Summary
Her beskriver vi en forbedring av semi-in vitro (SIV)-metoden for å observere pollenrørveiledning og mottak i Arabidopsis thaliana, noe som øker mottakeligheten til ovler. Den høye gjennomstrømningen SIV cum septum-metoden kan kombineres med gametofyttmarkørlinjer og genetisk kodede biosensorer for å overvåke den dynamiske prosessen med befruktning.
Abstract
I blomstrende planter er veksten og veiledningen av pollenrøret (mannlig gametofytt) i pistilen og mottak av pollenrøret av den kvinnelige gametofytten avgjørende for dobbel befruktning og påfølgende frøutvikling. Samspillet mellom mannlige og kvinnelige gametofytter under mottak av pollenrør kulminerer i pollenrørbrudd og frigjøring av to sædceller for å oppnå dobbel befruktning. Siden pollenrørvekst og dobbel befruktning er dypt skjult i blomstens vev, er denne prosessen vanskelig å observere in vivo.
En semi-in vitro (SIV) metode for levende celleavbildning av befruktning i modellplanten Arabidopsis thaliana er utviklet og implementert i flere undersøkelser. Disse studiene har bidratt til å belyse de grunnleggende egenskapene til hvordan befruktningsprosessen skjer i blomstrende planter og hvilke cellulære og molekylære endringer som oppstår under samspillet mellom mannlige og kvinnelige gametofytter. Men fordi disse levende cellebildebehandlingseksperimentene involverer eksisjon av individuelle ovler, er de begrenset til et lavt antall observasjoner per bildebehandling, noe som gjør denne tilnærmingen kjedelig og svært tidkrevende. Blant andre tekniske vanskeligheter rapporteres det ofte om svikt i pollenrørene for å gjødsle ovlene in vitro , noe som forvirrer slike analyser alvorlig.
Her er det gitt en detaljert videoprotokoll for avbildning av mottak og befruktning av pollenrør på en automatisert og høy gjennomstrømningsmåte, noe som muliggjør opptil 40 observasjoner av mottak og brudd av pollenrør per bildebehandling. Sammen med bruk av genetisk kodede biosensorer og markørlinjer, muliggjør denne metoden generering av store prøvestørrelser med redusert tidsinvestering. Nyanser og kritiske punkter i teknikken, inkludert blomsterstaging, disseksjon, mediumforberedelse og bildebehandling, er tydelig detaljert i videoformat for å lette fremtidig forskning på dynamikken i pollenrørveiledning, mottak og dobbeltbefruktning.
Introduction
Genereringen av genetisk unike avkom i seksuelt reproduserende organismer er avhengig av vellykket fusjon av mannlige og kvinnelige gameter. I blomstrende planter avhenger samspillet mellom to mannlige kjønnsceller (sædceller) med to kvinnelige gameter (eggcelle og sentralcelle) under dobbelt befruktning av sædfrigivelse fra pollenrøret (den mannlige gametofytten). Denne prosessen, kalt pollenrørmottak, styres i stor grad av synergidcellene som ligger i embryosekken (den kvinnelige gametofytten)1,2. Ettersom mottak av pollenrør foregår dypt inne i blomsten, erdet etablert en metode som tillater levende celleavbildning av prosessen, kalt semi-in vitro (SIV) pollenrørmottak. Med denne metoden plasseres utskårne Arabidopsis-ovler på halvflytende pollenspiringsmedium og målrettet av pollenrør som vokser gjennom stigma og stil av en pistil kuttet ved stiloverførende kanalkryss 3,4. Siden utviklingen av denne teknikken har detaljerte observasjoner ført til flere funn rundt pollenrørveiledning, mottak og befruktning. Blant annet inkluderer disse funnene oppkjøpet av pollenrørets målrettede kompetanse ved vekst gjennom stigma3, utbruddet av intracellulære kalsiumoscillasjoner i synergidene ved pollenrørets ankomst 5,6,7,8,9, og dynamikken i sædcellefrigjøring og befruktning ved pollenrørsprengning 10 . Likevel, fordi denne teknikken er avhengig av eksisjon av ovler, er observasjonene av befruktning begrenset i antall, og mottak av pollenrør er ofte avvikende, noe som resulterer i svikt i pollenrørbrudd (Video 1 og tilleggsfil 1). Derfor er det behov for en mer effektiv tilnærming som muliggjør høykapasitetsanalyser av mottak og befruktning av pollenrør.
Ved utviklingen av denne protokollen ble flere nye tilnærminger for å analysere pollenrørmottak, som spenner fra de mest "in vitro" til de mest "in vivo" -metodene, testet, og en effektiv teknikk basert på eksisjon av hele septum ble avgjort, noe som muliggjør opptil 40 observasjoner av befruktning per dag. Her er nyansene og kritiske punkter i teknikken skissert, inkludert blomsterstaging, disseksjon, mediumforberedelse og bildeinnstillinger. Ved å følge denne protokollen bør det legges til rette for forskning med fokus på pollenrørsveiledning, mottak av pollenrør og dobbeltbefruktning. De høyere utvalgsstørrelsene metoden tillater forventes å styrke den vitenskapelige forsvarligheten av konklusjonene fra levende bildeeksperimenter. De potensielle anvendelsene av denne teknikken inkluderer, men er ikke begrenset til, å utføre observasjoner av molekylære og fysiologiske endringer i cytosoliske kalsiumkonsentrasjoner ([Ca 2+] cyt), pH eller H 2 O2under gametofyttinteraksjoner ved bruk av genetisk kodede biosensorer. Videre kan cytologiske endringer, som degenerasjon av mottakelig synergid, sædcellemigrasjon eller karyogami, lettere observeres ved hjelp av denne forbedrede metoden. Endelig kan tidspunktet for de forskjellige stadiene av befruktning overvåkes under bredfeltsmikroskopi, og deretter kan mer detaljerte analyser ved hjelp av konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) eller to-foton eksitasjonsmikroskopi (2PEM) utføres for høyere oppløsning og 3D-rekonstruksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se materialfortegnelsen for en liste over materialer og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Betraktninger for utforming av bildeeksperimentet
- Forhåndsbestem bildevarigheten og samplingsfrekvensen som kreves for å fange det ønskede fenomenet som skal observeres. For eksempel, etter Nyquists samplingsteorem, må samplingsfrekvensen være større enn to ganger den høyeste frekvensen av inngangsprøven. Derfor, for å nøyaktig fange synergid [Ca2 +] cytoscillasjoner , utfør avbildning omtrent hver 10. s, men for å måle hastigheten til sædcellene ved pollenrørutslipp, sørg for en tidsmessig oppløsning på mindre enn 1 s10.
- Velg fluorescerende markører for cellene av interesse som er tilstrekkelig lyse utover bakgrunnsautofluorescens. For bruk av biosensorer, velg de lyseste linjene som ikke forstyrrer cellefunksjonen, da de generelt er mer følsomme og krever mindre eksponeringstid.
- Vurder hvilken type fluorescensmikroskopi og forstørrelse som er mest egnet for å fange det ønskede fenomenet. Bruk bredfeltsmikroskopi og mål med lav forstørrelse for å fange lys fra større dybdeskarphet, og opprettholde fokus over tid, avbilde større objekter som hele ovler, eller bruk ratiometriske sensorer som er følsomme for kromatiske skiftartefakter. Bruk CLSM eller 2PEM med høyforstørrelsesmål for bedre oppløsning av cellulære og subcellulære objekter, men merk vanskeligheten med å opprettholde fokus over tid.
- Beregn antall prøver som skal avbildes per eksperiment. Du kan for eksempel bruke et 10x-objektiv med en minste samplingstid på ~30 s for avbildning av tre septaer og avbildning av opptil 40 befruktningshendelser per eksperiment på grunn av tiden som kreves for autofokus- og flertrinnsanskaffelsesfunksjonene.
2. Pollen spiring medium forberedelse
- Forbered flytende pollenspiringsmedium (5mM CaCl2, 1mM MgSO4, 5mM KCl, 0,01% [w / v] H 3 BO3og 10% [w / v] sukrose) ved bruk av 1 M aliquot bestander av hvert mikronæringsstoff, som lagres ved -20 ° C. Juster pH til 7,5 med 0,1 M KOH. Oppbevar mediet ved 4 °C i opptil 2 uker.
MERK: pH kan falle over tid. - Tilsett 2,5 ml flytende medium til et 10 ml beger, og tilsett sakte 32 mg agarose med ultralavt smeltepunkt (~ 1,3%) med en raskt roterende rørestang for å unngå klumping.
- Smelt agarose på kokeplate ved 65 °C, og nøtt begeret for å samle opp kondens fra sidene.
- Pipett 130 μL medium inn i 14 mm brønnen på en 35 mm glassfatfat, og roter parabolen til mediet dekker brønnen.
- Aspirer totalt 40 μL med en pipette fra midten av fatet, og etterlater et totalt volum på 90 μL.
MERK: Mer medium kan aspireres ut av brønnen for å oppnå et lavere totalvolum; Dette kan være nødvendig for mål med høy forstørrelse med lav arbeidsavstand. Men jo tynnere agarputen er, desto raskere vil den tørke ut. - Avkjøl fatet på en aluminiumsblokk i et fuktighetskammer for å sikre jevn avkjøling. Oppbevar tallerkenene ved 4 °C over natten til bruk neste morgen.
3. Blomsteriscenesettelse av septumdonorer, stigmadonorer og pollendonorer
Figur 1: Blomsterstaging av septumdonorer, stigmadonorer og pollendonorer. (A) Stadier av Arabidopsis blomster (Ler-0) innenfor en blomsterstand. Knopper på stadium 12B, som har kronblad som er i ferd med å åpne og gule indehiscent støtfangere, bør emasculated ved å fjerne alle begerblad, kronblad og stammer. Pistiler (som huser den kvinnelige gametofyttmakeren) kan da brukes som septumdonorer 24 timer senere. (B) Stadier av Arabidopsis blomster (Col-0) i en blomsterstand. Knopper på stadium 12B, som har gule indehiscent støtfangere og stigmas som bare knapt kommer fra kronbladene, bør emasculated ved å fjerne alle begerblad, kronblad og stammer. Pistilene kan da brukes som stigmadonorer 24 timer senere, når de skal pollineres av blomster (som har den mannlige gametofyttmarkøren) som er åpne og kaster pollen. Pollinerte stigmas bør dissekeres innen 1 time etter pollinering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Morgenen før avbildning, velg Arabidopsis-planter som skal brukes som septumdonorer og stigmadonorer; Sørg for at de er sunne og nylig har begynt å produsere siliques.
MERK: Landsberg erecta (L er-0) er en god tiltredelse for bruk som septumdonor, siden septaen er solid, og deter små internoder mellom ovlene. Columbia (Col-0) er en god tiltredelse å bruke som stigmadonor fordi de ser ut til å bidra til pollenrørvekst. - Emasculate minst tre stadium 12B septum donor blomster og 12 stadium 12B stigma donor blomster ved å fjerne sine pollenbærere, begerblad og kronblad (figur 1A, B). Fjern også eldre blomster på samme blomsterstand, som potensielt kan pollinere den emasculated blomsten.
- Om morgenen, 24 timer senere, pollinerer stigmadonorene med pollendonorblomstene (f.eks. Har pollenrør eller sædcellemarkører) som lett kaster pollen. Pollineringen er fullført når stigmaene er nesten helt dekket med pollen (figur 1B).
4. Septum disseksjon
Figur 2: En rask guide til septum og stigma disseksjon. (A) Trinn av septum disseksjon. Fest pistilen på dobbeltsidig tape med en insulinsprøytenål, og gjør kutt ved stil-eggstokkkrysset og eggstokk-pedicle-krysset, etterfulgt av et grunt kutt langs septum av hver karpe (trinn 1). Riv karpeveggene tilbake på båndet (trinn 2). Skjær replumet under øverste septum (trinn 3). Skjær septum på stilen, og fjern med tang på pedikelen (trinn 4). Legg septum på agarmedier, og legg forsiktig inn med tang. (B) Trinn av stigma disseksjon. Fest pistilen (pollinert <1 time før) på dobbeltsidig tape, og kutt i stil-eggstokkkrysset med et barberblad (trinn 6). Legg stigmaet på agarmedium med en insulinnål ved siden av septum, og juster avstanden til ca. 250 μm (trinn 7-8). Sørg for at et halvflytende basseng dannes rundt mikropylene og basen av stilene (trinn 9). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Tretti minutter etter pollinering, samle sunne og modne septumdonorpistiler på pedicle, og legg dem på fersk dobbeltsidig klebrig tape montert på et glassglass, med stigmaet stikkende like utenfor kanten av båndet.
MERK: Begrens disseksjonstiden som pistilene er på klebrig tape for å sikre at den er så kort som mulig. Disseksjonen skal utføres ved høy luftfuktighet, noe som kan oppnås ved å plassere en luftfukter ved siden av lysbildet. - Fest pistilen sikkert på båndet ved å trykke forsiktig på pedicle og langs eggstokken ved hjelp av baksiden av en ny insulin sprøytenål før du fjerner sepal, petal og stamen rusk igjen fra emasculation.
- Under et stereoskop, bruk en insulin sprøytenål for å lage to kutt per karpe ved style-eggstokk krysset og eggstokk-pedicle krysset, etterfulgt av grunne kutt langs septum av hver karpe (figur 2, trinn 1).
MERK: Kutting for dypt langs septum vil kutte ovler ved funiculus. - Trekk eggstokkveggene forsiktig tilbake på båndet (figur 2, trinn 2), og skyv nålen forsiktig mellom de to septaene for å kutte replumet langs hele pistilens lengde uten å forstyrre eggene (figur 2, trinn 3).
NOTAT: Klipp replum i retning fra stilen til pedicle for å sikre at ovlene på toppseptum forstyrres så lite som mulig. - Skjær den øverste septumen forsiktig både i krysset med stilen og med pedicle, og fjern septum med tang fra pedicle-siden (figur 2, trinn 4).
NOTAT: Hold dette kuttet rett og forsiktig slik at septum forblir flatt og ikke kurver. - Plasser septum så flatt som mulig på mediet slik at mikropylene i ovlene er vendt opp og i samme fokalplan. Trykk septum forsiktig inn i mediet til eggene bare er litt innebygd i mediet (figur 2, trinn 5).
MERK: Det er viktig at septum plasseres slik at mikropylene i ovlene er tilgjengelige for pollenrørene (eventuelle utilgjengelige ovler kan forsiktig omarrangeres med en nål). Et lite basseng med væske skal dannes rundt septum etter innebygging. - Gjenta trinn 4.1-4.6 for opptil to pistiler til, og plasser septaen fra ende til annen.
5. Stigma disseksjon
- Plasser de pollinerte stigmadonorpistilene på fersk dobbeltsidig klebrig tape montert på et glassglass, slik at koblingen i eggstokkstil er utenfor kanten av båndet (figur 2, trinn 6).
- Bruk et nytt barberblad til å skjære stilen rett ned og løft bort for å holde stigmaet festet til bladet (figur 2, trinn 6).
NOTAT: Klipp på kanten av båndet for det reneste kuttet. - Fjern stigmaet fra bladet med en insulinsprøytenål og legg det flatt ca. 250-300 μm fra egglene (figur 2, trinn 7-8).
MERK: Stilen skal være orientert horisontalt på siden; Ellers vil de fleste pollenrørene vokse ned under septum. Et lite basseng med væske ved inngangen av stilen skal vises etter at den har ligget på mediet i 1 min; Dette er et godt tegn, da pollenrørene vil ha en jevn utgang fra stilen. - Gjenta trinn 5.1-5.3 for opptil 12 stigmaer, plasser to på hver side av hver septum. Se etter et lite basseng med væske som dannes rundt mikropylen i ovlene; Dette bidrar til tilgjengeligheten og målrettingen av pollenrørene til embryosekkene (figur 2, trinn 9).
NOTAT: Begrens tiden parabolen er åpen for å forhindre at mediet og eggene tørker ut.
6. Bildebehandling
Figur 3: SIV cum septum imaging scheme. (A) Full SIV cum septum oppsett med 12 pollinerte stigmas og 3 septa, sett gjennom et stereoskop. (B) Sammenslåtte bilder av hele SIV cum septumoppsettet sett i A 5 timer etter inkubasjon ved bruk av et 10x mål, med de fem oversiktsområdene (~ 1 mm hver) merket for flertrinns oppkjøp. De grønne boksene viser ovlene som mottok pollenrør som gjennomgikk et eksplosivt utbrudd i synergidene. (C) Nærmere visning av oversiktsområde 2 på forskjellige tidspunkter. Ca. 3 timer etter inkubering i fuktighetskammeret på mikroskopet, bør pollenrørene komme nær mikropylene, og ved 6 timers bildebehandling skal de fleste ovler ha mottatt pollenrør (grønne firkanter); Disse ovlene gjennomgår deretter eksplosiv pollenrørsprengning (stjerne). Skalastenger = (A) 5 mm, (B,C) 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Når disseksjonen er ferdig og fatet er klart til å avbildes, la det ruge i et fuktighetskammer på mikroskopet opprettholdt ved 92% relativ fuktighet og 21 ° C.
MERK: Hvis det ikke er noe fuktighetskammer tilgjengelig for mikroskopet, vil fôr ytterkantene på lokket og fatet med et lite volum vann bidra til å opprettholde et høyt fuktighetsnivå i parabolen. - Bring prøvene i fokus under lysstyrke ved lav lysintensitet, og bytt deretter til fluorescerende lys, og merk områdene av prøven på sceneoversikten som skal avbildes.
MERK: Ved 10x forstørrelse kan omtrent fem områder merkes for totalt tre septa (figur 3). Begrens tiden som brukes til merking av oversiktsområdene for å minimere fototoksisitet eller oppvarming av prøven med det fluorescerende lyset. - Start avbildning ved hjelp av et flertrinns anskaffelsesskjema med en autofokusfunksjon i begynnelsen av hvert oversiktsområde. Som pollenrør vil dukke opp fra stilen ~ 1 time etter inkubering av prøven, forsinke oppkjøpet med 2 timer eller til pollenrørene har nådd micropyle. Sørg for at autofokusen er innstilt med et område på 100 μm (7 μm store trinn og 1 μm fine trinn) for å holde eggene i fokus når septaen beveger seg litt og synker over tid.
- Stopp bildeoppkjøpet ~ 9 h etter å ha startet prøveinkubasjonen, da de fleste ovlene på dette tidspunktet burde ha tiltrukket og mottatt et pollenrør.
MERK: Hvis et lavt antall ovler tiltrekker pollenrør, er nøye observasjon av parabolen under et stereoskop nyttig for å bestemme hvordan eggløsningen eller stilorienteringen kan forbedres neste gang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å vurdere tidspunktet for kjernefysisk degenerasjon i den mottakelige synergiden med hensyn til pollenrørbrudd i Arabidopsis , samt å observere om venstre eller høyre synergid er forutbestemt til å bli den mottakelige synergien, ble SIV cum septummetoden beskrevet her ansatt ved hjelp av en kvinnelig gametofyttnukleær markør stablet med en synergid cytosolisk markør (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) som septumdonor og en mannlig gametofyttmarkør (pLAT52:R-GECO) som pollendonor. Septa og pollinerte stigmaer ble dissekert 24 timer etter avmaskulering, i henhold til § 4-5 i protokollen, og plassert på glassbunnfat med et medium tilberedt dagen før. Hver tallerken ble plassert i et fuktighetskammer på mikroskopet, og et flertrinnseksperiment ble utført med en 10x objektivlinse (numerisk blenderåpning: 0,4) med fem oversiktsområder (figur 3). Bilder av hvert område ble tatt hver 60. s i 9 timer med fire fluorescerende kanaler: Kanal (1) 560/640 for R-GECO (25 ms), Kanal (2) 488/520 for roGFP2-ORP1 (60 ms), Kanal (3) 387/520 for roGFP2-ORP1 (60 ms) og Kanal (4) 387/640 for bakgrunnssubtraksjon (60 ms) (tabell 1). En autofokusfunksjon med et område på 100 μm med 7 μm grovtråkk og 1 μm fintråkk ble brukt for hvert minutt før bildeopptak. De fem bildefilene ble åpnet i FIJI, kanalene ble separert, og deretter ble bildene manuelt flislagt sammen (Video 2 og Supplementary File 1).
I Video 2 (se også tilleggsfil 1) kan man se 41 eksempler på eksplosiv pollenrørsbrudd i synergidene i ovlene, med grønne firkanter som markerer interesseområdene. Ved å bruke kalsiumbiosensorlinjen pLAT52:RGECO som pollendonor, ble det sett tilfeller av eksplosiv pollenrørsbrudd i tuppen av pollenrørene der de lyse. Spesielt var det en rask økning i lysstyrken til biosensoren som et resultat av dens plutselige eksponering for høye nivåer av kalsium. Eksplosiv pollenrørsbrudd kan også analyseres med GFP-baserte eller RFP-baserte sædceller eller cytosoliske markører, som også viser rask frigjøring av sæd eller cytoplasmatisk innhold. Ved pollenrørsruptur ble kjernen til den reseptive synergiden observert å nedbrytes samtidig (innen 1 minutts tidsoppløsning i forsøket), og migrasjon av eggcellekjernen mot mikropyle ble også sett ved pollenrørsruptur som følge av karyogamy (Video 3 og tilleggsfil 1). Både venstre og høyre synergid var i stand til å tjene som den mottakelige synergien, og forekomster av to pollenrørutbrudd ble observert, for det første i den mottakelige synergiden og for det andre i den vedvarende synergiden. Video 2 (se også tilleggsfil 1) viser 10 eksempler på defekt mottak av pollenrør, som kan sees i ovlene, med interesseområdene markert med røde firkanter. Dermed var den totale effektiviteten av pollenrørmottak ~ 80% med hensyn til ovlene som tiltrakk pollenrør. I disse mislykkede tilfellene arresterer pollenrørene enten veksten i mikropylen, arresterer veksten etter den raske veksten i synergidene, eller unnlater å arrestere veksten og fortsette å vokse og spire i embryosekken. Ovlene uten noen indikerte interesseområder klarte ikke å tiltrekke pollenrør eller var ikke i en tilgjengelig orientering. Forstørrede eksempler på negative og positive utfall kan ses i video 3 (se også tilleggsfil 1), som viser to tilfeller av defekt mottak av pollenrør (Video 3A, C og tilleggsfil 1), og to tilfeller av vellykket mottak av pollenrør (Video 3B, D og tilleggsfil 1).
Figur 4: Sammenligning av SIV-metodens effektivitet. Åtte tekniske replikater av SIV excised ovles-metoden (71 totalt ovler) viste bare ~ 28% ovler med eksplosive pollenrørbrudd, noe som resulterte i en effektivitet fra ~ 10% -50%. Fem tekniske replikater av SIV cum septummetoden (8 septa og 102 ovler) viste ~ 79% ovler med eksplosiv pollenrørsprengning, noe som resulterte i en effektivitet fra ~ 70% -100%. Bare ovler som tiltrakk pollenrør til mikropylen og ovler som hadde nok registrert tid til å motta det tiltrukkede pollenrøret, ble talt. "X" angir henholdsvis gjennomsnittet og midtlinjen medianverdien (50. persentil ). Linjene utenfor øvre og nedre kvartil viser minimums- og maksimumsprosentene for vellykket mottak av pollenrør. Andelen ovler med pollenrørsprengning var signifikant forskjellig (p < 0,001) mellom de to metodene basert på uparret t-test. Forkortelse: SIV = semi-in vitro. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Utstyr/innstilling | Supplerende video 2 og 3 |
| Mikroskop | Olympus IX-81F-ZDC2 invertert mikroskop |
| Temperaturkontroll | Life Imaging Services GmbH-kube og boks (22C) |
| Fuktighetskontroll | Life Imaging Services GmbH-murstein (92 % relativ fuktighet) |
| Programvare | Olympus cellSens Dimension 2.3 |
| Kontroller i sanntid | Olympus U-RTC |
| Laser | MT20- 150 W xenonbuebrenner |
| Objektiv linse | 10x luftfordypning U Plan SApo objektivlinse (0,4 NA), arbeidsavstand 3,1 mm |
| Speil kube | GFP/RFP |
| Filterhjul | Olympus U-FFWO |
| Kanal 1 (25 ms): reflektert (560/25) observasjon (624/40) | |
| Kanal 2 (60 ms): reflektert (485/20) observasjon (525/30) | |
| Kanal 3 (60 ms): reflektert (387/11) observasjon (525/30) | |
| Kanal 4 (60 ms): reflektert (387/11) observasjon (624/30) | |
| Detektor | Hamamatsu ORCA-Fusion Digital CMOS kamera |
| Autofokus | 100 μm rekkevidde, 7 μm grovt trinn, 1 μm fint trinn |
| Tidsintervall | 1 min |
Tabell 1: Mikroskopsystemene og innstillingene som er brukt i dette manuskriptet.
Video 1: Timelapses av SIV excised ovles-metoden. Sammenslått timelapse fra åtte tekniske replikater av SIV ved hjelp av utskårne ovler som viser veksten av pollenrør (med pLAT52: R-GECO) og pollenrørmottak i ovlene. De 20 grønne boksene viser forekomster av eksplosive pollenrørsprengninger i synergidene, og de 51 røde boksene viser tilfeller av mislykket pollenrørsprengning og gjengroing. Tidsforløpene er mellom 260 min og 400 min, og skalaen er 100 μm. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: SIV cum septum timelapse. (A) Sammenslått timelapse fra alle fem oversiktsområdene (se figur 3) av pollenrørets vekst og mottak i eggene med bare RFP-kanalen (Kanal 1). Pollen har pLAT52: R-GECO og ovlene pFG: roGFP2-ORP1-NLS; pMYB98: roGFP2-ORP1. De 41 grønne boksene viser tilfeller av eksplosiv pollenrørsprengning, og de 10 røde boksene viser tilfeller av mislykket pollenrørsprengning og gjengroing av pollenrør. (B) Samme timelapse med både RFP- og GFP-kanalene (Kanal 1 og Kanal 2), som viser kjernedynamikken i kjønnscellene og synergidcellene under mottak av pollenrør. Tallene øverst til høyre angir klokkeslettet (t:min). Skala bar = 500 μm. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: Eksempler på positive og negative utfall fra SIV cum septum. (A,C) Eksempel ovler hentet fra Video 2 som viser to tilfeller av mislykket befruktning. I A klarer ikke pollenrørene å stanse veksten og fortsetter å kveile seg i embryosekken. I C ses en annen kategori av pollenrørets overvekst, hvor det første pollenrøret gjennomgår rask vekst når det vokser inn i synergiden, men arresterer veksten uten å briste. (B,D) Eksempel ovler hentet fra Video 2 som viser to tilfeller av vellykket mottak av pollenrør. Den villtypelignende pollenrørsprengningen viser den eksplosive rupturen av pollenrøret i synergidene, og migrasjonen av eggcellekjernen mot mikropylen indikerer karyogami. Tallene øverst til høyre angir klokkeslettet (t:min). Pilspissene indikerer de mottakelige synergidkjernene (rSN), og pilene indikerer migrasjonen av eggcellekjernen (EN) etter pollenrørsprengning (lysis). Skala bar = 30 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsfil 1: Stillbilder av Video 1, Video 2 og Video 3. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet introduserer en effektiv protokoll for avbildning av mottak av pollenrør og dobbeltbefruktning i Arabidopsis. Den forbedrede metoden, SIV cum septum, øker prosentandelen og det totale antallet vellykkede mottakshendelser for pollenrør som kan observeres per bildebehandling. De representative resultatene vist her viser en bildebehandlingsøkt med 41 vellykkede mottakshendelser for pollenrør og 10 ovler som viser mottaksfeil (~ 80% effektivitet). Dette er over dobbelt så mange vellykkede mottakshendelser for pollenrør fanget i totalt åtte bildebehandlingsøkter ved hjelp av den opprinnelige SIV-utskårne ovlesmetoden (Video 1). Ved å bruke SIV cum septum-metoden i fem tekniske replikater for totalt åtte septa, oppnådde vi en gjennomsnittlig pollenrørmottakseffektivitet på 79% sammenlignet med et gjennomsnitt på 28% ved bruk av SIV excised septum-metoden med åtte tekniske replikater (figur 4).
Mens effektiviteten av pollenrørmottak er mye større for SIV cum septummetoden , forekommer forekomster av pollenrørovervekst fortsatt i varierende hastigheter, avhengig av flere faktorer. Viktigst av alt, synergidcellene må holdes i live og mottakelige i flere timer som de blir avbildet. Opprettholde et fuktig miljø under disseksjon og avbildning, ved hjelp av nylaget medium, innebygging av ovler og septum i halvflytende agar, og unngå varme generert ved overdreven lyseksponering under bildeopptak er alle avgjørende faktorer for å sikre vellykket pollenrørmottak. Tilgjengeligheten og tiltrekningen av pollenrør til mikropyles av ovlene er også viktige faktorer som begrenser antall vellykkede pollenrørmottakshendelser. Minimere forstyrrelsen av ovlene på septum under disseksjon, orientere septum slik at mikropylene vender oppover, og dannelsen av et halvflytende basseng mellom ovlene og åpningen av stilen er nøkkelen til tiltrekning av pollenrøret. Dannelsen av dette bassenget kan variere mellom merker med lavsmeltepunktagar, og det anbefales derfor å starte forsøkene med varierende prosentandeler agar fra 1% til 1,5%. Endelig betyr vanskeligheten med disseksjonen at det krever litt øvelse, og det anbefales å være tålmodig, øve avslappende og dyp pusting før disseksjonen, og viktigere, å legge merke til teknikkene som forbedrer stabiliteten og konsistensen (f.eks. Håndposisjonering, lysbildeorientering).
Denne detaljerte protokollen for SIV cum septum-metoden skal forbedre effektiviteten og prøvenummeret for eksperimenter rettet mot levende avbildning av pollenrørmottak og dobbeltbefruktning. Bruksområder inkluderer bruk av genetisk kodede biosensorer, mutantanalyse og beskrivende observasjoner av cytologiske hendelser før, under og like etter dobbeltbefruktning. Vi håper at denne metoden kan utvides og utvides til andre blomstrende plantearter der opprettholdelse av ovler på eggstokkens morkake kan være til nytte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Sara Simonini og Stefano Bencivenga for å donere pFG: roGFP2-ORP1-NLS-konstruksjonen og Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter og Celia Baroux for deres råd om mikroskopi. Vi takker for råd fra Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima og alle andre på International Conference on Sexual Plant Reproduction 2022 som viste interesse for en protokoll om SIV cum septum. Dette arbeidet ble støttet av Universitetet i Zürich og tilskudd fra Swiss National Science Foundation til UG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7 (2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645 (2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722 (2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
