Summary
Här beskriver vi en förbättring av semi-in vitro (SIV) metoden för observation av pollenrörsstyrning och mottagning i Arabidopsis thaliana, vilket ökar mottagligheten av ägglossor. SIV cum septum-metoden med hög genomströmning kan kopplas till gametofytmarkörlinjer och genetiskt kodade biosensorer för att övervaka den dynamiska befruktningsprocessen.
Abstract
I blommande växter är tillväxten och styrningen av pollenröret (manlig gametofyt) inom pistilen och mottagandet av pollenröret av den kvinnliga gametofyten avgörande för dubbel befruktning och efterföljande fröutveckling. Samspelet mellan manliga och kvinnliga gametofyter under pollenrörsmottagning kulminerar i pollenrörsbrott och frisättning av två spermier för att åstadkomma dubbel befruktning. Eftersom pollenrörstillväxt och dubbel befruktning är djupt dolda i blommans vävnader är denna process svår att observera in vivo.
En semi-in vitro (SIV) metod för levande cellavbildning av befruktning i modellväxten Arabidopsis thaliana har utvecklats och implementerats i flera undersökningar. Dessa studier har bidragit till att belysa de grundläggande dragen i hur befruktningsprocessen sker i blommande växter och vilka cellulära och molekylära förändringar som uppstår under interaktionen mellan manliga och kvinnliga gametofyter. Men eftersom dessa levande cellavbildningsexperiment involverar excision av enskilda ägglossor, är de begränsade till ett lågt antal observationer per bildsession, vilket gör detta tillvägagångssätt tråkigt och mycket tidskrävande. Bland andra tekniska svårigheter rapporteras ofta att pollenrören inte kan befrukta ägglossningarna in vitro , vilket allvarligt förvirrar sådana analyser.
Här tillhandahålls ett detaljerat videoprotokoll för avbildning av pollenrörsmottagning och befruktning på ett automatiserat och högt genomströmningssätt, vilket möjliggör upp till 40 observationer av pollenrörsmottagning och bristning per bildsession. Tillsammans med användningen av genetiskt kodade biosensorer och markörlinjer möjliggör denna metod generering av stora provstorlekar med en minskad tidsinvestering. Nyanser och kritiska punkter i tekniken, inklusive blomstaging, dissektion, mediumberedning och avbildning, beskrivs tydligt i videoformat för att underlätta framtida forskning om dynamiken i pollenrörsstyrning, mottagning och dubbelbefruktning.
Introduction
Genereringen av genetiskt unika avkommor i sexuellt reproducerande organismer är beroende av en framgångsrik fusion av manliga och kvinnliga könsceller. I blommande växter beror interaktionen mellan två manliga gameter (spermier) med två kvinnliga gameter (äggcell och central cell) under dubbelbefruktning på spermiefrisättning från pollenröret (den manliga gametofyten). Denna process, som kallas pollenrörsmottagning, styrs till stor del av de synergidceller som finns i embryosäcken (den kvinnliga gametofyten)1,2. Eftersom pollenrörsmottagning sker djupt inne i blomman har en metod som möjliggör levande cellavbildning av processen, kallad semi-in vitro (SIV) pollenrörsmottagning, etablerats3. Med denna metod placeras utskurna Arabidopsis-ägglossor på halvflytande pollengroningsmedium och riktas mot pollenrör som växer genom stigma och stil av en pistill avskuren vid den stilöverförande kanalkorsningen 3,4. Sedan utvecklingen av denna teknik har detaljerade observationer lett till flera upptäckter kring pollenrörsstyrning, mottagning och befruktning. Bland annat inkluderar dessa upptäckter förvärv av pollenrörsinriktningskompetens genom tillväxt genom stigma3, uppkomsten av intracellulära kalciumoscillationer i synergiderna vid pollenrörets ankomst 5,6,7,8,9 och dynamiken i spermiefrisättning och befruktning vid pollenrörsbrott 10 . Ändå, eftersom denna teknik bygger på excision av ägglossor, är observationerna av befruktning begränsade i antal, och pollenrörets mottagning är ofta avvikande, vilket resulterar i misslyckande av pollenrörsbrott (Video 1 och kompletterande fil 1). Därför finns det ett behov av ett effektivare tillvägagångssätt som möjliggör analyser med hög genomströmning av pollenrörsmottagning och befruktning.
Vid utvecklingen av detta protokoll testades flera nya metoder för att analysera pollenrörsmottagning, som sträcker sig från de mest "in vitro" till de mest "in vivo" -metoderna, och en effektiv teknik baserad på excision av hela septum bestämdes, vilket möjliggör upp till 40 observationer av befruktning per dag. Här beskrivs nyanserna och kritiska punkter i tekniken, inklusive blomstaging, dissektion, mediumberedning och bildinställningar. Genom att följa detta protokoll bör forskning med fokus på pollenrörsvägledning, pollenrörsmottagning och dubbel befruktning underlättas. De högre provstorlekar som metoden möjliggör förväntas stärka den vetenskapliga sundheten i slutsatserna från levande bildexperiment. De potentiella tillämpningarna av denna teknik inkluderar, men är inte begränsade till, att utföra observationer av molekylära och fysiologiska förändringar i cytosoliska kalciumkoncentrationer ([Ca2 +] cyt), pH ellerH2O2under gametofytinteraktioner genom användning av genetiskt kodade biosensorer. Dessutom kan cytologiska förändringar, såsom degeneration av den receptiva synergiden, spermiecellsmigration eller karyogami, lättare observeras med denna förbättrade metod. Slutligen kan tidpunkten för de olika stadierna av befruktning övervakas under widefieldmikroskopi, och sedan kan mer detaljerade analyser med konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) eller tvåfotonexcitationsmikroskopi (2PEM) utföras för högre upplösning och 3D-rekonstruktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se materialförteckningen för en lista över material och utrustning som används i detta protokoll.
1. Överväganden vid utformningen av avbildningsexperimentet
- Förutbestäm bildvaraktigheten och provtagningsfrekvensen som krävs för att fånga det önskade fenomenet som ska observeras. Till exempel, enligt Nyquists samplingsteorem, måste samplingsfrekvensen vara större än dubbelt så hög frekvens som ingångsprovet. Därför, för att exakt fånga synergid [Ca2 +] cyt oscillationer, utför avbildning ungefär var 10: e s, men för att mäta spermiernas hastighet vid pollenrörsurladdning, säkerställa en tidsupplösning på mindre än 1 s10.
- Välj fluorescerande markörer för cellerna av intresse som är tillräckligt ljusa bortom bakgrundsautofluorescensen. För användning av biosensorer, välj de ljusaste linjerna som inte stör cellfunktionen, eftersom de i allmänhet är känsligare och kräver mindre exponeringstid.
- Tänk på vilken typ av fluorescensmikroskopi och förstoring som är mest lämpade för att fånga det önskade fenomenet. Använd widefield-mikroskopi och mål med låg förstoring för att fånga ljus från ett större skärpedjup och behåll fokus över tid, avbilda större objekt som hela ägglossor eller använd ratiometriska sensorer som är känsliga för kromatiska skiftartefakter. Använd CLSM eller 2PEM med höga förstoringsmål för bättre upplösning av cellulära och subcellulära objekt, men notera svårigheten att behålla fokus över tid.
- Uppskatta antalet prover som ska avbildas per experiment. Använd till exempel ett 10x-mål med en minsta samplingstid på ~ 30 s för att avbilda tre septa och avbilda upp till 40 befruktningshändelser per experiment på grund av den tid som krävs för autofokus- och flerstegsförvärvsfunktionerna.
2. Beredning av pollengroningsmedium
- Bered flytande pollengroningsmedium (5 mMCaCl2, 1 mMMgSO4, 5 mM KCl, 0,01 % [w/v]H3BO3och 10 % [w/v] sackaros) med 1 M alikvoter av varje mikronäringsämne som lagras vid −20 °C. Justera pH till 7,5 med 0,1 M KOH. Förvara mediet vid 4 °C i upp till 2 veckor.
OBS: PH-värdet kan sjunka med tiden. - Tillsätt 2,5 ml flytande medium till en 10 ml bägare och tillsätt långsamt 32 mg agaros med extremt låg smältpunkt (~ 1,3%) med en snabbt roterande omrörningsstång för att undvika klumpar.
- Smält agaros på en värmeplatta vid 65 °C och nöt bägaren så att eventuell kondens samlas upp från sidorna.
- Pipettera in 130 μl medium i 14 mm-brunnen på en 35 mm glasbottenskål och rotera skålen tills mediet täcker brunnen.
- Aspirera totalt 40 μL med en pipett från mitten av skålen och lämna en total volym på 90 μL.
OBS: Mer medium kan sugas ut ur brunnen för att uppnå en lägre total volym; Detta kan vara nödvändigt för mål med hög förstoring och låga arbetsavstånd. Ju tunnare agardynan är desto snabbare torkar den ut. - Kyl skålen på ett aluminiumblock i en fuktighetskammare för att säkerställa jämn kylning. Förvara plattorna vid 4 °C över natten för användning nästa morgon.
3. Blommig iscensättning av septumgivare, stigmagivare och pollendonatorer
Figur 1: Blommig iscensättning av septumdonatorer, stigmagivare och pollengivare. (A) Stadier av Arabidopsis blommor (Ler-0) inom en blomställning. Knoppar i steg 12B, som har kronblad som håller på att öppna och gula indehiscenta strumpor, bör emasculeras genom att ta bort alla kronblad, kronblad och ståndare. Pistiller (som hyser den kvinnliga gametofyttillverkaren) kan sedan användas som septumdonatorer 24 timmar senare. (B) Stadier av Arabidopsis blommor (Col-0) inom en blomställning. Knoppar i steg 12B, som har gula indehiscent strumpor och stigmas som knappt kommer ut ur kronbladen, bör emasculeras genom att ta bort alla kronblad, kronblad och ståndare. Pistillerna kan sedan användas som stigmadonatorer 24 timmar senare, när de ska pollineras av blommor (som hyser den manliga gametofytmarkören) som är öppna och släpper pollen. Pollinerade stigmas bör dissekeras inom 1 h efter pollinering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Morgonen före avbildning, välj Arabidopsis-växter som ska användas som septumgivare och stigmagivare; Se till att de är friska och nyligen har börjat producera siliques.
OBS: Landsberg erecta (Ler-0) är en bra anslutning för användning som septumdonator, eftersom dess septa är robust och det finns små internoder mellan ägglossorna. Columbia (Col-0) är en bra anslutning att använda som stigmagivare eftersom de verkar bidra till pollenrörstillväxt. - Emasculera minst tre steg 12B septum donatorblommor och 12 steg 12B stigma donatorblommor genom att ta bort deras ståndare, foderblad och kronblad (figur 1A, B). Ta bort även äldre blommor på samma blomställning, vilket potentiellt kan pollinera den emasculerade blomman.
- På morgonen, 24 timmar senare, pollinera stigmadonatorerna med pollendonatorblommorna (t.ex. som innehåller pollenrör eller spermiecellmarkörer) som lätt tappar pollen. Pollinering är fullständig när stigmasna är nästan helt täckta med pollen (Figur 1B).
4. Septum dissektion
Figur 2: En snabbguide till septum och stigmadissektion . (A) Steg för septumdissektion. Fäst pistillen på dubbelsidig tejp med en insulinsprutnål och gör snitt vid stil-äggstockskorsningen och äggstock-pedikelkorsningen, följt av ett grunt snitt längs septum av endera karpeln (steg 1). Dra tillbaka karpelväggarna på tejpen (steg 2). Skär replum under den övre septumet (steg 3). Skär septumet i stilen och ta bort med pincett vid pedicelen (steg 4). Placera septum på agarmedia och bädda försiktigt med pincett. (B) Steg för stigmadissektion. Fäst pistillen (pollinerad <1 h före) på dubbelsidig tejp och skär vid stil-äggstockskorsningen med ett rakblad (steg 6). Placera stigmat på agarmediet med en insulinnål bredvid septumet och justera avståndet till cirka 250 μm (steg 7-8). Se till att en halvflytande pool bildas runt mikropyles och basen av stilarna (steg 9). Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Trettio minuter efter pollinering, samla friska och mogna septumdonatorpistiller vid pedikeln och placera dem på färskt dubbelsidigt tejp monterat på en glasskiva, med stigmatiseringen som sticker precis utanför tejpens kant.
OBS: Begränsa dissektionstiden för vilken pistillerna är på tejpen för att säkerställa att den är så kort som möjligt. Dissektionen bör utföras vid hög luftfuktighet, vilket kan uppnås genom att placera en luftfuktare bredvid bilden. - Fäst pistillen ordentligt på tejpen genom att trycka försiktigt på pedikeln och längs äggstocken med baksidan av en ny insulinsprutnål innan du tar bort sepal, kronblad och ståndare skräp kvar från emasculationen.
- Under ett stereoskop, använd en insulinsprutnål för att göra två snitt per karpell vid stil-äggstockskorsningen och äggstock-pedikelkorsningen, följt av grunda snitt längs septum för varje karpel (figur 2, steg 1).
OBS: Att skära för djupt längs septum kommer att skära av ägglossningar vid funiculus. - Dra försiktigt tillbaka äggstocksväggarna på tejpen (figur 2, steg 2) och skjut nålen försiktigt mellan de två septa för att skära replum längs hela pistillens längd utan att störa ägglossningarna (figur 2, steg 3).
OBS: Skär replum i riktning från stilen till pedikeln för att säkerställa att ägglossorna på övre septum störs så lite som möjligt. - Skär den övre septumet försiktigt vid både korsningen med stilen och med pedikeln och ta bort septumet med pincett från pedikelsidan (figur 2, steg 4).
OBS: Håll detta snitt rakt och försiktigt så att septumet förblir platt och inte böjer sig. - Placera septum så platt som möjligt på mediet så att ägglossningarnas mikropyler är vända uppåt och i samma fokalplan. Tryck septumet försiktigt in i mediet tills ägglossningarna bara är något inbäddade i mediet (figur 2, steg 5).
OBS: Det är viktigt att septum placeras så att ägglossningarnas mikropyler är tillgängliga för pollenrören (eventuella otillgängliga ägglossor kan försiktigt ordnas om med en nål). En liten vätskepool bör bildas runt septum efter inbäddning. - Upprepa steg 4.1-4.6 för upp till två pistiller till, placera septaänden till änden.
5. Stigma dissektion
- Placera de pollinerade stigmadonatorpistillerna på färsk dubbelsidig tejp monterad på en glasskiva, så att korsningen i äggstocksstil ligger utanför tejpens kant (figur 2, steg 6).
- Använd ett nytt rakblad för att skära stilen rakt ner och lyft bort för att hålla stigmatiseringen fäst vid bladet (figur 2, steg 6).
OBS: Klipp vid kanten av tejpen för det renaste snittet. - Ta bort stigmatiseringen från bladet med en insulinsprutnål och placera den platt cirka 250-300 μm från ägglossningarna (figur 2, steg 7-8).
OBS: Stilen ska orienteras horisontellt på sin sida; Annars kommer de flesta pollenrören att växa ner under septum. En liten vätskepöl vid ingången till stilen ska visas efter att den har legat på mediet i 1 min; Detta är ett gott tecken, eftersom pollenrören kommer att ha en smidig utgång från stilen. - Upprepa steg 5.1-5.3 för upp till 12 stigmas, placera två på vardera sidan av varje septum. Leta efter en liten pool av vätska som bildas runt mikropyle av ägglossorna; Detta underlättar pollenrörens tillgänglighet och inriktning på embryosäckarna (figur 2, steg 9).
OBS: Begränsa den tid skålen är öppen för att förhindra att mediet och ägglossningarna torkar ut.
6. Bildbehandling
Figur 3: SIV cum septum imaging schema. (A) Full SIV cum septum-inställning med 12 pollinerade stigmas och 3 septa, sett genom ett stereoskop. (B) Sammanslagna bilder av hela SIV cum septum-installationen som ses i A 5 timmar efter inkubation med ett 10x-objektiv, med de fem översiktsområdena (~ 1 mm vardera) markerade för flerstegsförvärv. De gröna rutorna visar ägglossorna som fick pollenrör som genomgår en explosiv sprängning i synergiderna. (C) Närmare bild av översiktsområde 2 vid olika tidpunkter. Cirka 3 timmar efter inkubation i fuktighetskammaren på mikroskopet bör pollenrören komma nära mikropylesna, och vid 6 timmars avbildning bör de flesta ägglossor ha fått pollenrör (gröna rutor); Dessa ägglossor genomgår sedan explosiv pollenrörssprängning (asterisk). Skalstänger = (A) 5 mm, (B,C) 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- När dissektionen är klar och skålen är klar att avbildas, låt den inkubera i en fuktighetskammare på mikroskopet som hålls vid 92% relativ luftfuktighet och 21 ° C.
OBS: Om ingen fuktkammare är tillgänglig för mikroskopet, kommer fodring av lockets ytterkanter och skålen med en liten volym vatten att bidra till att upprätthålla en hög luftfuktighet i skålen. - Sätt proverna i fokus under ljusfält med låg ljusintensitet och växla sedan till fluorescerande ljus och markera de områden i provet i scenöversikten som ska avbildas.
OBS: Vid 10x förstoring kan cirka fem områden markeras för totalt tre septa (figur 3). Begränsa den tid som används för att markera översiktsområdena för att minimera fototoxicitet eller uppvärmning av provet med lysrör. - Börja avbilda med hjälp av ett flerstegsinsamlingsschema med en autofokusfunktion i början av varje översiktsområde. Eftersom pollenrör kommer att dyka upp från stilen ~ 1 h efter inkubation av provet, fördröja förvärvet med 2 timmar eller tills pollenrören har nått mikropylen. Se till att autofokusen är inställd med ett intervall på 100 μm (7 μm stora steg och 1 μm fina steg) för att hålla ägglossningarna i fokus när septa rör sig något och sjunker över tiden.
- Stoppa bildförvärvet ~ 9 timmar efter att provinkubationen startats, eftersom de flesta ägglossorna vid denna tid borde ha lockat och fått ett pollenrör.
OBS: Om ett lågt antal ägglossor lockar pollenrör, är noggrann observation av skålen under ett stereoskop användbar för att bestämma hur ägglossningen eller stilorienteringen kan förbättras nästa gång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bedöma tidpunkten för nukleär degenerering i den receptiva synergiden med avseende på pollenrörsbrott i Arabidopsis , samt för att observera om vänster eller höger synergid är förutbestämd att bli den receptiva synergiden, användes SIV cum septum-metoden som beskrivs här med användning av en kvinnlig gametofytkärnmarkör staplad med en synergid cytosolisk markör (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) som septumdonator och en manlig gametofytmarkör (pLAT52:R-GECO) som pollengivare. Septa och pollinerade stigmas dissekerades 24 timmar efter emasculation, enligt avsnitt 4-5 i protokollet, och placerades på glasbottenfat med ett medium som förbereddes dagen innan. Varje maträtt placerades i en fuktighetskammare på mikroskopet, och ett flerstegsexperiment utfördes med en 10x objektivlins (numerisk bländare: 0,4) med fem översiktsområden (figur 3). Bilder av varje område togs var 60:e sekund under 9 timmar med fyra fluorescerande kanaler: kanal (1) 560/640 för R-GECO (25 ms), kanal (2) 488/520 för roGFP2-ORP1 (60 ms), kanal (3) 387/520 för roGFP2-ORP1 (60 ms) och kanal (4) 387/640 för bakgrundssubtraktion (60 ms) (tabell 1). En autofokusfunktion med ett 100 μm-område med 7 μm grovstegning och 1 μm finstegning användes för varje minut före bildtagning. De fem bildfilerna öppnades i FIJI, kanalerna separerades och sedan kaklades bilderna manuellt ihop (Video 2 och Supplementary File 1).
I video 2 (se även kompletterande fil 1) kan 41 exempel på explosiv pollenrörsbrott i synergiderna ses inom ägglossningarna, med gröna rutor som markerar regionerna av intresse. Med hjälp av kalciumbiosensorlinjen pLAT52: RGECO som pollendonator sågs fall av explosiv pollenrörsbrott vid spetsarna på pollenrören där de lyser. I synnerhet var det en snabb ökning av biosensorns ljusstyrka som ett resultat av dess plötsliga exponering för höga nivåer av kalcium. Explosiv pollenrörsbrott kan också analyseras med GFP-baserade eller RFP-baserade spermieceller eller cytosoliska markörer, som också visar snabb frisättning av spermier eller cytoplasmatiskt innehåll. Vid pollenrörsbrott observerades kärnan i den receptiva synergiden brytas ned samtidigt (inom 1 min tidsupplösning i experimentet), och migration av äggcellkärnan mot mikropyle sågs också vid pollenrörsbrott som ett resultat av karyogami (Video 3 och kompletterande fil 1). Både vänster och höger synergid kunde fungera som den receptiva synergiden, och fall av två pollenrörsbrott observerades, för det första i den receptiva synergiden och för det andra i den ihållande synergiden. Video 2 (se även kompletterande fil 1) visar 10 exempel på defekt pollenrörsmottagning, som kan ses i ägglossningarna, med intresseområdena markerade med röda rutor. Således var den totala effektiviteten av pollenrörsmottagning ~ 80% med avseende på ägglossorna som lockade pollenrör. I dessa misslyckade fall stoppar pollenrören antingen sin tillväxt i mikropylen, stoppar deras tillväxt efter den snabba tillväxten i synergiderna, eller misslyckas med att stoppa deras tillväxt och fortsätta växa och spola i embryosäcken. Ägglossningarna utan några angivna regioner av intresse misslyckades med att locka pollenrör eller var inte i en tillgänglig orientering. Förstorade exempel på negativa och positiva resultat kan ses i Video 3 (se även Supplementary File 1), som visar två fall av defekt pollenrörsmottagning (Video 3A, C och Supplementary File 1) och två fall av framgångsrik pollenrörsmottagning (Video 3B, D och Supplementary File 1).
Figur 4: Jämförelse av SIV-metodens effektivitet. Åtta tekniska replikat av SIV-utskurna ägglossningsmetoden (totalt 71 ägglossor) visade endast ~ 28% ägglossor med explosiva pollenrörskurar, vilket resulterade i en effektivitet som sträckte sig från ~ 10% -50%. Fem tekniska repliker av SIV cum septum-metoden (8 septa och 102 ägglossor) visade ~ 79% ägglossor med explosiv pollenrörsbrist, vilket resulterade i en effektivitet som sträckte sig från ~ 70% -100%. Endast ägglossor som lockade pollenrör till mikropyle och ägglossor som hade tillräckligt med registrerad tid för att ta emot det lockade pollenröret räknades. "X" betecknar medelvärdet respektive mittlinjen medianvärdet (50: e percentilen). Linjerna utanför de övre och nedre kvartilerna visar de lägsta och högsta procentandelarna för framgångsrik pollenrörsmottagning. Procentandelen ägglossningar med pollenrörsbrott var signifikant annorlunda (p < 0,001) mellan de två metoderna baserat på ett oparat t-test. Förkortning: SIV = semi-in vitro. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Utrustning/inställning | Kompletterande video 2 &; 3 |
| Mikroskop | Olympus IX-81F-ZDC2 inverterat mikroskop |
| Temperaturkontroll | Life Imaging Services GmbH Kub &; Box (22C) |
| Luftfuktighet kontroll | Life Imaging Services GmbH Tegel (92% relativ luftfuktighet) |
| Mjukvara | Olympus cellSens Dimension 2.3 |
| Styrenhet i realtid | Olympus U-RTC |
| Laser | MT20- 150 W xenonbågbrännare |
| Objektiv lins | 10x luftsänkning U Plan SApo objektivobjektiv (0,4 NA), arbetsavstånd 3,1 mm |
| Spegel kub | GFP/RFP |
| Filterhjul | Olympus U-FFWO |
| Kanal 1 (25 ms) : reflekterad (560/25) observation (624/40) | |
| Kanal 2 (60 ms): reflekterad (485/20) observation (525/30) | |
| Kanal 3 (60 ms): reflekterad (387/11) observation (525/30) | |
| Kanal 4 (60 ms): reflekterad (387/11) observation (624/30) | |
| Detektor | Hamamatsu ORCA-Fusion Digital CMOS-kamera |
| Autofokus | 100 μm-område, 7 μm grovsteg, 1 μm finsteg |
| Tidsintervall | 1 minuter |
Tabell 1: De mikroskopsystem och inställningar som används i detta manuskript.
Video 1: Timelapses av SIV-utskurna ägglossningsmetoden. Sammanslagen timelapse från åtta tekniska replikat av SIV med hjälp av utskurna ägglossor som visar tillväxten av pollenrör (som rymmer pLAT52: R-GECO) och pollenrörsmottagning i ägglossorna. De 20 gröna lådorna visar fall av explosiva pollenrörsbrott i synergiderna, och de 51 röda lådorna visar fall av misslyckad pollenrörsbrott och överväxt. Tidsfördröjningarna är mellan 260 min och 400 min och skalstapeln är 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: SIV cum septum timelapse. (A) Sammanslagen timelapse från alla fem översiktsområden (se figur 3) av pollenrörets tillväxt och mottagning inom ägglossningarna med bara RFP-kanalen (kanal 1). Pollen hyser pLAT52: R-GECO och ägglossorna pFG: roGFP2-ORP1-NLS; pMYB98:roGFP2-ORP1. De 41 gröna rutorna visar fall av explosiv pollenrörsbrist, och de 10 röda lådorna visar fall av misslyckad pollenrörsbrott och pollenrörsöverväxt. (B) Samma timelapse med både RFP- och GFP-kanalerna (kanal 1 och kanal 2), som visar kärndynamiken i könscellerna och synergidcellerna under pollenrörsmottagning. Siffrorna längst upp till höger anger tiden (h:min). Skalstapel = 500 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Exempel på positiva och negativa resultat från SIV cum septum. (A,C) Exempel på ägglossningar tagna från video 2 som visar två fall av misslyckad befruktning. I A misslyckas pollenrören med att stoppa tillväxten och fortsätter att spola i embryosäcken. I C ses en andra kategori av pollenrörsöverväxt, där det första pollenröret genomgår snabb tillväxt när det växer in i synergiden men stoppar tillväxten utan att brista. (B, D) Exempel på ägglossningar tagna från Video 2 som visar två fall av framgångsrik pollenrörsmottagning. Den vildtypliknande pollenrörsbrottet visar pollenrörets explosiva bristning i synergiderna, och äggcellkärnans migration mot mikropyle indikerar karyogami. Siffrorna längst upp till höger anger tiden (h:min). Pilspetsarna indikerar de receptiva synergidkärnorna (rSN), och pilarna indikerar migrationen av äggcellkärnan (EN) efter pollenrörsbrott (lys). Skalstapel = 30 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande fil 1: Stillbilder av Video 1, Video 2 och Video 3. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript introducerar ett effektivt protokoll för avbildning av pollenrörsmottagning och dubbelbefruktning i Arabidopsis. Den förbättrade metoden, SIV cum septum, ökar kraftigt andelen och det totala antalet framgångsrika pollenrörsmottagningshändelser som kan observeras per bildsession. De representativa resultaten som visas här visar en bildbehandling med 41 framgångsrika pollenrörsmottagningshändelser och 10 ägglossor som visar mottagningsdefekter (~ 80% effektivitet). Detta är mer än dubbelt så många framgångsrika pollenrörsmottagningshändelser som fångats i totalt åtta bildsessioner med den ursprungliga SIV-utskurna ägglossningsmetoden (Video 1). Med hjälp av SIV cum septum-metoden i fem tekniska replikat för totalt åtta septa uppnådde vi en genomsnittlig pollenrörsmottagningseffektivitet på 79% jämfört med i genomsnitt 28% med SIV-utskuren septummetod med åtta tekniska replikat (figur 4).
Medan effektiviteten hos pollenrörsmottagningen är mycket större för SIV cum septum-metoden , förekommer fall av pollenrörsöverväxt fortfarande i varierande takt, beroende på flera faktorer. Viktigast av allt måste synergidcellerna hållas vid liv och mottagliga under de flera timmar under vilka de avbildas. Att upprätthålla en fuktig miljö under dissektion och avbildning, använda nytillverkat medium, bädda in ägglossningarna och septum i den halvflytande agaren och undvika värme som genereras av överdriven ljusexponering under bildförvärv är alla avgörande faktorer för att säkerställa framgångsrik pollenrörsmottagning. Pollenrörens tillgänglighet och attraktion till ägglossningarnas mikropyler är också viktiga faktorer som begränsar antalet framgångsrika pollenrörsmottagningshändelser. Minimera störningen av ägglossningarna på septum under dissektion, orientera septum så att mikropyles är vända uppåt och bildandet av en halvflytande pool mellan ägglossorna och öppningen av stilen är nyckeln till pollenrörets attraktion. Bildandet av denna pool kan variera mellan märken av agar med låg smältpunkt, och det rekommenderas därför att börja experimenten med varierande procentandelar agar från 1% till 1,5%. Slutligen innebär svårigheten med dissektionen att det kräver viss övning, och det rekommenderas att vara tålmodig, öva avslappnande och djup andning före dissektionen, och, viktigare, att notera de tekniker som förbättrar stabilitet och konsistens (t.ex. handpositionering, glidorientering).
Detta detaljerade protokoll för SIV cum septum-metoden bör avsevärt förbättra effektiviteten och provantalet för experiment som syftar till levande avbildning av pollenrörsmottagning och dubbelbefruktning. Tillämpningar inkluderar användning av genetiskt kodade biosensorer, mutantanalys och beskrivande observationer av cytologiska händelser före, under och strax efter dubbelbefruktning. Vi hoppas att denna metod kan utvidgas och utvidgas till andra blommande växtarter där upprätthållande av ägglossningar på äggstockens placenta kan vara till nytta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Sara Simonini och Stefano Bencivenga för att ha donerat pFG:roGFP2-ORP1-NLS-konstruktionen och Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter och Celia Baroux för deras råd om mikroskopi. Vi tackar Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima och alla andra på International Conference on Sexual Plant Reproduction 2022 som visade intresse för ett protokoll om SIV cum septum. Detta arbete stöddes av universitetet i Zürich och bidrag från Swiss National Science Foundation till U.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7 (2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645 (2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722 (2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
