Summary
Qui, descriviamo la produzione e la caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodisk. I nanodischi di amfotericina B sono presi come esempio per descrivere il protocollo in modo graduale.
Abstract
Il termine nanodisco si riferisce a un tipo discreto di nanoparticella composto da un lipide che forma un doppio strato, una proteina scaffold e un agente bioattivo integrato. I nanodischi sono organizzati come un doppio strato lipidico a forma di disco il cui perimetro è circoscritto dalla proteina dell'impalcatura, di solito un membro della famiglia delle apolipoproteine scambiabili. Numerosi agenti bioattivi idrofobici sono stati solubilizzati in modo efficiente in nanodischi mediante la loro integrazione nell'ambiente idrofobico del doppio strato lipidico della particella, producendo una popolazione ampiamente omogenea di particelle nell'intervallo di 10-20 nm di diametro. La formulazione di nanodischi richiede un rapporto preciso dei singoli componenti, un'aggiunta sequenziale appropriata di ciascun componente, seguita dalla sonicazione a bagno della miscela di formulazione. La proteina dello scaffold anfipatico contatta spontaneamente e riorganizza il doppio strato disperso formando una miscela di agenti lipidici / bioattivi per formare una popolazione discreta e omogenea di particelle di nanodischi. Durante questo processo, la miscela di reazione passa da un aspetto opaco e torbido a un campione chiarificato che, quando completamente ottimizzato, non produce precipitato dopo la centrifugazione. Gli studi di caratterizzazione riguardano la determinazione dell'efficienza di solubilizzazione dell'agente bioattivo, la microscopia elettronica, la cromatografia a filtrazione su gel, la spettroscopia di assorbanza ultravioletta visibile (UV/Vis) e/o la spettroscopia di fluorescenza. Questo è normalmente seguito da un'indagine sull'attività biologica utilizzando cellule o topi in coltura. Nel caso di nanodischi che ospitano un antibiotico (cioè l'antibiotico macrolide poliene amfotericina B), è possibile misurare la loro capacità di inibire la crescita di lieviti o funghi in funzione della concentrazione o del tempo. La relativa facilità di formulazione, la versatilità rispetto ai componenti, la dimensione delle particelle su scala nanometrica, la stabilità intrinseca e la solubilità acquosa consentono una miriade di applicazioni in vitro e in vivo della tecnologia dei nanodischi. Nel presente articolo, descriviamo una metodologia generale per formulare e caratterizzare i nanodischi contenenti amfotericina B come agente bioattivo idrofobo.
Introduction
Le lipoproteine discoidali nascenti ad alta densità (HDL) sono progenitori naturali delle HDL sferiche molto più abbondanti presenti nel sistema circolatorio umano. Queste particelle nascenti, note anche come pre-ß HDL, possiedono proprietà strutturali uniche e distintive1. Infatti, piuttosto che esistere come particella sferoidale, le HDL nascenti sono a forma di disco. Studi approfonditi di caratterizzazione strutturale su HDL discoidali naturali e ricostituite hanno rivelato che sono costituiti da un doppio strato fosfolipidico il cui perimetro è circoscritto da un'apolipoproteina anfipatica scambiabile (apo), come l'apoA-I. Nel metabolismo delle lipoproteine umane, le HDL nascenti circolanti accumulano lipidi dalle cellule periferiche e maturano in HDL sferiche in un processo che dipende da mediatori proteici chiave, tra cui il trasportatore di cassette leganti ATP A1 e lecitina: colesterolo aciltransfere2. Questo processo rappresenta una componente critica della via di trasporto inversa del colesterolo che è considerata protettiva contro le malattie cardiache. Armati di questa conoscenza e della capacità di ricostituire HDL discoidali, i ricercatori hanno impiegato queste particelle come intervento terapeutico per trattare l'aterosclerosi3. In sostanza, l'infusione di HDL ricostituito (rHDL) nei pazienti promuove l'efflusso di colesterolo dai depositi di placca e lo restituisce al fegato per la conversione in acidi biliari e l'escrezione dal corpo. Diverse aziende biotecnologiche/farmaceutiche stanno perseguendo questa strategia di trattamento4.
Allo stesso tempo, la capacità di generare queste particelle in laboratorio ha scatenato una raffica di attività di ricerca che hanno portato a nuove applicazioni e nuove tecnologie. Un'applicazione importante riguarda l'uso di particelle rHDL come membrana in miniatura per ospitare proteine transmembrana in un ambiente nativo5. Ad oggi, centinaia di proteine sono state incorporate con successo nella rHDL discoidale e la ricerca ha dimostrato che queste proteine mantengono sia la conformazione nativa che l'attività biologica come recettori, enzimi, trasportatori, ecc. Queste particelle, denominate "nanodischi", hanno anche dimostrato di essere suscettibili di caratterizzazione strutturale, spesso ad alta risoluzione6. Questo approccio allo studio delle proteine transmembrana è riconosciuto come superiore agli studi con micelle detergenti o liposomi e, di conseguenza, sta rapidamente avanzando. È importante riconoscere che sono stati descritti due metodi distinti che sono in grado di formare un rHDL. Il metodo "dialisi colata"13 è popolare per applicazioni relative all'incorporazione di proteine transmembrana nelbistrato 5 rHDL. Essenzialmente, questo metodo di formulazione prevede la miscelazione di un fosfolipide che forma un doppio strato, una proteina scaffold e la proteina transmembrana di interesse in un tampone contenente il detergente colato di sodio (o desossicolato di sodio; peso molecolare della micella [MW] di 4.200 Da). Il detergente solubilizza efficacemente i diversi componenti della reazione, consentendo di dializzare il campione contro tampone privo di detergente. Durante la fase di dialisi, quando il detergente viene rimosso dal campione, si forma spontaneamente un rHDL. Quando questo approccio viene utilizzato per intrappolare una proteina transmembrana di interesse, le particelle prodotto sono state definite nanodischi5. I tentativi di utilizzare questo metodo per incorporare agenti bioattivi idrofobici a piccole molecole (MW <1.000 Da), tuttavia, sono stati in gran parte infruttuosi. A differenza delle proteine transmembrana, gli agenti bioattivi a piccole molecole sono in grado di fuoriuscire dalla sacca di dialisi insieme al detergente, diminuendo notevolmente la loro efficienza di incorporazione nelle rHDL. Questo problema è stato risolto omettendo i detergenti dalla miscela di formulazione14. Invece, i componenti vengono aggiunti a un tampone acquoso in sequenza, iniziando con il lipide che forma il doppio strato, formando un agente bioattivo stabile contenente rHDL, indicato come nanodisk. Altri hanno utilizzato rHDL per l'incorporazione e il trasporto di agenti di imaging in vivo 7. Più recentemente, rHDL specializzato composto da un'impalcatura di apolipoproteina e il glicerofosfolipide anionico, cardiolipina, sono stati impiegati in studi di legame del ligando. Queste particelle forniscono una piattaforma per studi sull'interazione della cardiolipina con vari ligandi solubili in acqua, tra cui calcio, citocromo c e l'agente antitumorale doxorubicina8.
Il focus del presente studio è sulla formulazione di rHDL che possiedono un agente bioattivo idrofobico stabilmente incorporato (cioè nanodisk). La capacità di questi agenti di integrarsi nell'ambiente lipidico delle particelle rHDL discoidali conferisce loro efficacemente la solubilità acquosa. In quanto tali, i nanodischi hanno il potenziale per applicazioni terapeutiche in vivo . Quando si formulano i nanodisk, sono necessarie specifiche condizioni di incubazione / reazione per incorporare con successo agenti bioattivi idrofobici discreti nella particella del prodotto e l'obiettivo di questo rapporto è fornire informazioni pratiche dettagliate che possono essere utilizzate come modello fondamentale per la creazione di nuove particelle di nanodisk per applicazioni specifiche. Pertanto, nel contesto di questo manoscritto i termini nanodisco e nanodisco non sono intercambiabili. Mentre nanodisco si riferisce a un rHDL formulato per contenere una proteina transmembrana incorporata nel suo doppio strato lipidico5, il termine nanodisco si riferisce a un rHDL formulato per incorporare agenti bioattivi idrofobici a basso peso molecolare (< 1.000 Da), come l'amfotericina B14.
Sono disponibili vari metodi per l'acquisizione di proteine di scaffold adatte. È possibile acquistare proteine di scaffold da produttori [ad esempio apoA-I (SRP4693) o apoE4 (A3234)], tuttavia, il costo può essere un fattore limitante. Un approccio preferito è quello di esprimere le proteine dello scaffold ricombinante in Escherichia coli. I protocolli sono pubblicati per l'apoA-I9, l'apoE410 umano e la proteina emolinfatica degli insetti apolipophorin-III11. Ai fini degli esperimenti qui descritti, è stato utilizzato il dominio ricombinante umano apoE4 N-terminale (NT) (amminoacidi 1-183). La sequenza nucleotidica che codifica per l'apoE4-NT umano è stata sintetizzata e inserita in un vettore di espressione pET-22b (+) direttamente adiacente alla sequenza leader pelB codificata da vettori. Questo costrutto porta all'espressione di una proteina di fusione pelB leader sequence-apoE4-NT. Dopo la sintesi proteica, la sequenza leader pelB batterica dirige la proteina appena sintetizzata nello spazio periplasmatico dove la peptidasi leader fende la sequenza pelB. La proteina apoE4-NT risultante, senza tag di sequenza o code, successivamente sfugge ai batteri e si accumula nel terreno di coltura11,12, semplificando l'elaborazione a valle.
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Protocol
1. Trasformazione, espressione e purificazione della componente proteica dello scaffold
- Trasformazione batterica BL21 con plasmide contenente apoE4-NT
- Scongelare un tubo di cellule competenti BL21 (DE3) sul ghiaccio per 10 minuti.
- Una volta che tutto il ghiaccio si è sciolto, mescolare delicatamente e accuratamente pipettare 50 μL delle cellule in un tubo di trasformazione su ghiaccio.
- Aggiungere 5 μL contenenti 50 ng di DNA plasmidico (per la sequenza, vedere Tabella supplementare 1) alla miscela cellulare. Passare con attenzione il tubo quattro o cinque volte per mescolare. Non vortice.
- Mettere il composto sul ghiaccio per 30 minuti.
- Shock termico della miscela esattamente a 42 °C per 10 s.
- Mettere in ghiaccio per 5 min.
- Pipettare 950 μL di mezzo S.O.C. nel tubo a temperatura ambiente.
- Posizionare il tubo in un incubatore di agitazione a 37 °C per 60 minuti con oscillazione impostata a 250 giri/min.
- Mescolare accuratamente le cellule sfogliando e capovolgendo, quindi distribuire 100 μL di soluzione cellulare su una piastra di selezione Luria Brodo + Agar da 20 mL trattata con ampicillina ad una concentrazione di 0,1 mg/ml.
- Incubare durante la notte a 37 °C, o fino a quando le colonie visibili sono cresciute.
- Utilizzando un pipettatore elettronico, trasferire 25 mL di terreno sterile NZCYM in un matraccio conico sterile da 250 mL a temperatura ambiente e aggiungere ampicillina ad una concentrazione di lavoro finale di 0,1 mg/ml.
- Utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, trasferire una singola colonia dalla piastra di selezione contenente il ceppo batterico opportunamente trasformato e aggiungere direttamente al matraccio contenente 25 ml di NZCYM media + ampicillina.
- Introdurre i 25 mL di sementi di coltura NZCYM in un incubatore di agitazione a 37 °C con oscillazione orbitale impostata a 250 giri/min.
NOTA: Si raccomanda di coltivare questa coltura di semi durante la notte per raggiungere una concentrazione batterica adeguata (~ 1,5-2,0 unità di densità ottica), misurata utilizzando uno spettrofotometro impostato su lunghezza d'onda = 600 nm. - Trasferire 250 mL di terreno sterile NZCYM in quattro palloni sconcertati da 1 L e aggiungere l'antibiotico ampicillina ad una concentrazione operativa di 0,1 mg/ml.
- In condizioni sterili, trasferire 5 mL di coltura di semi saturi in ciascuno dei quattro palloni contenenti colture da 250 mL e porli in un incubatore agitatore a 37 °C con oscillazione orbitale impostata a 250 giri/min.
NOTA: A questo punto, la coltura verrà indicata come coltura di espansione e la crescita esponenziale verrà monitorata utilizzando uno spettrofotometro UV1800. La crescita può procedere fino a quando la densità ottica della coltura a 600 nm (OD600) raggiunge un valore compreso tra 0,6-0,8. - Una volta che la coltura di espansione ha raggiunto il valore desiderato di OD600 di 0,6-0,8, aggiungere 59,6 mg di isopropile β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) a ciascuna coltura contenente 250 ml di matraccio per una concentrazione finale di 1 mM per indurre l'espressione proteica. A questo punto, la cultura dell'espansione viene definita cultura dell'espressione. Iniziare l'espressione per un periodo di 5 ore.
- Al termine del periodo di espressione di 5 ore, prelevare i quattro palloni dall'incubatrice agitatrice e pipettare 125 ml in sei flaconi di centrifuga da 250 ml (750 ml totali).
- Bilanciare ogni flacone della centrifuga per assicurarsi che la massa totale sia entro ±0,5 mg l'uno dall'altro.
NOTA: questo passaggio è essenziale per garantire un funzionamento sicuro del dispositivo centrifugo. - Preparare il dispositivo centrifugo ruotando prima l'interruttore di alimentazione in posizione accesa. Fare clic sul pulsante "Set/Actual" e regolare i parametri su "JA-14", "9.400 x g", 20,00 min e 4 °C utilizzando i quadranti corrispondenti.
- Caricare i sei flaconi bilanciati della centrifuga in un rotore di centrifuga di dimensioni appropriate e inserirli nella centrifuga assicurandosi che vengano rispettati tutti i parametri di sicurezza specifici.
NOTA: Continuare questo passaggio fino a quando tutte le colture cellulari batteriche sono state centrifugate e i surnatanti raccolti. - Filtrare il surnatante batterico isolato attraverso una filtrazione sottovuoto o un apparecchio equivalente dotato di un filtro da 0,45 micron per rimuovere eventuali residui residui.
- Purificazione dell'eparina della proteina scaffold apoE4-NT ricombinante
NOTA: La procedura di purificazione della colonna viene condotta a temperatura ambiente.- Equilibrare la colonna Hi-trap Eparina applicando 10 volumi di colonna (50 ml) di tampone fosfato di sodio 10 mM, pH 7,2, ed eluendo ad una velocità di 5 mL/min.
- Applicare il mezzo arricchito apoE4-NT alla colonna ad una velocità di 2,5 ml/min fino a quando non è stato applicato l'intero volume di 1 L del fluido ed eliminare il flusso continuo.
- Lavare la colonna con 10 volumi di colonna (50 ml) di tampone fosfato di sodio da 10 mM, pH 7,2, ed eliminare il flusso passante.
- Eluire la proteina apoE4-NT desiderata applicando tre volumi di colonna (15 mL) di tampone di eluizione (10 mM tampone fosfato di sodio + 1,5 M NaCl, pH 7,2) alla colonna e raccogliere l'eluato.
- Dialisi dell'eluato apoE4-NT
- Preparare una sezione di tubi per dialisi (le dimensioni del tubo di dialisi utilizzato erano 22 cm di lunghezza, 12 mm di diametro interno e 10.000 MWCO) immergendo accuratamente in acqua distillata deionizzata (ddi) per 10 minuti.
- Preparare 1 L di tampone fosfato salino (PBS) (10 mM fosfato di sodio + 150 mM NaCl, pH 7,2) in un becher di plastica da 1 L o equivalente.
- Utilizzando un morsetto per tubi di dialisi, bloccare un'estremità del tubo di dialisi imbevuto, assicurandosi che il morsetto sia fissato e che nessun liquido possa fuoriuscire.
- Inserire un imbuto a collo stretto nell'estremità aperta del tubo di dialisi e versare i 15 ml di eluato apoE4-NT nel tubo di dialisi.
NOTA: è imperativo verificare la presenza di eventuali perdite in questa fase. - Rimuovere l'imbuto e bloccare l'estremità del tubo di dialisi con un altro morsetto per tubo di dialisi.
- Posizionare un galleggiante di dialisi in schiuma su una delle estremità sigillate del tubo di dialisi e posizionare il tubo di dialisi assemblato nel becher contenente 1 L di tampone PBS.
- Posizionare una barra di agitazione magnetica nella parte inferiore del becher e regolare il controllo di agitazione su "basso", assicurandosi che non si formi un vortice.
- Al termine della dialisi, decantare il retentato in un tubo conico da 50 mL e conservare a -20 °C.
NOTA: Si raccomanda di eseguire questa dialisi a 4 °C durante la notte.
2. Formulazione di un agente bioattivo contenente nanofloppy
- Preparazione di aliquote fosfolipidiche
- Pesare 5 mg di un fosfolipide appropriato (ad esempio, dimiristoilfosfatidilcolina [DMPC]) e trasferire in una provetta di vetro.
- Sciogliere i 5 mg di fosfolipidi aggiungendo 300 μL di CHCl 3 e 100 μL di CH 3 OH per un rapporto totale di3:1 v/v.
- Evaporare il solvente organico ponendo la provetta di vetro sotto un flusso delicato di gas N2 per 10-15 minuti, in modo tale che un sottile film di fosfolipidi essiccati si formi lungo le pareti della porzione inferiore della provetta.
- Liofilizzazione delle aliquote fosfolipidiche
- Preparare aliquote fosfolipidiche per la liofilizzazione coprendo l'apertura della provetta di vetro con parafilm.
- Forare il parafilm con un ago da 24 G circa 10-15 volte.
- Collocare le aliquote perforate in un contenitore di liofilizzazione appropriato e assicurarsi che il coperchio di gomma sia sigillato correttamente.
- Collegare il contenitore di liofilizzazione al collettore a vuoto situato nella parte superiore della macchina di liofilizzazione e assicurarsi che tutte le altre valvole siano chiuse ermeticamente.
- Accendere la macchina di liofilizzazione ruotando l'interruttore di alimentazione e premendo il pulsante di inizializzazione del vuoto.
- Dopo che il sistema ha raggiunto il vuoto totale, fare clic sul pulsante di inizializzazione della refrigerazione per iniziare il processo di liofilizzazione.
NOTA: Si raccomanda di consentire ai campioni di liofilizzarsi durante la notte.
- Formulazione di nanodischi di amfotericina-B (amp-B)
- Pipettare 0,45 mL di PBS sull'aliquota fosfolipidica liofilizzata e vortice per ~30 s per disperdere il lipide.
NOTA: il campione risultante apparirà opaco e torbido. - Pipettare 50 μL di una soluzione madre di ampB da 20 mg/mL (20 mg di ampB disciolti in 1 mL di dimetilsolfossido [DMSO], conservati a -20 °C in un recipiente ambrato chiuso) nel campione fosfolipidico disperso e nel vortice.
NOTA: Quando si seleziona un solvente da utilizzare nella preparazione di una soluzione madre dell'agente bioattivo idrofobo, le due considerazioni generali sono 1) la solubilità dell'agente bioattivo e 2) la miscibilità del solvente con il tampone acquoso utilizzato nella formulazione. Mentre DMSO è spesso usato 15,16,17,18,19, dimetilformammide 20,21 o tetraidrofurano 22 sono stati impiegati con successo anche 23. - Pipettare 0,5 mL di proteina scaffold apoE4-NT (concentrazione di ~4 mg/ml) nella provetta di vetro contenente il fosfolipide disperso e ampB. Il volume finale del campione deve essere di circa 1 ml.
- Bagno sonicare il campione a 24 °C fino a quando la soluzione non chiarisce (generalmente 10-15 min).
- Pipettare 0,45 mL di PBS sull'aliquota fosfolipidica liofilizzata e vortice per ~30 s per disperdere il lipide.
- Centrifugazione a nanodischi
- Trasferire la soluzione chiarificata di ampB-nanodisk in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,7 ml.
- Posizionare il tubo in un rotore di microcentrifuga da tavolo con l'aggiunta di un tubo di bilanciamento posto direttamente di fronte.
- Stringere il tappo del rotore e chiudere il coperchio della centrifuga.
- Programmare la centrifuga per girare per 10 minuti a ~11.000 x g utilizzando i quadranti corrispondenti situati sulla parte anteriore dell'unità micro-centrifuga.
NOTA: A questo punto, potrebbe essere visibile un pellet. Questo pellet è costituito da fosfolipidi non incorporati e/o ampB. - Rimuovere il surnatante e trasferirlo in un'altra provetta da microcentrifuga pulita da 1,7 ml.
- Dialisi del campione di ampB-nanodisk
- Preparare una sezione di tubi per dialisi (le dimensioni del tubo di dialisi utilizzati erano di 3 cm di lunghezza, 16 mm di diametro interno e 10.000 MWCO) immergendo accuratamente in acqua ddi per 10 minuti.
- Preparare una soluzione tampone PBS da 1 L (10 mM di fosfato di sodio + 150 mM di NaCl, pH 7,2) in un becher di plastica da 1 L o equivalente.
- Utilizzando un morsetto per tubi di dialisi, bloccare un'estremità del tubo di dialisi imbevuto, assicurandosi che il morsetto sia fissato e che nessun liquido possa fuoriuscire.
- Inserire un imbuto a collo stretto nell'estremità aperta del tubo di dialisi e trasferire il campione di ampB-nanodisk nel tubo di dialisi.
- Rimuovere l'imbuto e bloccare l'estremità del tubo di dialisi con un altro morsetto per tubo di dialisi.
- Posizionare un galleggiante di dialisi in schiuma su una delle estremità sigillate del tubo di dialisi e posizionare il tubo di dialisi assemblato nel becher contenente 1 L di tampone PBS.
- Posizionare una barra di agitazione magnetica nella parte inferiore del becher e regolare il controllo di agitazione su "basso", assicurandosi che non si formi un vortice. Lasciare proseguire la dialisi per tutta la notte a 4 °C.
3. Analisi spettrale di campioni di ampB-nanodisk
- Inizializzazione dello spettrofotometro seguita da spegnimento automatico
- Accendere lo spettrofotometro ruotando l'interruttore di alimentazione e collegarlo a un computer di supporto corrispondente premendo il pulsante "PC Control".
- Sul computer di supporto, aprire il software etichettato "UVProbe 2.61" e connettersi allo spettrofotometro facendo clic sul pulsante "Connetti" nell'angolo in basso a sinistra.
- Fare clic sul pulsante Spectrum sulla barra degli strumenti in alto all'interno del software UVProbe.
- Fare clic sul pulsante con l'etichetta Metodo sulla barra degli strumenti in alto.
- Fare clic sulla scheda Misurazione e immettere "500" nella casella di testo Start situata in "Intervallo di lunghezza d'onda (nm)" e "300" nella casella di testo "Fine".
- Fare clic sul menu a discesa accanto alla scheda denominata Velocità di scansione e impostarla su Media.
- Preparare un campione in bianco trasferendo 1 ml di DMSO in due cuvette di quarzo (QS 1.000).
- Caricare entrambe le cuvette nelle rispettive porte campione dello spettrofotometro, fare clic su Autoblank e registrare uno spettro compreso tra 300 e 500 nm facendo clic su Start nell'angolo in basso a sinistra.
- Preparazione e analisi spettrale dello standard ampB
- Preparare 20 μg/mL ampB standard rimuovendo la cuvetta dalla porta anteriore del campione e aggiungendo 20 μL di una soluzione madre da 1 mg/mL di ampB (20 μg di ampB totale).
- Caricare nuovamente la cuvetta nella porta del campione dello spettrofotometro e fare clic su Start per registrare l'assorbanza del campione.
- Rimuovere la cuvetta dalla porta del campione e decantare il contenuto del liquido in un contenitore dei rifiuti opportunamente etichettato.
- Risciacquare accuratamente la cuvetta con tre lavaggi di acqua deionizzata seguiti da tre lavaggi con etanolo al 70%.
- Preparazione e analisi spettrale di campioni di ampB-nanodisk interrotti
- Preparare un campione di ampB-nanodisk interrotto (contenente 20 μg/mL come ampB) pipettando 20 μL di uno stock di nanodisk ampB da 1 mg/mL in 1 mL di DMSO. Incubare per almeno 1 minuto prima di registrare lo spettro.
- Caricare la cuvetta nella porta anteriore del campione dello spettrofotometro e fare clic su Start per registrare l'assorbanza del campione.
- Preparazione e analisi spettrale di un buffer PBS blank
- Preparare un buffer PBS bianco trasferendo 1 mL di tampone PBS in due cuvette al quarzo (QS 1.000).
- Caricare le cuvette nelle rispettive porte campione dello spettrofotometro, fare clic su Autoblank e registrare lo spettro da 300-500 nm.
- Preparazione e analisi spettrale di un campione di ampB-nanodisk non interrotto
- Preparare un campione di ampB-nanodisk non interrotto (contenente 20 μg/mL come ampB) rimuovendo la cuvetta dalla porta anteriore del campione e introducendo 20 μL di un campione di ampB-nanodisk da 1 mg/mL nel buffer PBS.
- Caricare nuovamente la cuvetta nella porta campione dello spettrofotometro, fare clic su Start e registrare lo spettro del campione.
NOTA: Tutti i rifiuti chimici devono essere smaltiti in un contenitore per rifiuti opportunamente etichettato seguendo le linee guida accettate.
4. Analisi del saggio di vitalità del lievito
NOTA: Sono stati eseguiti saggi di vitalità del lievito al fine di valutare l'attività biologica di ampB e determinare se il processo di formulazione o incorporazione in nanodisk, ha influenzato la sua attività di inibizione della crescita del lievito.
- Formulare due campioni di ampB-nanodisk (volume finale = 1 mL) per contenere 1 mg di ampB per 5 mg di DMPC e 0,1 mg di ampB per 5 mg di DMPC seguendo il metodo precedentemente descritto (2.3-2.4.1).
NOTA: Per preparare un ampB da 1 mg/mL e 0,1 mg/mL per 5 mg di DMPC, pipettare rispettivamente 50 μL e 5 μL di un ampB da 20 mg/mL in DMSO in ciascun flaconcino del campione. - Preparazione di una coltura di lievito saturo
- Trasferire 25 ml di terreno sterile di estratto di lievito-peptone-destrosio (YPD) in un tubo conico sterile da 50 ml.
- Utilizzare un ciclo di inoculazione sterile per trasferire una singola colonia di Saccharomyces cerevisiae (BY4741) nei 25 mL di terreno YPD.
- Coltivare il lievito in un incubatore agitatore impostato a 30 °C, con oscillazione impostata a 200 giri / min per 18 h.
- Preparazione di campioni di test individuali di inibizione della crescita
- Trasferire 5 ml di terreno YPD sterile in 30 provette sterili da 13 mL.
- Trattare tre serie di provette di coltura aggiungendo 20, 10 e 5 μL del campione di ampB-nanodisk da 1 mg/mL, che rappresentano rispettivamente 20, 10 e 5 μg di ampB.
- Trattare tre serie di provette di coltura aggiungendo 20, 10 e 5 μl del campione di 0,1 mg/mL ampB-nanodisk, che rappresentano rispettivamente 2, 1 e 0,5 μg di ampB.
- Trattare quattro serie di provette di coltura aggiungendo 20 μL di PBS, DMSO, rHDL di controllo (senza ampB) o 20 μg di ampB in DMSO.
NOTA: ogni set di provette di coltura rappresenta una replica indipendente. Pertanto, seguendo questo metodo si ottiene un valore n complessivo di n = 3.
- Inizializzazione del saggio di vitalità del lievito
- Avviare l'esperimento inoculando ogni campione con 100 μL (2% vol/vol) di coltura di lievito saturo
- Coltivare il lievito utilizzando un incubatore agitatore impostato a 30 °C, con oscillazione impostata a 200 rpm per un massimo di 18 h.
- Misurazioni della vitalità del lievito
- Accendere lo spettrofotometro ruotando l'interruttore di alimentazione, quindi fare clic sul pulsante Go To WL e impostare il valore su 600 nm.
- Trasferire 1 mL di terreno YPD sterile in due cuvette di plastica, caricare nelle rispettive porte campione sullo spettrofotometro e fare clic su Autoblank.
- Trasferire 1 mL di ciascun campione in una cuvetta di plastica, assicurandosi di cambiare le cuvette ogni volta e caricare la cuvetta nella porta anteriore del campione dello spettrofotometro.
- Misurare e registrare la densità ottica di ciascun campione a 600 nm e smaltire ogni cuvetta consumata in un contenitore per rifiuti a rischio biologico correttamente etichettato.
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Representative Results
Processo di formulazione di nanodischi di agenti bioattivi
Nella procedura di formulazione ampB-nanodisk descritta, la reazione è considerata completa quando l'aspetto del campione passa da torbido a chiaro (Figura 1). Questo cambiamento indica che si sono formati nanofloppy e che l'agente bioattivo è stato solubilizzato. Spesso, gli agenti bioattivi assorbono la luce nella regione della lunghezza d'onda visibile (ad esempio, ampB, curcumina, luteina, coenzima Q10) e, in questi casi, il campione adotta il colore dell'agente bioattivo. Una volta completata la chiarificazione del campione (di solito 5-20 minuti di sonicazione del bagno), il campione viene trasferito in una provetta da microcentrifuga da 1,7 ml e centrifugato a 11.000 x g per 5 minuti su materiale insolubile in pellet. L'assenza di un pellet visibile può essere considerata una forte prova che l'agente bioattivo è stato incorporato nei nanodischi. D'altra parte, l'aspetto di un pellet indica che si è verificata un'incorporazione parziale o senza agente bioattivo. Se necessario o utile, le formulazioni di controllo contenenti solo la proteina lipidica e scaffold che forma il doppio strato possono essere eseguite in parallelo e l'entità della chiarificazione di entrambi i campioni può essere confrontata visivamente e quantitativamente utilizzando uno spettrofotometro. In ogni caso, dopo la centrifugazione di un agente bioattivo contenente nanodischi, il campione viene dializzato contro PBS, o altro tampone appropriato, per rimuovere tracce di solvente.
Analisi dell'efficienza di solubilizzazione degli agenti bioattivi
Per illustrare come l'assorbanza del campione può essere utilizzata per determinare l'efficienza di solubilizzazione, possono essere utilizzati nanodischi ampB. Inizialmente, uno spettro di ampB viene raccolto in DMSO. Ciò si ottiene aggiungendo 20 μL da una soluzione madre da 1 mg/mL di ampB (in DMSO) a una cuvetta contenente 980 μl di DMSO. Lo spettro viene quindi registrato nell'intervallo di lunghezze d'onda visibili da 300-500 nm su uno spettrofotometro UV/Vis (Figura 2). Questo spettro, ottenuto nel solvente DMSO, produce tre distinti massimi di assorbanza a 372 nm, 392 nm e 415 nm, picchi indicativi di ampB. Successivamente, viene raccolto uno spettro di assorbanza di ampB-nanodisks in PBS. Per ottenere questo spettro, 20 μL di ampB-nanodisk in PBS vengono aggiunti a 980 μL di PBS e lo spettro registrato. Questo spettro dovrebbe essere molto diverso, con un singolo picco di assorbanza maggiore a una lunghezza d'onda più corta, dallo spettro osservato in DMSO25. Questo risultato è dovuto al fatto che, nella PBS, la struttura delle particelle ampB-nanodisk rimane intatta, con le singole molecole di ampB confinate e vincolate all'interno dell'ambiente idrofobico del doppio strato del nanodisco. Poiché le molecole di ampB nel campione si trovano in prossimità di altre molecole di ampB, possono formarsi complessi / strutture di ordine superiore, con conseguente cambiamento drammatico nelle proprietà spettrali di ampB. Per confrontare direttamente gli spettri di ampB formulati in nanofloppy rispetto agli ampB di serie, viene aggiunta un'aliquota di 20 μL di nanodischi ampB dializzati (in PBS) a 980 μL di DMSO. In questo caso, il solvente DMSO porta alla rottura della struttura delle particelle del nanodisco, in modo tale che l'ampB integrato nel doppio strato lipidico del campione di nanodisk viene liberato e diventa liberamente solubile nel solvente DMSO. Lo spettro di assorbanza di questo campione dovrebbe apparire molto simile, se non identico, allo spettro degli ampB stock sopra descritti. Questo risultato fornisce la prova diretta che l'ampB è presente e che le sue proprietà chimiche non sono state alterate dal processo di formulazione dei nanodischi. In questo caso, si prevede che verranno rilevati gli stessi tre massimi di assorbanza.
Attività biologica dei nanofloppy ampB
Per valutare l'attività biologica dei nanodischi ampB, sono stati eseguiti saggi di inibizione della crescita del lievito. È stato utilizzato il ceppo di lievito BY4741 (un discendente del ceppo S. cerevisiae S288C). Dopo il trattamento, la densità ottica di ciascun campione di lievito è stata misurata a 600 nm su uno spettrofotometro UV-1800 UV/Vis (Figura 3). L'inclusione di tre campioni di controllo (PBS, DMSO e rHDL) ha dimostrato che i componenti dei nanodisk diversi dall'ampB non hanno alcun effetto visibile sulla crescita del lievito. Il controllo positivo (20 μg di ampB nel DMSO) ha confermato che l'ampB è un inibitore efficace della crescita del lievito. Quando sono stati testati i nanodischi ampB, è stata ottenuta la prova dell'attività di inibizione della crescita dipendente dalla concentrazione di ampB. Pertanto, il sequestro di ampB nell'ambiente lipidico delle particelle del nanodisco consente una maggiore solubilità del tampone acquoso, con la conservazione di una potente attività biologica.
Figura 1: Effetto della sonicazione del bagno sulla formulazione del nanodisco e sull'aspetto del campione. Un campione di ampB-nanodisk (ampB-ND) è stato preparato disperdendo 5 mg di DMPC in 0,75 mL di PBS, aggiungendo 1 mg di ampB al campione da una soluzione madre da 20 mg/mL in DMSO, seguita dall'aggiunta di 2 mg di proteina scaffold in 0,5 ml di PBS (da una soluzione madre da 4 mg/ml). (A) Dispersione del DMPC nella PBS. (B) Dispersione di DMPC in PBS dopo l'aggiunta di 1 mg di ampB. (C) soluzione di nanodisk contenente DMPC, ampB e proteina scaffold dopo sonicazione del bagno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Spettroscopia di assorbanza UV/Vis di campioni di ampB. (A) ampB in DMSO. (B) ampB-nanodisks (ampB-ND) in PBS. (C) ampB-nanofloppy in DMSO. Gli spettri sono stati raccolti su uno spettrometro UV/Vis. Il contenuto di ampB dei campioni di ampB-nanodisk può essere determinato trasferendo un'aliquota nota ad una soluzione di DMSO e misurando l'assorbanza a 416 nm (coefficiente di estinzione ampB a 416 nm = 1,24 x 105 M-1 cm-1). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Effetto dell'ampB sulla crescita di S. cerevisiae. I lieviti sono stati coltivati a 30 °C in assenza e presenza di ampB. I campioni di controllo privi di ampB includevano PBS da solo e rHDL. Come controllo positivo, ampB è stato somministrato in DMSO. Le formulazioni di prova includevano ampB-nanodischi (ampB-ND) alle concentrazioni indicate di ampB. Dopo l'incubazione, i valori di densità ottica del singolo campione sono stati determinati a 600 nm. La significatività statistica è stata determinata utilizzando un confronto multiplo ANOVA bidirezionale con un test post hoc di Tukey. I valori riportati sono la media ± errore standard (n = 3), rappresentativo di tre esperimenti indipendenti. ns = non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Agente bioattivo | Peso molecolare (Da) | Solvente | Riferimento |
| Amfotericina B | 924.1 | DMSO | 15 |
| Acido retinoico all-trans | 300.4 | DMSO | 16 |
| Curcumina | 368.4 | DMSO | 17 |
| Nutlin 3a | 581.5 | DMSO | 21 |
| Coenzima Q10 | 863.3 | Dimetilformammide | 20 |
| Luteina | 568.9 | Tetraidrofurano | 22 |
| Sfingadiene | 297.5 | DMSO | 19 |
| Docetaxel 1 | 807.9 | - | 23 |
| 10-idrossicamptotecina | 364.4 | DMSO | 18 |
| Simvastatina1 | 418.5 | - | 24 |
| 1 Il solvente dell'agente bioattivo selezionato è stato essiccato con fosfolipidi invece di essere aggiunto al fosfolipide disperso nel tampone. | |||
Tabella 1: Agenti bioattivi incorporati con successo nei nanodisk.
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Discussion
La formulazione di un agente bioattivo contenente nanodischi fornisce un metodo conveniente per solubilizzare composti idrofobici altrimenti insolubili. Poiché i nanodischi dell'agente bioattivo prodotto sono completamente solubili in mezzi acquosi, forniscono un utile metodo di rilascio per un'ampia gamma di molecole idrofobiche (Tabella 1). Questi includono piccole molecole, droghe naturali e sintetiche, fitonutrienti, ormoni, ecc. La strategia di formulazione segue solitamente un protocollo standard che deve prendere in considerazione le proprietà di solubilità dell'agente bioattivo nei solventi organici. Oltre a selezionare un solvente organico appropriato per sciogliere l'agente bioattivo, sono necessari due parametri aggiuntivi, ottenendo una soluzione madre ~ 20 mg / ml e la miscibilità del solvente con soluzioni acquose. Ciò è necessario perché consente di aggiungere una quantità significativa di agente bioattivo alla miscela di formulazione senza introdurre solvente organico in eccesso. La missibilità è importante perché la separazione di fase impedirà l'incorporazione dell'agente bioattivo nel nanodisco del prodotto.
L'introduzione dell'agente bioattivo immediatamente dopo la dispersione di fosfolipidi a doppio strato nel tampone di scelta consente a questi componenti di interagire tra loro prima di aggiungere la proteina dello scaffold. Prima e immediatamente dopo l'aggiunta di proteine dello scaffold, il campione appare come una sospensione opaca. Tuttavia, una volta aggiunti i tre componenti (fosfolipide, agente bioattivo e proteina dello scaffold, con un rapporto di 5/1/2 p/p/p/p) e il campione viene sottoposto alla sonicazione del bagno alla temperatura corretta per un periodo sufficiente, il suo aspetto cambia da torbido a chiaro. Se l'agente bioattivo è colorato, il campione chiarificato assumerà quel colore. Pertanto, è facile rilevare la formazione di nanodischi mediante ispezione visiva.
Sebbene il DMPC sia conveniente e spesso usato come fosfolipide di scelta per molte applicazioni, con alcuni agenti bioattivi, questo fosfolipide resiste alla formulazione del nanodisco. Ad esempio, i nanodischi del coenzima Q10 si sono formati solo quando è stata utilizzata la fosfatidilcolina dell'uovo (PC)19, e allo stesso modo per la xantofilla, la luteina22. Quindi, mentre DMPC è spesso il fosfolipide di scelta, questo non è universale. Il motivo per cui il coenzima Q10 e la luteina preferiscono l'uovo PC può essere dovuto alle loro estese regioni idrofobiche, una preferenza per i doppi strati che possiedono acidi grassi insaturi o qualche altro fattore. Quando si utilizza il PC dell'uovo, la temperatura di sonicazione viene aumentata a 45 °C durante la sonicazione per ottenere una chiarificazione completa del campione. Una volta formulati, i nanodischi contenenti agenti bioattivi vengono centrifugati per rimuovere il materiale insolubile. Va notato, tuttavia, che normalmente un precipitato non si forma una volta determinate e seguite le condizioni ottimali. Successivamente, il campione viene dializzato contro tampone durante la notte per rimuovere la piccola quantità di solvente organico che è stata aggiunta alla miscela di formulazione insieme all'agente bioattivo. Dopo la dialisi, il nanodisco prodotto può essere conservato a 4 °C per periodi prolungati. Se l'agente bioattivo incorporato è suscettibile all'ossidazione, il campione di nanodisk deve essere conservato in un recipiente chiuso sotto il gas N2 .
Sono stati utilizzati vari metodi per caratterizzare e convalidare che i nanodischi si sono effettivamente formati. Forse il metodo più preciso è la microscopia elettronica26,27. Questa tecnica fornisce informazioni sulla morfologia delle particelle, sul diametro e sull'eterogeneità delle dimensioni della popolazione. Questo metodo è considerato definitivo per la formazione di nanodischi. Un metodo correlato, la microscopia a forza atomica, è stato utilizzato anche per studiare le proprietà dei nanodischi contenenti agenti bioattivi 17,24,28. Per scopi pratici, tuttavia, la cromatografia a filtrazione su gel per cromatografia liquida a proteine veloci (FPLC) è conveniente e tipicamente sufficiente per caratterizzare le dimensioni (~ 200.000 Da) e l'omogeneità di un dato campione di nanodisk di agente bioattivo20,22. Una volta determinato che si sono formati nanodischi di agente bioattivo, è anche importante e utile determinare l'efficienza di solubilizzazione dell'agente bioattivo. Se l'agente bioattivo ha proprietà di assorbanza caratteristiche a una data lunghezza d'onda, allora la spettroscopia di assorbanza UV/Vis rappresenta un metodo conveniente. Un fattore potenzialmente complicante è l'assorbanza delle proteine dello scaffold a 280 nm. Tuttavia, se un dato agente bioattivo assorbe a una lunghezza d'onda diversa, questo non è un problema. Se è noto un coefficiente di estinzione per l'agente bioattivo di interesse, è possibile determinare con precisione la quantità di agente bioattivo solubilizzato nei nanodisk. In caso contrario, è possibile utilizzare una curva standard derivata da spettri di quantità note dell'agente bioattivo in un solvente appropriato. I metodi alternativi includono la spettroscopia di fluorescenza17,22 o l'analisi della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)20,24.
Il processo di formulazione di base descritto per l'agente bioattivo contenente nanofloppy è suscettibile di una vasta gamma di applicazioni. Ad esempio, i nanodischi che ospitano agenti di contrasto sono stati utilizzati negli studi di imaging medico per diagnosticare e valutare la progressione della malattia29. Un altro approccio è quello di integrare proteine lipidiche modificate nel doppio strato di nanodischi. Ad esempio, Lalefar et al. hanno incorporato con successo la proteina "Wnt" nei nanodischi attraverso l'inserimento della sua porzione di acido oleico legata covalentemente30. I nanodischi Wnt hanno successivamente dimostrato di costituire un veicolo di trasporto Wnt solubile in acqua in grado di promuovere l'espansione ex vivo delle cellule staminali ematopoietiche. In un altro studio, Crosby et al. hanno costruito una chimera proteica scaffold composta da apoA-I fusa a un frammento di anticorpo variabile a catena singola (scFv) diretto contro l'antigene di superficie delle cellule B CD2031. La successiva formulazione di nanodischi di curcumina con α-CD20 scFv·apoA-I come componente dello scaffold ha conferito il targeting alle cellule B, migliorando così la consegna dell'agente bioattivo. Questa strategia fornisce un nuovo approccio per ridurre al minimo la tossicità associata agli agenti chemioterapici indirizzandoli specificamente al tipo di cellula bersaglio. In un altro esempio, il lipide cationico sintetico 1,2-dimiristoil-3-trimetilammonio-propano cloruro (DMTAP) è stato incorporato nel doppio strato di nanodischi32. Questa strategia di formulazione ha effettivamente conferito un carattere di carica positiva alla superficie del doppio strato del nanodisco e, quindi, ha promosso un'interazione di legame stabile con l'RNA interferente corto (si). I nanodischi DMTAP arricchiti con siRNA hanno quindi dimostrato di possedere attività biologica negli studi di abbattimento del gene bersaglio. In un altro esempio, i nanodischi sono stati formulati con cardiolipina come unico componente fosfolipidico. Questo glicerofosfolipide anionico unico è noto per legare vari ligandi, tra cui il calcio minerale bivalente, l'emoproteina citocromo c, l'agente anti-cancro antraciclina doxorubicina, e altri33,34,35,36. I nanodischi di cardiolipina sono stati utilizzati per caratterizzare queste interazioni di legame in dettaglio sfruttando le proprietà di solubilità dei nanodischi, le loro dimensioni su scala nanometrica e la presenza di un doppio strato di cardiolipina accessibile8. Sulla base di queste e altre applicazioni, è evidente che la tecnologia dei nanodisk è una piattaforma versatile per una moltitudine di applicazioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del National Institutes of Health (R37 HL-64159).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Cayman Chemical Company | 11636 | ND Formulation & Standard Preparation |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP17925 | Transformation & Expansion |
| ApoE4-NT Plasmid | GenScript | N/A | Transformation |
| Baffled Flask | New Brunswick Scientific | N/A | Expansion & Expression |
| BL21 competent E coli | New England Biolabs | C2527I | Transformation |
| Centrifuge bottles | Nalgene | 3140-0250 | Expression |
| Chloroform | Fisher Scientific | G607-4 | ND Formulation |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | Standard Prepartation |
| Dymyristoylphosphatidylcholine | Avanti Lipids | 850345P | ND Formulation |
| Erlenmeyer flask | Bellco Biotechnology | N/A | Expansion & Expression |
| Falcon Tubes | Sarstedt Ag & Co | D51588 | Yeast Viability Assay |
| Glass borosilicate tubes | VWR | 47729-570 | ND Formulation |
| GraphPad (Software) | Dotmatics | N/A | Yeast Viability Assay |
| Heated Sonication Bath | VWR | N/A | ND Formulaton |
| Heating and Nitrogen module | Thermo Scientific | TS-18822 | ND Formulation |
| HiTrap Heparin HP (5 mL) | GE Healthcare | 17-0407-03 | Purification |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755 | Expression |
| J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | J325-IM-2 | Expression |
| JA-14 Rotor | Beckman Coulter | 339247 | Expression |
| Lyophilizer | Labconco | 7755030 | ND Formulation |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | ND Formulation |
| Nitrogen gas | Praxair | UN1066 | ND Formulation |
| NZCYM media | RPI Research Products | N7200-1000.0 | Expansion & Expression |
| Pet-22B vector | GenScript | N/A | Transformation |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875718 | Transformation & Expansion |
| Quartz Cuvettes | Fisher Brand | 14385 928A | Spectral Analysis |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | M1344-0004 | Transformation, Expansion, & Expression |
| Slide-A-Lyzer Buoys | Thermo Scientific | 66430 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 68100 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88243 | Purification |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Purification |
| Sodium Phosphate dibasic | Fisher Scientific | S374-500 | Purification |
| Sodium Phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | Purification |
| Spectra/POR Weighted Closures | Spectrum Medical Industries | 132736 | Purification |
| Spectrophotometer | Shimadzu UV-1800 | 220-92961-01 | spectral analysis |
| Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | ND Formulation |
| UVProbe 2.61 (Software) | Shimadzu | N/A | Spectral Analysis |
| Vacuum filter | Millipore | 9004-70-0 | Expression & Purification |
| Vacuum pump | GAST Manufacturing Inc | DOA-P704-AA | Expression & Purification |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | ND Formulation |
| Yeast | N/A | BY4741 | Yeast Viability Assay |
| Yeast Extract-Peptone-Dextrose | BD | 242820 | Yeast Viability Assay |
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