Summary
Questo studio descrive un protocollo ottimizzato per stabilire fibroblasti primari da tessuti cheloidi in grado di fornire in modo efficace e costante fibroblasti puri e vitali.
Abstract
I fibroblasti, il principale tipo di cellula nel tessuto cheloide, svolgono un ruolo essenziale nella formazione e nello sviluppo dei cheloidi. L'isolamento e la coltura di fibroblasti primari derivati dal tessuto cheloide sono la base per ulteriori studi sulla funzione biologica e sui meccanismi molecolari dei cheloidi, nonché nuove strategie terapeutiche per il loro trattamento. Il metodo tradizionale per ottenere fibroblasti primari ha dei limiti, come il cattivo stato cellulare, la miscelazione con altri tipi di cellule e la suscettibilità alla contaminazione. Questo documento descrive un protocollo ottimizzato e facilmente riproducibile che potrebbe ridurre l'insorgenza di possibili problemi quando si ottengono fibroblasti. In questo protocollo, i fibroblasti possono essere osservati 5 giorni dopo l'isolamento e raggiungere quasi l'80% di confluenza dopo 10 giorni di coltura. Quindi, i fibroblasti vengono fatti passare e verificati utilizzando anticorpi PDGFRα e vimentina per saggi di immunofluorescenza e anticorpi CD90 per citometria a flusso. In conclusione, i fibroblasti dal tessuto cheloide possono essere facilmente acquisiti attraverso questo protocollo, che può fornire una fonte abbondante e stabile di cellule in laboratorio per la ricerca sui cheloidi.
Introduction
Il cheloide, una malattia fibroproliferativa, si manifesta come la crescita continua di placche che spesso invadono la pelle normale circostante senza autolimitazione e causano vari gradi di prurito, dolore e oneri estetici e psicologici per i pazienti1. I fibroblasti, le cellule primarie coinvolte nei cheloidi, svolgono un ruolo essenziale nella formazione e nello sviluppo di questa malattia attraverso un'eccessiva proliferazione, la produzione ridondante di matrice extracellulare e collageni disorganizzati 2,3. Tuttavia, la patogenesi sottostante rimane poco chiara e manca ancora un metodo terapeutico efficace per il cheloide; Pertanto, vi è un urgente bisogno di ulteriori ricerche 4,5.
Poiché non esiste un modello animale ideale per la ricerca sui cheloidi in vivo 6,7, la costruzione di un modello in vitro mediante l'acquisizione di fibroblasti primari da tessuti cheloidi può offrire fattibilità e affidabilità per la ricerca cheloide 2,6. Le cellule primarie sono quelle derivate direttamente da tessuti viventi ed è generalmente riconosciuto che queste cellule possono assomigliare più da vicino allo stato fisiologico e al background genetico di più individui rispetto alle linee cellulari 8,9. La coltura delle cellule primarie fornisce un potente mezzo per studiare la crescita e il metabolismo delle cellule, così come altri fenotipi cellulari.
Allo stato attuale, ci sono due metodi per acquisire fibroblasti primari: digestione enzimatica e coltura di espianto. Tuttavia, sono stati identificati diversi ostacoli all'ottenimento di fibroblasti primari, come il rischio di contaminazione da parte di vari batteri o funghi, la miscelazione con altri tipi di cellule che non sono facilmente rimosse, il lungo periodo del ciclo di coltura, le successive modifiche alle caratteristiche cellulari rispetto alle cellule originali e così via9. Pertanto, lo sviluppo di un processo fattibile ed efficace per ottenere fibroblasti primari è la base per ulteriori studi e applicazioni. Questo studio descrive un protocollo ottimizzato per l'estrazione di fibroblasti primari da tessuti cheloidi in grado di fornire in modo efficace e costante fibroblasti puri e vitali.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale del Dermatology Hospital, Southern Medical University (2020081). Il consenso informato del paziente è stato ottenuto prima che i tessuti fossero raccolti dagli individui.
1. Preparazione
NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite in ambiente sterile sotto un armadio di sicurezza biologica.
- Preparare un terreno di coltura completo aggiungendo il 10% di siero bovino fetale (FBS) e la soluzione di penicillina-streptomicina-amfotericina B (PSA) all'alto contenuto di glucosio del terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM).
- Preparare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con PSA aggiungendo l'1% di PSA in 1x PBS. Prepara PBS con FBS aggiungendo l'1% di FBS a 1x PBS.
- Preparare diverse forbici sterilizzate, pinze e bisturi in autoclave.
2. Ottenere i tessuti rimossi
- Ottenere tessuti da pazienti cheloidi attraverso la chirurgia. Raccogliere i tessuti cheloidi freschi in un sacchetto di imballaggio sterile o in una provetta da centrifuga sterile e trasferirli in un armadio di sicurezza biologica in laboratorio il prima possibile.
NOTA: In questo protocollo, la dimensione del tessuto cheloide acquisito era di circa ~ 20 x 20 x 10 mm3 e la dimensione può variare a seconda dell'intervento chirurgico.
3. Isolamento
- Estrarre il tessuto cheloide con una pinzetta sterile e metterlo in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml contenente 10-25 ml di PBS con PSA all'1% per 10 minuti. Quindi, preparare una piastra a 6 pozzetti e aggiungere 4 ml di PBS integrato con PSA all'1% a ciascun pozzetto. Estrarre il tessuto con una pinzetta sterilizzata e lavarlo due volte con PBS integrato con PSA all'1%. Utilizzando una pinza sterile, trasferire il tessuto in sequenza da un pozzetto all'altro.
- Rimuovere gli strati adiposi dell'epidermide usando forbici chirurgiche o un bisturi chirurgico e lasciare intatto lo strato del derma. Tagliare e sezionare lo strato del derma in 3-5 mm2 pezzi con le forbici, trasferire questi pezzi con una pinza sterile al pozzetto successivo e lavarli nuovamente in PBS con una soluzione di PSA all'1%.
4. Cultura
- Posizionare i pezzi di tessuto del derma in piastre di Petri usando una pinza sterilizzata; Assicurarsi che il numero di pezzi sia compreso tra 10 e 30 e che la distanza tra ogni pezzo sia >5 mm. Mettere le piastre di Petri capovolte in un'incubatrice al 5% di CO2 a 37 °C per 30-60 minuti fino a quando i pezzi di tessuto si asciugano un po 'e si attaccano alla capsula di Petri. Quindi, aggiungere DMEM integrato con FBS al 10% e PSA all'1% e posizionare con cura le piastre di Petri in un incubatore al 5% di CO2 a 37 ° C.
NOTA: I fibroblasti sono una popolazione cellulare morfologicamente e funzionalmente eterogenea. Considerando questa complessità, le fasi di isolamento e cultura dovrebbero essere eseguite con cura; selezionare uniformemente i pezzi di tessuto dermico cheloide e mescolare bene questi pezzi prima di metterli nella capsula di Petri. - Dopo 3 giorni, sostituire metà del surnatante con un terreno di coltura completo. Cambia il terreno di coltura ogni 2-3 giorni. Osservare i fibroblasti al microscopio con un ingrandimento 40x ogni giorno.
NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti delicatamente. Non spostare la capsula di Petri per 2 giorni dopo l'isolamento, poiché i pezzi di tessuto richiedono tempo per aderire alle piastre di Petri. - Quando i fibroblasti che crescono intorno ai pezzi di tessuto raggiungono circa il 90% di confluenza, rimuovere i pezzi di tessuto e il terreno di coltura. Lavare i fibroblasti con 1x PBS sterile e aggiungere 2 ml di soluzione sterile 1x tripsina-EDTA alle piastre. Incubare le cellule per circa ~3-5 minuti a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 . Picchiettare delicatamente il piatto di coltura e osservarlo al microscopio. Quando la maggior parte delle cellule si stacca dalla piastra, aggiungere 2 ml di mezzo completo per terminare il processo di digestione.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 mL e centrifugare la provetta a 300 × g per 3 minuti a temperatura ambiente. Scartare attentamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo completo. Seminare i fibroblasti in un piatto di coltura cellulare di 9 cm e incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 .
5. Manutenzione e conservazione
- Circa 3-4 giorni dopo, quando i fibroblasti sono cresciuti fino all'80% di confluenza, ripetere i passaggi 4,2-4,4 e far passare i fibroblasti con un rapporto di 1:3. Utilizzare i fibroblasti di passaggio per ulteriori esperimenti.
NOTA: La coltura di fibroblasti deve essere interrotta dopo 10 passaggi, perché le cellule possono iniziare a mostrare caratteristiche modificate rispetto alle cellule originali. - Crioconservare le cellule passate di P1-P3 in azoto liquido per un ulteriore utilizzo.
- Ripetere i passaggi 4.2-4.3. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da centrifuga da 15 mL e centrifugare la provetta per 3 minuti a 300 × g. Scartare il surnatante con attenzione, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo di congelamento cellulare contenente il 90% di FBS e il 10% di DMSO e trasferire la sospensione nei criotubi cellulari.
- Spostare le celle in una scatola congelata, quindi mettere la scatola congelata in un congelatore a -80 °C. Dopo 1 giorno, trasferire le cellule in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
6. Identificazione dei fibroblasti mediante colorazione con immunofluorescenza
- Posizionare i vetrini rotondi in una piastra a 24 pozzetti e coltivare i fibroblasti passaggi ad una concentrazione di 1 × 104 cellule / pozzetto. Quando i fibroblasti raggiungono il 60% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura. Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% per fissare i fibroblasti per 20 minuti a temperatura ambiente e lavare 3 volte con PBS per 1 minuto ogni volta.
NOTA: Contare il numero di cellule utilizzando un vetrino emocitometrico al microscopio o un contatore automatico delle cellule. - Rimuovere il PBS, incubare con Triton X-100 allo 0,5% per 20 minuti per la permeabilizzazione delle membrane cellulari, quindi lavare 3 volte con PBS per 1 minuto ogni volta. Aggiungere PBS con albumina sierica bovina allo 0,5% e immergere per 30 minuti. Quindi, rimuoverlo e aggiungere l'anticorpo PDGFR-α/vimentina diluito nel diluente anticorpale a 1:1.000. Incubare per una notte a 4 °C.
- Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo primario, lavare le cellule 3 volte con PBS per 3 minuti e aggiungere l'anticorpo secondario Alexa Fluor-555 capra anti-coniglio IgG diluito con diluente anticorpale a 1:200 per immergere per 1 ora.
- Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare le cellule 3 volte con PBS. Estrarre i vetrini rotondi con una pinza, metterli su vetrini e aggiungere 50 μL di soluzione di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) da 5 μg/mL per colorare i nuclei cellulari. Conservare i campioni in una scatola umida e buia e osservarli al microscopio a fluorescenza confocale laser.
NOTA: Aggiungere un gruppo di controllo negativo senza un anticorpo primario ma con un anticorpo secondario per escludere la colorazione non specifica.
7. Identificazione di fibroblasti mediante citometria a flusso
- Raccogliere il pellet cellulare in una provetta sterile da centrifuga da 1,5 ml e risospendere con 50 μL di PBS contenente FBS all'1%. Incubare con anti-CD90 per 30 minuti al buio e aggiungere un controllo isotipo anti-IgG al gruppo di controllo. Quindi, aggiungere 200 μL di PBS contenente l'1% di FBS e centrifugare la provetta per 10 minuti a 300 × g a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 μL di PBS contenente l'1% di FBS. Risospendere e filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare (70 mesh). Aggiungere una soluzione madre da 5 μg/mL di DAPI a 1:100 al filtrato, quindi acquisire i risultati mediante citometria a flusso. Impostare lo scatter in avanti (FSC) come ascissa e lo scatter laterale (SSC) come ordinata e cerchiare la popolazione cellulare principale. Selezionare la popolazione cellulare e impostare la ficoeritrina come ascissa e il conteggio come ordinata per l'analisi.
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Representative Results
La sequenza temporale del protocollo è riassunta nella Figura 1A. Alcune immagini rappresentative del processo di isolamento sono mostrate nella Figura 2; l'epidermide e gli strati adiposi sono stati accuratamente rimossi e lo strato del derma è stato separato in piccoli frammenti di 3-4 mm2, che sono stati inoculati nelle piastre di Petri.
Come mostrato nella Figura 3A, diverse escrescenze di fibroblasti dei pezzi di tessuto sono state osservate al microscopio 5 giorni dopo l'elaborazione. Come mostrato nella Figura 3B, i fibroblasti hanno mostrato alti tassi di proliferazione e hanno raggiunto un alto livello di confluenza dopo 10 giorni. Questi fibroblasti avevano corpi cellulari allungati simili a fusi ed erano allineati in fasci quando raggiungevano un alto livello di confluenza. Seguendo questo protocollo, i fibroblasti sono stati fatti passare ed espansi alla quantità desiderata entro 2-3 settimane.
Per verificare l'identità e la purezza dei fibroblasti, è stato utilizzato un test di colorazione con immunofluorescenza per rilevare i marcatori specifici dei fibroblasti PDGFRα10 e vimentina. Come previsto, la Figura 4A e la Figura 4C mostrano che tutti i fibroblasti sono stati colorati positivamente dall'anticorpo PDGFRα/vimentina, con immunofluorescenza rossa e immunofluorescenza blu nel nucleo cellulare. Come dimostrato nella Figura 4C, il test di citometria a flusso ha anche mostrato positività CD90 in quasi tutti i fibroblasti.
Figura 1: Panoramica della procedura di isolamento e coltura dei fibroblasti cheloidi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative dell'isolamento e della coltura di fibroblasti da tessuti cheloidi . (A) Lavare il tessuto. (B) Rimuovere l'epidermide e gli strati adiposi. (C) Sezionare il derma in 3-4 mm3 pezzi e lavare nuovamente con PBS. (D) Porre i frammenti di tessuto in una capsula di Petri. (E) Mettere le piastre di Petri capovolte nell'incubatore al 5% di CO2 a 37 °C per 30-60 minuti per lasciare asciugare un po' i pezzi di tessuto e attaccarli alla capsula di Petri. (F) Aggiungere terreno di coltura completo nella capsula di Petri e coltura nell'incubatore cellulare contenente CO2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative delle escrescenze dei fibroblasti dai pezzi di tessuto cheloide. (A) Escrescenze di fibroblasti dai pezzi di tessuto in ~ 5 giorni. (B) I fibroblasti hanno raggiunto un alto livello di confluenza in ~ 10 giorni. Barre di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Identificazione di fibroblasti altamente purificati mediante colorazione a immunofluorescenza e citometria a flusso. (A) Colorazione a immunofluorescenza dei fibroblasti mediante anti-PDGFRα. (B) Gruppo di controllo negativo senza l'anticorpo primario per PDGFRα. (C) Colorazione immunofluorescenza dei fibroblasti mediante antivimentina. (D) Gruppo di controllo negativo senza l'anticorpo primario per vimentina. (E) Analisi citometrica a flusso dei fibroblasti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Ottenere fibroblasti primari dai tessuti cheloidi è una base fondamentale per ulteriori ricerche. Fino ad ora, ci sono stati due metodi per acquisire fibroblasti primari: digestione enzimatica e coltura di espianti11,12,13,14. Tuttavia, entrambi i metodi tradizionali hanno limiti, come la suscettibilità alla contaminazione, la miscelazione con altri tipi di cellule, un lungo periodo di coltura e un basso tasso di successo15,16. Questo studio ha descritto un metodo ottimizzato e fornito istruzioni chiare per risolvere queste sfide esistenti e aumentare le possibilità di successo per l'isolamento e la coltura dei fibroblasti cheloidi.
La possibilità di contaminazione microbica è uno dei maggiori problemi nell'ottenere fibroblasti primari. Tutte le apparecchiature e le soluzioni devono essere sterilizzate e le tecniche asettiche standard devono essere implementate durante tutte le fasi del protocollo. Il protocollo contiene promemoria per rimanere asettici per ridurre il rischio di contaminazione. Il primo passo critico è il processo di isolamento; lo scopo di immergere i tessuti in PBS integrato con PSA all'1% e lavarli più volte è quello di rimuovere i microbi esistenti e le macchie di sangue residue. Per prevenire il possibile trasferimento di contaminazione, è necessario preparare un paio extra di forbici e pinze sterilizzate; Questi strumenti potrebbero essere sostituiti da quelli inutilizzati nella prossima operazione. Inoltre, il PSA viene aggiunto al terreno di coltura per prevenire la crescita di microbi. Test periodici per il micoplasma durante l'isolamento e la successiva coltura dei fibroblasti cheloidi devono essere incorporati nel protocollo. Attraverso questi processi, la possibilità di contaminazione microbica può essere significativamente ridotta.
L'altra sfida è mescolarsi con altri tipi di cellule, come i cheratinociti. Questo tipo di cellula ha anche un'intensa capacità proliferativa, che lo rende difficile da rimuovere. La purezza dei fibroblasti dipende fortemente dal processo di isolamento; L'epidermide e gli strati adiposi devono essere completamente rimossi per evitare di mescolarsi con altre cellule. PDGFR-α è un marcatore specifico dei fibroblasti espresso nella membrana e nel citoplasma dei fibroblasti10,17,18. CD90 e vimentina sono anche marcatori mesenchimali specifici che sono specificamente espressi nelle membrane dei fibroblasti 19,20,21. Il test di colorazione con immunofluorescenza in questo lavoro ha mostrato che tutte le cellule esprimevano positivamente PDGFR-α e vimentina. Il test di citometria a flusso ha anche dimostrato direttamente la positività CD90 in quasi tutti i fibroblasti e una maggiore positività CD90 rispetto al controllo isotipo, confermando così che abbiamo ottenuto fibroblasti di purezza relativamente elevata utilizzando questo protocollo.
I passaggi cruciali raccomandati per promuovere la crescita e migliorare l'efficienza proliferativa dei fibroblasti sono i seguenti. In primo luogo, i pezzi di tessuto dovrebbero essere tagliati in dimensioni appropriate di 3-5 mm2, poiché i pezzi di tessuto più piccoli hanno maggiori probabilità di galleggiare durante il movimento della piastra di Petri e le cellule non supereranno facilmente i pezzi più grandi. In secondo luogo, il primo cambiamento del mezzo dovrebbe essere dopo il terzo giorno, poiché i pezzi di tessuto impiegano tempo per aderire alle piastre di Petri. Spostare le piastre di Petri troppo presto tende a disturbare i tessuti e diminuire la possibilità di escrescenza dei fibroblasti. In terzo luogo, tutti i passaggi di questo protocollo dovrebbero essere condotti delicatamente; Una manipolazione impropria causerà movimenti non necessari dei pezzi di tessuto e comprometterà la crescita cellulare.
I fibroblasti sono una popolazione cellulare morfologicamente e funzionalmente eterogenea che può essere suddivisa in diverse sottopopolazioni. Una limitazione di questo studio è che possiamo ottenere fibroblasti generali dall'intero tessuto cheloide, ma non dalle diverse sottopopolazioni di fibroblasti. Stiamo cercando di trovare metodi migliori per risolvere questo problema in futuro.
Come dimostrato nei nostri precedenti studi da RNA-seq, ci sono molte differenze tra fibroblasti cheloidi e fibroblasti normali. I fibroblasti cheloidi producono più collagene I e collagene III. Inoltre, i fibroblasti cheloidi esprimono marcatori specifici come POSTN, tra gli altri. Dopo il passaggio, i fibroblasti mantengono ancora queste caratteristiche, il che dimostra che i fibroblasti primari potrebbero anche mostrare alcune caratteristiche riscontrate nei pazienti cheloidi.
In conclusione, questo studio fornisce un metodo ottimizzato e fornisce istruzioni chiare per risolvere le difficoltà esistenti nell'estrazione dei fibroblasti cheloidi, come la contaminazione microbica, la miscelazione con altri tipi di cellule e il lungo periodo di coltura, e per aumentare le possibilità di successo. Il lavoro attuale fornisce un metodo semplice e riproducibile per isolare e coltivare fibroblasti primari cheloidi, che fornirà una ricca risorsa per studi e ricerche futuri o potrebbe essere congelato in azoto liquido per la banca.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzioni 81903189 e 82073418) e della Science and Technology Foundation di Guangzhou (numero di sovvenzione 202102020025).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| 15 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% polyformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | Cell fixation |
| 50 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8081 | Put keloid tissue |
| Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG | Abcam | Alexa Fluor 555 | second antibody for immunofluorescence staining assay |
| Anti human CD90 | BioLegend | B301002 | Identify the purity of fibroblasts |
| Antibody diluent | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 series A2 | Isolation and culture cells |
| Bovine serum albumin | aladdin | B265993 | Blocking for immunofluorescence staining assay |
| Carbon dioxide incubator | ESCO | CCL-170B-8 | Using for culturing cells |
| Cell cryotubes | Corning | 43513 | Store the cells in low temperature |
| centrifugal machine | Thermo Fisher | ST 16R | Discard supernatant |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | Stain the cellular nucleus |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Using for preserving cells |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | C11995500BT | Culture medium solution |
| Fetal bovine serum | BI | 04-001-1A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCelesta | Observing the identity of cells |
| frozen box | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Laser confocal microscope | Nikon | AIR-HD25 | Observing the immunofluorescence staining assay |
| PDGFR-α antibody | CST | 3174T | First antibody for immunofluorescence staining assay |
| Penicillin-streptomycin-Am solution | Solarbio | P1410 | Add in culture medium solution to avoid contamination |
| petri dish | JETBIOFIL | 7556 | Culture fibroblasts |
| Phosphate buffered saline solution | Gibco | C10010500BT | Culture medium solution |
| Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE) | Cell Signaling Technology | 5742S | As a control for flow cytometry |
| Round coverslip | Biosharp | 801007 | Cell culture |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Punch holes in the cell membrane |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Used for passaging cells |
| Vimentin antibody | Abcam | ab8978 | First antibody for immunofluorescence staining assay |
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