Summary
この研究では、ケロイド組織から初代線維芽細胞を確立するための最適化されたプロトコルについて説明します 純粋で生存可能な線維芽細胞を効果的かつ着実に提供できます。
Abstract
ケロイド組織の主要な細胞型である線維芽細胞は、ケロイドの形成と発達に不可欠な役割を果たします。ケロイド組織に由来する初代線維芽細胞の単離と培養は、ケロイドの生物学的機能と分子メカニズム、およびそれらを治療するための新しい治療戦略のさらなる研究の基礎となります。初代線維芽細胞を得るための従来の方法には、細胞状態の悪さ、他の種類の細胞との混合、汚染に対する感受性などの制限があります。この論文では、線維芽細胞を取得する際に起こりうる問題の発生を減らすことができる、最適化され、簡単に再現できるプロトコルについて説明します。このプロトコルでは、線維芽細胞は単離後5日で観察され、10日間の培養後にほぼ80%のコンフルエントに達することができます。次に、線維芽細胞を継代し、免疫蛍光アッセイ用のPDGFRαおよびビメンチン抗体およびフローサイトメトリー用のCD90抗体を使用して検証します。結論として、ケロイド組織からの線維芽細胞は、このプロトコルを介して容易に取得することができ、ケロイド研究のための実験室で豊富で安定した細胞源を提供することができます。
Introduction
線維増殖性疾患であるケロイドは、プラークの継続的な成長として現れ、多くの場合、自己制限なしに周囲の正常な皮膚に侵入し、患者にさまざまな程度のかゆみ、痛み、美容的および心理的負担を引き起こします1。ケロイドに関与する初代細胞である線維芽細胞は、過剰な増殖、冗長な細胞外マトリックス産生、および無秩序なコラーゲンを通じて、この病気の形成と発症に不可欠な役割を果たします2,3。しかし、根底にある病因は不明であり、ケロイドの効果的な治療法はまだ不足しています。したがって、さらなる研究が急務です4,5。
in vivoでのケロイド研究に理想的な動物モデルがないため6,7,ケロイド組織から初代線維芽細胞を取得してin vitroモデルを構築することで、ケロイド研究の実現可能性と信頼性を提供できます2,6。初代細胞は生体組織から直接誘導される細胞であり、これらの細胞は細胞株と比較して複数の個体の生理学的状態および遺伝的背景により近いことが一般に認識されている8,9。初代細胞の培養は、細胞の成長と代謝、およびその他の細胞表現型を研究するための強力な手段を提供します。
現在、初代線維芽細胞を獲得するための2つの方法がある:酵素消化および外植片培養。しかし、初代線維芽細胞を得るには、さまざまな細菌や真菌による汚染のリスク、除去が容易ではない他の種類の細胞との混合、培養サイクルの長い期間、その後の元の細胞と比較した細胞特性の変化など、いくつかの障害が確認されています9.したがって、初代線維芽細胞を得るための実行可能で効果的なプロセスを開発することは、さらなる研究と応用の基礎となります。この研究では、ケロイド組織から初代線維芽細胞を抽出するための最適化されたプロトコルについて説明します 純粋で生存可能な線維芽細胞を効果的かつ着実に提供できます。
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Protocol
この研究は、南部医科大学皮膚科病院の治験審査委員会によって承認されました(2020081)。個人から組織を採取する前に、インフォームド患者の同意を得た。
1. 事前準備
注意: 次の手順は、生物学的安全キャビネットの下の無菌環境で実行する必要があります。
- 高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB溶液(PSA)を加えて、完全な培地を調製します。
- 1%PSAを1x PBSに添加することにより、PSAを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。1x PBSに1%FBSを加えて、FBSでPBSを調製します。
- オートクレーブ滅菌したハサミ、鉗子、メスをいくつか用意します。
2.除去した組織の入手
- 手術によってケロイド患者から組織を取得します。新鮮なケロイド組織を滅菌梱包袋または滅菌遠心チューブに収集し、できるだけ早く実験室の生物学的安全キャビネットに移します。
注:このプロトコルでは、獲得されたケロイド組織のサイズは約~20 x 20 x 10 mm3であり、サイズは手術によって異なる場合があります。
3.分離
- 滅菌ピンセットを使用してケロイド組織を取り出し、1%PSAを含む10〜25 mLのPBSを含む50 mLの滅菌遠心チューブに10分間入れます。次に、6ウェルプレートを調製し、1%PSAを添加した4mLのPBSを各ウェルに添加する。滅菌したピンセットを使用してティッシュを取り出し、1%PSAを添加したPBSで2回洗浄します。滅菌鉗子を使用して、組織をあるウェルから次のウェルに順次移します。
- 外科用ハサミや手術用メスを使って脂肪層や表皮層を取り除き、真皮層はそのままにしておきます。真皮層をハサミで3〜5 mm2 個にトリミングして解剖し、滅菌鉗子を使用してこれらの断片を次のウェルに移し、1%PSA溶液を含むPBSで再度洗浄します。
4. 文化
- 滅菌鉗子を使用して真皮組織片をペトリ皿に入れます。ピースの数が10〜30で、各ピース間の距離が>5mmであることを確認します。ペトリ皿を逆さまにして、5°Cの37%CO2 インキュベーターに、組織片が少し乾いてペトリ皿にくっつくまで30〜60分間入れます。次に、10%FBSおよび1%PSAを添加したDMEMを添加し、ペトリ皿を37°Cの5%CO2 インキュベーターに注意深く入れます。
注:線維芽細胞は、形態学的および機能的に不均一な細胞集団です。この複雑さを考慮すると、分離と培養のステップは注意して実行する必要があります。ケロイド真皮組織片を均等に選択し、これらの片をよく混ぜてからペトリ皿に入れます。 - 3日後、上清の半分を完全培養液と交換する。2〜3日ごとに培地を交換してください。毎日40倍の倍率で顕微鏡で線維芽細胞を観察します。
注意: すべての手順は穏やかに実行する必要があります。組織片がペトリ皿に付着するのに時間がかかるため、分離後2日間ペトリ皿を動かさないでください。 - 組織片の周囲で増殖する線維芽細胞が約90%のコンフルエントに達したら、組織片と培地を取り除きます。線維芽細胞を滅菌1x PBSで洗浄し、滅菌1x トリプシン-EDTA溶液2 mLをプレートに加えます。加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cで約3~5分間細胞をインキュベートします。培養皿を軽くたたき、顕微鏡で観察します。細胞の大部分がプレートから剥離したら、2 mLの完全培地を加えて消化プロセスを終了します。
- 細胞懸濁液を15 mL滅菌遠心チューブに移し、チューブを300 × g で室温で3分間遠心分離します。上清を注意深く廃棄し、細胞ペレットを完全培地に再懸濁する。線維芽細胞を9cmの細胞培養皿に播種し、加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cでインキュベートする。
5. 維持・保全
- 約3〜4日後、線維芽細胞が80%コンフルエントに成長したら、ステップ4.2〜4.4を繰り返し、線維芽細胞を1:3の比率で継代します。継代した線維芽細胞をさらなる実験に使用します。
注:線維芽細胞培養は、細胞が元の細胞と比較して変化した特性を示し始める可能性があるため、10回の継代後に停止する必要があります。 - P1-P3の継代細胞を液体窒素中で凍結保存し、さらに使用します。
- 手順4.2〜4.3を繰り返します。細胞懸濁液を15 mL滅菌遠心チューブに移し、チューブを300 × gで3分間遠心分離します。上清を注意深く廃棄し、90%FBSおよび10%DMSOを含む1 mLの細胞凍結培地に細胞ペレットを再懸濁し、懸濁液を細胞クライオチューブに移します。
- 細胞を冷凍ボックスに移し、凍結ボックスを-80°Cの冷凍庫に入れます。1日後、長期保存のために細胞を液体窒素に移します。
6. 免疫蛍光染色による線維芽細胞の同定
- 丸いカバーガラスを24ウェルプレートに入れ、継代した線維芽細胞を1 ×10 4 細胞/ウェルの濃度で培養します。線維芽細胞が60%コンフルエントに達したら、培養液を除去します。1 mLの4%パラホルムアルデヒドを加えて線維芽細胞を室温で20分間固定し、毎回PBSで3回1分間洗浄します。
注:顕微鏡下で血球計算盤のスライドまたは自動セルカウンターを使用して細胞数を数えます。 - PBSを除去し、細胞膜の透過処理のために0.5%Triton X-100で20分間インキュベートした後、毎回1分間PBSで3回洗浄します。0.5%ウシ血清アルブミンを含むPBSを加え、30分間浸します。その後、それを取り出し、抗体希釈液で1:1,000に希釈したPDGFR-α/ビメンチン抗体を添加します。4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、一次抗体を除去し、細胞をPBSで3倍3分間洗浄し、抗体希釈液で希釈した二次抗体Alexa Fluor-555ヤギ抗ウサギIgGを1:200で添加して1時間浸漬した。
- 二次抗体を除去し、細胞をPBSで3倍洗浄した。鉗子を使用して丸いカバーガラスを取り出し、スライドガラスに置き、50 μLの5 μg/mL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)溶液を加えて細胞核を染色します。サンプルを湿った暗い箱に入れ、レーザー共焦点蛍光顕微鏡で観察します。
注:非特異的染色を除外するために、一次抗体がなく二次抗体を含む陰性対照群を追加します。
7. フローサイトメトリーによる線維芽細胞の同定
- 細胞ペレットを1.5 mL滅菌遠心チューブに回収し、1%FBSを含む50 μLのPBSで再懸濁します。暗所で抗CD90と30分間インキュベートし、抗IgGアイソタイプコントロールを対照群に追加します。次に、1%FBSを含むPBSを200 μL加え、チューブを300 × g 、4°Cで10分間遠心分離します。
- 上清を除去し、1%FBSを含むPBSを200μL加えます。懸濁液を再懸濁し、セルストレーナー(70メッシュ)でろ過します。DAPIの5 μg/mLストック溶液を1:100でろ液に加え、フローサイトメトリーで結果を取得します。前方散乱(FSC)を横軸、側方散乱(SSC)を縦軸として設定し、主細胞集団を円で囲みます。細胞集団を選択し、フィコエリスリンを横軸として設定し、カウントを分析の縦軸として設定します。
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Representative Results
プロトコルのタイムラインを 図1Aにまとめます。分離プロセスの代表的な画像を 図2に示します。表皮層および脂肪層を注意深く除去し、真皮層を3〜4mm2の小さな断片に分離し、それらをペトリ皿に接種した。
図3Aに示すように、組織片のいくつかの線維芽細胞伸長物は、処理後5日目に顕微鏡下で観察された。図3Bに示すように、線維芽細胞は高い増殖率を示し、10日後に高レベルのコンフルエントに達した。これらの線維芽細胞は細長い紡錘状の細胞体を有し、高レベルのコンフルエントに達すると束状に整列した。このプロトコルに従うことにより、線維芽細胞を継代し、2〜3週間以内に所望の量に拡大した。
線維芽細胞の同一性および純度を検証するために、線維芽細胞特異的マーカーPDGFRα10およびビメンチンを検出するために免疫蛍光染色アッセイを用いた。予想通り、図4Aおよび図4Cは、すべての線維芽細胞がPDGFRα/ビメンチン抗体によって陽性に染色され、細胞核に赤色の免疫蛍光および青色の免疫蛍光が認められたことを示している。 図4Cで実証されるように、フローサイトメトリーアッセイはまた、ほとんどすべての線維芽細胞においてCD90陽性を示した。
図1:ケロイド線維芽細胞の単離および培養手順の概要。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ケロイド組織からの線維芽細胞の単離および培養の代表的な画像 。 (A)組織を洗います。(B)表皮層と脂肪層を取り除きます。(C)真皮を3〜4mm3 個に解剖し、再度PBSで洗浄する。(D)組織片をシャーレに入れます。(E)ペトリ皿を逆さまにして5%CO2 インキュベーターに37°Cで30〜60分間入れ、組織片を少し乾かしてペトリ皿に貼り付けます。(f)完全培養液をシャーレに加え、CO2含有セルインキュベーター内で培養する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ケロイド組織片からの線維芽細胞伸長の代表的な画像 。 (A)~5日で組織片から線維芽細胞が増殖する。(B)線維芽細胞は~10日で高レベルのコンフルエントに達した。スケールバー = 200 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーによる高度に精製された線維芽細胞の同定 。 (A)抗PDGFRαによる線維芽細胞の免疫蛍光染色。(B)PDGFRαに対する一次抗体を含まない陰性対照群。(c)抗ビメンチンによる線維芽細胞の免疫蛍光染色。(d)ビメンチンに対する一次抗体を含まない陰性対照群。(e)線維芽細胞のフローサイトメトリー解析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ケロイド組織から初代線維芽細胞を得ることは、さらなる研究のための重要な基盤です。これまで、初代線維芽細胞を獲得するには、酵素消化と外植片培養の2つの方法がありました11、12、13、14。ただし、どちらの従来の方法にも、汚染に対する感受性、他の種類の細胞との混合、長い培養期間、成功率の低さなどの制限があります15,16。この研究では、最適化された方法を説明し、これらの既存の課題を解決し、ケロイド線維芽細胞の分離と培養の成功の可能性を高めるための明確な指示を提供しました。
微生物汚染の可能性は、一次線維芽細胞を得る際の主要な問題の1つです。すべての機器と溶液を滅菌し、プロトコルのすべてのステップで標準的な無菌技術を実装する必要があります。プロトコルには、汚染のリスクを減らすために無菌状態を維持するためのリマインダーが含まれています。最初の重要なステップは分離プロセスです。1%PSAを添加したPBSに組織を浸し、数回洗浄する目的は、既存の微生物と残留血痕を除去することです。汚染の可能性のある移動を防ぐために、滅菌されたはさみと鉗子の追加のペアを準備する必要があります。これらの機器は、次の操作で未使用の機器と交換できます。さらに、微生物の増殖を防ぐためにPSAが培地に添加されます。ケロイド線維芽細胞の単離およびその後の培養中のマイコプラズマの定期的な検査は、プロトコルに組み込む必要があります。これらのプロセスにより、微生物汚染の可能性を大幅に減らすことができます。
他の課題は、ケラチノサイトなどの他の種類の細胞との混合です。この細胞型はまた、強力な増殖能力を有し、除去を困難にする。線維芽細胞の純度は単離プロセスに大きく依存します。表皮層と脂肪層は、他の細胞との混合を避けるために完全に除去する必要があります。PDGFR-αは、線維芽細胞の膜および細胞質に発現する線維芽細胞特異的マーカーである10、17、18。CD90およびビメンチンはまた、線維芽細胞の膜において特異的に発現される特異的間葉系マーカーである19、20、21。この研究における免疫蛍光染色アッセイは、すべての細胞がPDGFR-αおよびビメンチンを陽性に発現したことを示した。フローサイトメトリーアッセイでは、ほぼすべての線維芽細胞でCD90陽性が直接示され、アイソタイプコントロールと比較してCD90陽性が高いことが確認されたため、このプロトコルを使用して比較的高純度の線維芽細胞が得られました。
線維芽細胞の伸長を促進し、増殖効率を高めるための重要な推奨ステップは次のとおりです。第一に、小さい組織片はペトリ皿の移動中に浮遊する可能性が高く、細胞は大きな片を容易に成長させないため、組織片は3〜5 mm2の適切なサイズに切断する必要があります。第二に、組織片がペトリ皿に付着するのに時間がかかるため、最初の培地交換は3日目以降に行う必要があります。ペトリ皿を早すぎると、組織が乱れ、線維芽細胞の成長の可能性が低下する傾向があります。第三に、このプロトコルのすべてのステップは穏やかに実施されるべきです。不適切な取り扱いは、組織片の不必要な動きを引き起こし、細胞の成長を損ないます。
線維芽細胞は、形態学的および機能的に不均一な細胞集団であり、いくつかの亜集団に分けることができます。この研究の1つの制限は、ケロイド組織全体から一般的な線維芽細胞を得ることができるが、線維芽細胞の異なる亜集団は得られないことである。将来的には、この問題を解決するためのより良い方法を見つけようとしています。
RNA-seqによる先行研究で実証されているように、ケロイド線維芽細胞と正常線維芽細胞には多くの違いがあります。ケロイド線維芽細胞は、より多くのコラーゲンIおよびコラーゲンIIIを産生する。さらに、ケロイド線維芽細胞は、とりわけPOSTNなどの特異的マーカーを発現します。継代後も線維芽細胞はこれらの特徴を維持しており、これは一次線維芽細胞がケロイド患者に見られるいくつかの特徴も示す可能性があることを証明しています。
結論として、この研究は、微生物汚染、他の細胞タイプとの混合、長い培養期間など、ケロイド線維芽細胞抽出の既存の困難を解決し、成功の可能性を高めるための最適化された方法を提供し、明確な指示を提供します。現在の研究は、ケロイド初代線維芽細胞を単離および培養するための簡単で再現性のある方法を提供し、将来の研究および研究のための豊富なリソースを提供するか、バンク用に液体窒素で凍結する可能性があります。
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Disclosures
宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号81903189および82073418)および広州科学技術財団(助成金番号202102020025)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| 15 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% polyformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | Cell fixation |
| 50 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8081 | Put keloid tissue |
| Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG | Abcam | Alexa Fluor 555 | second antibody for immunofluorescence staining assay |
| Anti human CD90 | BioLegend | B301002 | Identify the purity of fibroblasts |
| Antibody diluent | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 series A2 | Isolation and culture cells |
| Bovine serum albumin | aladdin | B265993 | Blocking for immunofluorescence staining assay |
| Carbon dioxide incubator | ESCO | CCL-170B-8 | Using for culturing cells |
| Cell cryotubes | Corning | 43513 | Store the cells in low temperature |
| centrifugal machine | Thermo Fisher | ST 16R | Discard supernatant |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | Stain the cellular nucleus |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Using for preserving cells |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | C11995500BT | Culture medium solution |
| Fetal bovine serum | BI | 04-001-1A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCelesta | Observing the identity of cells |
| frozen box | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Laser confocal microscope | Nikon | AIR-HD25 | Observing the immunofluorescence staining assay |
| PDGFR-α antibody | CST | 3174T | First antibody for immunofluorescence staining assay |
| Penicillin-streptomycin-Am solution | Solarbio | P1410 | Add in culture medium solution to avoid contamination |
| petri dish | JETBIOFIL | 7556 | Culture fibroblasts |
| Phosphate buffered saline solution | Gibco | C10010500BT | Culture medium solution |
| Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE) | Cell Signaling Technology | 5742S | As a control for flow cytometry |
| Round coverslip | Biosharp | 801007 | Cell culture |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Punch holes in the cell membrane |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Used for passaging cells |
| Vimentin antibody | Abcam | ab8978 | First antibody for immunofluorescence staining assay |
References
- Zhu, Y. Q., et al. Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes. Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883 (2022).
- Feng, F., et al. Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 13, 906212 (2022).
- Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).
- Wang, W., et al. Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid. Frontiers in Medicine. 9, 1043840 (2022).
- Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic. British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).
- Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models. Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).
- Supp, D. M. Animal models for studies of keloid scarring. Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).
- Künzel, S. R., et al. Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59858 (2019).
- He, Y., et al. An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics. Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).
- Philippeos, C., et al. Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
- Li, L., et al. Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition. Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733 (2022).
- Zhou, B. Y., et al. Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).
- Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway. Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).
- Sato, C., et al. Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).
- Li, J., et al. Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts. Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).
- Wang, Q., et al. Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia. Redox Biology. 38, 101815 (2021).
- Fan, C., et al. Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts. Frontiers in Genetics. 13, 798331 (2022).
- Yao, L., et al. Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing. Cell Reports. 40 (7), 111192 (2022).
- Domdey, M., et al. Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium. Stem Cell Research. 40, 102936 (2022).
- Lin, Z., et al. Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease. FASEB Journal. 36 (12), e22625 (2022).
- Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).
