Summary
यहां, हम एराबिडोप्सिस थैलियाना में पराग ट्यूब मार्गदर्शन और रिसेप्शन का अवलोकन करने के लिए सेमी-इन विट्रो (एसआईवी) विधि के सुधार का वर्णन करते हैं, जो अंडाणुओं की ग्रहणशीलता को बढ़ाता है। निषेचन की गतिशील प्रक्रिया की निगरानी के लिए उच्च-थ्रूपुट एसआईवी सह सेप्टम विधि को गैमेटोफाइट मार्कर लाइनों और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर के साथ जोड़ा जा सकता है।
Abstract
फूलों के पौधों में, पिस्टिल के भीतर पराग ट्यूब (नर गैमेटोफाइट) की वृद्धि और मार्गदर्शन और मादा गैमेटोफाइट द्वारा पराग ट्यूब का रिसेप्शन डबल निषेचन और बाद में बीज विकास के लिए आवश्यक है। पराग ट्यूब रिसेप्शन के दौरान नर और मादा गैमेटोफाइट्स के बीच बातचीत पराग ट्यूब टूटने और दोहरे निषेचन को प्रभावित करने के लिए दो शुक्राणु कोशिकाओं की रिहाई में समाप्त होती है। चूंकि पराग ट्यूब विकास और डबल निषेचन फूल के ऊतकों के भीतर गहराई से छिपे हुए हैं, इस प्रक्रिया को विवो में देखना मुश्किल है।
मॉडल पौधे एराबिडोप्सिस थैलियाना में निषेचन की लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक अर्ध-इन विट्रो (एसआईवी) विधि विकसित की गई है और कई जांचों में लागू की गई है। इन अध्ययनों ने फूलों के पौधों में निषेचन प्रक्रिया कैसे होती है और नर और मादा गैमेटोफाइट्स की बातचीत के दौरान कौन से सेलुलर और आणविक परिवर्तन होते हैं, इसकी मूलभूत विशेषताओं को स्पष्ट करने में मदद की है। हालांकि, क्योंकि इन लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों में व्यक्तिगत अंडाणुओं का छांटना शामिल है, वे प्रति इमेजिंग सत्र में कम संख्या में टिप्पणियों तक सीमित हैं, जिससे यह दृष्टिकोण थकाऊ और बहुत समय लेने वाला हो जाता है। अन्य तकनीकी कठिनाइयों के अलावा, विट्रो में अंडाणुओं को निषेचित करने के लिए पराग ट्यूबों की विफलता अक्सर रिपोर्ट की जाती है, जो इस तरह के विश्लेषणों को गंभीर रूप से भ्रमित करती है।
यहां, एक स्वचालित और उच्च-थ्रूपुट तरीके से पराग ट्यूब रिसेप्शन और निषेचन की इमेजिंग के लिए एक विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जिससे पराग ट्यूब रिसेप्शन और प्रति इमेजिंग सत्र टूटने के 40 अवलोकनों की अनुमति मिलती है। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर और मार्कर लाइनों के उपयोग के साथ युग्मित, यह विधि कम समय निवेश के साथ बड़े नमूना आकारों की पीढ़ी को सक्षम बनाती है। फूलों के मंचन, विच्छेदन, मध्यम तैयारी और इमेजिंग सहित तकनीक की बारीकियों और महत्वपूर्ण बिंदुओं को स्पष्ट रूप से वीडियो प्रारूप में विस्तृत किया गया है ताकि पराग ट्यूब मार्गदर्शन, रिसेप्शन और डबल निषेचन की गतिशीलता पर भविष्य के शोध की सुविधा मिल सके।
Introduction
यौन प्रजनन करने वाले जीवों में आनुवंशिक रूप से अद्वितीय संतानों की पीढ़ी नर और मादा युग्मकों के सफल संलयन पर निर्भर है। फूलों के पौधों में, दोहरे निषेचन के दौरान दो मादा युग्मकों (अंडा कोशिका और केंद्रीय कोशिका) के साथ दो नर युग्मकों (शुक्राणु कोशिकाओं) की बातचीत पराग ट्यूब (पुरुष गैमेटोफाइट) से शुक्राणु रिलीज पर निर्भर करती है। यह प्रक्रिया, जिसे पराग ट्यूब रिसेप्शन कहा जाता है, काफी हद तक सिनर्जिड कोशिकाओं द्वारा नियंत्रित होती है जो भ्रूण थैली (मादा गैमेटोफाइट) 1,2 के भीतर रहती हैं। चूंकि पराग ट्यूब रिसेप्शन फूल के अंदर गहराई से होता है, प्रक्रिया की लाइव-सेल इमेजिंग की अनुमति देने वाली एक विधि, जिसे सेमी-इन विट्रो (एसआईवी) पराग ट्यूब रिसेप्शन कहा जाता है, स्थापित किया गया है। इस विधि के साथ, एराबिडोप्सिस डिंब्यूल्स को अर्ध-तरल पराग अंकुरण माध्यम पर रखा जाता है और पराग ट्यूबों द्वारा लक्षित किया जाता है जो शैली-संचारित पथ जंक्शन 3,4 पर अलग किए गए पिस्टिल के कलंक और शैली के माध्यम से बढ़ते हैं। इस तकनीक के विकास के बाद से, विस्तृत टिप्पणियों ने पराग ट्यूब मार्गदर्शन, रिसेप्शन और निषेचन के आसपास कई खोजों को जन्म दिया है। दूसरों के अलावा, इन खोजों में कलंक 3 के माध्यम से विकास द्वारा पराग ट्यूब लक्ष्यीकरण क्षमता का अधिग्रहण, पराग ट्यूब आगमन 5,6,7,8,9 पर सिनर्जिड्स में इंट्रासेल्युलर कैल्शियम दोलनों की शुरुआत, और पराग ट्यूब फटने पर शुक्राणु कोशिका रिलीज और निषेचन की गतिशीलता10 शामिल है . फिर भी, क्योंकि यह तकनीक अंडाणुओं के छांटने पर निर्भर करती है, निषेचन के अवलोकन संख्या में सीमित होते हैं, और पराग ट्यूब रिसेप्शन अक्सर असामान्य होता है, जिसके परिणामस्वरूप पराग ट्यूब टूटने की विफलता होती है (वीडियो 1 और पूरक फ़ाइल 1)। इसलिए, पराग ट्यूब रिसेप्शन और निषेचन के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति देने के लिए एक अधिक कुशल दृष्टिकोण की आवश्यकता है।
इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में, पराग ट्यूब रिसेप्शन का विश्लेषण करने के लिए कई नए दृष्टिकोण, जो सबसे "इन विट्रो" से लेकर सबसे "विवो" विधियों तक फैले हुए थे, का परीक्षण किया गया था, और पूरे सेप्टम के छांटने के आधार पर एक कुशल तकनीक पर फैसला किया गया था, जो प्रति दिन निषेचन के 40 अवलोकनों की अनुमति देता है। यहां, तकनीक की बारीकियों और महत्वपूर्ण बिंदुओं को रेखांकित किया गया है, जिसमें फूल मंचन, विच्छेदन, मध्यम तैयारी और इमेजिंग सेटिंग्स शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल का पालन करके, पराग ट्यूब मार्गदर्शन, पराग ट्यूब रिसेप्शन और डबल निषेचन पर ध्यान केंद्रित करने वाले अनुसंधान को सुविधाजनक बनाया जाना चाहिए। विधि के लिए उच्च नमूना आकार की अनुमति देता है, लाइव इमेजिंग प्रयोगों से निकाले गए निष्कर्षों की वैज्ञानिक सुदृढ़ता को बढ़ावा देने की उम्मीद है। इस तकनीक के संभावित अनुप्रयोगों में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर के उपयोग के माध्यम से गैमेटोफाइट इंटरैक्शन के दौरान साइटोसोलिक कैल्शियम सांद्रता ([सीए2 +]साइट), पीएच, या एच2ओ2 में आणविक और शारीरिक परिवर्तनों के अवलोकन शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। इसके अलावा, साइटोलॉजिकल परिवर्तन, जैसे कि ग्रहणशील सिनर्जिड का अध: पतन, शुक्राणु कोशिका प्रवास, या कैरियोगैमी, इस बेहतर विधि का उपयोग करके अधिक आसानी से देखा जा सकता है। अंत में, निषेचन के विभिन्न चरणों के समय की निगरानी वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी के तहत की जा सकती है, और फिर उच्च रिज़ॉल्यूशन और 3 डी पुनर्निर्माण के लिए कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) या दो-फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी (2पीईएम) का उपयोग करके अधिक विस्तृत विश्लेषण किया जा सकता है।
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Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों और उपकरणों की सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. इमेजिंग प्रयोग को डिजाइन करने के लिए विचार
- देखी जाने वाली वांछित घटना को पकड़ने के लिए आवश्यक इमेजिंग अवधि और नमूना आवृत्ति को पूर्वनिर्धारित करें। उदाहरण के लिए, Nyquist के नमूना प्रमेय के बाद, नमूना आवृत्ति इनपुट नमूने की उच्चतम आवृत्ति से दोगुनी से अधिक होनी चाहिए। इसलिए, सिनर्जिड [सीए2 +] साइट दोलनों को सटीक रूप से पकड़ने के लिए, लगभग हर 10 सेकंड में इमेजिंग करें, लेकिन पराग ट्यूब निर्वहन पर शुक्राणु कोशिकाओं के वेग को मापने के लिए, 1 एस10 से कम का अस्थायी रिज़ॉल्यूशन सुनिश्चित करें।
- रुचि की कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट मार्करों का चयन करें जो पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस से परे पर्याप्त उज्ज्वल हैं। बायोसेंसर के उपयोग के लिए, सबसे चमकीली रेखाओं का चयन करें जो सेल फ़ंक्शन को परेशान नहीं करती हैं, क्योंकि वे आम तौर पर अधिक संवेदनशील होती हैं और कम एक्सपोजर समय की आवश्यकता होती है।
- विचार करें कि वांछित घटना को पकड़ने के लिए किस प्रकार की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और आवर्धन सबसे उपयुक्त हैं। क्षेत्र की अधिक गहराई से प्रकाश को पकड़ने के लिए वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी और कम-आवर्धन उद्देश्यों का उपयोग करें, और समय के साथ ध्यान बनाए रखें, पूरे अंडाणुओं जैसी बड़ी वस्तुओं की छवि बनाएं, या अनुपातमित सेंसर का उपयोग करें जो क्रोमैटिक शिफ्ट कलाकृतियों के प्रति संवेदनशील हैं। सेलुलर और उपकोशिकीय वस्तुओं के बेहतर समाधान के लिए उच्च-आवर्धन उद्देश्यों के साथ सीएलएसएम या 2पीईएम का उपयोग करें, लेकिन समय के साथ ध्यान केंद्रित करने में कठिनाई पर ध्यान दें।
- प्रति प्रयोग चित्रित किए जाने वाले नमूनों की संख्या का अनुमान लगाएं। उदाहरण के लिए, ऑटोफोकस और बहु-चरण अधिग्रहण कार्यों के लिए आवश्यक समय के कारण प्रति प्रयोग तीन सेप्टा और 40 निषेचन घटनाओं तक इमेजिंग के लिए ~ 30 सेकंड के न्यूनतम नमूना समय के साथ 10x उद्देश्य का उपयोग करें।
2. पराग अंकुरण मध्यम तैयारी
- प्रत्येक सूक्ष्म पोषक तत्व के 1 एम एलिकोट स्टॉक का उपयोग करके तरल पराग अंकुरण माध्यम (5 mM CaCl2, 1mM MgSO4, 5mM KCl, 0.01% [w/v] H3BO3, और 10% [w/v] सुक्रोज) तैयार करें, जो -20 °C पर संग्रहीत होते हैं। 0.1 एम कोह के साथ पीएच को 7.5 में समायोजित करें। माध्यम को 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: पीएच समय के साथ गिर सकता है। - 10 एमएल बीकर में 2.5 एमएल तरल माध्यम जोड़ें, और धीरे-धीरे झुरमुट से बचने के लिए तेजी से घूमने वाली हलचल पट्टी के साथ 32 मिलीग्राम अल्ट्रा-लो पिघलने बिंदु अगारोस (~ 1.3%) जोड़ें।
- 65 डिग्री सेल्सियस पर एक हॉटप्लेट पर अगारोस पिघलाएं, और किनारों से किसी भी संघनन को इकट्ठा करने के लिए बीकर को नट करें।
- पिपेट 130 μL माध्यम को 35 मिमी ग्लास बॉटम डिश के 14 मिमी कुएं में डाल देता है, और डिश को तब तक घुमाता है जब तक कि माध्यम कुएं को कवर न करे।
- पकवान के केंद्र से एक पिपेट के साथ कुल 40 μL को एस्पिरेटेड करें, जिससे कुल मात्रा 90 μL हो गई।
नोट: कम कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए कुएं से अधिक माध्यम को बाहर निकाला जा सकता है; यह कम कामकाजी दूरी के साथ उच्च-आवर्धन उद्देश्यों के लिए आवश्यक हो सकता है। हालांकि, अगर पैड जितना पतला होगा, उतनी ही जल्दी यह सूख जाएगा। - शीतलन सुनिश्चित करने के लिए आर्द्रता कक्ष में एल्यूमीनियम ब्लॉक पर पकवान को ठंडा करें। अगली सुबह उपयोग के लिए प्लेटों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
3. सेप्टम दाताओं, कलंक दाताओं और पराग दाताओं का पुष्प मंचन
चित्र 1: सेप्टम दाताओं, कलंक दाताओं और पराग दाताओं का पुष्प मंचन। (ए) पुष्पक्रम के भीतर एराबिडोप्सिस फूलों (एलईआर -0) के चरण। स्टेज 12 बी पर कलियों, जिनमें पंखुड़ियां होती हैं जो खुलने वाली होती हैं और पीले रंग की होती हैं, को सभी सेपल, पंखुड़ियों और स्टैमेंस को हटाकर अनुकरण किया जाना चाहिए। पिस्टिल्स (मादा गैमेटोफाइट निर्माता को आश्रय देना) तब 24 घंटे बाद सेप्टम दाताओं के रूप में उपयोग करने योग्य होते हैं। (बी) पुष्पक्रम के भीतर एराबिडोप्सिस फूलों (कोल -0) के चरण। स्टेज 12 बी पर कलियों, जिनमें पीले रंग के गर्भनाल और कलंक होते हैं जो पंखुड़ियों से मुश्किल से उभर रहे होते हैं, को सभी सेपल, पंखुड़ियों और स्टैमेंस को हटाकर अनुकरण किया जाना चाहिए। पिस्टिल तब 24 घंटे बाद कलंक दाताओं के रूप में उपयोग करने योग्य होते हैं, जब उन्हें फूलों (नर गैमेटोफाइट मार्कर को आश्रय देते हुए) द्वारा परागित किया जाना चाहिए जो खुले होते हैं और पराग को बहाते हैं। परागण के 1 घंटे के भीतर परागित कलंक को विच्छेदित किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- इमेजिंग से पहले सुबह, एराबिडोप्सिस पौधों को सेप्टम दाताओं और कलंक दाताओं के रूप में उपयोग करने के लिए चुनें; सुनिश्चित करें कि वे स्वस्थ हैं और हाल ही में सिलिक का उत्पादन शुरू कर दिया है।
नोट: लैंड्सबर्ग इरेक्टा (एलईआर -0) सेप्टम दाता के रूप में उपयोग के लिए एक अच्छा परिग्रहण है, क्योंकि इसके सेप्टा मजबूत हैं, और अंडाणुओं के बीच छोटे इंटरनोड हैं। कोलंबिया (कोल -0) एक कलंक दाता के रूप में उपयोग करने के लिए एक अच्छा परिग्रहण है क्योंकि वे पराग ट्यूब के विकास के लिए अनुकूल प्रतीत होते हैं। - कम से कम तीन चरण 12 बी सेप्टम दाता फूलों और 12 चरण 12 बी कलंक दाता फूलों को उनके स्टैमेंस, सेपल और पंखुड़ियों को हटाकर मैस्कुलेट करें (चित्रा 1 ए, बी)। उसी पुष्पक्रम पर पुराने फूलों को भी हटा दें, जो संभावित रूप से सुगंधित फूल को परागित कर सकते हैं।
- सुबह में, 24 घंटे बाद, पराग दाता के फूलों (जैसे, पराग ट्यूब या शुक्राणु कोशिका मार्करों को आश्रय देना) के साथ कलंक दाताओं को परागित करें जो आसानी से पराग को बहा रहे हैं। परागण तब पूरा होता है जब कलंक लगभग पूरी तरह से पराग के साथ कवर होते हैं (चित्रा 1 बी)।
4. सेप्टम विच्छेदन
चित्र 2: सेप्टम और कलंक विच्छेदन के लिए एक त्वरित मार्गदर्शिका। (ए) सेप्टम विच्छेदन के चरण। इंसुलिन सिरिंज सुई के साथ दो तरफा टेप पर पिस्टिल को पिन करें, और स्टाइल-अंडाशय जंक्शन और अंडाशय-पेडिकल जंक्शन पर कटौती करें, इसके बाद कार्पेल (चरण 1) के सेप्टम के साथ उथला कट लगाएं। कार्पेल की दीवारों को टेप पर वापस छीलें (चरण 2)। शीर्ष सेप्टम (चरण 3) के नीचे रिप्लम काटें। शैली में सेप्टम को काटें, और पेडिकेल (चरण 4) पर बल का उपयोग करके हटा दें। सेप्टम को आगर मीडिया पर रखें, और बल के साथ धीरे से एम्बेड करें। (बी) कलंक विच्छेदन के कदम। दो तरफा टेप पर पिस्टिल (परागण <1 घंटे पहले) पिन करें, और रेजर ब्लेड (चरण 6) के साथ स्टाइल-अंडाशय जंक्शन पर काटें। सेप्टम के बगल में इंसुलिन सुई के साथ आगर माध्यम पर कलंक रखें, और दूरी को लगभग 250 μm (चरण 7-8) तक समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि शैलियों के माइक्रोपाइल और आधार के चारों ओर एक अर्ध-तरल पूल बनता है (चरण 9)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- परागण के तीस मिनट बाद, पेडिकल पर स्वस्थ और परिपक्व सेप्टम डोनर पिस्टिल इकट्ठा करें, और उन्हें कांच की स्लाइड पर लगे ताजा दो तरफा चिपचिपे टेप पर रखें, जिसमें कलंक टेप के किनारे से चिपका हुआ है।
नोट: विच्छेदन समय को सीमित करें जिसके लिए पिस्टिल चिपचिपा टेप पर हैं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह यथासंभव छोटा है। विच्छेदन उच्च आर्द्रता पर आयोजित किया जाना चाहिए, जिसे स्लाइड के बगल में ह्यूमिडिफायर रखकर प्राप्त किया जा सकता है। - इमैक्यूलेशन से बचे सेपल, पंखुड़ी और स्टैमेन मलबे को हटाने से पहले एक नई इंसुलिन सिरिंज सुई के पीछे की ओर का उपयोग करके पेडिकल पर और अंडाशय के साथ धीरे से दबाकर पिस्टिल को टेप पर सुरक्षित रूप से पिन करें।
- एक स्टीरियोस्कोप के तहत, स्टाइल-अंडाशय जंक्शन और अंडाशय-पेडिकल जंक्शन पर प्रति कार्पेल दो कट बनाने के लिए इंसुलिन सिरिंज सुई का उपयोग करें, इसके बाद प्रत्येक कार्पेल के सेप्टम के साथ उथले कट (चित्रा 2, चरण 1)।
नोट: सेप्टम के साथ बहुत गहराई से काटने से फनीकुलस में डिंब टूट जाएंगे। - अंडाशय की दीवारों को टेप पर सावधानीपूर्वक वापस छीलें (चित्रा 2, चरण 2), और अंडाणुओं को परेशान किए बिना पिस्टिल की पूरी लंबाई के साथ रिप्लम को काटने के लिए दो सेप्टा के बीच सुई को धीरे से स्लाइड करें (चित्रा 2, चरण 3)।
नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि शीर्ष सेप्टम पर डिंब जितना संभव हो उतना कम परेशान होते हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए शैली से पेडिकल तक की दिशा में रिप्लम को काटें। - शीर्ष सेप्टम को शैली के साथ और पेडिकल के साथ जंक्शन पर धीरे से काटें, और पेडिकल साइड से बल के साथ सेप्टम को हटा दें (चित्रा 2, चरण 4)।
नोट: इस कट को सीधा और कोमल रखें ताकि सेप्टम सपाट रहे और घुमावदार न हो। - सेप्टम को माध्यम पर यथासंभव सपाट रखें ताकि अंडाणुओं के माइक्रोपाइल्स सामने और एक ही फोकल प्लेन में हों। सेप्टम को धीरे से माध्यम में दबाएं जब तक कि डिंब माध्यम में थोड़ा एम्बेडेड न हो जाएं (चित्रा 2, चरण 5)।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि सेप्टम को इस तरह रखा जाए कि अंडाणुओं के माइक्रोपाइल पराग ट्यूबों के लिए सुलभ हों (किसी भी दुर्गम अंडाणु को धीरे से सुई के साथ पुनर्व्यवस्थित किया जा सकता है)। एम्बेड करने के बाद सेप्टम के चारों ओर तरल का एक छोटा पूल बनना चाहिए। - सेप्टा को अंत तक रखते हुए, दो और पिस्टिल के लिए चरण 4.1-4.6 दोहराएं।
5. कलंक विच्छेदन
- परागित कलंक दाता पिस्टिल्स को कांच की स्लाइड पर लगाए गए ताजा दो तरफा चिपचिपे टेप पर रखें, जैसे कि अंडाशय-शैली जंक्शन टेप के किनारे से दूर है (चित्रा 2, चरण 6)।
- शैली को सीधे काटने के लिए एक ताजा रेजर ब्लेड का उपयोग करें और ब्लेड से जुड़े कलंक को बनाए रखने के लिए उठाएं (चित्रा 2, चरण 6)।
नोट: सबसे साफ कट के लिए टेप के किनारे पर काटें। - इंसुलिन सिरिंज सुई के साथ ब्लेड से कलंक को हटा दें, और इसे अंडाणुओं से लगभग 250-300 μm सपाट रखें (चित्र 2, चरण 7-8)।
नोट: शैली को इसके पक्ष में क्षैतिज रूप से उन्मुख किया जाना चाहिए; अन्यथा, अधिकांश पराग ट्यूब सेप्टम के नीचे विकसित होंगे। शैली के प्रवेश पर तरल का एक छोटा पूल 1 मिनट के लिए माध्यम पर लेटने के बाद दिखाई देना चाहिए; यह एक अच्छा संकेत है, क्योंकि पराग ट्यूबों में शैली से एक चिकनी निकास होगा। - 12 कलंकों के लिए चरण 5.1-5.3 दोहराएं, प्रत्येक सेप्टम के दोनों ओर दो रखें। डिंब के माइक्रोपाइल के चारों ओर बनने वाले तरल के एक छोटे पूल की तलाश करें; यह भ्रूण की थैली के लिए पराग ट्यूबों की पहुंच और लक्ष्यीकरण में सहायता करता है (चित्रा 2, चरण 9)।
नोट: माध्यम और अंडाणुओं को सूखने से रोकने के लिए पकवान के खुले होने की मात्रा को सीमित करें।
6. इमेजिंग
चित्रा 3: एसआईवी सह सेप्टम इमेजिंग योजना। (ए) 12 परागण ति कलंक और 3 सेप्टा के साथ पूर्ण एसआईवी सह सेप्टम सेटअप, जैसा कि स्टीरियोस्कोप के माध्यम से देखा जाता है। (बी) 10x उद्देश्य का उपयोग करके इनक्यूबेशन के बाद A 5 घंटे में देखे गए पूर्ण SIV सह सेप्टम सेटअप की मिश्रित छवियां, जिसमें मल्टीस्टेज अधिग्रहण के लिए चिह्नित पांच अवलोकन क्षेत्र (~ 1 मिमी प्रत्येक) थे। हरे रंग के बक्से उन अंडाणुओं को दिखाते हैं जिन्हें पराग ट्यूब प्राप्त होते हैं जो सिनर्जिड्स में विस्फोटक विस्फोट से गुजरते हैं। (ग) विभिन्न समय बिंदुओं पर अवलोकन क्षेत्र 2 का निकट दृश्य। माइक्रोस्कोप पर आर्द्रता कक्ष में इंजेक्शन लगाने के लगभग 3 घंटे बाद, पराग ट्यूबों को माइक्रोपाइल्स के पास पहुंचना चाहिए, और इमेजिंग के 6 घंटे तक, अधिकांश अंडाणुओं को पराग ट्यूब (हरे वर्ग) ठीक से प्राप्त होना चाहिए; ये अंडाणु तब विस्फोटक पराग ट्यूब फटने (तारांकन) से गुजरते हैं। स्केल बार = (A) 5 मिमी, (B, C) 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- एक बार विच्छेदन हो जाने के बाद और पकवान छवि बनाने के लिए तैयार हो जाता है, तो इसे 92% सापेक्ष आर्द्रता और 21 डिग्री सेल्सियस पर बनाए गए माइक्रोस्कोप पर आर्द्रता कक्ष में इनक्यूबेट करने दें।
नोट: यदि माइक्रोस्कोप के लिए कोई आर्द्रता कक्ष उपलब्ध नहीं है, तो ढक्कन और पकवान के बाहरी किनारों को पानी की थोड़ी मात्रा के साथ अस्तर करने से पकवान में आर्द्रता का उच्च स्तर बनाए रखने में मदद मिलेगी। - कम प्रकाश तीव्रता पर उज्ज्वल क्षेत्र के तहत नमूनों को फोकस में लाएं, और फिर फ्लोरोसेंट लाइट पर स्विच करें, जो छवि के लिए मंच अवलोकन पर नमूने के क्षेत्रों को चिह्नित करते हैं।
नोट: 10x आवर्धन पर, लगभग पांच क्षेत्रों को कुल तीन सेप्टा (चित्रा 3) के लिए चिह्नित किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट लाइट द्वारा फोटोटॉक्सिसिटी या नमूने के वार्मिंग को कम करने के लिए अवलोकन क्षेत्रों को चिह्नित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले समय की मात्रा को सीमित करें। - प्रत्येक अवलोकन क्षेत्र की शुरुआत में ऑटोफोकस फ़ंक्शन के साथ एक बहु-चरण अधिग्रहण योजना का उपयोग करके इमेजिंग शुरू करें। चूंकि पराग ट्यूब नमूने को इनक्यूबेट करने के बाद शैली ~ 1 घंटे से उभरेंगे, अधिग्रहण में 2 घंटे की देरी करें या जब तक पराग ट्यूब माइक्रोपाइल तक नहीं पहुंच जाते। सुनिश्चित करें कि ऑटोफोकस को 100 μm रेंज (7 μm बड़े कदम और 1 μm ठीक चरणों) के साथ सेट किया गया है ताकि अंडा को फोकस में रखा जा सके क्योंकि सेप्टा थोड़ा हिलता है और समय के साथ डूबता है।
- नमूना इनक्यूबेशन शुरू करने के बाद छवि अधिग्रहण ~ 9 घंटे बंद करें, क्योंकि इस समय तक, अधिकांश अंडाणुओं को पराग ट्यूब को आकर्षित और प्राप्त करना चाहिए था।
नोट: यदि कम संख्या में अंडाणु पराग ट्यूबों को आकर्षित करते हैं, तो स्टीरियोस्कोप के तहत पकवान का सावधानीपूर्वक अवलोकन यह निर्धारित करने के लिए उपयोगी है कि अगली बार डिंब या शैली अभिविन्यास में सुधार कैसे किया जा सकता है।
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Representative Results
एराबिडोप्सिस में पराग ट्यूब टूटने के संबंध में ग्रहणशील सिनर्जिड में परमाणु अध: पतन के समय का आकलन करने के लिए, साथ ही यह देखने के लिए कि क्या बाएं या दाएं सिनर्जिड को ग्रहणशील सिनर्जिड बनने के लिए पूर्वनिर्धारित किया गया है, यहां वर्णित एसआईवी कम सेप्टम विधि को एक महिला गैमेटोफाइट परमाणु मार्कर का उपयोग करके नियोजित किया गया था जो एक सिनर्जिड साइटोसोलिक मार्कर (पीएफजी) के साथ स्टैक किया गया था। roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98: roGFP2-ORP1) सेप्टम दाता के रूप में और एक पुरुष गैमेटोफाइट मार्कर (pLAT52: R-GECO) पराग दाता के रूप में। प्रोटोकॉल की धारा 4-5 के अनुसार, सेप्टा और परागण ति कलंक को अनुकरण के 24 घंटे बाद विच्छेदित किया गया था, और एक दिन पहले तैयार किए गए माध्यम के साथ कांच के निचले व्यंजनों पर रखा गया था। प्रत्येक डिश को माइक्रोस्कोप पर एक आर्द्रता कक्ष में रखा गया था, और पांच अवलोकन क्षेत्रों (चित्रा 3) के साथ 10x उद्देश्य लेंस (संख्यात्मक एपर्चर: 0.4) का उपयोग करके एक बहुस्तरीय प्रयोग किया गया था। प्रत्येक क्षेत्र की छवियों को चार फ्लोरोसेंट चैनलों के साथ 9 घंटे के लिए हर 60 सेकंड में लिया गया था: चैनल (1) आर-जीईसीओ (25 एमएस) के लिए 560/640, आरओजीएफपी 2-ओआरपी 1 (60 एमएस) के लिए चैनल (2) 488/520, आरओजीएफपी 2-ओआरपी 1 (60 एमएस) के लिए चैनल (3) 387/520, और चैनल (4) 387/640 पृष्ठभूमि घटाव के लिए (तालिका 1)। छवि अधिग्रहण से पहले प्रत्येक मिनट के लिए 100 μm रेंज का उपयोग करके एक ऑटोफोकस फ़ंक्शन नियोजित किया गया था, जिसमें 7 μm मोटे स्टेपिंग और 1 μm ठीक स्टेपिंग शामिल थे। पांच छवि फ़ाइलों को फिजी में खोला गया था, चैनलों को अलग किया गया था, और फिर छवियों को मैन्युअल रूप से एक साथ टाइल किया गया था (वीडियो 2 और पूरक फ़ाइल 1)।
वीडियो 2 में (पूरक फ़ाइल 1 भी देखें), सिनर्जिड्स में विस्फोटक पराग ट्यूब टूटने के 41 उदाहरण डिंब के भीतर देखे जा सकते हैं, जिसमें हरे वर्ग रुचि के क्षेत्रों को चिह्नित करते हैं। पराग दाता के रूप में कैल्शियम बायोसेंसर लाइन पीएलएटी 52: आरजीईसीओ का उपयोग करते हुए, पराग ट्यूबों की युक्तियों पर विस्फोटक पराग ट्यूब टूटने के उदाहरण देखे गए थे जहां वे लाइस करते हैं। विशेष रूप से, कैल्शियम के उच्च स्तर के अचानक संपर्क के परिणामस्वरूप बायोसेंसर की चमक में तेजी से वृद्धि हुई थी। विस्फोटक पराग ट्यूब टूटने का विश्लेषण जीएफपी-आधारित या आरएफपी-आधारित शुक्राणु कोशिका या साइटोसोलिक मार्करों के साथ भी किया जा सकता है, जो शुक्राणु या साइटोप्लाज्मिक सामग्री की तेजी से रिहाई भी दिखाते हैं। पराग ट्यूब टूटने पर, ग्रहणशील सिनर्जिड के नाभिक को एक साथ (प्रयोग में 1 मिनट के समय संकल्प के भीतर) खराब होते देखा गया था, और कैरियोगामी के परिणामस्वरूप पराग ट्यूब टूटने पर अंडे की कोशिका नाभिक का माइक्रोपाइल की ओर प्रवास भी देखा गया था (वीडियो 3 और पूरक फ़ाइल 1)। बाएं और दाएं दोनों सिनर्जिड ग्रहणशील सिनर्जिड के रूप में काम करने में सक्षम थे, और दो पराग ट्यूब फटने के उदाहरण देखे गए थे, पहले ग्रहणशील सिनर्जिड में और दूसरा लगातार सिनर्जिड में। वीडियो 2 (पूरक फ़ाइल 1 भी देखें) दोषपूर्ण पराग ट्यूब रिसेप्शन के 10 उदाहरण दिखाता है, जिसे अंडाणुओं में देखा जा सकता है, जिसमें लाल वर्गों द्वारा चिह्नित रुचि के क्षेत्र हैं। इस प्रकार, पराग ट्यूब रिसेप्शन की समग्र दक्षता पराग ट्यूबों को आकर्षित करने वाले अंडाणुओं के संबंध में ~ 80% थी। इन असफल मामलों में, पराग ट्यूब या तो माइक्रोपाइल में उनके विकास को रोकते हैं, तालमेल में तेजी से वृद्धि के बाद उनके विकास को रोकते हैं, या उनके विकास को रोकने में विफल रहते हैं और भ्रूण की थैली के भीतर बढ़ते और कॉइलिंग को जारी रखते हैं। रुचि के किसी भी संकेतित क्षेत्र के बिना डिंब पराग ट्यूबों को आकर्षित करने में विफल रहे या एक सुलभ अभिविन्यास में नहीं थे। नकारात्मक और सकारात्मक परिणामों के बढ़े हुए उदाहरण वीडियो 3 में देखे जा सकते हैं (पूरक फ़ाइल 1 भी देखें), दोषपूर्ण पराग ट्यूब रिसेप्शन (वीडियो 3 ए, सी और पूरक फ़ाइल 1) के दो उदाहरण दिखाते हैं, और सफल पराग ट्यूब रिसेप्शन के दो उदाहरण (वीडियो 3 बी, डी और पूरक फ़ाइल 1)।
चित्रा 4: एसआईवी विधि क्षमता की तुलना। एसआईवी एक्साइज्ड डिंब विधि (71 कुल अंडाणु) की आठ तकनीकी प्रतिकृतियों ने विस्फोटक पराग ट्यूब फटने के साथ केवल ~ 28% अंडाणु दिखाए, जिसके परिणामस्वरूप ~ 10% -50% तक की दक्षता हुई। एसआईवी कम सेप्टम विधि (8 सेप्टा और 102 डिंब) की पांच तकनीकी प्रतिकृतियों ने विस्फोटक पराग ट्यूब फटने के साथ ~ 79% अंडाणु दिखाए, जिसके परिणामस्वरूप ~ 70% -100% तक की दक्षता हुई। केवल उन अंडाणुओं की गणना की गई जो पराग ट्यूबों को माइक्रोपाइल और डिंबों की ओर आकर्षित करते थे जिनके पास आकर्षित पराग ट्यूब प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रिकॉर्ड किया गया समय था। "एक्स" क्रमशः माध्य और केंद्र रेखा को औसत मूल्य (50वां प्रतिशत) दर्शाता है। ऊपरी और निचले चतुर्थक के बाहर की रेखाएं सफल पराग ट्यूब रिसेप्शन के न्यूनतम और अधिकतम प्रतिशत दिखाती हैं। पराग ट्यूब फटने के साथ अंडाणुओं का प्रतिशत एक अप्रकाशित टी-परीक्षण के आधार पर दो विधियों के बीच काफी भिन्न (पी < 0.001) था। संक्षिप्त नाम: एसआईवी = अर्ध-इन विट्रो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| उपकरण/सेटिंग | पूरक वीडियो 2 और 3 |
| सूक्ष्मदर्शी | Olympus IX-81F-ZDC2 उल्टे माइक्रोस्कोप |
| तापमान नियंत्रण | लाइफ इमेजिंग सर्विसेज जीएमबीएच क्यूब एंड बॉक्स (22 सी) |
| आर्द्रता नियंत्रण | लाइफ इमेजिंग सर्विसेज जीएमबीएच ब्रिक (92% सापेक्ष आर्द्रता) |
| सॉफ़्टवेयर | Olympus सेलसेंस आयाम 2.3 |
| वास्तविक समय नियंत्रक | ओलंपस यू-आरटीसी |
| लेजर | MT20- 150 W xenon arc बर्नर |
| उद्देश्य लेंस | 10x वायु विसर्जन यू प्लान एसएपीओ उद्देश्य लेंस (0.4 एनए), काम की दूरी 3.1 मिमी |
| मिरर क्यूब | GFP/RFP |
| फ़िल्टर व्हील | Olympus U-FFWO |
| चैनल 1 (25 एमएस) : प्रतिबिंबित (560/25) अवलोकन (624/40) | |
| चैनल 2 (60 एमएस): प्रतिबिंबित (485/20) अवलोकन (525/30) | |
| चैनल 3 (60 एमएस): प्रतिबिंबित (387/11) अवलोकन (525/30) | |
| चैनल 4 (60 एमएस): प्रतिबिंबित (387/11) अवलोकन (624/30) | |
| संसूचक | हमामात्सु ओआरसीए-फ्यूजन डिजिटल सीएमओएस कैमरा |
| ऑटोफोकस | 100 μm रेंज, 7 μm मोटा कदम, 1 μm ठीक कदम |
| समय अंतराल | 1 मिनट |
तालिका 1: इस पांडुलिपि में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप सिस्टम और सेटिंग्स।
वीडियो 1: एसआईवी एक्साइज्ड डिंब विधि के टाइमलैप्स। एस.आई.वी. की आठ तकनीकी प्रतिकृतियों से विलय किए गए टाइमलैप्स में एक्साइज्ड डिंब्स का उपयोग किया गया, जो पराग ट्यूबों ( पीएलएटी 52: आर-जीईसीओ) और अंडाणुओं के भीतर पराग ट्यूब रिसेप्शन के विकास को दर्शाता है। 20 हरे बक्से सिनर्जिड्स में विस्फोटक पराग ट्यूब फटने के उदाहरण दिखाते हैं, और 51 लाल बक्से असफल पराग ट्यूब फटने और अतिवृद्धि के उदाहरण दिखाते हैं। समय अंतराल 260 मिनट और 400 मिनट के बीच है, और स्केल बार 100 μm है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 2: एसआईवी सह सेप्टम टाइमलैप्स। (ए) पराग ट्यूब वृद्धि और अंडाणुओं के भीतर रिसेप्शन के सभी पांच अवलोकन क्षेत्रों ( चित्रा 3 देखें) से विलय किए गए टाइमलैप्स को केवल आरएफपी चैनल (चैनल 1) के साथ जोड़ा गया। पराग पीएलएटी 52: आर-जीईसीओ और अंडाणु पीएचजी: आरओजीएफपी 2-ओआरपी 1-एनएलएस को आश्रय दे रहा है; pMYB98: roGFP2-ORP1. 41 हरे बक्से विस्फोटक पराग ट्यूब फटने के उदाहरण दिखाते हैं, और 10 लाल बक्से असफल पराग ट्यूब फटने और पराग ट्यूब अतिवृद्धि के उदाहरण दिखाते हैं। (बी) आरएफपी और जीएफपी चैनलों (चैनल 1 और चैनल 2) दोनों के साथ एक ही समय अंतराल, पराग ट्यूब रिसेप्शन के दौरान युग्मकों और सिनर्जिड कोशिकाओं में परमाणु गतिशीलता को दर्शाता है। शीर्ष दाईं ओर की संख्याएं समय (h:min) को इंगित करती हैं। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें.
वीडियो 3: एसआईवी कम सेप्टम से सकारात्मक और नकारात्मक परिणामों के उदाहरण। (ए, सी) वीडियो 2 से लिए गए उदाहरण अंडाणु विफल निषेचन के दो उदाहरण दिखाते हैं। ए में, पराग ट्यूब विकास को रोकने में विफल रहते हैं और भ्रूण की थैली में कॉइलिंग जारी रखते हैं। सी में, पराग ट्यूब अतिवृद्धि की एक दूसरी श्रेणी देखी जाती है, जहां पहली पराग ट्यूब तेजी से विकास से गुजरती है क्योंकि यह तालमेल में बढ़ती है लेकिन बिना टूटे विकास को रोकती है। (बी, डी) वीडियो 2 से लिए गए उदाहरण अंडाणु सफल पराग ट्यूब रिसेप्शन के दो उदाहरण दिखाते हैं। जंगली प्रकार की तरह पराग ट्यूब फटने से सिनर्जिड्स में पराग ट्यूब का विस्फोटक टूटना दिखाई देता है, और माइक्रोपाइल की ओर अंडा कोशिका नाभिक का प्रवास कैरियोगामी को इंगित करता है। शीर्ष दाईं ओर की संख्याएं समय (h:min) को इंगित करती हैं। तीर के निशान ग्रहणशील सिनर्जिड नाभिक (आरएसएन) का संकेत देते हैं, और तीर पराग ट्यूब फटने (लाइसिस) के बाद अंडे की कोशिका नाभिक (ईएन) के प्रवास का संकेत देते हैं। स्केल बार = 30 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 1: वीडियो 1, वीडियो 2 और वीडियो 3 की अभी भी छवियां। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यह पांडुलिपि एराबिडोप्सिस में पराग ट्यूब रिसेप्शन और डबल निषेचन की इमेजिंग के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का परिचय देती है। बेहतर विधि, एसआईवी कम सेप्टम, सफल पराग ट्यूब रिसेप्शन घटनाओं के प्रतिशत और कुल संख्या को बहुत बढ़ाती है जो प्रति इमेजिंग सत्र में देखने योग्य हैं। यहां दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम 41 सफल पराग ट्यूब रिसेप्शन घटनाओं और 10 अंडाणुओं के साथ एक इमेजिंग सत्र प्रदर्शित करते हैं जो रिसेप्शन दोष (~ 80% दक्षता) दिखाते हैं। यह मूल एसआईवी एक्साइज्ड डिंब विधि (वीडियो 1) का उपयोग करके कुल आठ इमेजिंग सत्रों में कैप्चर किए गए सफल पराग ट्यूब रिसेप्शन घटनाओं की संख्या से दोगुना है। कुल आठ सेप्टा के लिए पांच तकनीकी प्रतिकृतियों में एसआईवी सह सेप्टम विधि का उपयोग करते हुए, हमने आठ तकनीकी प्रतिकृतियों के साथ एसआईवी उत्पादित सेप्टम विधि का उपयोग करके औसतन 28% की तुलना में 79% की औसत पराग ट्यूब रिसेप्शन दक्षता हासिल की (चित्रा 4)।
जबकि एसआईवी सह सेप्टम विधि के लिए पराग ट्यूब रिसेप्शन की दक्षता बहुत अधिक है, पराग ट्यूब अतिवृद्धि के उदाहरण अभी भी कई कारकों के आधार पर अलग-अलग दरों पर होते हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात, सिनर्जिड कोशिकाओं को कई घंटों तक जीवित और ग्रहणशील रखा जाना चाहिए, जिस पर उन्हें चित्रित किया जा रहा है। विच्छेदन और इमेजिंग के दौरान आर्द्र वातावरण बनाए रखना, ताजा बने माध्यम का उपयोग करना, अर्ध-तरल आगर में अंडाणुओं और सेप्टम को एम्बेड करना, और छवि अधिग्रहण के दौरान अत्यधिक प्रकाश जोखिम से उत्पन्न गर्मी से बचना सभी सफल पराग ट्यूब रिसेप्शन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। अंडाणुओं के माइक्रोपाइल्स के लिए पराग ट्यूबों की पहुंच और आकर्षण भी महत्वपूर्ण कारक हैं जो सफल पराग ट्यूब रिसेप्शन घटनाओं की संख्या को सीमित करते हैं। विच्छेदन के दौरान सेप्टम पर अंडाणुओं की गड़बड़ी को कम करना, सेप्टम को इस तरह उन्मुख करना कि माइक्रोपाइल ऊपर की ओर उन्मुख हो रहे हैं, और अंडाणुओं के बीच एक अर्ध-तरल पूल का गठन और शैली का उद्घाटन पराग ट्यूब आकर्षण के लिए महत्वपूर्ण है। इस पूल का गठन कम पिघलने बिंदु एगर के ब्रांडों के बीच भिन्न हो सकता है, और इसलिए, 1% से 1.5% तक एगर के अलग-अलग प्रतिशत के साथ प्रयोग शुरू करने की सिफारिश की जाती है। अंत में, विच्छेदन की कठिनाई का मतलब है कि इसके लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है, और रोगी रहने, विच्छेदन से पहले आराम और गहरी सांस लेने का अभ्यास करने की सिफारिश की जाती है, और, महत्वपूर्ण रूप से, स्थिरता और स्थिरता में सुधार करने वाली तकनीकों पर ध्यान देने के लिए (जैसे, हाथ की स्थिति, स्लाइड अभिविन्यास)।
एसआईवी सह सेप्टम विधि के इस विस्तृत प्रोटोकॉल को पराग ट्यूब रिसेप्शन और डबल निषेचन की लाइव इमेजिंग के उद्देश्य से प्रयोगों के लिए दक्षता और नमूना संख्या में काफी सुधार करना चाहिए। अनुप्रयोगों में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर, उत्परिवर्ती विश्लेषण और दोहरे निषेचन से पहले, दौरान और उसके तुरंत बाद साइटोलॉजिकल घटनाओं के वर्णनात्मक अवलोकनों का उपयोग शामिल है। हमें उम्मीद है कि इस विधि का विस्तार अन्य फूलों के पौधों की प्रजातियों पर किया जा सकता है और बढ़ाया जा सकता है जहां अंडाशय की नाल पर अंडाणु को बनाए रखने से लाभ हो सकता है।
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Disclosures
लेखकों ने हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं की है।
Acknowledgments
हम सारा सिमोनिनी और स्टेफानो बेन्सिवेंगा को pFG: roGFP2-ORP1-NLS निर्माण दान करने के लिए और क्रिस्टोफ़ ईचेनबर्गर, जोहान अल्मेंडिंगर, विन्सेंट सटर और सेलिया बारोक्स को माइक्रोस्कोपी पर उनकी सलाह के लिए धन्यवाद देते हैं। हम कृपया रवि पलानिवेलु, फिलिप डेनिंगर, शेरोन केसलर, मार्क जॉनसन, तोमोकाजू कावाशिमा और यौन पौधे प्रजनन 2022 पर अंतर्राष्ट्रीय सम्मेलन में बाकी सभी की सलाह को स्वीकार करते हैं, जिन्होंने एसआईवी सह सेप्टम पर एक प्रोटोकॉल में रुचि दिखाई। इस काम को ज्यूरिख विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन से यू.जी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
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