Live billeddannelse af arabidopsis pollenrørmodtagelse og dobbelt befrugtning ved hjælp af semi-in vitro cum septummetoden

Summary

Her beskriver vi en forbedring af semi-in vitro (SIV) metoden til observation af pollenrørsvejledning og modtagelse i Arabidopsis thaliana, hvilket øger ægløsningens modtagelighed. High-throughput SIV cum septum-metoden kan kobles med gametofytmarkørlinjer og genetisk kodede biosensorer for at overvåge den dynamiske befrugtningsproces.

Abstract

I blomstrende planter er vækst og vejledning af pollenrøret (mandlig gametofyt) i støvlen og modtagelse af pollenrøret af den kvindelige gametofyt afgørende for dobbelt befrugtning og efterfølgende frøudvikling. Interaktionerne mellem mandlige og kvindelige gametofytter under pollenrørmodtagelse kulminerer i pollenrørbrud og frigivelse af to sædceller for at opnå dobbelt befrugtning. Da pollenrørvækst og dobbelt befrugtning er dybt skjult i blomstens væv, er denne proces vanskelig at observere in vivo.

En semi-in vitro (SIV) metode til levende celle billeddannelse af befrugtning i modelplanten Arabidopsis thaliana er blevet udviklet og implementeret i flere undersøgelser. Disse undersøgelser har bidraget til at belyse de grundlæggende træk ved, hvordan befrugtningsprocessen forekommer i blomstrende planter, og hvilke cellulære og molekylære ændringer der opstår under interaktionen mellem de mandlige og kvindelige gametofytter. Men fordi disse levende cellebilleddannelseseksperimenter involverer udskæring af individuelle ægceller, er de begrænset til et lavt antal observationer pr. Billeddannelsessession, hvilket gør denne tilgang kedelig og meget tidskrævende. Blandt andre tekniske vanskeligheder rapporteres ofte om pollenrørenes manglende evne til at befrugte æggene in vitro , hvilket alvorligt forvirrer sådanne analyser.

Her leveres en detaljeret videoprotokol til billeddannelse af pollenrørmodtagelse og befrugtning på en automatiseret og høj gennemstrømningsmåde, hvilket giver mulighed for op til 40 observationer af pollenrørmodtagelse og brud pr. Billeddannelsessession. Sammen med brugen af genetisk kodede biosensorer og markørlinjer muliggør denne metode generering af store prøvestørrelser med en reduceret tidsinvestering. Nuancer og kritiske punkter i teknikken, herunder blomsteriscenesættelse, dissektion, medium forberedelse og billeddannelse, er tydeligt detaljeret i videoformat for at lette fremtidig forskning om dynamikken i pollenrørstyring, modtagelse og dobbelt befrugtning.

Introduction

Genereringen af genetisk unikke afkom i seksuelt reproducerende organismer er afhængig af en vellykket fusion af mandlige og kvindelige kønsceller. I blomstrende planter afhænger interaktionen mellem to mandlige gameter (sædceller) med to kvindelige gameter (ægcelle og central celle) under dobbeltbefrugtning af sædfrigivelse fra pollenrøret (den mandlige gametofyt). Denne proces, kaldet pollenrørsmodtagelse, styres stort set af de synergiceller, der befinder sig i embryosækken (den kvindelige gametofyt)^1,2. Da pollenrørsmodtagelse finder sted dybt inde i blomsten, er der etableret en metode, der muliggør levende cellebilleddannelse af processen, kaldet semi-in vitro (SIV) pollenrørmodtagelse³. Med denne metode placeres udskårne Arabidopsis-ægløsninger på halvflydende pollenspiringsmedium og målrettes af pollenrør, der vokser gennem stigmatiseringen og stilen af en pistil afskåret ved det stiltransmitterende kanalkryds ^3,4. Siden udviklingen af denne teknik har detaljerede observationer ført til flere opdagelser omkring pollenrørsvejledning, modtagelse og befrugtning. Disse opdagelser omfatter blandt andet erhvervelse af pollenrørsmålretningskompetence ved vækst gennem stigma³, begyndelsen af intracellulære calciumoscillationer i synergiderne ved pollenrørsankomst 5,6,7,8,9 og dynamikken i sædcellefrigivelse og befrugtning ved pollenrørsudbrud ¹⁰ . Ikke desto mindre, fordi denne teknik er afhængig af udskæring af æg, er observationerne af befrugtning begrænset i antal, og pollenrørmodtagelse er ofte afvigende, hvilket resulterer i svigt i pollenrørbrud (Video 1 og supplerende fil 1). Derfor er der behov for en mere effektiv tilgang, der giver mulighed for analyser med høj kapacitet af pollenrørsmodtagelse og befrugtning.

Ved udviklingen af denne protokol blev flere nye tilgange til analyse af pollenrørmodtagelse, der spænder fra de mest "in vitro" til de mest "in vivo" -metoder, testet, og en effektiv teknik baseret på udskæring af hele septum blev afgjort, hvilket giver mulighed for op til 40 observationer af befrugtning om dagen. Her skitseres nuancerne og de kritiske punkter i teknikken, herunder blomsteriscenesættelse, dissektion, medium forberedelse og billeddannelsesindstillinger. Ved at følge denne protokol bør forskning med fokus på pollenrørsvejledning, pollenrørmodtagelse og dobbelt befrugtning lettes. De højere prøvestørrelser, som metoden giver mulighed for, forventes at styrke den videnskabelige soliditet af konklusionerne fra levende billeddannelseseksperimenter. De potentielle anvendelser af denne teknik omfatter, men er ikke begrænset til, udførelse af observationer af de molekylære og fysiologiske ændringer i cytosoliske calciumkoncentrationer ([Ca²⁺] _cyt), pH ellerH 2 O₂ under gametofytinteraktioner ved brug af genetisk kodede biosensorer. Desuden kan cytologiske ændringer, såsom degeneration af den modtagelige synergid, sædcellemigration eller karyogami, lettere observeres ved hjælp af denne forbedrede metode. Endelig kan timingen af de forskellige stadier af befrugtning overvåges under widefield mikroskopi, og derefter kan mere detaljerede analyser ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) eller to-foton excitationsmikroskopi (2PEM) udføres for højere opløsning og 3D-rekonstruktion.

Protocol

BEMÆRK: Se materialetabellen for en liste over materialer og udstyr, der anvendes i denne protokol.

1. Overvejelser i forbindelse med udformningen af billeddannelseseksperimentet

1. Forudbestemme billeddannelsens varighed og prøveudtagningsfrekvens, der kræves for at fange det ønskede fænomen, der skal observeres. For eksempel, ifølge Nyquists prøveudtagningssætning, skal prøveudtagningsfrekvensen være større end det dobbelte af den højeste frekvens af inputprøven. For nøjagtigt at fange synergistre [Ca²⁺] _{cytsvingninger} skal du derfor udføre billeddannelse ca. hver 10. s, men for at måle sædcellernes hastighed ved pollenrørsudladning skal du sikre en tidsmæssig opløsning på mindre end 1 s¹⁰.
2. Vælg fluorescerende markører for de celler af interesse, der er tilstrækkeligt lyse ud over baggrunden autofluorescens. Til brug af biosensorer skal du vælge de lyseste linjer, der ikke forstyrrer cellefunktionen, da de generelt er mere følsomme og kræver mindre eksponeringstid.
3. Overvej hvilken type fluorescensmikroskopi og forstørrelse der er bedst egnet til at fange det ønskede fænomen. Brug widefieldmikroskopi og målsætninger med lav forstørrelse til at fange lys fra en større dybdeskarphed, og hold fokus over tid, afbild større objekter, f.eks. hele ægarter, eller brug ratiometriske sensorer, der er følsomme over for kromatiske forskydningsartefakter. Brug CLSM eller 2PEM med høje forstørrelsesmål for bedre opløsning af cellulære og subcellulære objekter, men bemærk vanskeligheden ved at bevare fokus over tid.
4. Anslå antallet af prøver, der skal afbildes pr. Eksperiment. Brug f.eks. et 10x mål med en mindste prøvetagningstid på ~30 s til billeddannelse af tre septa og billeddannelse af op til 40 befrugtningshændelser pr. eksperiment på grund af den tid, der kræves til autofokus og flertrinserhvervelsesfunktioner.

2. Pollen spiring medium forberedelse

1. Der fremstilles flydende pollenspiringssubstrat (5mM_CaCl2, 1mM_MgSO4, 5mM KCl, 0,01% [w/v]_H3BO3 og 10% [w/v] saccharose) ved hjælp af 1 M alikvote stammer af hvert mikronæringsstof, som opbevares ved -20 °C. Juster pH til 7,5 med 0,1 M KOH. Opbevar mediet ved 4 °C i op til 2 uger.
   BEMÆRK: pH-værdien kan falde over tid.
2. Tilsæt 2,5 ml flydende medium til et 10 ml bægerglas, og tilsæt langsomt 32 mg agarose med ultralavt smeltepunkt (~ 1,3%) med en hurtigt roterende omrøringsstang for at undgå klumpning.
3. Smelt agarose på en kogeplade ved 65 °C, og mød bægerglasset for at opsamle kondens fra siderne.
4. Der pipetteres 130 μL medium ned i 14 mm hullet i en 35 mm glasbundskål, og skålen drejes, indtil mediet dækker hullet.
5. Opsug i alt 40 μL med en pipette fra midten af skålen, hvilket efterlader et samlet volumen på 90 μL.
   BEMÆRK: Mere medium kan suges ud af brønden for at opnå et lavere samlet volumen; Dette kan være nødvendigt for mål med høj forstørrelse med lave arbejdsafstande. Men jo tyndere agarpuden er, jo hurtigere tørrer den ud.
6. Afkøl skålen på en aluminiumsblok i et fugtighedskammer for at sikre jævn afkøling. Opbevar pladerne ved 4 °C natten over til brug næste morgen.

3. Blomsteriscenesættelse af septumdonorer, stigmadonorer og pollendonorer

Figur 1: Blomsteriscenesættelse af septumdonorer, stigmadonorer og pollendonorer. (A) Stadier af Arabidopsis blomster (Ler-0) inden for en blomsterstand. Knopper på stadium 12B, som har kronblade, der er ved at åbne og gule uhæmmende støvknapper, skal emasculeres ved at fjerne alle bægerblade, kronblade og støvdragere. Pistiller (der huser den kvindelige gametofytproducent) kan derefter bruges som septumdonorer 24 timer senere. (B) Stadier af Arabidopsis blomster (Col-0) inden for en blomsterstand. Knopper på stadium 12B, som har gule uhæmmende støvknapper og stigmas, der lige knap kommer ud af kronbladene, bør emaskuleres ved at fjerne alle bægerblade, kronblade og støvdragere. Pistillerne kan derefter bruges som stigmadonorer 24 timer senere, når de skal bestøves af blomster (der huser den mandlige gametofytmarkør), der er åbne og kaster pollen. Bestøvede stigmas bør dissekeres inden for 1 time efter bestøvning. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Morgenen før billeddannelse skal du vælge Arabidopsis-planter , der skal bruges som septumdonorer og stigmadonorer; Sørg for, at de er sunde og for nylig er begyndt at producere siliques.
   BEMÆRK: Landsberg erecta (L er-0) er en god tiltrædelse til brug som septumdonor, da dens septa er robust, og derer små internoder mellem æggene. Columbia (Col-0) er en god tiltrædelse at bruge som stigmadonor, fordi de synes at være befordrende for pollenrørvækst.
2. Emasculate mindst tre trin 12B septum donor blomster og 12 fase 12B stigma donor blomster ved at fjerne deres støvdragere, bægerblade og kronblade (figur 1A, B). Fjern også ældre blomster på samme blomsterstand, som potentielt kan bestøve den emaskulerede blomst.
3. Om morgenen, 24 timer senere, pollinere stigmadonorerne med pollendonorblomsterne (f.eks. Huser pollenrør eller sædcellemarkører), der let kaster pollen. Bestøvning er afsluttet, når stigmatiseringen næsten er helt dækket af pollen (figur 1B).

4. Septum dissektion

Figur 2: En hurtig guide til septum og stigmadissektion . (A) Trin af septum dissektion. Fastgør støvlen på dobbeltsidet tape med en insulinsprøjtenål, og lav snit ved stil-ovariekrydset og æggestokke-pedikelkrydset, efterfulgt af et lavt snit langs septum af enten carpel (trin 1). Skræl karpelvæggene tilbage på båndet (trin 2). Skær replum under den øverste septum (trin 3). Skær septum i stil, og fjern ved hjælp af tang ved pedicel (trin 4). Placer septum på agarmedier, og indlejr forsigtigt med tang. (B) Trin af stigmadissektion. Fastgør støvlen (bestøvet <1 time før) på dobbeltsidet tape, og skær ved stil-ovariekrydset med et barberblad (trin 6). Placer stigmatiseringen på agarmedium med en insulinnål ved siden af septumet, og juster afstanden til ca. 250 μm (trin 7-8). Sørg for, at der dannes en halvflydende pool omkring mikropylerne og bunden af stilarterne (trin 9). Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Tredive minutter efter bestøvning skal du samle sunde og modne septumdonorpistiller på pedicle og placere dem på frisk dobbeltsidet klæbebånd monteret på et glasglas, med stigmatiseringen klæbende lige ud for kanten af båndet.
   BEMÆRK: Begræns dissektionstiden, hvor pistillerne er på klæbebåndet for at sikre, at det er så kort som muligt. Dissektionen skal udføres ved høj luftfugtighed, hvilket kan opnås ved at placere en luftfugter ved siden af diaset.
2. Fastgør støvlen sikkert på båndet ved at trykke forsigtigt på pedicle og langs æggestokken ved hjælp af bagsiden af en ny insulinsprøjtenål, før du fjerner bægerblad, kronblad og støvdragere, der er tilbage fra emasculationen.
3. Under et stereoskop skal du bruge en insulinsprøjtenål til at lave to snit pr. Carpel ved stil-ovarie-krydset og æggestokke-pedicle-krydset, efterfulgt af overfladiske snit langs septum af hver carpel (figur 2, trin 1).
   BEMÆRK: Skæring for dybt langs septum vil adskille ægløsninger ved funiculus.
4. Træk omhyggeligt æggestokkens vægge tilbage på tapen (figur 2, trin 2), og skub nålen forsigtigt mellem de to septa for at skære replumen langs hele støvlens længde uden at forstyrre æggene (figur 2, trin 3).
   BEMÆRK: Skær replum i retning fra stilen til pedicle for at sikre, at æggene på øverste septum forstyrres så lidt som muligt.
5. Skær den øverste septum forsigtigt ved både krydset med stilen og med pedicle, og fjern septum med tang fra pediclesiden (figur 2, trin 4).
   BEMÆRK: Hold dette snit lige og blidt, så septum forbliver fladt og ikke kurver.
6. Placer septum så fladt som muligt på mediet, således at æggenes mikropyler vender opad og i samme brændplan. Tryk septum forsigtigt ind i mediet, indtil æggene kun er lidt indlejret i mediet (figur 2, trin 5).
   BEMÆRK: Det er afgørende, at septum placeres således, at æggenes mikropyler er tilgængelige for pollenrørene (eventuelle utilgængelige ægløsninger kan forsigtigt omarrangeres med en nål). En lille pool af væske skal dannes omkring septum efter indlejring.
7. Gentag trin 4.1-4.6 for op til to pistiller mere, og placer septaen ende mod ende.

5. Stigma dissektion

1. Placer de bestøvede stigmadonorpistiller på frisk dobbeltsidet klæbebånd monteret på et glasglas, således at krydset i æggestokkestokstil er væk fra kanten af båndet (figur 2, trin 6).
2. Brug et frisk barberblad til at skære stilen lige ned og løft væk for at holde stigmatiseringen fastgjort til bladet (figur 2, trin 6).
   BEMÆRK: Skær i kanten af tapen for det reneste snit.
3. Fjern stigmatiseringen fra bladet med en insulinsprøjtenål, og læg den fladt ca. 250-300 μm fra æggene (figur 2, trin 7-8).
   BEMÆRK: Stilen skal orienteres vandret på sin side; Ellers vil de fleste pollenrør vokse ned under septum. En lille pulje af væske ved indgangen til stilen skal vises, efter at den har ligget på mediet i 1 min; Dette er et godt tegn, da pollenrørene vil have en jævn udgang fra stilen.
4. Gentag trin 5.1-5.3 for op til 12 stigmas, og placer to på hver side af hver septum. Se efter en lille pulje af væske, der dannes omkring æggenes mikropyle; dette hjælper pollenrørenes tilgængelighed og målretning mod embryosækkene (figur 2, trin 9).
   BEMÆRK: Begræns den tid, skålen er åben for at forhindre, at mediet og æggene tørrer ud.

6. Billedbehandling

Figur 3: SIV cum septum billeddannelsesskema. (A) Fuld SIV cum septum opsætning med 12 bestøvede stigmas og 3 septa, set gennem et stereoskop. (B) Flettede billeder af den fulde SIV cum septumopsætning set i A 5 timer efter inkubation ved hjælp af et 10x mål, med de fem oversigtsområder (~ 1 mm hver) markeret til flertrinserhvervelse. De grønne bokse viser de æg, der modtog pollenrør, der gennemgik et eksplosivt udbrud i synergiderne. (C) Nærmere overblik over oversigtsområde 2 på forskellige tidspunkter. Ca. 3 timer efter inkubation i fugtighedskammeret på mikroskopet skal pollenrørene ankomme nær mikropylerne, og ved 6 timers billeddannelse skal de fleste ægløsninger have modtaget pollenrør korrekt (grønne firkanter); Disse ægløsninger gennemgår derefter eksplosiv pollenrørsudbrud (stjerne). Skalastænger = (A) 5 mm, (B,C) 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Når dissektionen er færdig, og skålen er klar til at blive fotograferet, lad den inkubere i et fugtighedskammer på mikroskopet, der holdes ved 92% relativ luftfugtighed og 21 ° C.
   BEMÆRK: Hvis der ikke er noget fugtighedskammer til mikroskopet, vil foring af lågets og skålens ydre kanter med et lille volumen vand bidrage til at opretholde et højt fugtighedsniveau i skålen.
2. Bring prøverne i fokus under brightfield ved lav lysintensitet, og skift derefter til fluorescerende lys, og markér de områder af prøven på sceneoversigten, der skal afbildes.
   BEMÆRK: Ved 10x forstørrelse kan ca. fem områder markeres for i alt tre septa (figur 3). Begræns den tid, der bruges til markering af oversigtsområderne for at minimere fototoksicitet eller opvarmning af prøven med det fluorescerende lys.
3. Begynd billedbehandling ved hjælp af et flertrins erhvervelsesskema med en autofokusfunktion i begyndelsen af hvert oversigtsområde. Da pollenrør vil komme ud af stilen ~ 1 time efter inkubation af prøven, skal du forsinke erhvervelsen med 2 timer, eller indtil pollenrørene har nået mikropylen. Sørg for, at autofokus er indstillet med et interval på 100 μm (7 μm store trin og 1 μm fine trin) for at holde æggene i fokus, når septaen bevæger sig lidt og synker over tid.
4. Stop billedoptagelsen ~ 9 timer efter start af prøveinkubationen, da de fleste ægløsninger på dette tidspunkt skulle have tiltrukket og modtaget et pollenrør.
   BEMÆRK: Hvis et lavt antal ægløsninger tiltrækker pollenrør, er omhyggelig observation af skålen under et stereoskop nyttig for at bestemme, hvordan ægget eller stilorienteringen kan forbedres næste gang.

Representative Results

For at vurdere tidspunktet for nuklear degeneration i den modtagelige synergid med hensyn til pollenrørsbrud i Arabidopsis , samt for at observere, om venstre eller højre synergid er forudbestemt til at blive den modtagelige synergid, blev SIV cum septum-metoden beskrevet her anvendt ved hjælp af en kvindelig gametofyt-nuklear markør stablet med en synergid cytosolisk markør (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) som septumdonor og en mandlig gametofytmarkør (pLAT52:R-GECO) som pollendonor. Septaen og bestøvede stigmas blev dissekeret 24 timer efter emasculation i henhold til afsnit 4-5 i protokollen og anbragt på glasbundfade med et medium tilberedt dagen før. Hver skål blev placeret i et fugtighedskammer på mikroskopet, og et flertrinseksperiment blev udført ved hjælp af en 10x objektiv linse (numerisk blænde: 0,4) med fem oversigtsområder (figur 3). Billeder af hvert område blev taget hver 60. sek. i 9 timer med fire fluorescerende kanaler: kanal (1) 560/640 for R-GECO (25 ms), kanal (2) 488/520 for roGFP2-ORP1 (60 ms), kanal (3) 387/520 for roGFP2-ORP1 (60 ms) og kanal (4) 387/640 for baggrundssubtraktion (60 ms) (tabel 1). En autofokusfunktion med et 100 μm område med 7 μm grove skridt og 1 μm fine stepping blev anvendt for hvert minut før billedoptagelse. De fem billedfiler blev åbnet i FIJI, kanalerne blev adskilt, og derefter blev billederne manuelt flisebelagt sammen (Video 2 og Supplementary File 1).

I video 2 (se også supplerende fil 1) kan der ses 41 eksempler på eksplosiv pollenrørsbrud i synergiderne inden for æggene, hvor grønne firkanter markerer de interessante regioner. Ved hjælp af calciumbiosensorlinjen pLAT52: RGECO som pollendonor blev der set tilfælde af eksplosiv pollenrørbrud ved spidserne af pollenrørene, hvor de lyser. Især var der en hurtig stigning i biosensorens lysstyrke som følge af dens pludselige eksponering for høje niveauer af calcium. Eksplosiv pollenrørbrud kan også analyseres med GFP-baserede eller RFP-baserede sædcelle- eller cytosoliske markører, som også viser hurtig frigivelse af sæd eller cytoplasmatisk indhold. Ved pollenrørsbrud blev kernen i den modtagelige synergid observeret at nedbrydes samtidigt (inden for 1 min tidsopløsning i eksperimentet), og migration af ægcellekernen mod mikropylen blev også set ved pollenrørsbrud som følge af karyogami (Video 3 og supplerende fil 1). Både venstre og højre synergider var i stand til at tjene som den modtagelige synergid, og forekomster af to pollenrørsudbrud blev observeret, for det første i den modtagelige synergid og for det andet i den vedvarende synergid. Video 2 (se også supplerende fil 1) viser 10 eksempler på defekt pollenrørsmodtagelse, som kan ses i æggene, med de interessante områder markeret med røde firkanter. Således var den samlede effektivitet af pollenrørmodtagelse ~ 80% med hensyn til de æg, der tiltrak pollenrør. I disse mislykkede tilfælde standser pollenrørene enten deres vækst i mikropylen, standser deres vækst efter den hurtige vækst i synergiderne eller undlader at standse deres vækst og fortsætte med at vokse og spole i embryosækken. Æggene uden nogen angivne interesseområder kunne ikke tiltrække pollenrør eller var ikke i en tilgængelig orientering. Forstørrede eksempler på negative og positive resultater kan ses i video 3 (se også supplerende fil 1), der viser to tilfælde af defekt pollenrørsmodtagelse (video 3A, C og supplerende fil 1) og to tilfælde af vellykket pollenrørmodtagelse (video 3B, D og supplerende fil 1).

Figur 4: Sammenligning af SIV-metodens effektivitet. Otte tekniske replikater af SIV-udskårne ægløsninger (71 samlede æg) viste kun ~ 28% ægløsninger med eksplosive pollenrørsudbrud, hvilket resulterede i en effektivitet fra ~ 10% -50%. Fem tekniske replikater af SIV cum septum-metoden (8 septa og 102 ovler) viste ~ 79% ægløsninger med eksplosiv pollenrørsprængning, hvilket resulterede i en effektivitet fra ~ 70% -100%. Kun æg, der tiltrak pollenrør til mikropylen og ægløsninger, der havde tilstrækkelig registreret tid til at modtage det tiltrukkede pollenrør, blev talt. "X" betegner middelværdien og midterlinjen medianværdien (50^. percentil). Linjerne uden for de øvre og nedre kvartiler viser minimums- og maksimumsprocenterne for vellykket pollenrørmodtagelse. Procentdelen af ægløsning med pollenrørsudbrud var signifikant forskellig (p < 0,001) mellem de to metoder baseret på en uparret t-test. Forkortelse: SIV = semi-in vitro. Klik her for at se en større version af denne figur.

Udstyr/indstilling	Supplerende video 2 & 3
Mikroskop	Olympus IX-81F-ZDC2 inverteret mikroskop
Temperatur kontrol	Life Imaging Services GmbH Cube & Box (22C)
Fugtighed kontrol	Life Imaging Services GmbH mursten (92% relativ luftfugtighed)
Programmel	Olympus cellSens Dimension 2,3
Controller i realtid	Olympus U-RTC
Laser	MT20- 150 W xenonbuebrænder
Objektiv linse	10x luftnedsænkning U Plan SApo objektivobjektiv (0,4 NA), arbejdsafstand 3,1 mm
Spejlterning	GFP/RFP
Filterhjul	Olympus U-FFWO
	Kanal 1 (25 ms) : reflekteret (560/25) observation (624/40)
	Kanal 2 (60 ms): reflekteret (485/20) observation (525/30)
	Kanal 3 (60 ms): reflekteret (387/11) observation (525/30)
	Kanal 4 (60 ms): reflekteret (387/11) observation (624/30)
Detektor	Hamamatsu ORCA-Fusion Digital CMOS-kamera
Autofokus	100 μm rækkevidde, 7 μm groft trin, 1 μm fint trin
Tidsinterval	1 min

Tabel 1: De mikroskopsystemer og indstillinger, der er anvendt i dette manuskript.

Video 1: Timelapses af SIV udskårne ægløsning metode. Fusioneret timelapse fra otte tekniske replikater af SIV ved hjælp af udskårne æg, der viser væksten af pollenrør (der huser pLAT52: R-GECO) og pollenrørmodtagelse i æggene. De 20 grønne bokse viser tilfælde af eksplosivt pollenrørsbrud i synergiderne, og de 51 røde bokse viser tilfælde af mislykket pollenrørsbrud og tilgroning. Tidsforløbene er mellem 260 min og 400 min, og skalabjælken er 100 μm. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: SIV cum septum timelapse. (A) Sammenlagt timelapse fra alle fem oversigtsområder (se figur 3) af pollenrørsvækst og modtagelse inden for æggene med kun RFP-kanalen (kanal 1). Pollen huser pLAT52: R-GECO og æggene pFG: roGFP2-ORP1-NLS; pMYB98:roGFP2-ORP1. De 41 grønne bokse viser tilfælde af eksplosiv pollenrørssprængning, og de 10 røde bokse viser tilfælde af mislykket pollenrørsudbrud og pollenrørsovervækst. (B) Den samme timelapse med både RFP- og GFP-kanalerne (kanal 1 og kanal 2), der viser den nukleare dynamik i kønscellerne og synergidcellerne under pollenrørmodtagelse. Tallene øverst til højre angiver klokkeslættet (t:min). Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at downloade denne video.

Video 3: Eksempler på positive og negative resultater fra SIV cum septum. (A,C) Eksempel på ægløsning taget fra video 2, der viser to tilfælde af mislykket befrugtning. I A undlader pollenrørene at standse væksten og fortsætter med at spole i embryosækken. I C ses en anden kategori af pollenrørsovervækst, hvor det første pollenrør gennemgår hurtig vækst, da det vokser ind i synergiden, men standser væksten uden at briste. (B,D) Eksempel på ægløsning taget fra video 2, der viser to tilfælde af vellykket pollenrørsmodtagelse. Det vildtypelignende pollenrørsudbrud viser pollenrørets eksplosive brud i synergiderne, og ægcellekernens migration mod mikropylen indikerer karyogami. Tallene øverst til højre angiver klokkeslættet (t:min). Pilespidserne angiver de modtagelige synergidkerner (rSN), og pilene angiver ægcellekernens (EN) migration efter pollenrørsudbrud (lysis). Skalabjælke = 30 μm. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende fil 1: Stillbilleder af video 1, video 2 og video 3. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Dette manuskript introducerer en effektiv protokol til billeddannelse af pollenrørmodtagelse og dobbeltbefrugtning i Arabidopsis. Den forbedrede metode, SIV cum septum, øger i høj grad procentdelen og det samlede antal vellykkede pollenrørmodtagelseshændelser, der kan observeres pr. Billeddannelsessession. De repræsentative resultater vist her viser en billeddannelsessession med 41 vellykkede pollenrørmodtagelseshændelser og 10 ægløsninger, der viser modtagelsesfejl (~ 80% effektivitet). Dette er over dobbelt så mange som antallet af vellykkede pollenrørsmodtagelseshændelser fanget i i alt otte billeddannelsessessioner ved hjælp af den originale SIV-udskårne ægløsningsmetode (video 1). Ved hjælp af SIV cum septum-metoden i fem tekniske replikater for i alt otte septa opnåede vi en gennemsnitlig pollenrørsmodtagelseseffektivitet på 79% sammenlignet med et gennemsnit på 28% ved hjælp af SIV-excised septum-metoden med otte tekniske replikater (figur 4).

Mens effektiviteten af pollenrørmodtagelse er meget større for SIV cum septum-metoden , forekommer forekomster af pollenrørsvækst stadig med varierende hastigheder, afhængigt af flere faktorer. Vigtigst er det, at de synergiske celler skal holdes i live og modtagelige i de flere timer, hvor de bliver afbildet. Opretholdelse af et fugtigt miljø under dissektion og billeddannelse ved hjælp af frisklavet medium, indlejring af æggene og septum i den halvflydende agar og undgåelse af varme genereret af overdreven lyseksponering under billedoptagelse er alle afgørende faktorer for at sikre en vellykket modtagelse af pollenrør. Tilgængeligheden og tiltrækningen af pollenrør til mikropyler af æggene er også nøglefaktorer, der begrænser antallet af vellykkede pollenrørmodtagelsesbegivenheder. Minimering af forstyrrelsen af æggene på septum under dissektion, orientering af septumet, så mikropylerne vender opad, og dannelsen af en halvflydende pool mellem æggene og åbningen af stilen er nøglen til pollenrørattraktion. Dannelsen af denne pulje kan variere mellem mærker af lavsmeltepunktsagar, og det anbefales derfor at starte forsøgene med varierende procentdele agar fra 1% til 1,5%. Endelig betyder dissektionens sværhedsgrad, at det kræver lidt øvelse, og det anbefales at forblive tålmodig, øve afslappende og dyb vejrtrækning før dissektionen og vigtigst af alt at være opmærksom på de teknikker, der forbedrer stabiliteten og konsistensen (f.eks. Håndpositionering, glideretning).

Denne detaljerede protokol for SIV cum septum-metoden skulle i høj grad forbedre effektiviteten og prøveantallet for eksperimenter rettet mod levende billeddannelse af pollenrørmodtagelse og dobbelt befrugtning. Anvendelser omfatter anvendelse af genetisk kodede biosensorer, mutantanalyse og beskrivende observationer af cytologiske begivenheder før, under og lige efter dobbeltbefrugtning. Vi håber, at denne metode kan udvides og udvides til andre blomstrende plantearter, hvor opretholdelse af ægløsning på æggestokkens moderkage kan være til gavn.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mm glass slide	Epredia	16211551
35 mm glass bottom dish (14 mm well)	Mattek	P35G-1.5-14-C
Calcium Chloride	Roth	CN93.1
Columbia (Col-0)	Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)		stigma donor
Dissecting Scope	Olympus	SZX2-ILLT
Insulin needle (0.3 G)	BD	304000
Landsberg erecta (Ler-0)	Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)		septum donor
Magnesium Sulfate	Merck	5886
Potassium Chloride	Roth	6781.1
Razor blade	Beldura	7026797
Scotch double sided tape	Scotch	768720	Less thick and good for stigma dissection
Sodium Chloride	Roth	3957.1
Sucrose	ITW reagents	A2211,1000
Tesa double sided tape	Tesa	05681-00018	Very sticky and good for septum dissection
Ultra low gelling temperature agarose	FMC SeaPrep	50302