Formulação e caracterização de agentes bioativos contendo nanodiscos

Kyle Lethcoe; Colin A. Fox; Isabel Moh; Matthew Swackhamer; Michael Karo; Ryan Lockhart; Robert O. Ryan

doi:10.3791/65145

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Artigo de método

Formulação e caracterização de agentes bioativos contendo nanodiscos

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DOI:

10.3791/65145

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17 de março de 2023

Kyle Lethcoe¹ , Colin A. Fox¹ , Isabel Moh¹ , Matthew Swackhamer¹ , Michael Karo¹ , Ryan Lockhart¹ , Robert O. Ryan¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos a produção e caracterização de agentes bioativos contendo nanodiscos. Os nanodiscos de anfotericina B são tomados como exemplo para descrever o protocolo de forma escalonada.

Resumo

O termo nanodisco refere-se a um tipo discreto de nanopartícula composto por uma bicamada formando lipídio, uma proteína de andaime e um agente bioativo integrado. Os nanodiscos são organizados como uma bicamada lipídica em forma de disco cujo perímetro é circunscrito pela proteína do andaime, geralmente um membro da família das apolipoproteínas trocáveis. Numerosos agentes bioativos hidrofóbicos têm sido eficientemente solubilizados em nanodiscos por sua integração no meio hidrofóbico da bicamada lipídica da partícula, produzindo uma população amplamente homogênea de partículas na faixa de 10-20 nm de diâmetro. A formulação de nanodiscos requer uma proporção precisa de componentes individuais, uma adição sequencial apropriada de cada componente, seguida de sonicação em banho da mistura de formulação. A proteína do arcabouço anfipático entra em contato espontaneamente e reorganiza a bicamada dispersa formando mistura lipídico/agente bioativo para formar uma população discreta e homogênea de partículas de nanodisco. Durante esse processo, a mistura de reação faz a transição de uma aparência opaca e turva para uma amostra clarificada que, quando totalmente otimizada, não produz precipitado após a centrifugação. Estudos de caracterização envolvem a determinação da eficiência de solubilização de agentes bioativos, microscopia eletrônica, cromatografia de filtração em gel, espectroscopia de absorbância no ultravioleta visível (UV/Vis) e/ou espectroscopia de fluorescência. Isto é normalmente seguido por uma investigação da actividade biológica utilizando células cultivadas ou ratinhos. No caso de nanodiscos que abrigam um antibiótico (isto é, o antibiótico polieno macrolídeo anfotericina B), sua capacidade de inibir o crescimento de leveduras ou fungos em função da concentração ou do tempo pode ser medida. A relativa facilidade de formulação, versatilidade em relação às partes componentes, tamanho de partícula em nanoescala, estabilidade inerente e solubilidade aquosa permitem inúmeras aplicações in vitro e in vivo da tecnologia de nanodiscos. No presente artigo, descrevemos uma metodologia geral para formulação e caracterização de nanodiscos contendo anfotericina B como agente bioativo hidrofóbico.

Introdução

As lipoproteínas discoidais nascentes de alta densidade (HDLs) são progenitores naturais da HDL esférica muito mais abundante presente no sistema circulatório humano. Essas partículas nascentes, também chamadas de HDL pré-ß, possuem propriedades estruturais únicas e distintas¹. De fato, em vez de existir como uma partícula esferoidal, as HDLs nascentes são em forma de disco. Extensos estudos de caracterização estrutural das HDLs discoidais naturais e reconstituídas têm revelado que elas são compostas por uma bicamada fosfolipídica cujo perímetro é circunscrito por uma apolipoproteína anfipática trocável (apo), como a apoA-I. No metabolismo das ....