Summary
Ici, nous décrivons une amélioration de la méthode semi-in vitro (SIV) pour observer le guidage et la réception du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana, ce qui augmente la réceptivité des ovules. La méthode SIV cum septum à haut débit peut être couplée à des lignées marqueurs gamétophytes et à des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller le processus dynamique de fécondation.
Abstract
Chez les plantes à fleurs, la croissance et le guidage du tube pollinique (gamétophyte mâle) dans le pistil et la réception du tube pollinique par le gamétophyte femelle sont essentiels pour la double fécondation et le développement ultérieur des graines. Les interactions entre les gamétophytes mâles et femelles lors de la réception du tube pollinique aboutissent à la rupture du tube pollinique et à la libération de deux spermatozoïdes pour effectuer une double fécondation. Comme la croissance des tubes polliniques et la double fécondation sont profondément cachées dans les tissus de la fleur, ce processus est difficile à observer in vivo.
Une méthode semi-in vitro (SIV) pour l’imagerie de la fécondation sur cellules vivantes dans la plante modèle Arabidopsis thaliana a été développée et mise en œuvre dans plusieurs études. Ces études ont permis d’élucider les caractéristiques fondamentales de la façon dont le processus de fécondation se produit chez les plantes à fleurs et quels changements cellulaires et moléculaires se produisent lors de l’interaction des gamétophytes mâles et femelles. Cependant, comme ces expériences d’imagerie de cellules vivantes impliquent l’excision d’ovules individuels, elles sont limitées à un faible nombre d’observations par séance d’imagerie, ce qui rend cette approche fastidieuse et très longue. Entre autres difficultés techniques, une défaillance des tubes polliniques pour féconder les ovules in vitro est souvent signalée, ce qui complique gravement de telles analyses.
Ici, un protocole vidéo détaillé pour l’imagerie de la réception et de la fécondation des tubes polliniques de manière automatisée et à haut débit est fourni, permettant jusqu’à 40 observations de la réception et de la rupture du tube pollinique par séance d’imagerie. Couplée à l’utilisation de biocapteurs génétiquement codés et de lignes de marqueurs, cette méthode permet de générer des échantillons de grande taille avec un investissement en temps réduit. Les nuances et les points critiques de la technique, y compris la mise en scène des fleurs, la dissection, la préparation du milieu et l’imagerie, sont clairement détaillés sous forme vidéo pour faciliter les recherches futures sur la dynamique du guidage, de la réception et de la double fécondation du tube pollinique.
Introduction
La génération d’une progéniture génétiquement unique dans les organismes à reproduction sexuée dépend de la fusion réussie des gamètes mâles et femelles. Chez les plantes à fleurs, l’interaction de deux gamètes mâles (spermatozoïdes) avec deux gamètes femelles (ovule et cellule centrale) lors de la double fécondation dépend de la libération de spermatozoïdes par le tube pollinique (le gamétophyte mâle). Ce processus, appelé réception du tube pollinique, est largement contrôlé par les cellules synergiques qui résident dans le sac embryonnaire (le gamétophyte femelle)1,2. Comme la réception du tube pollinique a lieu profondément à l’intérieur de la fleur, une méthode permettant l’imagerie du processus par cellules vivantes, appelée réception semi-in vitro (SIV), a été établie3. Avec cette méthode, les ovules d’Arabidopsis excisés sont placés sur un milieu de germination pollinique semi-liquide et ciblés par des tubes polliniques qui se développent à travers le stigmate et le style d’un pistil sectionné à la jonction du tractus transmettant le style 3,4. Depuis le développement de cette technique, des observations détaillées ont conduit à plusieurs découvertes concernant le guidage, la réception et la fécondation des tubes polliniques. Ces découvertes comprennent, entre autres, l’acquisition de la compétence de ciblage du tube pollinique par croissance à travers le stigmate3, l’apparition d’oscillations calciques intracellulaires dans les synergides à l’arrivée du tube pollinique 5,6,7,8,9, et la dynamique de libération et de fécondation des spermatozoïdes lors de l’éclatement du tube pollinique 10 . Néanmoins, parce que cette technique repose sur l’excision des ovules, les observations de fécondation sont limitées en nombre, et la réception des tubes polliniques est souvent aberrante, entraînant l’échec de la rupture du tube pollinique (Vidéo 1 et Fichier supplémentaire 1). Par conséquent, il est nécessaire d’adopter une approche plus efficace permettant des analyses à haut débit de la réception et de la fécondation des tubes polliniques.
Lors de l’élaboration de ce protocole, plusieurs nouvelles approches d’analyse de la réception du tube pollinique, allant des méthodes les plus « in vitro » aux plus « in vivo », ont été testées, et une technique efficace basée sur l’excision du septum entier a été mise au point, ce qui permet jusqu’à 40 observations de fécondation par jour. Ici, les nuances et les points critiques de la technique sont décrits, y compris la mise en scène des fleurs, la dissection, la préparation du milieu et les paramètres d’imagerie. En suivant ce protocole, la recherche axée sur le guidage du tube pollinique, la réception du tube pollinique et la double fécondation devrait être facilitée. Les tailles d’échantillon plus élevées que la méthode permet devraient renforcer la solidité scientifique des conclusions tirées d’expériences d’imagerie en direct. Les applications potentielles de cette technique comprennent, sans toutefois s’y limiter, l’observation des changements moléculaires et physiologiques des concentrations de calcium cytosolique ([Ca2+]cyt), du pH ou de H 2 O2au cours des interactions entre gamétophytes grâce à l’utilisation de biocapteurs génétiquement codés. En outre, les changements cytologiques, tels que la dégénérescence de la synergie réceptive, la migration des spermatozoïdes ou la karyogamie, peuvent être plus facilement observés en utilisant cette méthode améliorée. Enfin, le calendrier des différentes étapes de la fécondation peut être surveillé en microscopie à grand champ, puis des analyses plus détaillées utilisant la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) ou la microscopie à excitation à deux photons (2PEM) peuvent être effectuées pour une résolution plus élevée et une reconstruction 3D.
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Protocol
NOTA : Voir le tableau des matériaux pour une liste des matériaux et de l’équipement utilisés dans ce protocole.
1. Considérations relatives à la conception de l’expérience d’imagerie
- Prédéterminer la durée d’imagerie et la fréquence d’échantillonnage requises pour capturer le phénomène souhaité à observer. Par exemple, selon le théorème d’échantillonnage de Nyquist, la fréquence d’échantillonnage doit être supérieure à deux fois la fréquence la plus élevée de l’échantillon d’entrée. Par conséquent, pour capturer avec précision les oscillations synergiques [Ca2+]cyt , effectuez une imagerie environ toutes les 10 s, mais pour mesurer la vitesse des spermatozoïdes lors de la décharge du tube pollinique, assurez-vous d’une résolution temporelle inférieure à 1 s10.
- Sélectionnez des marqueurs fluorescents pour les cellules d’intérêt qui sont suffisamment brillants au-delà de l’autofluorescence de fond. Pour l’utilisation de biocapteurs, sélectionnez les raies les plus brillantes qui ne perturbent pas le fonctionnement de la cellule, car elles sont généralement plus sensibles et nécessitent moins de temps d’exposition.
- Déterminez quel type de microscopie à fluorescence et de grossissement sont les plus appropriés pour capturer le phénomène souhaité. Utilisez la microscopie à grand champ et les objectifs à faible grossissement pour capturer la lumière à partir d’une plus grande profondeur de champ et maintenir la mise au point au fil du temps, imager des objets plus gros tels que des ovules entiers ou utiliser des capteurs ratiométriques sensibles aux artefacts de décalage chromatique. Utilisez CLSM ou 2PEM avec des objectifs de grossissement élevé pour une meilleure résolution des objets cellulaires et subcellulaires, mais notez la difficulté de maintenir la mise au point au fil du temps.
- Estimez le nombre d’échantillons à imager par expérience. Par exemple, utilisez un objectif 10x avec un temps d’échantillonnage minimum de ~30 s pour l’imagerie de trois septa et l’imagerie jusqu’à 40 événements de fécondation par expérience en raison du temps requis pour les fonctions d’autofocus et d’acquisition multi-étapes.
2. Préparation du milieu de germination du pollen
- Préparer le milieu de germination du pollen liquide (5 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4, 5 mM de KCl, 0,01 % [p/v] H 3 BO 3et 10 % [p/v] saccharose) en utilisant 1 M de stocks aliquotes de chaque micronutriment, qui sont stockés à −20 °C. Ajuster le pH à 7,5 avec 0,1 M KOH. Conserver le milieu à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
REMARQUE: Le pH peut chuter avec le temps. - Ajouter 2,5 mL de milieu liquide à un bécher de 10 mL et ajouter lentement 32 mg d’agarose à point de fusion ultra-bas (~1,3 %) à l’aide d’une barre d’agitation à rotation rapide pour éviter l’agglutination.
- Faire fondre l’agarose sur une plaque chauffante à 65 °C et nuter le bécher pour recueillir toute condensation sur les côtés.
- Introduire à la pipette 130 μL de milieu dans le puits de 14 mm d’un plat à fond en verre de 35 mm et faire pivoter le plat jusqu’à ce que le milieu recouvre le puits.
- Aspirer un total de 40 μL avec une pipette à partir du centre de la boîte, laissant derrière lui un volume total de 90 μL.
REMARQUE : Il est possible d’aspirer plus de milieu hors du puits pour obtenir un volume total inférieur; Cela peut être nécessaire pour les objectifs à fort grossissement avec de faibles distances de travail. Cependant, plus le tampon de gélose est mince, plus il sèchera rapidement. - Refroidissez le plat sur un bloc d’aluminium dans une chambre d’humidité pour assurer un refroidissement uniforme. Conservez les plaques à 4 °C pendant la nuit pour les utiliser le lendemain matin.
3. Stadification florale des donneurs de septum, de stigmatisation et de pollen
Figure 1 : Stadification florale des donneurs de septum, de stigmatisation et de pollen. (A) Stades des fleurs d’Arabidopsis (Ler-0) dans une inflorescence. Les bourgeons au stade 12B, qui ont des pétales sur le point de s’ouvrir et des anthères jaunes indéhiscentes, doivent être émasculés en enlevant tous les sépales, pétales et étamines. Les pistils (abritant la femelle fabricant de gamétophytes) sont alors utilisables comme donneurs de septum 24 h plus tard. (B) Stades des fleurs d’Arabidopsis (Col-0) dans une inflorescence. Les bourgeons au stade 12B, qui ont des anthères jaunes indéhiscentes et des stigmates qui émergent à peine des pétales, doivent être émasculés en enlevant tous les sépales, pétales et étamines. Les pistils sont ensuite utilisables comme donneurs de stigmate 24 h plus tard, date à laquelle ils devraient être pollinisés par des fleurs (abritant le marqueur gamétophyte mâle) qui sont ouvertes et excrètent du pollen. Les stigmates pollinisés doivent être disséqués dans les 1 heure suivant la pollinisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Le matin avant l’imagerie, choisissez des plantes d’Arabidopsis à utiliser comme donneurs de septum et donneurs de stigmatisation; s’assurer qu’ils sont en bonne santé et qu’ils ont récemment commencé à produire des siliques.
NOTE: Landsberg erecta (Ler-0) est une bonne accompagnation pour une utilisation comme donneur de septum, car ses septa sont robustes et il existe de petits entre-nœuds entre les ovules. Columbia (Col-0) est une bonne option à utiliser comme donneur de stigmatisation, car ils semblent favoriser la croissance des sondes polliniques. - Émasculez au moins trois fleurs donneuses de septum de stade 12B et 12 fleurs donneuses de stigmate de stade 12B en enlevant leurs étamines, sépales et pétales (Figure 1A, B). Enlevez également les fleurs plus âgées sur la même inflorescence, ce qui pourrait potentiellement polliniser la fleur émasculée.
- Le matin, 24 heures plus tard, pollinisez les donneurs de stigmate avec les fleurs donneuses de pollen (p. ex., hébergeant des marqueurs de pollen ou de spermatozoïdes) qui excrètent facilement le pollen. La pollinisation est complète lorsque les stigmates sont presque entièrement recouverts de pollen (Figure 1B).
4. Dissection du septum
Figure 2 : Guide rapide de la dissection du septum et de la stigmatisation. (A) Étapes de la dissection du septum. Épinglez le pistil sur du ruban adhésif double face avec une aiguille de seringue à insuline et faites des incisions à la jonction ovare-ovaire et à la jonction ovaire-pédicule, suivies d’une coupure peu profonde le long du septum de l’un ou l’autre carpelle (étape 1). Décollez les parois du carpel sur le ruban (étape 2). Coupez le replum sous le septum supérieur (étape 3). Coupez le septum au niveau du style et retirez-le à l’aide d’une pince au niveau du pédicelle (étape 4). Placer le septum sur un support gélose et l’enfoncer doucement avec une pince. (B) Étapes de la dissection de la stigmatisation. Épingler le pistil (pollinisé <1 h avant) sur du ruban adhésif double face et couper à la jonction style-ovaire avec une lame de rasoir (étape 6). Placez le stigmate sur un milieu gélosé à l’aide d’une aiguille à insuline à côté du septum et ajustez la distance à environ 250 μm (étapes 7 et 8). Assurez-vous qu’une piscine semi-liquide se forme autour des micropyles et de la base des styles (étape 9). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Trente minutes après la pollinisation, ramassez des pistils de donneurs de septum sains et matures au pédicule et placez-les sur du ruban adhésif double face frais monté sur une lame de verre, avec le stigmate qui colle juste à côté du bord du ruban.
REMARQUE: Limitez le temps de dissection pendant lequel les pistils sont sur le ruban adhésif pour vous assurer qu’il est aussi court que possible. La dissection doit être effectuée à une humidité élevée, ce qui peut être réalisé en plaçant un humidificateur à côté de la lame. - Épinglez solidement le pistil sur la bande en appuyant doucement sur le pédicule et le long de l’ovaire à l’aide de la face arrière d’une nouvelle aiguille de seringue à insuline avant de retirer les débris de sépale, de pétale et d’étamine laissés par l’émasculation.
- Sous un stéréoscope, utilisez une aiguille de seringue à insuline pour effectuer deux coupures par carpelle à la jonction ovarienne et à la jonction ovaire-pédicule, suivies de coupures peu profondes le long du septum de chaque carpelle (figure 2, étape 1).
REMARQUE: Couper trop profondément le long du septum coupera les ovules au niveau du funicule. - Décollez délicatement les parois ovariennes sur le ruban (Figure 2, étape 2) et glissez doucement l’aiguille entre les deux septa pour couper le replum sur toute la longueur du pistil sans perturber les ovules (Figure 2, étape 3).
REMARQUE: Coupez le replum dans le sens allant du style au pédicule pour vous assurer que les ovules sur le septum supérieur sont perturbés le moins possible. - Coupez doucement le septum supérieur à la jonction avec le style et avec le pédicule, puis retirez le septum à l’aide d’une pince du côté du pédicule (Figure 2, étape 4).
REMARQUE: Gardez cette coupe droite et douce afin que le septum reste plat et ne se courbe pas. - Placez le septum aussi plat que possible sur le milieu de telle sorte que les micropyles des ovules soient orientés vers le haut et dans le même plan focal. Appuyez doucement sur le septum dans le milieu jusqu’à ce que les ovules soient légèrement incrustés dans le milieu (Figure 2, étape 5).
NOTE: Il est essentiel que le septum soit placé de manière à ce que les micropyles des ovules soient accessibles aux tubes polliniques (tout ovule inaccessible peut être réarrangé doucement avec une aiguille). Une petite flaque de liquide devrait se former autour du septum après l’incorporation. - Répétez les étapes 4.1-4.6 pour un maximum de deux autres pistils, en plaçant les septa bout à bout.
5. Dissection de la stigmatisation
- Placez les pistils pollinisés du donneur de stigmate sur du ruban adhésif double face frais monté sur une lame de verre, de sorte que la jonction de type ovaire soit hors du bord de la bande (figure 2, étape 6).
- Utilisez une lame de rasoir neuve pour couper le style droit vers le bas et soulevez-le pour garder le stigmate attaché à la lame (Figure 2, étape 6).
REMARQUE: Coupez au bord du ruban pour la coupe la plus propre. - Retirez le stigmate de la lame à l’aide d’une aiguille de seringue à insuline et placez-le à plat à environ 250-300 μm des ovules (Figure 2, étapes 7-8).
REMARQUE: Le style doit être orienté horizontalement sur le côté; Sinon, la plupart des tubes polliniques se développeront sous le septum. Une petite flaque de liquide à l’entrée du style devrait apparaître après qu’il ait été couché sur le milieu pendant 1 min; C’est un bon signe, car les tubes polliniques auront une sortie en douceur du style. - Répétez les étapes 5.1 à 5.3 pour un maximum de 12 stigmates, en plaçant deux de chaque côté de chaque septum. Cherchez une petite flaque de liquide se formant autour du micropyle des ovules; cela facilite l’accessibilité et le ciblage des tubes polliniques vers les sacs embryonnaires (Figure 2, étape 9).
REMARQUE: Limitez la durée d’ouverture du plat pour éviter que le milieu et les ovules ne se dessèchent.
6. Imagerie
Figure 3 : schéma d’imagerie SIV cum septum. (A) Installation complète du VIS et du septum avec 12 stigmates pollinisés et 3 septas, comme on le voit à travers un stéréoscope. (B) Images fusionnées de la configuration complète du SIV cum septum vues dans A 5 h après l’incubation en utilisant un objectif 10x, avec les cinq zones de vue d’ensemble (~ 1 mm chacune) marquées pour l’acquisition en plusieurs étapes. Les encadrés verts montrent les ovules qui ont reçu des tubes polliniques subissant une explosion explosive dans les synergides. C) Vue plus rapprochée de la zone d’ensemble 2 à différents moments. Environ 3 h après l’incubation dans la chambre d’humidité au microscope, les tubes polliniques devraient arriver près des micropyles, et à 6 h d’imagerie, la plupart des ovules devraient avoir reçu correctement des tubes polliniques (carrés verts); Ces ovules subissent alors un éclatement explosif du tube pollinique (astérisque). Barres d’échelle = (A) 5 mm, (B,C) 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Une fois la dissection terminée et la capsule prête à être imagée, laissez-la incuber dans une chambre d’humidité au microscope maintenue à 92% d’humidité relative et 21 ° C.
REMARQUE: Si aucune chambre d’humidité n’est disponible pour le microscope, tapisser les bords extérieurs du couvercle et de la capsule avec un petit volume d’eau aidera à maintenir un niveau élevé d’humidité dans le plat. - Faites la mise au point des échantillons sous fond clair à une faible intensité lumineuse, puis passez à la lumière fluorescente, en marquant les zones de l’échantillon sur la vue de la scène à imager.
NOTE: À un grossissement de 10x, environ cinq zones peuvent être marquées pour un total de trois septa (Figure 3). Limiter le temps nécessaire au marquage des zones de surveillance afin de minimiser la phototoxicité ou le réchauffement de l’échantillon par la lumière fluorescente. - Commencez l’imagerie à l’aide d’un schéma d’acquisition à plusieurs étages avec une fonction de mise au point automatique au début de chaque zone de vue d’ensemble. Comme les tubes polliniques émergeront du style ~ 1 h après l’incubation de l’échantillon, retarder l’acquisition de 2 h ou jusqu’à ce que les tubes polliniques aient atteint le micropyle. Assurez-vous que l’autofocus est réglé avec une plage de 100 μm (pas de 7 μm de grand et pas fins de 1 μm) pour garder les ovules au point lorsque les septa se déplacent et s’enfoncent légèrement au fil du temps.
- Arrêtez l’acquisition de l’image ~9 h après le début de l’incubation de l’échantillon, car à ce moment-là, la plupart des ovules devraient avoir attiré et reçu un tube pollinique.
REMARQUE: Si un faible nombre d’ovules attirent les tubes polliniques, une observation attentive de la boîte sous un stéréoscope est utile pour déterminer comment l’orientation de l’ovule ou du style pourrait être améliorée la prochaine fois.
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Representative Results
Pour évaluer le moment de la dégénérescence nucléaire dans la synergide réceptive par rapport à la rupture du tube pollinique chez Arabidopsis , ainsi que pour observer si le synergide gauche ou droit est prédestiné à devenir le synergide réceptif, la méthode SIV cum septum décrite ici a été utilisée en utilisant un marqueur nucléaire gamétophyte femelle empilé avec un marqueur cytosolique synergide (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) en tant que donneur de septum et marqueur gamétophyte mâle (pLAT52:R-GECO) en tant que donneur de pollen. Les septa et les stigmates pollinisés ont été disséqués 24 h après l’émasculation, conformément aux sections 4-5 du protocole, et placés sur des plats à fond de verre avec un milieu préparé la veille. Chaque plat a été placé dans une chambre d’humidité au microscope, et une expérience en plusieurs étapes a été réalisée à l’aide d’une lentille d’objectif 10x (ouverture numérique: 0,4) avec cinq zones de vue d’ensemble (Figure 3). Des images de chaque zone ont été prises toutes les 60 s pendant 9 h avec quatre canaux fluorescents : canal (1) 560/640 pour R-GECO (25 ms), canal (2) 488/520 pour roGFP2-ORP1 (60 ms), canal (3) 387/520 pour roGFP2-ORP1 (60 ms) et canal (4) 387/640 pour la soustraction de fond (60 ms) (tableau 1). Une fonction de mise au point automatique utilisant une plage de 100 μm avec un pas grossier de 7 μm et un pas fin de 1 μm a été utilisée pour chaque minute avant l’acquisition de l’image. Les cinq fichiers image ont été ouverts dans FIJI, les canaux ont été séparés, puis les images ont été manuellement mosaïquées ensemble (vidéo 2 et fichier supplémentaire 1).
Dans la vidéo 2 (voir aussi le dossier supplémentaire 1), 41 exemples de rupture explosive du tube pollinique dans les synergides peuvent être vus dans les ovules, avec des carrés verts marquant les régions d’intérêt. En utilisant la lignée de biocapteurs de calcium pLAT52:RGECO comme donneur de pollen, des cas de rupture explosive du tube pollinique ont été observés à l’extrémité des tubes polliniques où ils se lysent. Notamment, il y a eu une augmentation rapide de la luminosité du biocapteur en raison de son exposition soudaine à des niveaux élevés de calcium. La rupture explosive du tube pollinique peut également être analysée avec des marqueurs spermatozoïdes ou cytosoliques à base de GFP ou RFP, qui montrent également une libération rapide du sperme ou du contenu cytoplasmique. Lors de la rupture du tube pollinique, on a observé que le noyau de la synergie réceptive se dégradait simultanément (dans la résolution temporelle de 1 min dans l’expérience), et la migration du noyau de l’ovule vers le micropyle a également été observée lors de la rupture du tube pollinique à la suite de la karyogamie (vidéo 3 et dossier supplémentaire 1). Les synergides gauche et droite ont pu servir de synergie réceptive, et des cas de deux sursauts de tube pollinique ont été observés, d’abord dans la synergide réceptive et ensuite dans la synergide persistante. La vidéo 2 (voir également le dossier supplémentaire 1) montre 10 exemples de réception défectueuse du tube pollinique, qui peut être vu dans les ovules, avec les régions d’intérêt marquées par des carrés rouges. Ainsi, l’efficacité globale de la réception des tubes polliniques était de ~80% par rapport aux ovules qui attiraient les tubes polliniques. Dans ces cas infructueux, les tubes polliniques arrêtent leur croissance dans le micropyle, arrêtent leur croissance après la croissance rapide dans les synergides, ou ne parviennent pas à arrêter leur croissance et continuent à croître et à s’enrouler dans le sac embryonnaire. Les ovules sans aucune région d’intérêt indiquée n’ont pas réussi à attirer les tubes polliniques ou n’étaient pas dans une orientation accessible. Des exemples élargis de résultats négatifs et positifs peuvent être vus dans la vidéo 3 (voir également le dossier supplémentaire 1), montrant deux cas de réception défectueuse du tube pollinique (vidéo 3A, C et dossier supplémentaire 1), et deux cas de réception réussie du tube pollinique (vidéo 3B, D et dossier supplémentaire 1).
Figure 4 : Comparaison de l’efficacité de la méthode SIV. Huit répétitions techniques de la méthode des ovules excisés par le VIS (71 ovules totaux) n’ont montré que ~28% d’ovules avec des éclatements de tubes polliniques explosifs, ce qui a donné une efficacité allant de ~10% à 50%. Cinq répétitions techniques de la méthode SIV cum septum (8 septa et 102 ovules) ont montré ~79% d’ovules avec éclatement explosif du tube pollinique, résultant en une efficacité allant de ~70% à 100%. Seuls les ovules qui ont attiré les tubes polliniques vers le micropyle et les ovules qui ont eu suffisamment de temps enregistré pour recevoir le tube pollinique attiré ont été comptés. Le « X » désigne la moyenne et la ligne centrale la valeur médiane (50ecentile), respectivement. Les lignes à l’extérieur des quartiles supérieur et inférieur montrent les pourcentages minimum et maximum de réception réussie du tube pollinique. Le pourcentage d’ovules avec éclatement du tube pollinique était significativement différent (p < 0,001) entre les deux méthodes basées sur un test t non apparié. Abréviation : SIV = semi-in vitro. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Équipement/Réglage | Vidéo supplémentaire 2 & 3 |
| Microscope | Microscope inversé Olympus IX-81F-ZDC2 |
| Contrôle de la température | Life Imaging Services GmbH Cube & Box (22C) |
| Contrôle de l’humidité | Life Imaging Services GmbH Brique (92% d’humidité relative) |
| Logiciel | Olympus cellSens Dimension 2.3 |
| Contrôleur temps réel | Olympus U-RTC |
| Laser | MT20- Brûleur à arc au xénon de 150 W |
| Lentille d’objectif | Objectif SApo 10x immersion dans l’air U Plan (0,4 NA), distance de travail 3,1 mm |
| Cube miroir | GFP/DP |
| Roue filtrante | Olympus U-FFWO |
| Canal 1 (25 ms) : observation réfléchie (560/25) (624/40) | |
| Canal 2 (60 ms) : observation réfléchie (485/20) (525/30) | |
| Canal 3 (60 ms) : observation réfléchie (387/11) (525/30) | |
| Canal 4 (60 ms) : observation réfléchie (387/11) (624/30) | |
| Détecteur | Caméra CMOS numérique ORCA-Fusion de Hamamatsu |
| Mise au point automatique | Gamme de 100 μm, pas grossier de 7 μm, pas fin de 1 μm |
| Intervalle de temps | 1 min |
Tableau 1 : Les systèmes de microscope et les paramètres utilisés dans ce manuscrit.
Vidéo 1 : Timelapses de la méthode des ovules excisés par le VIS. Timelapse fusionné à partir de huit répétitions techniques du VIS utilisant des ovules excisés montrant la croissance des tubes polliniques (hébergeant pLAT52:R-GECO) et la réception du tube pollinique dans les ovules. Les 20 cases vertes montrent les cas d’éclatement explosif du tube pollinique dans les synergides, et les 51 cases rouges montrent les cas d’éclatement et de prolifération du tube pollinique échoué. Les intervalles de temps sont compris entre 260 min et 400 min, et la barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2: SIV cum septum timelapse. (A) Timelapse fusionné des cinq zones de vue d’ensemble (voir Figure 3) de la croissance et de la réception des tubes polliniques dans les ovules avec seulement le canal RFP (canal 1). Le pollen héberge pLAT52:R-GECO et les ovules pFG:roGFP2-ORP1-NLS; pMYB98:roGFP2-ORP1. Les 41 cases vertes montrent les cas d’éclatement explosif du tube pollinique, et les 10 cases rouges montrent les cas d’éclatement du tube pollinique et de prolifération du tube pollinique. (B) Le même timelapse avec les canaux RFP et GFP (canal 1 et canal 2), montrant la dynamique nucléaire dans les gamètes et les cellules synergiques lors de la réception du tube pollinique. Les chiffres en haut à droite indiquent l’heure (h:min). Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 3 : Exemples de résultats positifs et négatifs du VIS cum septum. (A,C) Exemple d’ovules tirés de la vidéo 2 montrant deux cas d’échec de la fécondation. Dans A, les tubes polliniques ne parviennent pas à arrêter la croissance et continuent à s’enrouler dans le sac embryonnaire. En C, une deuxième catégorie de prolifération dans les tubes polliniques est observée, où le premier tube pollinique subit une croissance rapide à mesure qu’il se développe dans la synergie, mais arrête la croissance sans se rompre. (B, D) Exemple d’ovules tirés de la vidéo 2 montrant deux cas de réception réussie du tube pollinique. L’éclatement du tube pollinique de type sauvage montre la rupture explosive du tube pollinique dans les synergides, et la migration du noyau de l’ovule vers le micropyle indique une karyogamie. Les chiffres en haut à droite indiquent l’heure (h:min). Les pointes de flèches indiquent les noyaux synergiques réceptifs (rSN) et les flèches indiquent la migration du noyau de l’ovule (EN) après l’éclatement du tube pollinique (lyse). Barre d’échelle = 30 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Fichier supplémentaire 1 : images fixes de la vidéo 1, de la vidéo 2 et de la vidéo 3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ce manuscrit présente un protocole efficace pour l’imagerie de la réception du tube pollinique et de la double fécondation chez Arabidopsis. La méthode améliorée, SIV cum septum, augmente considérablement le pourcentage et le nombre total d’événements de réception réussie du tube pollinique qui sont observables par séance d’imagerie. Les résultats représentatifs présentés ici démontrent une séance d’imagerie avec 41 événements de réception réussie du tube pollinique et 10 ovules présentant des défauts de réception (~80% d’efficacité). C’est plus du double du nombre d’événements de réception réussie du tube pollinique capturés au cours d’un total de huit séances d’imagerie utilisant la méthode originale des ovules excisés par le VIS (vidéo 1). En utilisant la méthode SIV cum septum dans cinq réplicats techniques pour un total de huit septa, nous avons atteint une efficacité moyenne de réception du tube pollinique de 79% contre une moyenne de 28% en utilisant la méthode du septum excisé SIV avec huit répétitions techniques (Figure 4).
Bien que l’efficacité de la réception du tube pollinique soit beaucoup plus grande pour la méthode SIV cum septum , les cas de prolifération du tube pollinique se produisent encore à des rythmes variables, en fonction de plusieurs facteurs. Plus important encore, les cellules synergiques doivent être maintenues en vie et réceptives pendant les quelques heures pendant lesquelles elles sont imagées. Le maintien d’un environnement humide pendant la dissection et l’imagerie, l’utilisation d’un milieu fraîchement fabriqué, l’intégration des ovules et du septum dans la gélose semi-liquide et l’évitement de la chaleur générée par une exposition excessive à la lumière lors de l’acquisition de l’image sont tous des facteurs cruciaux pour assurer une réception réussie du tube pollinique. L’accessibilité et l’attraction des tubes polliniques vers les micropyles des ovules sont également des facteurs clés qui limitent le nombre d’événements de réception réussie des tubes polliniques. Minimiser la perturbation des ovules sur le septum pendant la dissection, orienter le septum de telle sorte que les micropyles soient orientés vers le haut et la formation d’une piscine semi-liquide entre les ovules et l’ouverture du style sont essentiels pour l’attraction du tube pollinique. La formation de ce pool peut varier d’une marque de gélose à bas point de fusion, et il est donc recommandé de commencer les expériences avec des pourcentages variables de gélose de 1% à 1,5%. Enfin, la difficulté de la dissection nécessite un peu de pratique, et il est recommandé de rester patient, de pratiquer la relaxation et la respiration profonde avant la dissection, et, surtout, de noter les techniques qui améliorent la stabilité et la cohérence (par exemple, le positionnement de la main, l’orientation de la glissière).
Ce protocole détaillé de la méthode SIV cum septum devrait grandement améliorer l’efficacité et le nombre d’échantillons pour les expériences visant l’imagerie en direct de la réception du tube pollinique et de la double fécondation. Les applications comprennent l’utilisation de biocapteurs génétiquement codés, l’analyse des mutants et les observations descriptives des événements cytologiques avant, pendant et juste après la double fécondation. Nous espérons que cette méthode pourra être étendue à d’autres espèces de plantes à fleurs où le maintien des ovules sur le placenta de l’ovaire pourrait être bénéfique.
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Disclosures
Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Sara Simonini et Stefano Bencivenga pour le don de la construction pFG:roGFP2-ORP1-NLS et Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter et Celia Baroux pour leurs conseils sur la microscopie. Nous remercions Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima et tous les autres participants à la Conférence internationale sur la reproduction sexuée des plantes 2022 qui ont manifesté leur intérêt pour un protocole sur le VIS cum septum. Ces travaux ont été soutenus par l’Université de Zurich et des subventions du Fonds national suisse à U.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
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