Summary
כאן, אנו מתארים שיפור של שיטת Semi-in vitro (SIV) לצפייה בהנחיית צינור אבקה וקליטה ב- Arabidopsis thaliana, אשר מגביר את הקבלה של הביציות. ניתן לשלב את שיטת SIV cum septum בעלת תפוקה גבוהה עם קווי סמן gametophyte וחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית כדי לפקח על התהליך הדינמי של ההפריה.
Abstract
בצמחים פורחים, הצמיחה וההכוונה של צינור האבקה (גמטופיט זכרי) בתוך הפיסטיל וקליטת צינור האבקה על ידי נקבת הגמטופיט חיוניים להפריה כפולה ולהתפתחות זרעים לאחר מכן. יחסי הגומלין בין הגמטופיטים הזכריים והנקביים במהלך קליטת צינור האבקה מגיעים לשיאם בקרע של צינור האבקה ובשחרור שני תאי זרע כדי לגרום להפריה כפולה. מכיוון שצמיחת צינור האבקה וההפריה הכפולה חבויים עמוק בתוך רקמות הפרח, קשה להבחין בתהליך זה in vivo.
שיטת SIV (Semi-in vitro ) להדמיית תאים חיים של דישון בצמח המודל Arabidopsis thaliana פותחה ויושמה במספר חקירות. מחקרים אלה סייעו להבהיר את המאפיינים הבסיסיים של האופן שבו תהליך ההפריה מתרחש בצמחים פורחים ואילו שינויים תאיים ומולקולריים מתרחשים במהלך האינטראקציה של הגמטופיטים הזכריים והנקביים. עם זאת, מכיוון שניסויי הדמיה אלה של תאים חיים כרוכים בכריתה של ביציות בודדות, הם מוגבלים למספר נמוך של תצפיות בכל מפגש הדמיה, מה שהופך גישה זו למייגעת וגוזלת זמן רב. בין שאר הקשיים הטכניים, לעתים קרובות מדווח על כישלון של צינורות האבקה להפרות את הביציות במבחנה, מה שמבלבל מאוד ניתוחים כאלה.
כאן, פרוטוקול וידאו מפורט להדמיית קליטה והפריה של צינור אבקה באופן אוטומטי ובתפוקה גבוהה, המאפשר עד 40 תצפיות של קליטת צינור אבקה וקרע בכל מפגש הדמיה. בשילוב עם השימוש בחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית וקווי סמן, שיטה זו מאפשרת יצירת דגימות גדולות בהשקעת זמן מופחתת. ניואנסים ונקודות קריטיות של הטכניקה, כולל בימוי פרחים, דיסקציה, הכנה בינונית והדמיה, מפורטים בבירור בפורמט וידאו כדי להקל על מחקר עתידי על הדינמיקה של הנחיית צינור אבקה, קליטה והפריה כפולה.
Introduction
יצירת צאצאים ייחודיים גנטית באורגניזמים המתרבים מינית תלויה באיחוי מוצלח של גמטות זכריות ונקביות. בצמחים פורחים, האינטראקציה של שתי גמטות זכריות (תאי זרע) עם שתי גמטות נקביות (תא ביצית ותא מרכזי) במהלך הפריה כפולה תלויה בשחרור זרע מצינור האבקה (הגמטופיט הגברי). תהליך זה, הנקרא קליטת צינור אבקה, נשלט במידה רבה על ידי התאים הסינרגידים השוכנים בתוך שק העובר (הגמטופיט הנשי)1,2. מכיוון שקליטת צינור האבקה מתרחשת עמוק בתוך הפרח, נקבעה שיטה המאפשרת הדמיה של תאים חיים של התהליך, הנקראת קליטת צינור אבקה למחצה במבחנה (SIV). בשיטה זו, ביציות Arabidopsis נכרתו מונחות על מדיום נביטת אבקה נוזלי למחצה וממוקדות על ידי צינורות אבקה הגדלים דרך הצלקת והסגנון של פיסטיל שנקטע בצומת דרכי העברת הסגנון 3,4. מאז פיתוח טכניקה זו, תצפיות מפורטות הובילו למספר תגליות סביב הנחיית צינור אבקה, קליטה והפריה. בין היתר, תגליות אלה כוללות רכישת יכולת מיקוד של צינור אבקה על ידי צמיחה באמצעות סטיגמה3, הופעת תנודות סידן תוך תאיות בסינרגידים עם הגעת צינור האבקה 5,6,7,8,9, והדינמיקה של שחרור תאי זרע והפריה עם פיצוץ צינור אבקה 10 . עם זאת, מכיוון שטכניקה זו מסתמכת על כריתת ביציות, התצפיות על ההפריה מוגבלות במספרן, וקליטת צינור האבקה היא לעתים קרובות חריגה, וכתוצאה מכך כישלון של קרע בצינור האבקה (וידאו 1 וקובץ משלים 1). לכן, יש צורך בגישה יעילה יותר המאפשרת ניתוחים בתפוקה גבוהה של קליטת צינור אבקה והפריה.
בפיתוח פרוטוקול זה, נבדקו מספר גישות חדשות לניתוח קליטת צינור אבקה, החל מהשיטות ה"חוץ גופיות" ביותר ועד לשיטות "in vivo" ביותר, והוחלט על טכניקה יעילה המבוססת על כריתה של המחיצה כולה, המאפשרת עד 40 תצפיות של הפריה ביום. כאן מתוארים הניואנסים והנקודות הקריטיות של הטכניקה, כולל בימוי פרחים, דיסקציה, הכנה בינונית והגדרות הדמיה. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, יש להקל על מחקר המתמקד בהנחיית צינור אבקה, קליטת צינור אבקה והפריה כפולה. גודל הדגימות הגבוה יותר שהשיטה מאפשרת צפוי לחזק את האיתנות המדעית של המסקנות שהוסקו מניסויי הדמיה חיים. היישומים האפשריים של טכניקה זו כוללים, אך אינם מוגבלים, לביצוע תצפיות של השינויים המולקולריים והפיזיולוגיים בריכוזי סידן ציטוסולי ([Ca2+]cyt), pH, או H 2 O2 במהלךאינטראקציות gametophyte באמצעות שימוש biosensors מקודדים גנטית. יתר על כן, שינויים ציטולוגיים, כגון ניוון של סינרגיד הקבלה, נדידת תאי זרע, או קאריוגמיה, ניתן לראות בקלות רבה יותר באמצעות שיטה משופרת זו. לבסוף, ניתן לעקוב אחר העיתוי של שלבי ההפריה השונים תחת מיקרוסקופ שדה רחב, ולאחר מכן ניתן לבצע ניתוחים מפורטים יותר באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) או מיקרוסקופ עירור שני פוטונים (2PEM) לרזולוציה גבוהה יותר ולשחזור תלת ממדי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
1. שיקולים לתכנון ניסוי ההדמיה
- לקבוע מראש את משך ההדמיה ואת תדירות הדגימה הדרושים כדי ללכוד את התופעה הרצויה לצפייה. לדוגמה, בעקבות משפט הדגימה של ניקוויסט, תדירות הדגימה חייבת להיות גדולה מפי שניים מהתדירות הגבוהה ביותר של דגימת הקלט. לכן, כדי ללכוד במדויק תנודות ציט סינרגידיות [Ca2+], בצע הדמיה בערך כל 10 שניות, אך כדי למדוד את מהירות תאי הזרע בעת פריקת צינור האבקה, ודא רזולוציה זמנית של פחות מ 1 s10.
- בחר סמנים פלואורסצנטיים עבור התאים המעניינים שהם בהירים מספיק מעבר לאוטופלואורסצנטיות של הרקע. לשימוש בחיישנים ביולוגיים, בחר את הקווים הבהירים ביותר שאינם מפריעים לתפקוד התא, מכיוון שהם בדרך כלל רגישים יותר ודורשים פחות זמן חשיפה.
- שקול איזה סוג של מיקרוסקופ פלואורסצנטי והגדלה הם המתאימים ביותר ללכידת התופעה הרצויה. השתמש במיקרוסקופ שדה רחב ובמטרות הגדלה נמוכה כדי ללכוד אור מעומק שדה גדול יותר, ולשמור על המיקוד לאורך זמן, לצלם עצמים גדולים יותר כגון ביציות שלמות, או להשתמש בחיישנים יחסיים הרגישים לממצאים של הזזה כרומטית. השתמשו ב-CLSM או 2PEM עם מטרות הגדלה גבוהה לרזולוציה טובה יותר של עצמים תאיים ותת-תאיים, אך שימו לב לקושי לשמור על מיקוד לאורך זמן.
- הערך את מספר הדגימות שיש לצלם בכל ניסוי. לדוגמה, השתמש במטרה של 10x עם זמן דגימה מינימלי של ~30 שניות עבור הדמיה של שלוש ספטות והדמיה של עד 40 אירועי הפריה לכל ניסוי בגלל הזמן הדרוש לפונקציות המיקוד האוטומטי והרכישה הרב-שלבית.
2. הכנת אבקה בינונית נביטה
- הכן מדיום נביטת אבקה נוזלית (5mM CaCl2, 1mM MgSO4, 5mM KCl, 0.01% [w/v] H 3 BO3ו- 10% [w/v] סוכרוז) באמצעות מלאי Aliquot של 1 M מכל מיקרונוטריאנטים, המאוחסנים ב -20 ° C. התאם את ה- pH ל- 7.5 עם 0.1 M KOH. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
הערה: רמת החומציות עשויה לרדת עם הזמן. - הוסף 2.5 מ"ל של מדיום נוזלי לכוס של 10 מ"ל, והוסף באיטיות 32 מ"ג של אגרוז נקודת התכה נמוכה במיוחד (~ 1.3%) עם מוט ערבוב מסתובב במהירות כדי למנוע גושים.
- ממיסים אגרוז על פלטה חמה ב 65 מעלות צלזיוס, ואגוז את הכד כדי לאסוף כל עיבוי מהצדדים.
- פיפטה 130 μL של בינוני לתוך באר 14 מ"מ של צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ, ומסובבים את המנה עד המדיום מכסה את הבאר.
- שואפים סך של 40 μL עם פיפטה ממרכז המנה, משאיר מאחור נפח כולל של 90 μL.
הערה: ניתן לשאוב יותר מדיום מהבאר כדי להשיג נפח כולל נמוך יותר; זה עשוי להיות נחוץ למטרות הגדלה גבוהה עם מרחקי עבודה נמוכים. עם זאת, ככל שכרית האגר דקה יותר, כך היא תתייבש מהר יותר. - קררו את הכלי על בלוק אלומיניום בתא לחות כדי להבטיח קירור אחיד. אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה לשימוש למחרת בבוקר.
3. בימוי פרחוני של תורמי מחיצה, תורמי סטיגמה ותורמי אבקה
איור 1: היערכות פרחונית של תורמי מחיצות, תורמי סטיגמה ותורמי אבקה. (A) שלבים של פרחי ארבידופסיס (Ler-0) בתוך תפרחת. ניצנים בשלב 12B, שיש להם עלי כותרת שעומדים להיפתח ואנתרים צהובים, צריכים להיות מסולקים על ידי הסרת כל עלי הגביע, עלי הכותרת והאבקנים. פיסטולים (המכילים את נקבת יצרנית הגמטופיטים) ניתנים לשימוש כתורמי מחיצה 24 שעות מאוחר יותר. (B) שלבים של פרחי Arabidopsis (Col-0) בתוך תפרחת. ניצנים בשלב 12B, שיש להם אנטרים צהובים וסטיגמות שבקושי יוצאות מעלי הכותרת, צריכים להיות מסולקים על ידי הסרת כל עלי הגביע, עלי הכותרת והאבקנים. לאחר מכן ניתן להשתמש בפיסטולות כתורמי סטיגמה 24 שעות מאוחר יותר, כאשר הן אמורות להיות מואבקות על ידי פרחים (המכילים את סמן הגמטופיט הזכרי) שהם פתוחים ומשירים אבקה. סטיגמות מואבקות יש לנתח בתוך 1 שעה של האבקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
- בבוקר שלפני ההדמיה, בחרו צמחי ארבידופסיס שישמשו כתורמי מחיצה ותורמי סטיגמה; לוודא שהם בריאים ולאחרונה החלו לייצר סיליקים.
הערה: Landsberg erecta (Ler-0) הוא חיבור טוב לשימוש כתורם מחיצה, שכן הספטה שלו חסונה, ויש צמתים קטנים בין הביציות. קולומביה (Col-0) היא תוספת טובה לשימוש כתורם סטיגמה מכיוון שנראה שהם תורמים לצמיחת צינור אבקה. - אמסקול לפחות שלושה פרחים מתורם מחיצה שלב 12B ו-12 פרחים מתורם סטיגמה שלב 12B על-ידי הסרת האבקנים, עלי הגביע ועלי הכותרת שלהם (איור 1A, B). הסר גם פרחים ישנים יותר על אותה תפרחת, אשר עלולה להאביק את הפרח המסולק.
- בבוקר, 24 שעות מאוחר יותר, להאביק את תורמי הסטיגמה עם פרחים תורם אבקה (למשל, מכילים צינור אבקה או סמנים תאי זרע) כי הם משירים אבקה בקלות. ההאבקה מושלמת כאשר הצלקות מכוסות כמעט לחלוטין באבקה (איור 1B).
4. דיסקציה של מחיצה
איור 2: מדריך מהיר לדיסקציה של מחיצה וסטיגמה . (A) שלבים של דיסקציה של מחיצה. נעצו את הפיסטיל על סרט דו-צדדי עם מחט מזרק אינסולין, ובצעו חתכים בצומת השחלה הסגנונית ובצומת השחלה-פדיקול, ולאחר מכן חתך רדוד לאורך המחיצה של כל קרפל (שלב 1). קלפו את דפנות הקרפל בחזרה אל סרט הדבק (שלב 2). חותכים את replum מתחת למחיצה העליונה (שלב 3). חותכים את המחיצה בסגנון, ומסירים באמצעות מלקחיים בפדיקל (שלב 4). מניחים את המחיצה על מצע אגר, ומטמיעים בעדינות במלקחיים. (B) שלבים של ניתוח סטיגמה. נעצו את הפיסטיל (שהואבק <1 שעה לפני) על סרט דו-צדדי, וחתכו בצומת השחלה הסגנונית בעזרת סכין גילוח (שלב 6). מניחים את הצלקת על מדיום אגר עם מחט אינסולין ליד המחיצה, ומתאימים את המרחק לכ-250 מיקרומטר (שלבים 7-8). ודא כי בריכה נוזלית למחצה נוצרת סביב micropyles ובסיס של סגנונות (שלב 9). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
- שלושים דקות לאחר ההאבקה, אספו פיסטולים בריאים ובוגרים מתורם המחיצה בפדיקור, והניחו אותם על סרט דביק דו-צדדי טרי המורכב על מגלשת זכוכית, כשהסטיגמה מבצבצת ממש מקצה הטייפ.
הערה: הגבל את זמן הדיסקציה שבו הפיסטלים נמצאים על סרט הדבק כדי להבטיח שהוא קצר ככל האפשר. הדיסקציה צריכה להתבצע בלחות גבוהה, אשר ניתן להשיג על ידי הצבת מכשיר אדים ליד המגלשה. - הצמידו את הפיסטיל היטב לסרט על ידי לחיצה עדינה על הפדיקל ולאורך השחלה באמצעות הצד האחורי של מחט מזרק אינסולין חדשה לפני הסרת שאריות עלי הגביע, עלי הכותרת והאבקנים שנותרו מהכריתה.
- תחת סטריאוסקופ, השתמשו במחט מזרק אינסולין כדי לבצע שני חתכים לכל קרפל בצומת השחלה הסגנונית ובצומת השחלה-פדיקול, ולאחר מכן חתכים רדודים לאורך המחיצה של כל קרפל (איור 2, שלב 1).
הערה: חיתוך עמוק מדי לאורך המחיצה ינתק ביציות בפוניקולוס. - קלפו את דפנות השחלה בזהירות על סרט הדבק (איור 2, שלב 2), והחליקו את המחט בעדינות בין שתי הספטות כדי לחתוך את המחט לכל אורך הפיסטיל מבלי להפריע לביציות (איור 2, שלב 3).
הערה: חתכו את הרפלום בכיוון שבין הסגנון לפדיקל כדי להבטיח שהביציות במחיצה העליונה יופרעו כמה שפחות. - חתכו את המחיצה העליונה בעדינות גם בצומת עם הסגנון וגם עם הפדיקול, והסירו את המחיצה עם מלקחיים מצד הפדיקל (איור 2, שלב 4).
הערה: שמור על חתך זה ישר ועדין כך שהמחיצה תישאר שטוחה ולא תתעקם. - מניחים את המחיצה שטוחה ככל האפשר על המדיום כך שהמיקרופיילים של הביציות פונים כלפי מעלה ובאותו מישור מוקד. לחצו בעדינות על המחיצה לתוך המדיום עד שהביציות נטמעו רק מעט בתווך (איור 2, שלב 5).
הערה: קריטי שהמחיצה תמוקם כך שהמיקרופיילים של הביציות יהיו נגישים לצינורות האבקה (ניתן לסדר מחדש בעדינות כל ביציות שאינן נגישות באמצעות מחט). בריכה קטנה של נוזל צריכה להיווצר סביב המחיצה לאחר הטבעה. - חזור על שלבים 4.1-4.6 עבור עד שני פיסטולים נוספים, והצבת הספטה מקצה לקצה.
5. דיסקציה של סטיגמה
- הניחו את הפיסטלים של תורם הצלקת המואבק על סרט דביק דו-צדדי טרי המורכב על מגלשת זכוכית, כך שהצומת בסגנון השחלה נמצא מחוץ לקצה הסרט (איור 2, שלב 6).
- השתמשו בסכין גילוח רענן כדי לחתוך את הסגנון ישר כלפי מטה ולהתרומם כדי לשמור על הצלקת מחוברת ללהב (איור 2, שלב 6).
הערה: גזור בקצה הסרט לקבלת החיתוך הנקי ביותר. - הסירו את הצלקת מהלהב בעזרת מחט מזרק אינסולין, והניחו אותה שטוחה במרחק של כ-250-300 מיקרומטר מהביציות (איור 2, שלבים 7-8).
הערה: הסגנון צריך להיות בכיוון אופקי על צידו; אחרת, רוב צינורות האבקה יגדלו למטה מתחת למחיצה. בריכה קטנה של נוזל בכניסה של הסגנון צריך להופיע לאחר שהוא כבר שוכב על המדיום במשך 1 דקה; זהו סימן טוב, מכיוון שלצינורות האבקה תהיה יציאה חלקה מהסגנון. - חזור על שלבים 5.1-5.3 עבור עד 12 סטיגמות, והצב שתיים מכל צד של כל מחיצה. חפש בריכה קטנה של נוזל שנוצר סביב micropyle של הביציות; זה מסייע לנגישות ולמיקוד של צינורות האבקה לשקי העוברים (איור 2, שלב 9).
הערה: יש להגביל את משך הזמן שבו התבשיל פתוח כדי למנוע התייבשות של המדיום והביציות.
6. הדמיה
איור 3: SIV cum septum imaging scheme. (A) מערך מלא של SIV cum septum עם 12 סטיגמות מואבקות ו-3 ספטה, כפי שניתן לראות דרך סטריאוסקופ. (B) תמונות ממוזגות של מערך מחיצת SIV cum המלא שנראה ב- A 5 שעות לאחר הדגירה באמצעות מטרה של 10x, כאשר חמשת אזורי הסקירה (~ 1 מ"מ כל אחד) מסומנים לרכישה רב-שלבית. הקופסאות הירוקות מראות את הביציות שקיבלו צינורות אבקה שעברו פיצוץ נפיץ בסינרגידים. (C) מבט מקרוב על אזור סקירה 2 בנקודות זמן שונות. כ -3 שעות לאחר הדגירה בתא הלחות במיקרוסקופ, צינורות האבקה צריכים להגיע ליד המיקרופיילים, ועל ידי 6 שעות של הדמיה, רוב הביציות היו צריכות לקבל כראוי צינורות אבקה (ריבועים ירוקים); ביציות אלה עוברות פיצוץ של צינור אבקה (כוכבית). פסי קנה מידה = (A) 5 מ"מ, (B,C) 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
- לאחר שהדיסקציה הסתיימה והצליחה מוכנה לצילום, תנו לה לדגור בתא לחות במיקרוסקופ שנשמר בלחות יחסית של 92% ו-21 מעלות צלזיוס.
הערה: אם אין תא לחות זמין עבור המיקרוסקופ, ריפוד הקצוות החיצוניים של המכסה והצלחת בנפח קטן של מים יעזור לשמור על רמה גבוהה של לחות בצלחת. - הבא את הדגימות למיקוד תחת שדה בהיר בעוצמת אור חלשה, ולאחר מכן עבור לאור פלואורסצנטי, תוך סימון אזורי הדגימה בסקירת הבמה שיש לצלם.
הערה: בהגדלה של פי 10 ניתן לסמן כחמישה אזורים בסך הכל שלוש ספטות (איור 3). הגבל את משך הזמן המשמש לסימון אזורי הסקירה כדי למזער את רעילות האור או את התחממות הדגימה על ידי האור הפלואורסצנטי. - התחל הדמיה באמצעות סכימת רכישה רב-שלבית עם פונקציית מיקוד אוטומטי בתחילת כל אזור סקירה. מכיוון שצינורות אבקה ייצאו מהסגנון ~ 1 שעות לאחר הדגירה על הדגימה, לעכב את הרכישה ב -2 שעות או עד שצינורות האבקה יגיעו למיקרופייל. ודא שהמיקוד האוטומטי מוגדר עם טווח של 100 מיקרומטר (צעדים גדולים של 7 מיקרומטר וצעדים עדינים של 1 מיקרומטר) כדי לשמור על הביציות בפוקוס כאשר המחיצה זזה מעט ושוקעת עם הזמן.
- עצור את רכישת התמונה ~ 9 שעות לאחר תחילת הדגירה של הדגימה, שכן בשלב זה, רוב הביציות היו צריכות להימשך ולקבל צינור אבקה.
הערה: אם מספר נמוך של ביציות מושכות צינורות אבקה, תצפית זהירה על המנה תחת סטריאוסקופ שימושית כדי לקבוע כיצד ניתן לשפר את כיוון הביצית או הסגנון בפעם הבאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את העיתוי של ניוון גרעיני בסינרגיד הקלטן ביחס לקרע בצינור האבקה בארבידופסיס, כמו גם כדי לבחון אם הסינרגיד השמאלי או הימני נועד מראש להפוך לסינרגיד הקולט, שיטת SIV cum septum שתוארה כאן שימשה באמצעות סמן גרעיני גמטופיט נשי מוערם עם סמן ציטוסולי סינרגידי (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) כתורם המחיצה וסמן גמטופיט זכר (pLAT52:R-GECO) כתורם האבקה. הספטה והסטיגמות המואבקות נותחו 24 שעות לאחר הכריתה, לפי סעיפים 4-5 לפרוטוקול, והונחו על כלי זכוכית עם מדיום שהוכן יום קודם. כל צלחת הונחה בתא לחות במיקרוסקופ, וניסוי רב-שלבי בוצע באמצעות עדשה אובייקטיבית פי 10 (צמצם מספרי: 0.4) עם חמישה אזורי סקירה (איור 3). תמונות של כל אזור צולמו כל 60 שניות במשך 9 שעות עם ארבעה ערוצים פלואורסצנטיים: ערוץ (1) 560/640 עבור R-GECO (25 אלפיות השנייה), ערוץ (2) 488/520 עבור roGFP2-ORP1 (60 אלפיות השנייה), ערוץ (3) 387/520 עבור roGFP2-ORP1 (60 אלפיות השנייה) וערוץ (4) 387/640 עבור חיסור רקע (60 אלפיות השנייה) (טבלה 1). פונקציית מיקוד אוטומטי באמצעות טווח של 100 מיקרומטר עם דריכה גסה של 7 מיקרומטר ודריכה עדינה של 1 מיקרומטר הופעלה עבור כל דקה לפני רכישת התמונה. חמשת קובצי התמונות נפתחו בפיג'י, הערוצים הופרדו ולאחר מכן התמונות הוצמדו ידנית זו לזו (וידאו 2 וקובץ משלים 1).
בסרטון 2 (ראו גם קובץ משלים 1) ניתן לראות 41 דוגמאות לקרע בצינור האבקה הנפיצה בסינרגידים בתוך הביציות, כאשר ריבועים ירוקים מסמנים את אזורי העניין. באמצעות שימוש בקו biosensor סידן pLAT52:RGECO כתורם אבקה, מקרים של קרע אבקה נפץ נראו בקצות צינורות אבקה שבו הם שוכבים. יש לציין כי חלה עלייה מהירה בבהירות החיישן הביולוגי כתוצאה מחשיפתו הפתאומית לרמות גבוהות של סידן. ניתן לנתח קרע בצינור האבקה הנפיץ גם באמצעות תאי זרע מבוססי GFP או RFP או סמנים ציטוסוליים, המראים גם שחרור מהיר של תוכן הזרע או הציטופלזמי. עם קרע צינור האבקה נצפתה גרעין הסינרגיד הקולט מתפרק בו זמנית (ברזולוציית הזמן של דקה אחת בניסוי), ונדידה של גרעין תא הביצית לכיוון המיקרופייל נראתה גם עם קרע בצינור האבקה כתוצאה מקרוגמיה (וידאו 3 וקובץ משלים 1). הן הסינרגיד השמאלי והן הסינרגיד הימני היו מסוגלים לשמש כסינרגיד הקלט, ונצפו מקרים של שני התפרצויות של צינור אבקה, ראשית בסינרגיד הקולט ושנית בסינרגיד המתמיד. סרטון 2 (ראה גם קובץ משלים 1) מציג 10 דוגמאות לקליטת צינור אבקה פגום, שניתן לראות בביציות, כאשר אזורי העניין מסומנים בריבועים אדומים. לפיכך, היעילות הכוללת של קליטת צינור האבקה הייתה ~ 80% ביחס לביציות שמשכו צינורות אבקה. במקרים לא מוצלחים אלה, צינורות האבקה עוצרים את גדילתם במיקרופייל, עוצרים את גדילתם לאחר הצמיחה המהירה לתוך הסינרגידים, או אינם מצליחים לעצור את גדילתם וממשיכים לגדול ולהתפתל בתוך שק העובר. הביציות ללא אזורי עניין מסומנים לא הצליחו למשוך צינורות אבקה או לא היו בכיוון נגיש. דוגמאות מוגדלות לתוצאות שליליות וחיוביות ניתן לראות בסרטון 3 (ראה גם קובץ משלים 1), המציג שני מקרים של קליטת שפופרת אבקה פגומה (וידאו 3A,C וקובץ משלים 1), ושני מקרים של קליטה מוצלחת של שפופרת אבקה (וידאו 3B,D וקובץ משלים 1).
תרשים 4: השוואת יעילות שיטת SIV. שמונה העתקים טכניים של שיטת SIV נכרתו ביציות (71 ביציות בסך הכל) הראו רק ~28% ביציות עם התפרצויות צינור אבקה נפיצות, וכתוצאה מכך יעילות שנעה בין ~10%-50%. חמישה העתקים טכניים של שיטת SIV cum septum (8 ספטה ו-102 ביציות) הראו ~79% ביציות עם פיצוץ צינור אבקה נפיצה, וכתוצאה מכך יעילות שנעה בין ~70%-100%. רק ביציות שמשכו צינורות אבקה למיקרופייל וביציות שהיה להן מספיק זמן רשום כדי לקבל את צינור האבקה הנמשך נספרו. ה- "X" מציין את הממוצע ואת קו האמצע את הערך החציוני (אחוזון 50), בהתאמה. הקווים מחוץ לרביעון העליון והתחתון מראים את האחוזים המינימליים והמקסימליים של קליטה מוצלחת של צינור אבקה. אחוז הביציות עם פיצוץ צינור אבקה היה שונה באופן משמעותי (p < 0.001) בין שתי השיטות בהתבסס על בדיקת t לא מזווגת. קיצור: SIV = חצי במבחנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| ציוד/הגדרה | וידאו משלים 2 ו-3 |
| מיקרוסקופ | אולימפוס IX-81F-ZDC2 מיקרוסקופ הפוך |
| בקרת טמפרטורה | Life Imaging Services, GmbH, קוביה וקופסה (22C) |
| בקרת לחות | לבנה GmbH של Life Imaging Services (לחות יחסית של 92%) |
| תוכנה | אולימפוס תאסנס מימד 2.3 |
| בקר בזמן אמת | אולימפוס U-RTC |
| לייזר | MT20- מבער קשת קסנון 150 W |
| עדשה אובייקטיבית | טבילת אוויר 10x U Plan SApo עדשה אובייקטיבית (0.4 NA), מרחק עבודה 3.1 מ"מ |
| קוביית מראה | GFP/RFP |
| גלגל סינון | אולימפוס U-FFWO |
| ערוץ 1 (25 מטר) : משתקף (560/25) תצפית (624/40) | |
| ערוץ 2 (60 מילישניות): משתקף (485/20) תצפית (525/30) | |
| ערוץ 3 (60 מילישניות): משתקף (387/11) תצפית (525/30) | |
| ערוץ 4 (60 מילישניות): משתקף (387/11) תצפית (624/30) | |
| גלאי | Hamamatsu ORCA-Fusion מצלמת CMOS דיגיטלית |
| מיקוד אוטומטי | טווח 100 מיקרומטר, צעד גס 7 מיקרומטר, צעד דק 1 מיקרומטר |
| מרווח זמן | 1 דקות |
טבלה 1: מערכות המיקרוסקופ וההגדרות המשמשות בכתב יד זה.
סרטון 1: הפסקות זמן של שיטת הביציות הנכרתו SIV. מיזוג timelapse משמונה העתקים טכניים של SIV באמצעות ביציות שנכרתו המראות את צמיחת צינורות האבקה (המכילים pLAT52:R-GECO) ואת קליטת צינור האבקה בתוך הביציות. 20 הקופסאות הירוקות מראות מקרים של פיצוץ צינור אבקה בסינרגידים, ו-51 הקופסאות האדומות מראות מקרים של פיצוץ צינור אבקה כושל וצמיחת יתר. הפסקות הזמן הן בין 260 דקות ל -400 דקות, וסרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.
סרטון 2: SIV cum septum timelapse. (A) מיזוג של חלוף זמן מכל חמשת אזורי הסקירה (ראו איור 3) של צמיחת צינור האבקה וקליטתו בתוך הביציות עם ערוץ RFP בלבד (ערוץ 1). האבקה מכילה pLAT52:R-GECO והביציות pFG:roGFP2-ORP1-NLS; pMYB98:roGFP2-ORP1. 41 הקופסאות הירוקות מראות מקרים של פיצוץ צינור אבקה, ו-10 הקופסאות האדומות מראות מקרים של פיצוץ כושל של צינור אבקה וצמיחת יתר של צינור אבקה. (B) אותו פרק זמן עם ערוצי RFP ו-GFP (ערוץ 1 וערוץ 2), המראה את הדינמיקה הגרעינית בגמטות ובתאים סינרגידים במהלך קליטת צינור האבקה. המספרים בפינה השמאלית העליונה מציינים את השעה (h:min). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.
סרטון 3: דוגמאות לתוצאות חיוביות ושליליות ממחיצת SIV cum. (A,C) ביציות לדוגמה שנלקחו מסרטון 2 המציגות שני מקרים של הפריה כושלת. ב-A, צינורות האבקה אינם מצליחים לעצור את הצמיחה וממשיכים להתפתל בשק העובר. ב-C נראית קטגוריה שנייה של צמיחת יתר של צינור אבקה, שבה צינור האבקה הראשון עובר צמיחה מהירה כשהוא גדל לתוך הסינרגיד אך עוצר את הצמיחה מבלי להיקרע. (ב,ד) דוגמה לביציות שנלקחו מסרטון 2 המראות שני מקרים של קליטה מוצלחת של צינור אבקה. פיצוץ צינור האבקה דמוי הבר מראה את הקרע הנפיץ של צינור האבקה בסינרגידים, ונדידת גרעין תא הביצה לכיוון המיקרופייל מצביעה על קאריוגמיה. המספרים בפינה השמאלית העליונה מציינים את השעה (h:min). ראשי החצים מציינים את גרעיני הסינרגיד הקלטניים (rSN), והחצים מציינים את נדידת גרעין תא הביצית (EN) לאחר התפוצצות צינור האבקה (ליזה). סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.
קובץ משלים 1: תמונות סטילס של וידאו 1, סרטון 2 וסרטון 3. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה מציג פרוטוקול יעיל להדמיית קליטת צינור אבקה והפריה כפולה בארבידופסיס. השיטה המשופרת, SIV cum septum, מגדילה מאוד את האחוז ואת המספר הכולל של אירועי קליטה מוצלחים של צינור אבקה הניתנים לצפייה בכל מפגש הדמיה. התוצאות המייצגות המוצגות כאן מדגימות מפגש הדמיה עם 41 אירועי קליטה מוצלחים של צינור האבקה ו-10 ביציות המראות פגמים בקליטה (~80% יעילות). זה יותר מכפול ממספר אירועי קליטת צינור האבקה המוצלחים שצולמו בסך הכל בשמונה מפגשי הדמיה באמצעות שיטת SIV המקורית של ביציות שנכרתו (וידאו 1). באמצעות שימוש בשיטת SIV cum septum בחמישה שכפולים טכניים עבור שמונה ספטות בסך הכל, השגנו יעילות קליטה ממוצעת של צינור אבקה של 79% בהשוואה לממוצע של 28% בשיטת SIV exected septum עם שמונה עותקים טכניים (איור 4).
בעוד שהיעילות של קליטת צינור האבקה היא הרבה יותר גדולה עבור שיטת SIV cum septum , מקרים של צמיחת יתר של צינור אבקה עדיין מתרחשים בשיעורים משתנים, בהתאם למספר גורמים. והכי חשוב, התאים הסינרגידים חייבים להישמר חיים ופתוחים במשך מספר השעות שבהן הם מצולמים. שמירה על סביבה לחה במהלך דיסקציה והדמיה, שימוש בתווך טרי, הטבעה של הביציות והמחיצה באגר הנוזלי למחצה, והימנעות מחום שנוצר על ידי חשיפה מוגזמת לאור במהלך רכישת התמונה הם כולם גורמים חיוניים כדי להבטיח קליטה מוצלחת של צינור אבקה. הנגישות והמשיכה של צינורות האבקה למיקרופיילים של הביציות הם גם גורמי מפתח המגבילים את מספר אירועי הקליטה המוצלחים של צינור האבקה. מזעור ההפרעה של הביציות על המחיצה במהלך דיסקציה, כיוון המחיצה כך שהמיקרופיילים פונים כלפי מעלה, והיווצרות בריכה נוזלית למחצה בין הביציות ופתיחת הסגנון הם המפתח למשיכת צינור אבקה. היווצרות מאגר זה יכולה להשתנות בין מותגים של אגר בעל נקודת היתוך נמוכה, ולכן מומלץ להתחיל את הניסויים עם אחוזים משתנים של אגר מ-1% עד 1.5%. לבסוף, הקושי של הדיסקציה אומר שזה דורש קצת תרגול, ומומלץ להישאר סבלני, לתרגל נשימה מרגיעה ועמוקה לפני הנתיחה, וחשוב מכך, לשים לב לטכניקות המשפרות יציבות ועקביות (למשל, מיקום ידיים, כיוון החלקה).
פרוטוקול מפורט זה של שיטת SIV cum septum אמור לשפר מאוד את היעילות ואת מספר הדגימה לניסויים שמטרתם הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה והפריה כפולה. היישומים כוללים שימוש בחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית, ניתוח מוטנטיות ותצפיות תיאוריות של אירועים ציטולוגיים לפני, במהלך ומיד אחרי הפריה כפולה. אנו מקווים שניתן יהיה להרחיב שיטה זו ולהרחיב אותה למיני צמחים פורחים אחרים שבהם שמירה על הביציות על שליית השחלה יכולה להועיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לשרה סימוניני וסטפנו בנסיוונגה על תרומת מבנה pFG:roGFP2-ORP1-NLS ולכריסטוף אייכנברגר, יוהאן אלמנדינגר, וינסנט סאטר וסיליה בארו על עצתם בנושא מיקרוסקופיה. אנו מודים בחביבות לעצות של ראווי פלניבלו, פיליפ דנינגר, שרון קסלר, מארק ג'ונסון, טומוקזו קוואשימה וכל שאר המשתתפים בכנס הבינלאומי לרבייה מינית של צמחים 2022 שהביעו עניין בפרוטוקול על SIV cum septum. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת ציריך ומענקים מהקרן הלאומית למדע של שווייץ ל- U.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7 (2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645 (2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722 (2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
