Summary
Här beskriver vi produktion och karakterisering av bioaktiva ämnen innehållande nanodiskar. Amfotericin B nanodiskar tas som ett exempel för att beskriva protokollet stegvis.
Abstract
Termen nanodisk avser en diskret typ av nanopartikel som består av ett dubbelskikt som bildar lipid, ett ställningsprotein och ett integrerat bioaktivt medel. Nanodiskar är organiserade som ett skivformat lipid-dubbelskikt vars omkrets är begränsad av ställningsproteinet, vanligtvis en medlem av den utbytbara apolipoproteinfamiljen. Många hydrofoba bioaktiva medel har effektivt solubiliserats i nanodiskar genom deras integration i den hydrofoba miljön i partikelns lipid-dubbelskikt, vilket ger en i stort sett homogen population av partiklar i intervallet 10-20 nm i diameter. Formuleringen av nanodiskar kräver ett exakt förhållande mellan enskilda komponenter, en lämplig sekventiell tillsats av varje komponent, följt av bad ultraljudsbehandling av formuleringsblandningen. Det amfipatiska ställningsproteinet kommer spontant i kontakt med och omorganiserar det dispergerade dubbelskiktet som bildar en blandning av lipid / bioaktivt medel för att bilda en diskret, homogen population av nanodiskpartiklar. Under denna process övergår reaktionsblandningen från ett ogenomskinligt, grumligt utseende till ett klarat prov som, när det är helt optimerat, inte ger någon fällning vid centrifugering. Karakteriseringsstudier innefattar bestämning av bioaktivt medel solubiliseringseffektivitet, elektronmikroskopi, gelfiltreringskromatografi, ultraviolett synlig (UV / Vis) absorbansspektroskopi och / eller fluorescensspektroskopi. Detta följs normalt av en undersökning av biologisk aktivitet med hjälp av odlade celler eller möss. När det gäller nanodiskar som hyser ett antibiotikum (dvs makrolidpolyenantibiotikumet amfotericin B) kan deras förmåga att hämma tillväxten av jäst eller svampar som en funktion av koncentration eller tid mätas. Den relativa lättheten att formulera, mångsidighet med avseende på komponentdelar, partikelstorlek i nanoskala, inneboende stabilitet och vattenlöslighet möjliggör otaliga in vitro- och in vivo-tillämpningar av nanodiskteknik. I denna artikel beskriver vi en generell metod för att formulera och karakterisera nanodiskar innehållande amfotericin B som det hydrofoba bioaktiva medlet.
Introduction
Framväxande discoidala högdensitetslipoproteiner (HDL) är naturligt förekommande föregångare till den mycket rikligare sfäriska HDL som finns i det mänskliga cirkulationssystemet. Dessa framväxande partiklar, även kallade pre-ß HDL, har unika och distinkta strukturella egenskaper1. I själva verket, snarare än att existera som en sfäroidal partikel, är framväxande HDL skivformade. Omfattande strukturella karakteriseringsstudier på naturliga och rekonstituerade discoidala HDL har visat att de består av ett fosfolipid-dubbelskikt vars omkrets omges av ett amfipatiskt utbytbart apolipoprotein (apo), såsom apoA-I. I human lipoproteinmetabolism ackumulerar cirkulerande begynnande HDL lipider från perifera celler och mognar till sfäriska HDL i en process som är beroende av viktiga proteinmediatorer, inklusive ATP-bindande kassetttransportör A1 och lecitin: kolesterolacyltransferse2. Denna process representerar en kritisk komponent i den omvända kolesteroltransportvägen som anses vara skyddande mot hjärtsjukdomar. Beväpnad med denna kunskap och förmågan att rekonstruera discoidala HDL har forskare använt dessa partiklar som ett terapeutiskt ingrepp för att behandla åderförkalkning3. I huvudsak främjar infusionen av rekonstituerad HDL (rHDL) till patienter kolesterolutflöde från plackavlagringar och återför det till levern för omvandling till gallsyror och utsöndring från kroppen. Flera bioteknik- / läkemedelsföretag följer denna behandlingsstrategi4.
Samtidigt har förmågan att generera dessa partiklar i laboratoriet utlöst en uppsjö av forskningsaktiviteter som har lett till nya tillämpningar och ny teknik. En framträdande tillämpning innefattar användningen av rHDL-partiklar som ett miniatyrmembran för att hysa transmembranproteiner i en infödd miljö5. Hittills har hundratals proteiner framgångsrikt införlivats i discoidal rHDL, och forskning har visat att dessa proteiner behåller både naturlig konformation och biologisk aktivitet som receptorer, enzymer, transportörer etc. Dessa partiklar, kallade "nanodiscs", har också visat sig vara mottagliga för strukturell karakterisering, ofta vid hög upplösning6. Detta tillvägagångssätt för undersökningar av transmembranproteiner erkänns som överlägset studier med tvättmedelsmiceller eller liposomer och går därför snabbt framåt. Det är viktigt att inse att två distinkta metoder har rapporterats som kan bilda en rHDL. "Cholatdialys" -metoden13 är populär för applikationer relaterade till införlivandet av transmembranproteiner i rHDL-bilager5. I huvudsak innefattar denna formuleringsmetod blandning av ett dubbelskikt som bildar fosfolipid, ett ställningsprotein och det transmembranprotein som är av intresse i en buffert innehållande tvättmedlet natriumkolat (eller natriumdeoxikolat; micellmolekylvikt [MW] på 4 200 Da). Tvättmedlet löser effektivt upp de olika reaktionskomponenterna, vilket gör att provet kan dialyseras mot buffert som saknar tvättmedel. Under dialyssteget, när tvättmedlet avlägsnas från provet, bildas en rHDL spontant. När detta tillvägagångssätt används för att fånga ett transmembranprotein av intresse har produktpartiklarna kallats nanoskivor5. Försök att använda denna metod för att införliva småmolekylära hydrofoba bioaktiva medel (MW <1000 Da) har dock i stort sett misslyckats. Till skillnad från transmembranproteiner kan småmolekylära bioaktiva medel fly från dialyspåsen tillsammans med tvättmedlet, vilket kraftigt minskar deras inkorporeringseffektivitet i rHDL. Detta problem löstes genom att utelämna tvättmedel från formuleringsblandningen14. Istället tillsätts komponenterna till en vattenhaltig buffert sekventiellt, som börjar med att dubbelskiktet bildar lipid och bildar ett stabilt bioaktivt medel innehållande rHDL, kallad en nanodisk. Andra har använt rHDL för inkorporering och transport av in vivo-avbildningsmedel 7. På senare tid har specialiserad rHDL bestående av en apolipoproteinställning och den anjoniska glycerofosfolipiden, kardiolipin, använts i ligandbindningsstudier. Dessa partiklar utgör en plattform för studier av interaktionen mellan kardiolipin och olika vattenlösliga ligander, inklusive kalcium, cytokrom c och cancermedlet doxorubicin8.
Fokus för denna studie ligger på formuleringen av rHDL som har ett stabilt inkorporerat hydrofobt bioaktivt medel (dvs. nanodisk). Dessa medels förmåga att integreras i lipidmiljön hos discoidala rHDL-partiklar ger dem effektivt vattenlöslighet. Som sådan har nanodiskar potential för in vivo terapeutiska tillämpningar. Vid formulering av nanodiskar krävs specifika inkubations-/reaktionsbetingelser för att framgångsrikt införliva diskreta hydrofoba bioaktiva ämnen i produktpartikeln, och målet med denna rapport är att ge detaljerad praktisk information som kan användas som en grundläggande mall för att skapa nya nanodiskpartiklar för specifika tillämpningar. Således är termerna nanodisc och nanodisk inte utbytbara i samband med detta manuskript. Medan nanodisc avser en rHDL formulerad för att innehålla ett transmembranprotein inbäddat i dess lipid bilayer5, hänvisar termen nanodisk till en rHDL formulerad för att införliva hydrofoba bioaktiva medel med låg molekylvikt (< 1,000 Da), såsom amfotericin B14.
En mängd olika metoder finns tillgängliga för förvärv av lämpliga ställningsproteiner. Det är möjligt att köpa ställningsproteiner från tillverkare [t.ex. apoA-I (SRP4693) eller apoE4 (A3234)], men kostnaden kan vara en begränsande faktor. Ett föredraget tillvägagångssätt är att uttrycka rekombinanta ställningsproteiner i Escherichia coli. Protokoll publiceras för humant apoA-I9, apoE410, liksom insektshemolymfproteinet apolipophorin-III11. För de experiment som beskrivs här användes rekombinant human apoE4 N-terminal (NT) domän (aminosyror 1-183). Nukleotidsekvensen som kodar för humant apoE4-NT syntetiserades och infördes i en pET-22b (+) uttrycksvektor direkt intill den vektorkodade pelB-ledarsekvensen. Denna konstruktion leder till uttrycket av ett pelB-ledarsekvens-apoE4-NT-fusionsprotein. Efter proteinsyntesen leder den bakteriella pelB-ledarsekvensen det nyligen syntetiserade proteinet till det periplasmatiska utrymmet där ledarpeptidas klyver pelB-sekvensen. Det resulterande apoE4-NT-proteinet, utan sekvenstaggar eller svansar, flyr därefter från bakterierna och ackumuleras i odlingsmediet11,12, vilket förenklar nedströms bearbetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transformation, uttryck och rening av ställningsproteinkomponent
- BL21 bakteriell transformation med apoE4-NT innehållande plasmid
- Tina en tub BL21 (DE3) kompetenta celler på is i 10 min.
- När all is har smält, blanda försiktigt och försiktigt 50 μL av cellerna i ett transformationsrör på is.
- Tillsätt 5 μL innehållande 50 ng plasmid-DNA (för sekvens, se kompletterande tabell 1) till cellblandningen. Vrid försiktigt röret fyra eller fem gånger för att blanda. Virvla inte.
- Lägg blandningen på is i 30 min.
- Värmechock blandningen vid exakt 42 °C i 10 sekunder.
- Lägg på is i 5 min.
- Pipettera 950 μL S.O.C.-medium in i röret vid rumstemperatur.
- Placera röret i en 37 °C skakande inkubator i 60 minuter med svängningen inställd på 250 rpm.
- Blanda cellerna noggrant genom att snärta och invertera och sprid sedan 100 μL celllösning på en 20 ml Luria buljong + agar urvalsplatta behandlad med ampicillin i en koncentration av 0,1 mg / ml.
- Inkubera över natten vid 37 °C eller tills synliga kolonier har vuxit.
- Överför med hjälp av en elektronisk pipett 25 ml sterilt NZCYM-medium till en steril 250 ml E-kolv vid rumstemperatur och tillsätt ampicillin till en slutlig arbetskoncentration på 0,1 mg/ml.
- Överför med hjälp av en steril inokuleringsslinga en enskild koloni från urvalsplattan som innehåller den lämpligt transformerade bakteriestammen och tillsätt direkt till kolven innehållande 25 ml NZCYM media + ampicillin.
- Placera 25 ml NZCYM-fröodlingskolv i en 37 °C skakinkubator med orbital svängning inställd på 250 rpm.
OBS: Det rekommenderas att denna frökultur odlas över natten för att nå en lämplig bakteriekoncentration (~ 1,5-2,0 optiska densitetsenheter), mätt med en spektrofotometer inställd på våglängd = 600 nm. - Överför 250 ml sterilt NZCYM-medium till fyra 1 L förvirrade kolvar och tillsätt ampicillinantibiotikum till en arbetskoncentration på 0,1 mg / ml.
- Överför under sterila förhållanden 5 ml mättad fröodling till var och en av de fyra 250 ml kolvar som innehåller kolvar och placera den i en 37 °C skakinkubator med omloppsoscillation inställd på 250 rpm.
OBS: Vid denna tidpunkt kommer kulturen att kallas en expansionskultur och exponentiell tillväxt kommer att övervakas med hjälp av en UV1800-spektrofotometer. Tillväxten får fortsätta tills kulturens optiska densitet vid 600 nm (OD600) når ett värde mellan 0,6-0,8. - När expansionskulturen har nått önskat OD600-värde på 0,6-0,8, tillsätt 59,6 mg isopropyl β-D-1-tiogalaktospyranosid (IPTG) till varje 250 ml kultur innehållande kolv för en slutlig koncentration på 1 mM för att inducera proteinuttryck. Vid denna tidpunkt kallas expansionskulturen för uttryckskulturen. Börja uttrycket under en period av 5 timmar.
- Vid slutet av uttrycksperioden på 5 timmar, avlägsna de fyra kolvarna från skakinkubatorn och pipettera 125 ml i sex 250 ml centrifugflaskor (totalt 750 ml).
- Balansera varje centrifugflaska för att säkerställa att den totala massan ligger inom ±0,5 mg från varandra.
OBS: Detta steg är viktigt för att säkerställa säker drift av centrifuganordningen. - Förbered centrifuganordningen genom att först vrida strömbrytaren till på-läge. Klicka på knappen märkt "Set / Actual" och justera parametrarna till "JA-14", "9,400 x g", 20.00 min och 4 ° C med motsvarande rattar.
- Fyll de sex balanserade centrifugflaskorna i en centrifugrotor av lämplig storlek och placera dem i centrifugen för att säkerställa att alla specifika säkerhetsparametrar följs.
OBS: Fortsätt detta steg tills all bakteriell cellkultur har centrifugerats och supernatanter samlats in. - Filtrera den isolerade bakteriella supernatanten genom en vakuumfiltrering eller likvärdig apparat försedd med ett 0,45 mikronfilter för att avlägsna eventuellt kvarvarande skräp.
- Heparinrening av det rekombinanta apoE4-NT-ställningsproteinet
OBS: Kolonnreningsproceduren utförs vid rumstemperatur.- Balansera Hi-trap Heparin-kolonnen genom att applicera 10 kolonnvolymer (50 ml) 10 mM natriumfosfatbuffert, pH 7,2, och eluering med en hastighet av 5 ml / min.
- Applicera apoE4-NT-berikat medium på kolonnen med en hastighet av 2,5 ml/min tills hela 1 L-volymen medium har applicerats och kassera genomflödet.
- Tvätta kolonnen med 10 kolonnvolymer (50 ml) 10 mM natriumfosfatbuffert, pH 7,2, och kassera genomströmningen.
- Eluera det önskade apoE4-NT-proteinet genom att applicera tre kolonnvolymer (15 ml) elueringsbuffert (10 mM natriumfosfatbuffert + 1,5 M NaCl, pH 7,2) på kolonnen och samla eluatet.
- Dialys av apoE4-NT-eluat
- Förbered en sektion av dialysslangar (dimensionerna på dialysslangar som användes var 22 cm långa, 12 mm innerdiameter och 10 000 MWCO) genom att noggrant blötlägga i destillerat avjoniserat (ddi) vatten i 10 minuter.
- Bered 1 liter fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (10 mM natriumfosfat + 150 mM NaCl, pH 7,2) i en 1 L plastbägare eller motsvarande.
- Använd en dialysslangklämma och kläm fast ena änden av den blötlagda dialysslangen, så att klämman är säkrad och ingen vätska kan komma ut.
- För in en smal nacktratt i den öppna änden av dialysslangen och häll 15 ml apoE4-NT-eluat i dialysslangen.
OBS: Det är absolut nödvändigt att kontrollera om det finns några läckor i detta steg. - Ta bort tratten och kläm fast änden av dialysslangen med en annan dialysrörklämma.
- Placera en skumdialysflottör på en av de förseglade ändarna av dialysslangen och placera den monterade dialysslangen i bägaren som innehåller 1 l PBS-buffert.
- Placera en magnetisk omrörningsstång i botten av bägaren och justera omrörningskontrollen till "låg", så att en virvel inte bildas.
- Efter avslutad dialys, dekantera retentatet i en 50 ml konisk slang och förvara vid -20 °C.
OBS: Det rekommenderas att denna dialys utförs vid 4 °C över natten.
2. Formulering av bioaktivt ämne som innehåller nanodisketter
- Beredning av fosfolipidalikvot
- Väg upp 5 mg av en lämplig fosfolipid (t.ex. dimyristoylfosfatidylkolin [DMPC]) och överför till ett provrör av glas.
- Lös upp 5 mg fosfolipid genom tillsats av 300 μl CHCl 3 och 100 μlCH3OHi ett totalt förhållande på3:1 v/v.
- Indunsta det organiska lösningsmedlet genom att placera glasprovröret under en mild ström avN2-gas i 10-15 minuter, så att en tunn film av torkad fosfolipid bildas längs väggarna i rörets nedre del.
- Frystorkning av fosfolipidalikvoter
- Förbered fosfolipidalikvoter för frystorkning genom att täcka glasprovrörets öppning med parafilm.
- Perforera parafilmen med en 24 G nål ungefär 10-15 gånger.
- Placera de perforerade alikvoterna i en lämplig frystorkningsbehållare och se till att gummilocket är korrekt förseglat.
- Fäst frystorkningsbehållaren på vakuumgrenröret längst upp på frystorkningsmaskinen och se till att alla andra ventiler är tätt stängda.
- Slå på frystorkningsmaskinen genom att vrida strömbrytaren och trycka på vakuuminitieringsknappen.
- När systemet har nått totalt vakuum klickar du på kylinitieringsknappen för att starta frystorkningsprocessen.
OBS: Det rekommenderas att prover får frystorkas över natten.
- Formulering av amfotericin-B (amp-B) nanodisketter
- Pipettera 0,45 ml PBS till den frystorkade fosfolipidalikvoten och virveln i ~ 30 s för att dispergera lipiden.
OBS: Det resulterande provet kommer att se ogenomskinligt och grumligt ut. - Pipettera 50 μl av en 20 mg/ml ampB-lösning (20 mg ampB upplöst i 1 ml dimetylsulfoxid [DMSO], lagrad vid -20 °C i ett slutet bärnstensfärgat kärl) i det dispergerade fosfolipidprovet och virveln.
OBS: När du väljer ett lösningsmedel som ska användas vid beredning av en stamlösning av det hydrofoba bioaktiva medlet är de två övergripande övervägandena 1) det bioaktiva medlets löslighet och 2) lösningsmedlets blandbarhet med den vattenhaltiga buffert som används i formuleringen. Medan DMSO ofta används 15,16,17,18,19, har dimetylformamid 20,21 eller tetrahydrofuran 22 också framgångsrikt använts 23. - Pipettera 0,5 ml apoE4-NT-ställningsprotein (koncentration av ~ 4 mg / ml) till glasprovröret innehållande dispergerad fosfolipid och ampB. Den slutliga volymen av provet bör vara ca 1 ml.
- Bad sonicate provet vid 24 ° C tills lösningen klarnar (vanligtvis 10-15 min).
- Pipettera 0,45 ml PBS till den frystorkade fosfolipidalikvoten och virveln i ~ 30 s för att dispergera lipiden.
- Nanodisk centrifugering
- Överför den klarade ampB-nanodisklösningen till ett sterilt 1,7 ml mikrocentrifugrör.
- Placera röret i en mikrocentrifugrotor med tillägg av ett balansrör placerat mittemot.
- Dra åt rotorlocket och stäng centrifuglocket.
- Programmera centrifugen att snurra i 10 minuter vid ~ 11 000 x g med motsvarande rattar på framsidan av mikrocentrifugenheten.
OBS: Vid denna tidpunkt kan en pellets vara synlig. Denna pellet består av icke-inkorporerad fosfolipid och / eller ampB. - Ta bort supernatanten och överför den till ett annat rent 1,7 ml mikrocentrifugrör.
- Dialys av ampB-nanodiskprov
- Förbered en sektion av dialysslangar (dimensionerna på dialysslangar som användes var 3 cm långa, 16 mm innerdiameter och 10 000 MWCO) genom att blötlägga noggrant i ddi-vatten i 10 minuter.
- Bered en 1 L PBS-buffertlösning (10 mM natriumfosfat + 150 mM NaCl, pH 7,2) i en 1 L plastbägare eller motsvarande.
- Använd en dialysslangklämma och kläm fast ena änden av den blötlagda dialysslangen, så att klämman är säkrad och ingen vätska kan komma ut.
- För in en smal halstratt i den öppna änden av dialysslangen och överför ampB-nanodiskprovet till dialysslangen.
- Ta bort tratten och kläm fast änden av dialysslangen med en annan dialysrörklämma.
- Placera en skumdialysflottör på en av de förseglade ändarna av dialysslangen och placera den monterade dialysslangen i bägaren som innehåller 1 L PBS-buffert.
- Placera en magnetisk omrörningsstång i botten av bägaren och justera omrörningskontrollen till "låg", så att en virvel inte bildas. Låt dialysen fortsätta över natten vid 4 °C.
3. Spektralanalys av ampB-nanodiskprover
- Spektrofotometerinitiering följt av auto blank
- Slå på spektrofotometern genom att vrida strömbrytaren och anslut till en motsvarande stöddator genom att trycka på knappen märkt "PC Control".
- På supportdatorn öppnar du programvaran märkt "UVProbe 2.61" och ansluter till spektrofotometern genom att klicka på knappen märkt "Anslut" i det nedre vänstra hörnet.
- Klicka på knappen märkt Spektrum i det övre verktygsfältet i UVProbe-programvaran.
- Klicka på knappen märkt Metod i det övre verktygsfältet.
- Klicka på fliken Mätning och mata in "500" i starttextrutan under "Våglängdsområde (nm)" och "300" i textrutan "Slut".
- Klicka på rullgardinsmenyn bredvid fliken Skanningshastighet och ställ in den på Medium.
- Bered ett provprov genom att överföra 1 ml DMSO till två kvartskyvetter (QS 1.000).
- Ladda båda kyvetterna i respektive provportar på spektrofotometern, klicka på Autoblank och spela in ett spektrum från 300-500 nm genom att klicka på Start i det nedre vänstra hörnet.
- Beredning och spektralanalys av ampB-standard
- Bered standarden 20 μg/ml ampB genom att avlägsna kyvetten från den främre provporten och tillsätta 20 μl stamlösning på 1 mg/ml ampB (totalt 20 μg ampB).
- Lägg tillbaka kyvetten i provporten på spektrofotometern och klicka på Start för att registrera provabsorbansen.
- Ta bort kyvetten från provporten och dekantera vätskeinnehållet i en lämpligt märkt avfallsbehållare.
- Skölj kyvetten noggrant med tre tvättar avjoniserat vatten följt av tre tvättar med 70% etanol.
- Beredning och spektralanalys av störd ampB-nanodiskprov
- Bered ett avbrutet ampB-nanodiskprov (innehållande 20 μg/ml som ampB) genom att pipettera 20 μL av en 1 mg/ml ampB-nanodiskstam till 1 ml DMSO. Inkubera i minst 1 minut före inspelning av spektrumet.
- Ladda kyvetten i spektrofotometerns främre provport och klicka på Start för att registrera provabsorbansen.
- Beredning och spektralanalys av ett PBS-buffertämne
- Förbered ett PBS-buffertämne genom att överföra 1 ml PBS-buffert till två kvartskyvetter (QS 1.000).
- Ladda kyvetterna i respektive provportar på spektrofotometern, klicka på Autoblank och spela in spektrumet från 300-500 nm.
- Beredning och spektralanalys av ett icke-stört ampB-nanodiskprov
- Bered ett icke-stört ampB-nanodiskprov (innehållande 20 μg/ml som ampB) genom att avlägsna kyvetten från den främre provporten och föra in 20 μl av ett 1 mg/ml ampB-nanodiskprov i PBS-bufferten.
- Ladda kyvetten tillbaka till spektrofotometerns provport, klicka på Start och registrera provspektrumet.
OBS: Allt kemiskt avfall ska kasseras i en lämpligt märkt avfallsbehållare enligt accepterade riktlinjer.
4. Analys av jästens livskraft
OBS: Jästlivskraftsanalyser utfördes för att utvärdera den biologiska aktiviteten hos ampB och bestämma om processen för formulering eller införlivande i nanodiskar påverkade dess jästtillväxthämningsaktivitet.
- Formulera två ampB-nanodiskprover (slutlig volym = 1 ml) som innehåller 1 mg ampB per 5 mg DMPC och 0,1 mg ampB per 5 mg DMPC enligt den tidigare beskrivna metoden (2.3-2.4.1).
OBS: För att göra en 1 mg/ml och 0,1 mg/ml ampB per 5 mg DMPC, pipettera 50 μL respektive 5 μL av en 20 mg/ml ampB i DMSO-stam i varje provflaska. - Framställning av en mättad jästkultur
- Överför 25 ml sterilt jästextrakt-pepton-dextrosmedium (YPD) till ett sterilt 50 ml koniskt rör.
- Använd en steril inokuleringsslinga för att överföra en enda Saccharomyces cerevisiae (BY4741) koloni till 25 ml YPD-medium.
- Odla jästen i en skakinkubator inställd på 30 °C, med svängningen inställd på 200 rpm i 18 timmar.
- Beredning av individuella tillväxthämningsanalysprover
- Överför 5 ml sterilt YPD-medium till 30 sterila 13 ml odlingsrör.
- Behandla tre uppsättningar odlingsrör genom att tillsätta 20, 10 och 5 μL av 1 mg/ml ampB-nanodiskprovet, vilket motsvarar 20, 10 respektive 5 μg ampB.
- Behandla tre uppsättningar odlingsrör genom att tillsätta 20, 10 och 5 μl av 0,1 mg / ml ampB-nanodiskprovet, vilket representerar 2, 1 respektive 0,5 μg ampB.
- Behandla fyra uppsättningar odlingsrör genom att tillsätta 20 μL PBS, DMSO, kontroll rHDL (ingen ampB) eller 20 μg ampB i DMSO.
OBS: Varje uppsättning odlingsrör representerar ett oberoende replikat. Att följa dessa metoder resulterar därför i ett totalt n-värde på n = 3.
- Initiering av analys av jästviabilitet
- Starta experimentet genom att inokulera varje prov med 100 μl (2 % vol/vol) av den mättade jästkulturen
- Odla jästen med en skakinkubator inställd på 30 °C, med svängningen inställd på 200 rpm i högst 18 timmar.
- Mätning av jästens livskraft
- Slå på spektrofotometern genom att vrida strömbrytaren, klicka sedan på knappen märkt Gå till WL och ställ in värdet till 600 nm.
- Överför 1 ml sterilt YPD-medium till två plastkyvetter, fyll på respektive provportar på spektrofotometern och klicka på Autoblank.
- Överför 1 ml av varje prov till en plastkyvett, se till att byta kyvetter varje gång och ladda kyvetten i spektrofotometerns främre provport.
- Mät och registrera varje provs optiska densitet vid 600 nm och kassera varje förbrukad kyvett i en korrekt märkt behållare för biologiskt farligt avfall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formuleringsprocess för bioaktivt medel nanodisk
I den beskrivna ampB-nanodiskformuleringsproceduren anses reaktionen vara fullständig när provets utseende övergår från grumligt till klart (figur 1). Denna förändring indikerar att nanodiskar har bildats och att det bioaktiva medlet har solubiliserats. Ofta absorberar bioaktiva medel ljus i det synliga våglängdsområdet (t.ex. ampB, curcumin, lutein, koenzym Q10) och i dessa fall antar provet färgen på det bioaktiva medlet. När provförtydligandet är klart (vanligtvis 5-20 min badultraljudsbehandling) överförs provet till ett 1,7 ml mikrocentrifugrör och centrifugeras vid 11 000 x g i 5 minuter till pelletsolösligt material. Frånvaron av en synlig pellet kan betraktas som starka bevis för att det bioaktiva medlet har införlivats i nanodiskarna. Å andra sidan indikerar utseendet på en pellet att partiell eller ingen bioaktiv medelsinförlivande har inträffat. Om det är nödvändigt eller användbart kan kontrollformuleringar som innehåller endast det dubbelskiktsbildande lipid- och ställningsproteinet utföras parallellt, och omfattningen av förtydligandet av båda proverna jämförs visuellt och kvantitativt med hjälp av en spektrofotometer. Efter centrifugering av ett bioaktivt ämne som innehåller nanodisketter dialyseras provet under alla omständigheter mot PBS eller annan lämplig buffert för att avlägsna spår av lösningsmedel.
Analys av bioaktivt medel solubiliseringseffektivitet
För att illustrera hur provabsorbans kan användas för att bestämma löslighetseffektiviteten kan ampB-nanodiskar användas. Initialt samlas ett spektrum av ampB i DMSO. Detta uppnås genom tillsats av 20 μL från en 1 mg/ml stamlösning av ampB (i DMSO) till en kyvett innehållande 980 μl DMSO. Spektrumet registreras sedan i det synliga våglängdsområdet från 300-500 nm på en UV / Vis-spektrofotometer (figur 2). Detta spektrum, erhållet i DMSO-lösningsmedel, ger tre distinkta absorbansmaxima vid 372 nm, 392 nm och 415 nm, toppar som indikerar ampB. Därefter samlas ett absorbansspektrum av ampB-nanodiskar i PBS. För att erhålla detta spektrum tillsätts 20 μL ampB-nanodiskar i PBS till 980 μL PBS och spektrumet registreras. Detta spektrum förväntas vara helt annorlunda, med en enda större absorbanstopp vid en kortare våglängd, från det spektrum som observerats i DMSO25. Detta resultat beror på det faktum att ampB-nanodiskpartikelstrukturen i PBS förblir intakt, med enskilda ampB-molekyler begränsade och begränsade till det inre av den hydrofoba miljön i nanodisk-dubbelskiktet. Eftersom ampB-molekyler i provet ligger i närheten av andra ampB-molekyler kan högre ordningens komplex / strukturer bildas, vilket resulterar i en dramatisk förändring av ampB: s spektrala egenskaper. För att direkt jämföra spektra för ampB formulerade i nanodisketter kontra lager ampB, tillsätts en 20 μL alikvot av dialyserade ampB-nanodiskar (i PBS) till 980 μL DMSO. I detta fall leder DMSO-lösningsmedlet till störning av nanodiskpartikelstrukturen, så att ampB integrerat i nanodiskprovets lipid-dubbelskikt frigörs och blir lättlösligt i DMSO-lösningsmedlet. Absorbansspektrumet för detta prov bör vara mycket likt, om inte identiskt, med det spektrum av stamampB som beskrivs ovan. Detta resultat ger direkta bevis för att ampB är närvarande och att dess kemiska egenskaper inte har förändrats genom processen för nanodiskformulering. I detta fall förväntas samma tre absorbansmaxima detekteras.
Biologisk aktivitet hos ampB-nanodiskar
För att bedöma den biologiska aktiviteten hos ampB-nanodiskar utfördes jästtillväxthämningsanalyser. Jäststammen BY4741 (en ättling till S. cerevisiae S288C-stammen) användes. Efter behandlingen mättes den optiska densiteten hos varje jästprov vid 600 nm på en UV-1800 UV/Vis-spektrofotometer (figur 3). Införandet av tre kontrollprover (PBS, DMSO och rHDL) visade att andra nanodiskkomponenter än ampB inte har någon märkbar effekt på jästtillväxten. Den positiva kontrollen (20 μg ampB i DMSO) bekräftade att ampB är en effektiv hämmare av jästtillväxt. När ampB-nanodiskar testades erhölls bevis på ampB-koncentrationsberoende tillväxthämningsaktivitet. Således möjliggör sekvestrering av ampB i lipidmiljön av nanodiskpartiklar ökad vattenhaltig buffertlöslighet, med retention av potent biologisk aktivitet.
Figur 1: Effekten av bad ultraljudsbehandling på nanodisk formulering och prov utseende. Ett ampB-nanodiskprov (ampB-ND) bereddes genom att dispergera 5 mg DMPC i 0,75 ml PBS, tillsätta 1 mg ampB till provet från en 20 mg/ml stamlösning i DMSO, följt av tillsats av 2 mg ställningsprotein i 0,5 ml PBS (från en 4 mg/ml stamlösning). (A) DMPC-dispersion i PBS. (B) DMPC-dispersion i PBS efter tillsats av 1 mg ampB. (C) nanodisk lösning som innehåller DMPC, ampB, och ställningsprotein efter bad ultraljudsbehandling. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: UV/Vis-absorbansspektroskopi av ampB-prover. (A) ampB i DMSO. b) ampB-nanodisketter (ampB-ND) i PBS. c) ampB-nanodisketter i DMSO. Spektra samlades in på en UV/Vis-spektrometer. AmpB-halten i ampB-nanodiskprover kan bestämmas genom överföring av en känd alikvot till en lösning av DMSO och mätning av absorbansen vid 416 nm (ampB-extinktionskoefficient vid 416 nm = 1,24 x 105 M-1 cm-1). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Effekt av ampB på tillväxten av S. cerevisiae. Jäst odlades vid 30 °C i frånvaro och närvaro av ampB. Kontrollprover som saknade ampB inkluderade enbart PBS och rHDL. Som en positiv kontroll administrerades ampB i DMSO. Testformuleringar inkluderade ampB-nanodiskar (ampB-ND) vid de angivna koncentrationerna av ampB. Efter inkubation bestämdes individuella provoptiska densitetsvärden vid 600 nm. Statistisk signifikans bestämdes med hjälp av en tvåvägs ANOVA-multipeljämförelse med ett Tukeys post hoc-test. Rapporterade värden är medelvärdet ± standardfelet (n = 3), representativt för tre oberoende experiment. ns = inte signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Bioaktivt medel | Molekylvikt (Da) | Lösningsmedel | Hänvisning |
| Amfotericin B | 924.1 | DMSO | 15 |
| All-trans retinsyra | 300.4 | DMSO | 16 |
| Curcumin | 368.4 | DMSO | 17 |
| Nutlin 3a | 581.5 | DMSO | 21 |
| Koenzym Q10 | 863.3 | Dimetylformamid | 20 |
| Lutein | 568.9 | Tetrahydrofuran | 22 |
| Sfingingadien | 297.5 | DMSO | 19 |
| Docetaxel 1 Annonser | 807.9 | - | 23 |
| 10-hydroxicamptothecin | 364.4 | DMSO | 18 |
| Simvastatin1 | 418.5 | - | 24 |
| 1 Valt bioaktivt medel lösningsmedel torkades med fosfolipid istället för att tillsättas till dispergerad fosfolipid i buffert. | |||
Tabell 1: Bioaktiva ämnen införlivas framgångsrikt i nanodisketter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formulering av ett bioaktivt medel innehållande nanodiskar ger en lämplig metod för att solubilisera annars olösliga hydrofoba föreningar. Eftersom produktens bioaktiva substansnanodisketter är fullt lösliga i vattenhaltiga medier ger de en användbar leveransmetod för ett brett spektrum av hydrofoba molekyler (tabell 1). Dessa inkluderar små molekyler, naturliga och syntetiska droger, fytonäringsämnen, hormoner etc. Formuleringsstrategin följer vanligtvis ett standardprotokoll som måste ta hänsyn till löslighetsegenskaperna hos det bioaktiva medlet i organiska lösningsmedel. Förutom att välja ett lämpligt organiskt lösningsmedel för att lösa upp det bioaktiva medlet krävs ytterligare två parametrar, som uppnår en ~ 20 mg / ml stamlösning och blandbarhet av lösningsmedlet med vattenlösningar. Detta är nödvändigt eftersom det gör det möjligt att tillsätta en betydande mängd bioaktivt medel till formuleringsblandningen utan att införa överskott av organiskt lösningsmedel. Blandbarhet är viktigt eftersom fasseparation förhindrar att bioaktiva ämnen införlivas i produktnanodisketten.
Genom att introducera det bioaktiva medlet omedelbart efter dubbelskiktsbildande fosfolipiddispersion i den valda bufferten kan dessa komponenter interagera med varandra innan ställningsproteinet tillsätts. Före och omedelbart efter tillsats av ställningsprotein uppträder provet som en ogenomskinlig suspension. Men när de tre komponenterna (fosfolipid, bioaktivt medel och ställningsprotein, i ett förhållande på 5/1/2 w / w / w) tillsätts och provet utsätts för badultraljudsbehandling vid rätt temperatur under en tillräcklig period, ändras dess utseende från grumligt till klart. Om det bioaktiva medlet är färgat kommer det klarade provet att ta på sig den färgen. Således är det lätt att upptäcka nanodiskbildning genom visuell inspektion.
Även om DMPC är bekvämt och ofta används som fosfolipid val för många applikationer, med vissa bioaktiva medel, motstår denna fosfolipid nanodisk formulering. Till exempel bildades koenzym Q10 nanodiskar endast när äggfosfatidylkolin (PC) användes19, och likaså för xantofyll, lutein22. Således, medan DMPC ofta är fosfolipid val, är detta inte universellt. Anledningen till att koenzym Q10 och lutein föredrar ägg-PC kan bero på deras utökade hydrofoba regioner, en preferens för dubbelskikt som har omättade fettsyror eller någon annan faktor. När ägg PC används, temperaturen på ultraljudsbehandling höjs till 45 ° C under ultraljudsbehandling för att uppnå fullständig prov förtydligande. Efter formulering centrifugeras bioaktiva nanodiskar som innehåller medel för att avlägsna olösligt material. Det bör dock noteras att normalt bildas inte en fällning när optimala förhållanden har bestämts och följts. Därefter dialyseras provet mot buffert över natten för att avlägsna den lilla mängd organiskt lösningsmedel som tillsattes till formuleringsblandningen tillsammans med det bioaktiva medlet. Efter dialys kan produkten förvaras vid 4 °C under längre perioder. Om det inkorporerade bioaktiva medlet är känsligt för oxidation bör nanodiskprovet förvaras i ett slutet kärl underN2-gas .
Olika metoder har använts för att karakterisera och validera att nanodiskar faktiskt har bildats. Den kanske mest exakta metoden är elektronmikroskopi26,27. Denna teknik ger information om partikelmorfologi, diameter och populationsstorlek heterogenitet. Denna metod anses vara definitiv för nanodiskbildning. En besläktad metod, atomkraftsmikroskopi, har också använts för att undersöka egenskaperna hos bioaktiva agentinnehållande nanodiskar 17,24,28. För praktiska ändamål är emellertid snabb proteinvätskekromatografi (FPLC) gelfiltreringskromatografi lämplig och typiskt tillräcklig för att karakterisera storleken (~ 200 000 Da) och homogeniteten hos ett givet bioaktivt ämne nanodiskprov20,22. När det väl har bestämts att bioaktiva nanodiskar har bildats är det också viktigt och användbart att bestämma löslighetseffektiviteten hos det bioaktiva medlet. Om det bioaktiva medlet har karakteristiska absorbansegenskaper vid en given våglängd, representerar UV / Vis-absorbansspektroskopi en lämplig metod. En potentiellt komplicerande faktor är ställningsproteinabsorbansen vid 280 nm. Men om ett givet bioaktivt medel absorberar vid en annan våglängd är detta inte ett problem. Om en utrotningskoefficient är känd för det bioaktiva medlet av intresse, är det möjligt att exakt bestämma mängden bioaktivt medel som solubiliseras i nanodisker. I annat fall kan en standardkurva härledd från spektra av kända mängder av det bioaktiva medlet i ett lämpligt lösningsmedel användas. Alternativa metoder inkluderar fluorescensspektroskopi17,22 eller högtrycksvätskekromatografianalys (HPLC)20,24.
Den grundläggande formuleringsprocessen som beskrivs för bioaktiva medel innehållande nanodisketter är mottaglig för ett brett spektrum av tillämpningar. Till exempel har nanodiskar som innehåller kontrastmedel använts i medicinska avbildningsstudier för att diagnostisera och bedöma utvecklingen av sjukdom29. Ett annat tillvägagångssätt är att integrera lipidmodifierade proteiner i det dubbla lagret av nanodiskar. Till exempel införlivade Lalefar et al. framgångsrikt "Wnt" -proteinet i nanodiskar via införande av dess kovalent bundna oljesyradel30. Wnt-nanodisketter visade sig senare utgöra ett vattenlösligt Wnt-transportfordon som kan främja ex vivo-expansion av hematopoetiska stamceller. I en annan studie konstruerade Crosby et al. en ställningsproteinchimär bestående av apoA-I smält till ett enkelkedjigt variabelt antikroppsfragment (scFv) riktat mot B-cellytantigenet CD2031. Efterföljande formulering av curcumin nanodiskar med α-CD20 scFv · apoA-I som ställningskomponent tilldelade inriktning till B-celler, vilket förbättrade bioaktiva agentleveranser. Denna strategi ger ett nytt tillvägagångssätt för att minimera toxicitet associerad med kemoterapeutiska medel genom att rikta dem specifikt till målcelltypen. I ett annat exempel införlivades den syntetiska katjonlipiden 1,2-dimyristoyl-3-trimetylammoniumpropanklorid (DMTAP) i dubbelskiktet av nanodiskar32. Denna formuleringsstrategi gav effektivt positiv laddningskaraktär till nanodiskens dubbelskiktsyta och främjade därigenom en stabil bindningsinteraktion med kort interfererande (si) RNA. siRNA-berikade DMTAP-nanodiskar visade sig sedan ha biologisk aktivitet i målgenknockdownstudier. I ytterligare ett exempel har nanodiskar formulerats med kardiolipin som enda fosfolipidkomponent. Denna unika anjoniska glycerofosfolipid är känd för att binda olika ligander, inklusive det tvåvärda mineralkalciumet, hemoproteinet cytokrom c, antracyklinanti-cancermedlet doxorubicin och andra33,34,35,36. Kardiolipinnanodiskar har använts för att karakterisera dessa bindningsinteraktioner i detalj genom att dra nytta av nanodiskarnas löslighetsegenskaper, deras nanoskala och närvaron av ett tillgängligt kardiolipin-dubbelskikt8. Baserat på dessa och andra applikationer är det uppenbart att nanodiskteknik är en mångsidig plattform för en mängd applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (R37 HL-64159).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Cayman Chemical Company | 11636 | ND Formulation & Standard Preparation |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP17925 | Transformation & Expansion |
| ApoE4-NT Plasmid | GenScript | N/A | Transformation |
| Baffled Flask | New Brunswick Scientific | N/A | Expansion & Expression |
| BL21 competent E coli | New England Biolabs | C2527I | Transformation |
| Centrifuge bottles | Nalgene | 3140-0250 | Expression |
| Chloroform | Fisher Scientific | G607-4 | ND Formulation |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | Standard Prepartation |
| Dymyristoylphosphatidylcholine | Avanti Lipids | 850345P | ND Formulation |
| Erlenmeyer flask | Bellco Biotechnology | N/A | Expansion & Expression |
| Falcon Tubes | Sarstedt Ag & Co | D51588 | Yeast Viability Assay |
| Glass borosilicate tubes | VWR | 47729-570 | ND Formulation |
| GraphPad (Software) | Dotmatics | N/A | Yeast Viability Assay |
| Heated Sonication Bath | VWR | N/A | ND Formulaton |
| Heating and Nitrogen module | Thermo Scientific | TS-18822 | ND Formulation |
| HiTrap Heparin HP (5 mL) | GE Healthcare | 17-0407-03 | Purification |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755 | Expression |
| J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | J325-IM-2 | Expression |
| JA-14 Rotor | Beckman Coulter | 339247 | Expression |
| Lyophilizer | Labconco | 7755030 | ND Formulation |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | ND Formulation |
| Nitrogen gas | Praxair | UN1066 | ND Formulation |
| NZCYM media | RPI Research Products | N7200-1000.0 | Expansion & Expression |
| Pet-22B vector | GenScript | N/A | Transformation |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875718 | Transformation & Expansion |
| Quartz Cuvettes | Fisher Brand | 14385 928A | Spectral Analysis |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | M1344-0004 | Transformation, Expansion, & Expression |
| Slide-A-Lyzer Buoys | Thermo Scientific | 66430 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 68100 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88243 | Purification |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Purification |
| Sodium Phosphate dibasic | Fisher Scientific | S374-500 | Purification |
| Sodium Phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | Purification |
| Spectra/POR Weighted Closures | Spectrum Medical Industries | 132736 | Purification |
| Spectrophotometer | Shimadzu UV-1800 | 220-92961-01 | spectral analysis |
| Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | ND Formulation |
| UVProbe 2.61 (Software) | Shimadzu | N/A | Spectral Analysis |
| Vacuum filter | Millipore | 9004-70-0 | Expression & Purification |
| Vacuum pump | GAST Manufacturing Inc | DOA-P704-AA | Expression & Purification |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | ND Formulation |
| Yeast | N/A | BY4741 | Yeast Viability Assay |
| Yeast Extract-Peptone-Dextrose | BD | 242820 | Yeast Viability Assay |
References
- Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).
- Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A.
- Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
- Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
- Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704 (2022).
- Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
- Fox, C. A., Ryan, R. O.
- Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
- Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
- Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
- Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
- Jonas, A.
- Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
- Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
- Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O.
- Ghosh, M., et al.
- Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
- Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
- Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
- Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).
- Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).
- Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).
- Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065 (2014).
- Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
- Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O.
- Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
- Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
- Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).
- Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).
- Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
- Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
- Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O.
- Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).
- Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).
- Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).
