Summary
Deze techniek beschrijft een effectieve workflow om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus in HeLa-cellen te visualiseren en kwantitatief te meten met behulp van op fluorescentie gebaseerde live beeldvorming.
Abstract
Mitochondriën zijn dynamische organellen die cruciaal zijn voor metabole homeostase door de energieproductie te regelen via ATP-synthese. Om het cellulaire metabolisme te ondersteunen, werken verschillende mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen samen om een gezond mitochondriaal netwerk te behouden. Een dergelijke route is mitofagie, waarbij PTEN-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) en Parkin fosfo-ubiquitinatie van beschadigde mitochondriën autofagosoomsekwestratie en daaropvolgende verwijdering uit de cel via lysosoomfusie vergemakkelijken. Mitofagie is belangrijk voor cellulaire homeostase en mutaties in Parkin zijn gekoppeld aan de ziekte van Parkinson (PD). Vanwege deze bevindingen is er een aanzienlijke nadruk gelegd op het onderzoeken van mitochondriale schade en omzet om de moleculaire mechanismen en dynamiek van mitochondriale kwaliteitscontrole te begrijpen. Hier werd live-cell imaging gebruikt om het mitochondriale netwerk van HeLa-cellen te visualiseren, om het mitochondriale membraanpotentieel en superoxideniveaus te kwantificeren na behandeling met carbonylcyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel. Bovendien werd een PD-gebonden mutatie van Parkin (ParkinT240R) die Parkin-afhankelijke mitofagie remt, uitgedrukt om te bepalen hoe mutante expressie het mitochondriale netwerk beïnvloedt in vergelijking met cellen die wild-type Parkin tot expressie brengen. Het hier beschreven protocol beschrijft een eenvoudige workflow met behulp van fluorescentie-gebaseerde benaderingen om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus effectief te kwantificeren.
Introduction
Het mitochondriale netwerk is een reeks onderling verbonden organellen die een cruciale rol spelen bij energieproductie1, aangeboren immuniteit2,3 en celsignalering 4,5. Mitochondriale ontregeling is in verband gebracht met neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson (PD)6,7. PD is een progressieve neurodegeneratieve aandoening die dopaminerge neuronen van de substantia nigra aantast en die wereldwijd bijna 10 miljoen mensen treft8. PD is genetisch gekoppeld aan mitofagie, een mitochondriale kwaliteitscontroleroute die nodig is voor het handhaven van cellulaire homeostase die selectief beschadigde mitochondriën verwijdert 9,10. Studies hebben meerdere onafhankelijke mitofagieroutes geïdentificeerd, waaronder het FUN14-domein met 1 (FUNDC1) -gemedieerde mitofagie, Bcl-2 interagerende eiwit 3 (BNIP3) -gefaciliteerde mitofagie, NIX-afhankelijke mitofagie en de goed gekarakteriseerde PTEN-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) / Parkin-gereguleerde mitofagie10,11. PINK1 (een vermeend kinase) en Parkin (een E3 ubiquitine ligase) werken samen met fosfo-ubiquitinaat beschadigde mitochondriën, die de vorming van autofagosomen aandrijft die het beschadigde organel overspoelen en fuseren met lysosomen om de afbraak te initiëren 12,13,14,15,16. Mutaties in Parkin zijn in verband gebracht met PD-gebonden fenotypes zoals neurodegeneratie via het verlies van dopaminerge neuronen17,18.
Hier wordt een protocol beschreven waarin HeLa-cellen, routinematig gebruikte onsterfelijke cellen afgeleid van baarmoederhalskanker, worden gebruikt om de rol van Parkin bij het handhaven van mitochondriale netwerkgezondheid te onderzoeken. HeLa-cellen drukken verwaarloosbare niveaus van endogene Parkin uit en vereisen daarom exogene Parkin-expressie19. Om de rol van Parkin in de gezondheid van mitochondriale netwerken te bestuderen, worden HeLa-cellen getransfecteerd met wild-type Parkin (ParkinWT), een Parkin-mutant (ParkinT240R) of een lege controlevector. ParkinT240R is een autosomaal recessieve juveniele parkinsonismemutatie die de Parkin E3-ligaseactiviteit beïnvloedt, waardoor de efficiëntie van de mitofagieroute aanzienlijk wordt verminderd20. HeLa-cellen zijn onderhevig aan milde (5 μM) of ernstige (20 μM) concentraties van carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon (CCCP), een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel. Behandeling met ernstige concentraties CCCP wordt routinematig gebruikt om parkine-gemedieerde mitofagie te induceren in verschillende cellijnen, zoals HeLa- en COS-7-cellen21,22,23.
Na de behandeling maakt het protocol gebruik van live beeldvorming van het mitochondriale netwerk met behulp van twee momenteel beschikbare mitochondriale gerichte fluorescerende kleurstoffen. Tetramethylrhodamine, ethylester, perchloraat (TMRE) is een kationische kleurstof die fluoresceert op basis van mitochondriaal membraanpotentiaal24, terwijl MitoSOX een mitochondriale superoxide-indicator is waarbij de fluorescentie-intensiteit een functie is van superoxideconcentratie25. Ten slotte maakt het geschetste protocol gebruik van een op fluorescentie gebaseerde kwantificering en eenvoudige workflow om het mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus effectief te kwantificeren met minimale ruimte voor gebruikersbias. Hoewel dit protocol is ontworpen om de mitochondriale functie in HeLa-cellen te bestuderen, kan het worden aangepast voor extra cellijnen en primaire celtypen om de mitochondriale netwerkgezondheid kwantitatief te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van biologische monsters
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit met behulp van steriele techniek in een bioveiligheidskast. Spuit het oppervlak van de kast en alle materialen met 70% ethanol.
- HeLa cel kweken en transfectie
- Kweek 30.000 HeLa-cellen in Dulbecco's gemodificeerde adelaarmedium (DMEM) met 4,5 g / L glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% L-glutamine-oplossing (HeLa-media; zie Tabel met materialen). Plaats de cellen op 35 mm beeldvormende schalen met glazen bodem (zieT able of Materials) die 2 ml voorverwarmde HeLa-media bevatten. Houd de HeLa-culturen op 5% CO2 en 37 °C26,27.
- Inspecteer de dag na het plateren de 35 mm beeldvormende schotels met behulp van een lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat de cellen ~ 50% -60% confluent zijn. Eenmaal samenvloeiend, transfecteren de HeLa-cellen met lege gele fluorescerende eiwit (YFP) vector, YFP-ParkinWT of YFP-ParkinT240R (figuur 1A).
- Bereid twee afzonderlijke mengsels in steriele microcentrifugebuizen voor elke transfectie. Meng door op de buis te tikken of zachtjes op en neer te pipetteren.
- Meng in buis 1 200 μl gereduceerde serummedia (zie materiaaltabel) met 2 μg plasmide-DNA.
- Meng in buis 2 200 μl gereduceerd serummedium met 6 μl transfectiereagens (zie materiaaltabel)28.
- Incubeer de buizen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Voeg buis 2 toe aan buis 1, meng door op en neer te pipetteren en incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
- Voeg de transfectiecomplexen druppelsgewijs toe aan de bestaande beeldvormingsschotels met de HeLa-celculturen, waardoor een gelijke verdeling over de hele schaal wordt gegarandeerd. Plaats de beeldvormende schalen een nacht in de incubator van 5% CO2 en 37 °C.
OPMERKING: Label elk gerecht met het juiste getransfecteerde plasmide. Label voor elk experiment de drie YFP-ParkinWT-schotels (dimethylsulfoxide [DMSO; zie materiaaltabel], 5 μM CCCP en 20 μM CCCP). Herhaal de etikettering met de drie YFP-ParkinT240R-schotels en de drie lege YFP-vectorschotels.
- Bereiding van CCCP en fluorescerende kleurstoffen
LET OP: Fluorescerende kleurstoffen zijn vaak lichtgevoelig. Bewaar de kleurstoffen in het donker met behulp van aluminiumfolie of bruine centrifugebuizen om de blootstelling aan licht te verminderen.- Maak een werkvoorraad CCCP van 5 mM (zie materiaaltabel) door 5 mg CCCP op te lossen in 4,89 ml DMSO. Maak een werkvoorraad CCCP van 20 mM door 5 mg CCCP op te lossen in 1,22 ml DMSO.
- Verdun 10 μL van een 1 mM MitoTracker Deep Red (zie Materiaaltabel) stamoplossing in 390 μL DMSO om een werkvoorraad van 25 μM te maken.
- Los 50 μg MitoSOX Red25 (zie materiaaltabel) op in 13 μL DMSO om een werkvoorraad van 5 mM te creëren.
- Los 10 mg TMRE24 (zie materiaaltabel) op in 19,4 ml DMSO om een stamoplossing van 1 mM te maken. Verdun de TMRE door 10 μL 1 mM TMRE toe te voegen aan 990 μL DMSO om een werkvoorraad van 10 μM te maken.
2. CCCP-behandeling en mitochondriale etikettering met fluorescerende sondes in HeLa-cellen
LET OP: Voer de volgende stappen snel uit om ervoor te zorgen dat de HeLa-cellen niet voor een langere periode uit de incubator zijn.
- Voeg de dag na de transfectie 2 μL van 5 of 20 mM CCCP (eindconcentratie: respectievelijk 5 μM en 20 μM) toe aan elke experimentele plaat. Voeg voor controleplaten 2 μL DMSO toe. Breng de platen gedurende 1,5 uur terug naar de incubator van 5% CO2 en 37 °C (figuur 1A).
OPMERKING: De CCCP-behandeling duurt in totaal 2 uur. De mitochondriën worden echter gelabeld met fluorescerende sondes tijdens de laatste 30 minuten van de CCCP-behandeling. - Verwijder na 1,5 uur de platen uit de incubator en voeg fluorescerende sondes toe aan de beeldvormende schotels. Breng de platen gedurende 30 minuten terug naar de incubator van 5% CO2 en 37 °C (figuur 1A).
- TMRE-experiment: Voeg 2 μL 25 μM MitoTracker (eindconcentratie: 25 nM) en 2 μL 10 μM TMRE (eindconcentratie: 10 nM) toe.
- MitoSOX-experiment: Voeg 2 μL 25 μM MitoTracker (eindconcentratie: 25 nM) en 1 μL 5 mM MitoSOX (eindconcentratie: 2,5 μM) toe.
- Na de 2 uur durende CCCP-behandeling bereidt u de HeLa-cellen voor op beeldvorming (figuur 1A,B).
- TMRE-experiment: HeLa-cellen zijn onmiddellijk klaar om in beeld te brengen; ervoor te zorgen dat de TMRE in de HeLa-celkweekmedia blijft.
- MitoSOX-experiment: Was de cellen 3x met 2 ml voorverwarmde HeLa-media om vrije MitoSOX-kleurstof te verwijderen. Voeg 2 ml voorverwarmde media toe. De HeLa-cellen zijn nu klaar om in beeld te worden gebracht.
OPMERKING: Was de HeLa-cellen met verse, voorverwarmde HeLa-media die dezelfde DMSO- of CCCP-concentratie bevatten als de experimentele toestand; omvatten geen MitoSOX of MitoTracker.
3. Confocale microscoop beeldacquisitie setup
OPMERKING: Maak een afbeelding van de HeLa-cellen met behulp van een confocale microscoop (zie materiaaltabel) die is uitgerust met een 63x/1,40 numeriek diafragma (NA) olie-onderdompelingsobjectief en een omgevingskamer (zie materiaaltabel).
- Schakel 1 uur voor het beeld de CO2 in door de tankklep te openen. Druk op de aan-knop om de omgevingsregelaar voor de microscoop in te schakelen. Gebruik de pijlen omhoog en omlaag op het touchpad om de temperatuur in te stellen op 37 °C en de CO2 op 5%. Druk op Instellen wanneer u klaar bent.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de deuren naar de omgevingskamer gesloten zijn en wacht tot de omstandigheden stabiliseren. - Laserinstellingen
- Schakel de White Light Laser (WLL) in en stel het laservermogen in op 85% en de excitatieregeling op maximaal vermogen. Klik op het tabblad Verwerven, selecteer Laser toevoegen en schakel in het dialoogvenster dat verschijnt de WLL in op Aan. Klik op de Laser Power-knop en voer 85% in. Klik op de knop Excitatiecontrole en selecteer Maximaal vermogen in het vervolgkeuzemenu (Afbeelding 2A).
- TMRE-experiment: Stel de excitatie- en emissiespectra in voor YFP, MitoTracker en TMRE.
- Stel voor YFP de excitatielaser in op 514 nm en het emissiespectravenster op 524-545 nm. Klik op het tabblad Verkrijgen op de knop Nieuwe instelling toevoegen. klik vervolgens op Laser toevoegen en sleep deze naar instelling 1. Dubbelklik op de excitatieregel en voer 514 in als golflengte in het dialoogvenster. Dubbelklik op de bijbehorende detector en voer 524 in voor het begin en 545 voor de eindgolflengte.
- Voor MitoTracker Deep Red stelt u de excitatielaser in op 641 en het emissiespectravenster op 650-750 nm. Klik op het tabblad Verkrijgen op de knop Laser toevoegen en sleep deze naar instelling 1. Dubbelklik op de excitatielijn en voer 641 in als golflengte in het dialoogvenster. Dubbelklik op de bijbehorende detector en voer 650 in voor het begin en 750 voor de eindgolflengte.
- Stel voor TMRE de excitatielaser in op 555 nm en het emissiespectravenster op 557-643 nm. Klik op het tabblad Verkrijgen op de knop Nieuwe instelling toevoegen . klik vervolgens op de knop Laser toevoegen en sleep deze naar instelling 2. Dubbelklik op de excitatielijn en voer 555 in als golflengte in het dialoogvenster. Dubbelklik op de bijbehorende detector en voer 557 in voor het begin en 643 voor de eindgolflengte.
- MitoSOX experiment: Stel de excitatie- en emissiespectra in voor YFP, MitoTracker en MitoSOX (figuur 2B).
- Stel voor YFP de excitatielaser in op 507 nm en het emissiespectravenster op 517-540 nm. Klik op het tabblad Verkrijgen op de knop Nieuwe instelling toevoegen. klik vervolgens op de knop Laser toevoegen en sleep deze naar instelling 1. Dubbelklik op de excitatieregel en voer 507 in als golflengte in het dialoogvenster. Dubbelklik op de bijbehorende detector en voer 517 in voor het begin en 540 voor de eindgolflengte.
- Stel voor MitoSOX de excitatielaser in op 547 nm en het emissiespectravenster op 564-636 nm. Klik op het tabblad Verkrijgen op de knop Nieuwe instelling toevoegen . klik vervolgens op de knop Laser toevoegen en sleep deze naar instelling 2. Dubbelklik op de excitatielijn en voer 547 in als golflengte in het dialoogvenster. Dubbelklik op de bijbehorende detector en voer 564 in voor het begin en 636 voor de eindgolflengte.
- Voor MitoTracker Deep Red stelt u de excitatielaser in op 641 nm en het emissiespectravenster op 652-742 nm. Klik op het tabblad Verkrijgen op de knop Nieuwe instelling toevoegen. klik op de knop Laser toevoegen en sleep deze naar instelling 3. Dubbelklik op de excitatielijn en voer 641 in als golflengte in het dialoogvenster. Dubbelklik op de bijbehorende detector en voer 652 in voor het begin en 742 voor de eindgolflengte.
- Instellingen voor beeldacquisitie (figuur 2C)
- Stel het formaat in op 1.024 x 1.024, de scansnelheid op 600 Hz en het lijngemiddelde op 3.
- Selecteer het tabblad Acquisitie en klik op de knop Opmaken . Selecteer in het vervolgkeuzemenu 1.024 x 1.024. Klik op de knop Snelheid en selecteer 600 in het vervolgkeuzemenu. Klik vervolgens op de knop Lijngemiddelde en selecteer 3 in het vervolgkeuzemenu.
- Schakel Bidirectioneel scannen in en stel de fase- en zoomfactor in op respectievelijk 22,61 en 1,50.
- Zet op het tabblad Acquisitie de knop Bidirectioneel op Aan. Klik op de fase X-instelling en stel deze in op 22.61. Klik op de instelling Zoomfactor en stel deze in op 1,50.
- Stel het formaat in op 1.024 x 1.024, de scansnelheid op 600 Hz en het lijngemiddelde op 3.
4. Beeldacquisitie
LET OP: De experimentator moet een visueel oordeel vellen om de cellen te selecteren op basis van het YFP-fluorescentiesignaal. Vermijd oververzadigde pixels, omdat deze de kwantificering van de fluorescentie-intensiteit aanzienlijk kunnen beïnvloeden. Gebruik een over/onder opzoektabel die pixelverzadiging aangeeft om te voorkomen dat u verzadigde afbeeldingen krijgt.
- Klik op de gewenste instelling en druk op Fast Live om een live voorbeeld van het fluorescentiebeeld te geven.
- Pas de versterking en intensiteit aan door te dubbelklikken op de bijbehorende detector. Pas in het dialoogvenster dat wordt weergegeven de versterking aan met de schuifregelaar. Als u de intensiteit wilt wijzigen, dubbelklikt u op de excitatielijn en gebruikt u de pijlen omhoog en omlaag in het pop-upvenster om de intensiteit te wijzigen. Klik op Stoppen om de voorvertoning te beëindigen.
- TMRE-experiment : maak eerst een afbeelding van de DMSO-besturingsplaat . Pas de versterking en intensiteit van het TMRE-signaal (instelling 2) aan zodat de mitochondriale netwerkintensiteit net onder de verzadiging ligt; Houd de winst en intensiteit constant voor het experiment. Pas de versterking en intensiteit van de MitoTracker en YFP (instelling 1) aan zodat het mitochondriale netwerk zichtbaar maar gedimd is.
- MitoSOX-experiment: maak eerst een afbeelding van de DMSO-besturingsplaat. Pas de versterking en intensiteit van het MitoSOX-signaal (instelling 2) aan zodat de fluorescentie zichtbaar maar gedimd is; Houd de winst en intensiteit constant voor het experiment. Pas de versterking en intensiteit van de YFP (instelling 1) en MitoTracker (instelling 3) aan zodat het mitochondriale netwerk zichtbaar maar gedimd is.
OPMERKING: Noteer de versterking en intensiteit van TMRE en MitoSOX, omdat deze waarden gedurende het hele experiment constant moeten blijven. De fluorescentiesignalen van YFP en MitoTracker zijn in dit protocol niet gekwantificeerd. Daarom kunnen de versterking en intensiteit voor elk beeld worden aangepast. Het is het meest effectief om de versterkings- en intensiteitsinstellingen te hebben waarbij de cellen gemakkelijk te zien zijn, maar nog steeds dimmen, om ervoor te zorgen dat de cellen niet worden blootgesteld aan overmatige laserintensiteiten die celbeschadiging of fotobleking veroorzaken.
- Zodra de versterkings- en intensiteitsinstellingen zijn voltooid, klikt u op Start om een afbeelding te verkrijgen. Verkrijg afbeeldingen van 20 cellen per experimentele toestand (bijvoorbeeld vijf afbeeldingen met vier cellen per afbeelding; Figuur 2D).
5. Kwantificering van de fluorescentie-intensiteit met behulp van ImageJ
OPMERKING: Imaging-bestanden worden opgeslagen als ".lif" en zijn compatibel met ImageJ29. Compatibele bestandstypen met ImageJ worden op hun website gespecificeerd. Het kan nodig zijn om het bestandstype te converteren als het niet compatibel is.
- Maak en bewaar een interessante regio (ROI).
- Klik in ImageJ op Bestand | Nieuw | Beeld. Klik in het dialoogvenster dat wordt weergegeven op OK.
- Klik op de knop Rechthoek en teken een vak van 6 micron x 6 micron. Open de ROI-manager door te klikken op Analyseren | Hulpmiddelen | ROI-beheer en wacht tot er een dialoogvenster met de ROI-manager wordt weergegeven (afbeelding 3A). Voeg de rechthoekige ROI toe aan de manager door op Toevoegen te klikken in het dialoogvenster Manager. Sla de ROI op door Meer te selecteren en klik vervolgens op de knop Opslaan en OK.
- Meet de fluorescentie-intensiteit.
- Klik in afbeelding J op Bestand en selecteer Openen. Selecteer in het dialoogvenster de afbeeldingsbestanden voor het experiment en klik op Openen.
- Wacht tot het venster Importopties voor bio-indelingen verschijnt (afbeelding 3B). Selecteer Kanalen splitsen en klik op Openen.
OPMERKING: Met de functie voor gesplitste kanalen kan elk kanaal in de afbeelding als een afzonderlijk venster worden geopend. De kanaalorder komt overeen met de acquisitieorder.- TMRE-experimenten : YFP (instelling 1) is het eerste kanaal (c = 0); MitoTracker (instelling 1) is het tweede kanaal (c = 1); en TMRE (Instelling 2) is het derde kanaal (c = 2).
- MitoSOX-experimenten : YFP (instelling 1) is het eerste kanaal (c = 0); MitoSOX (Instelling 2) is het tweede kanaal (c = 1); en MitoTracker (instelling 3) is het derde kanaal (c = 2).
- Pas de helderheid aan door Afbeelding | Aanpassen | Helderheid (figuur 3C).
OPMERKING: Druk niet op Instellen of Toepassen om ervoor te zorgen dat de helderheid van de afbeelding niet permanent wordt gewijzigd. Soms is de fluorescentie-intensiteit niet zichtbaar in de TMRE- of MitoSOX-kanalen. Pas de helderheid aan om de visualisatie te vergemakkelijken. Het wijzigen van de helderheid heeft geen invloed op de ruwe fluorescentie-intensiteitswaarden. - Klik op Analyseren en selecteer Metingen instellen. Schakel de vakken Gebied en Gemiddelde grijswaarde in en klik op OK (Afbeelding 3D).
OPMERKING: De gemiddelde grijswaarde is de fluorescentie-intensiteit. - Open de ROI Manager en laad de ROI die is opgeslagen in stap 5.1 door te klikken op Analyseren | Hulpmiddelen | ROI-manager. Klik in ROI-beheer op Meer, vervolgens op Openen in de lijst die wordt weergegeven en selecteer de opgeslagen ROI.
- Meet de fluorescentie-intensiteit van vijf willekeurige regio's in een enkele cel door de opgeslagen ROI van de ROI-manager te selecteren en de ROI naar een willekeurige locatie in een cel te verplaatsen (figuur 3E). Meet de fluorescentie-intensiteit door op M te drukken. Herhaal deze stap met vier extra niet-overlappende gebieden. Wanneer een dialoogvenster met de grijze waarden gebied en gemiddelde grijswaarden wordt weergegeven (afbeelding 3F), kopieert en plakt u de waarden in een spreadsheet voor analyse.
- TMRE-experiment : Selecteer afbeelding (c = 2).
- MitoSOX-experiment : Selecteer afbeelding (c = 2).
- Behaal de gemiddelde fluorescentie-intensiteitswaarden. Gebruik spreadsheetsoftware (zie Materiaaltabel) en neem het gemiddelde van de vijf gemiddelde grijswaarden. Herhaal dit proces voor elke cel.
- Analyseer en vergelijk de TMRE- of MitoSOX-gemiddelde grijswaarden over experimentele omstandigheden met behulp van een statistisch softwareprogramma (zie Materiaaltabel; Figuur 4 en figuur 5). Presenteer gegevens als staafdiagrammen of vioolplots.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol werd op fluorescentie gebaseerde kwantificering gebruikt om de membraanpotentiaal en superoxideniveaus van het mitochondriale netwerk te meten na CCCP-behandeling (figuur 1). Deze workflow gebruikte HeLa-cellen, een vereeuwigde cellijn afgeleid van baarmoederhalskanker. HeLa-cellen worden routinematig gebruikt om mitochondriale biologie te bestuderen en zijn relatief vlak, waardoor het gemakkelijk is om het mitochondriale netwerk te visualiseren met behulp van microscopie. Om de rol van Parkin bij het handhaven van de gezondheid van het mitochondriale netwerk te onderzoeken, werden HeLa-cellen tijdelijk getransfecteerd met een lege controlevector, ParkinWT of ParkinT240R (een mutant die mitofagie verstoort)21. HeLa-cellen werden geplateerd in beeldvormingsschalen met glazen bodem van 35 mm en werden getransfecteerd zodra ~ 50% -60% confluentie was bereikt (figuur 1A). Omdat HeLa-cellen zich snel delen, is dit meestal de dag na het plaatsen van de cellen in de beeldvormende schotels. Een lichtmicroscoop werd gebruikt om het YFP-fluorescentiesignaal de volgende dag te observeren om de transfectie-efficiëntie te beoordelen. Experimenten werden alleen uitgevoerd na een succesvolle transfectie.
Na inspectie werden de HeLa-cellen behandeld met milde (5 μM) of ernstige (20 μM) concentraties van CCCP om het mitochondriale netwerk te depolariseren (stap 1.2 toont gedetailleerde instructies voor het bereiden van CCCP en fluorescerende sondes). De CCCP-behandeling werd in totaal 2 uur uitgevoerd. Tijdens de laatste 30 minuten van de CCCP-behandeling werden de mitochondriën gelabeld met MitoTracker en TMRE/MitoSOX (figuur 1A). Opgemerkt moet worden dat TMRE en MitoSOX overlappende fluorescentiespectra hebben en niet tegelijkertijd kunnen worden gebruikt. In plaats daarvan gebruikten we afzonderlijke beeldvormingsschotels voor de TMRE- en MitoSOX-experimenten. Voor TMRE-experimenten waren de HeLa-cellen onmiddellijk klaar om in beeld te brengen aan het einde van de 2 uur CCCP-behandeling. De TMRE-concentratie moet constant blijven; daarom bleef TMRE in de HeLa-media. Vrije MitoSOX moet echter worden verwijderd voordat beeldvorming wordt gemaakt. Voor de MitoSOX-experimenten werden de cellen drie keer gewassen met HeLa-media om de vrije kleurstof te verwijderen. Voor deze stap is het essentieel om HeLa-media te gebruiken die dezelfde DMSO- of CCCP-concentratie bevatten als de experimentele omstandigheden. Hoechst 33342, een kernmarker, werd aanvankelijk gebruikt om de HeLa-cellen te beoordelen na de transiënte transfectie en CCCP-behandeling (figuur 1B).
Vervolgens werd confocale microscopie uitgevoerd om TMRE- en MitoSOX-fluorescentie-intensiteiten te visualiseren, om respectievelijk de mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus te meten. De beelden werden verkregen met behulp van een 63x (1,4 NA) olie-onderdompelingsobjectief met parameters van bidirectioneel scannen, een ruimtelijke resolutie van 1.024 x 1.024 pixels, een scansnelheid van 600 Hz, lijngemiddelde van 3, een fase van 22,61 en een zoomfactor van 1,5 (figuur 2C). De DMSO-regelplaat werd als eerste in beeld gebracht voor alle experimenten om de versterkings- en intensiteitswaarden voor TMRE en MitoSOX in te stellen. Om kwantitatieve vergelijkingen tussen omstandigheden te maken, moeten deze waarden worden ingesteld in de DMSO-toestand en constant blijven gedurende het hele experiment. CCCP induceert mitochondriale depolarisatie en een verlies van membraanpotentiaal, wat resulteert in een verminderde TMRE-fluorescentie-intensiteit. Daarom hadden de controle-experimenten de hoogste TMRE-intensiteit en werden de versterkings- en intensiteitswaarden dicht bij verzadiging ingesteld. Daarentegen verhogen hogere superoxideniveaus de MitoSOX-intensiteit. Daarom had de besturing de laagste MitoSOX-fluorescentie-intensiteit en werden de versterkings- en intensiteitswaarden laag ingesteld waar een dimsignaal aanwezig was. Aangezien MitoTracker, TMRE en MitoSOX vitale kleurstoffen zijn en alle cellen labelen, mogen ze niet worden gebruikt bij het selecteren van cellen om af te beelden. In plaats daarvan werden de cellen geselecteerd op basis van het YFP-signaal om ervoor te zorgen dat ze werden getransfecteerd. Er werden eenvlaksbeelden verkregen, gericht op de bodem van de HeLa-cel, waar zich een grote populatie mitochondriën bevond.
Kwantificering van TMRE- en MitoSOX-fluorescentie-intensiteit
Kwantificering van de fluorescentie-intensiteiten van TMRE en MitoSOX werd geanalyseerd met behulp van ImageJ (figuur 3). Een ROI van 6 micron x 6 micron werd gemaakt en opgeslagen in de ROI-manager. De ROI werd in vijf willekeurige niet-overlappende gebieden van elke cel geplaatst om de TMRE- of MitoSOX-intensiteit te meten. De fluorescentie-intensiteit komt overeen met de gemiddelde grijswaarde in ImageJ. De vijf intensiteitswaarden werden gemiddeld voor elke cel om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit per cel te berekenen. Deze waarden werden uitgezet en geanalyseerd op statistische significantie over de behandelingsomstandigheden.
De resultaten voor de fluorescentie-intensiteiten TMRE en MitoSOX zijn weergegeven in respectievelijk figuur 4 en figuur 5. Zoals verwacht verminderde behandeling met het bekende ontkoppelingsmiddel CCCP de TMRE-fluorescentie-intensiteit in vergelijking met de controleomstandigheden (figuur 4A,B). Bovendien veroorzaakte een ernstige (20 μM) CCCP-behandeling de productie van superoxide en verhoogde de MitoSOX-fluorescentie-intensiteit (figuur 5A,B). In milde (5 μM) CCCP-stressomstandigheden resulteerde de expressie van ParkinWT en ParkinT240R in een hogere TMRE-intensiteit in vergelijking met de lege YFP-controlevector. Evenzo was de MitoSOX-intensiteit lager in cellen die ParkinWT en ParkinT240R tot expressie brachten in vergelijking met cellen die de YFP-controlevector tot expressie brachten (figuur 5A,B). Deze resultaten suggereren dat Parkin-expressie helpt de gezondheid van het mitochondriale netwerk te behouden door hogere mitochondriale membraanpotentialen en lage superoxideniveaus te behouden. Het hier beschreven protocol kan dus worden gebruikt om de fluorescentie-intensiteit nauwkeurig te vergelijken om de rol van Parkin bij het beheersen van mitochondriaal membraanpotentiaal en superoxidevorming te analyseren.
Figuur 1: Experimentele workflow. (A) Schema van de experimentele workflow die wordt gebruikt om het mitochondriënnetwerk te transfecteren, te behandelen met CCCP en het te labelen, en TMRE- en MitoSOX-fluorescentie-intensiteit in HeLa-cellen af te beelden. (B) Representatieve afbeeldingen van cellen die een lege YFP-vector (boven), YFP-ParkinWT (midden) en YFP-ParkinT240R (onder; magenta) tot expressie brengen. Hoechst 33342 (wit) wordt gebruikt om het DNA te labelen. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: CCCP = carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon; TMRE = tetramethylrhodamine-ethylester-perchloraat; YFP = geel fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De gebruikersinterface voor het instellen van confocale acquisitie-instellingen . (A) Dialoogvenster Laserinstellingen. De rode rechthoek markeert de witlichtlaser, de voedingstoestand, het laservermogen en de golflengten. (B) Experimenteel kanaal opgezet voor een MitoSOX-experiment. De instellingen, excitatielijnen en emissiespectravensters worden weergegeven voor YFP, MitoSOX en MitoTracker. (C) Acquisitie-instellingen tonen het formaat, de snelheid, bidirectionaliteit, fase X, zoomfactor en lijngemiddelde. (D) Een representatief verworven beeld. HeLa-cellen brengen YFP (magenta) tot expressie en de mitochondriën zijn gelabeld met MitoSOX (groen) en MitoTracker (cyaan). Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: WLL = witlichtlaser; YFP = geel fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: ImageJ-workflow om TMRE- en MitoSOX-fluorescentie-intensiteiten te kwantificeren . (A) Het ROI-managerpaneel met een voorbeeld-ROI in ImageJ. (B) Optiepaneel voor het importeren van bioformaten. De rode rechthoek markeert de optie Kanalen splitsen die moet worden geselecteerd. (C) Parameters voor helderheids- en contrastinstellingen. (D) Stel de meetparameter in. De rode rechthoeken markeren de grijze waardeopties Gebied en Gemiddelde die moeten worden geselecteerd. (E) Representatieve afbeelding van een HeLa-cel gelabeld met MitoSOX. Het rode vierkant illustreert de ROI van paneel A. Schaalbalk = 10 μm. (F) Resultatenpaneel met het experimentele gebied en de gemiddelde grijswaarden van de ROI's. De gemiddelde grijswaarde (oranje) vertegenwoordigt de fluorescentie-intensiteitswaarden. Afkortingen: TMRE = tetramethylrhodamine-ethylester-perchloraat; ROI = regio van belang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: TMRE-fluorescentie-intensiteit na mitochondriale schade. (A) Representatieve beelden van HeLa-cellen na een behandeling van 2 uur met DMSO, 5 μM CCCP of 20 μM CCCP om mitochondriale schade te induceren. Cellen drukken exogeen een lege YFP-vector uit, YFP-ParkinWT of YFP-ParkinT240R (magenta), en gelabeld met MitoTracker (cyaan) en TMRE (groen). Schaalbalk = 30 μm. (B) Kwantificering van TMRE-fluorescentie-intensiteit voor cellen die lege YFP-vector (blauw), YFP-ParkinWT (oranje) en YFP-ParkinT240R (paars) tot expressie brengen in DMSO- en CCCP-behandelde omstandigheden. p < 0,0001 door tweeweg ANOVA met een meervoudige vergelijkingstest. (C-E) De kwantificering van de TMRE-fluorescentie-intensiteiten van paneel B wordt gescheiden om verschillen in DMSO (C), 5 μM CCCP (D) en 20 μM CCCP (E) te benadrukken. * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001 door Kruskal-Wallis ANOVA met Dunn's meervoudige vergelijkingstest. Ns = niet significant. Gemiddelde ± SEM; n= 79-104 van drie onafhankelijke biologische replicaties. Afkortingen: CCCP = carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon; TMRE = tetramethylrhodamine-ethylester-perchloraat; YFP = geel fluorescerend eiwit; DMSO = dimethylsulfoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: MitoSOX fluorescentie-intensiteit na schade aan het mitochondriale netwerk. (A) Representatieve beelden van HeLa-cellen die gedurende 2 uur zijn behandeld met DMSO, 5 μM CCCP of 20 μM CCCP om de mitochondriale membraanpotentiaal los te koppelen. Cellen werden getransfecteerd met lege YFP-vector, YFP-ParkinWT of YFP-ParkinT240R (magenta) en gelabeld met MitoTracker (cyaan) en MitoSOX (groen). Schaalbalk = 30 μm. (B) Kwantificering van MitoSOX-fluorescentie-intensiteit voor cellen die lege YFP-vector (blauw), YFP-ParkinWT (oranje) en YFP-ParkinT240R (paars) tot expressie brengen voor controle- en behandelde omstandigheden. p < 0,0001 door tweeweg ANOVA met Dunn's meervoudige vergelijkingstest. (C-E) De kwantificering van de MitoSOX-fluorescentie-intensiteiten van paneel B wordt gescheiden om verschillen in DMSO (C), 5 μM CCCP (D) en 20 μM CCCP (E) te benadrukken. *p < 0,05; p < 0,0001 door Kruskal-Wallis ANOVA met Dunn's meervoudige vergelijkingstest. Ns = niet significant. Gemiddelde ± SEM; n = 87-107 van drie onafhankelijke biologische replicaties. Afkortingen: CCCP = carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon; TMRE = tetramethylrhodamine-ethylester-perchloraat; YFP = geel fluorescerend eiwit; DMSO = dimethylsulfoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven workflow kan worden gebruikt om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus robuust en reproduceerbaar te kwantificeren met behulp van op fluorescentie gebaseerde beeldvorming30. Er zijn belangrijke technische beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van deze experimenten. HeLa-cellen werden getransfecteerd met een lege YFP-vector, YFP-ParkinWT of YFP-ParkinT240R. De lege YFP-vector werd gebruikt als een controle om te bevestigen dat de experimentele bevindingen specifiek waren voor Parkin. Voor de transiënte transfectie werd experimenteel een massaverhouding van 1:3 voor DNA tot transfectiereagens bepaald om de hoogste transfectiesnelheid op te leveren, waarbij 2 μg plasmide-DNA werd gebruikt voor elk construct28. Het was belangrijk om de YFP-tag consistent te houden voor alle constructen, omdat fluorescerende eiwitten verschillen in aangeboren helderheid31,32. Als meerdere fluorescerende eiwittags moeten worden gebruikt, moeten fluorescerende eiwitten met vergelijkbare helderheid en fotostabiliteit worden geselecteerd33.
Om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus te meten, werden twee goed gedocumenteerde kleurstoffen geselecteerd. Het fluorescentiesignaal van TMRE is gebaseerd op de mitochondriale membraanpotentiaal, terwijl MitoSOX-fluorescentie-intensiteit een functie is van superoxideniveaus. Voor op fluorescentie gebaseerde beeldvorming mag er geen spectrale overlap zijn tussen fluorescerende sondes. Het initiële protocol werd echter uitgevoerd met behulp van mCherry-ParkinWT en mCherry-ParkinT240R, die overlapten met de rood-verschoven spectra van TMRE en MitoSOX. Om spectrale overlap te voorkomen en potentiële overspraak te minimaliseren, werden YFP-gelabelde Parkin-constructies geselecteerd. Deze aanpassing maakte het noodzakelijk om de MitoTracker-kleurstof te veranderen van groen naar verrood. Daarnaast werd de HeLa-celbeplatingsdichtheid geoptimaliseerd; aanvankelijk werden HeLa-cellen geplateerd op 45.000 cellen per beeldvormingsschotel, maar dit resulteerde in over-confluente schotels. Hoge celconfluentie kan de transfectie-efficiëntie verminderen, celdood bevorderen en het cellulaire metabolisme veranderen34,35,36. Om deze potentiële effecten te voorkomen, werden de cellen geplateerd met een dichtheid van 30.000 cellen per beeldvormingsschaal.
De belangrijkste beperking van dit protocol is het potentieel voor gebruikersbias, met name bij het selecteren van cellen en ROI-locaties. Het protocol gebruikt veranderingen in de fluorescentie-intensiteiten van TMRE en MitoSOX als een functionele uitlezing voor membraanpotentiaal en superoxideniveaus. Daarom kan celselectie met behulp van deze sondes mogelijk de experimentele resultaten vertekenen. Om deze bias te bestrijden, kozen we cellen die uitsluitend gebaseerd waren op YFP-expressie. Niet-overlappende ROIs werden willekeurig geselecteerd in het mitochondriale netwerk in de cel. Hoewel deze methode eerder werd gebruikt om fluorescentie-intensiteit27 te meten, konden aanvullende bias-reducerende maatregelen worden genomen. Ten eerste kan de studie worden geblindeerd met behulp van de Blind Analysis Tools in ImageJ om ROI-selectie te voorkomen die de verwachte resultaten ondersteunt. Ten tweede kunnen fluorescentie-intensiteiten worden gemeten met behulp van geavanceerde beeldanalysesoftware die de noodzaak van ROIs elimineert.
Hoewel dit protocol confocale microscopie gebruikt voor op fluorescentie gebaseerde kwantificering, kunnen aanvullende methoden, zoals flowcytometrie, worden gebruikt om fluorescentieveranderingen in TMRE en MitoSOX37 te kwantificeren. Hier gebruikten we confocale microscopie in plaats van flowcytometrie om de mitochondriale netwerkmorfologie te visualiseren. Het geschetste protocol kan eenvoudig worden aangepast om TMRE- en MitoSOX-fluorescentie te meten met flowcytometrie die vergelijkbare experimentele resultaten oplevert. Bovendien kunnen zuurstofverbruikssnelheidstests (OCR) worden gebruikt om veranderingen in de functie van de mitochondriale elektronentransportketen te detecteren zonder kationische kleurstoffen. Hoewel OCR een gevoelige maat is voor mitochondriale disfunctie, is het niet specifiek voor membraanpotentiaal of superoxideconcentratie, maar biedt het in plaats daarvan een globale maat voor de mitochondriale functie38. Deze testen kunnen worden uitgevoerd in combinatie met TMRE- en MitoSOX-experimenten om de mitochondriale gezondheid te beoordelen39.
Hoewel dit protocol zich specifiek richt op het effect van de mitochondriale ontkoppeling CCCP40, kunnen schadelijke reagentia met alternatieve mechanismen worden gebruikt. Antimycine A en oligomycine A zijn bijvoorbeeld elektronentransportketenremmers die vaak worden gebruikt om mitochondriale schade te induceren via de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS)38. Terwijl we specifiek mitochondriale superoxideniveaus hebben gemeten met MitoSOX, kan intracellulaire ROS worden gemeten met CellROX. In HeLa-cellen was het noodzakelijk om Parkin te overexpresseren vanwege de lage endogene expressie. Toekomstige studies zouden de effecten van Parkin-expressie op mitochondriale netwerkgezondheid kunnen observeren met behulp van celkweeksystemen die endogene Parkin41 tot expressie brengen. Aangezien mitochondriën kritische regulatoren zijn van het energiemetabolisme en cellulaire homeostase, wordt mitochondriale disfunctie geassocieerd met tal van ziekten, waaronder diabetes42, de ziekte van Alzheimer 43,44,45, kanker 46 en leverziekte 47. Daarom kan deze workflow worden aangepast om mitochondriale gezondheid en ontregeling in relevante cellijnen en primaire culturen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen aan te geven.
Acknowledgments
We danken de leden van het Evans-lab voor hun doordachte feedback op dit manuscript. Dit werk wordt ondersteund door Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars en Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Figuur 1A is gemaakt met behulp van BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
| DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
| FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
| GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
| Experimental models: Organisms/Strains | |||
| HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
| Recombinant DNA | |||
| EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
| YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
| YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
| Software and Algorithms | |||
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
| Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
| ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
| Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
| Other | |||
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
| DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
| LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
| STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
- Tait, S. W. G., Green, D. R.
- Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
- Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
- Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
- Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
- Martinez-Vicente, M.
- Youle, R. J., Narendra, D. P.
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
- Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
- Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
- Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
- Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
- Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
- Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
- Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
- Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
- Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
- Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
- Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
- Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
- Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).
- Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
- Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
- Thorn, K.
- Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
- Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
- Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
- Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
- Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K.
- Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
- Baloyannis, S. J.
- Wallace, D. C.
- Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).
