (Software) | Shimadzu | N/A | Spectral Analysis |
| Vacuum filter | Millipore | 9004-70-0 | Expression & Purification |
| Vacuum pump | GAST Manufacturing Inc | DOA-P704-AA | Expression & Purification |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | ND Formulation |
| Yeast | N/A | BY4741 | Yeast Viability Assay |
| Yeast Extract-Peptone-Dextrose | BD | 242820 | Yeast Viability Assay |
References
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