Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fluorescensbasert kvantifisering av mitokondriemembranpotensial og superoksidnivåer ved bruk av levende avbildning i HeLa-celler

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65304
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

Summary

Denne teknikken beskriver en effektiv arbeidsflyt for å visualisere og kvantitativt måle mitokondriemembranpotensial og superoksidnivåer i HeLa-celler ved hjelp av fluorescensbasert levende bildebehandling.

Abstract

Mitokondrier er dynamiske organeller som er kritiske for metabolsk homeostase ved å kontrollere energiproduksjon via ATP-syntese. For å støtte cellulær metabolisme samarbeider ulike mitokondrielle kvalitetskontrollmekanismer for å opprettholde et sunt mitokondrielt nettverk. En slik vei er mitofagi, hvor PTEN-indusert kinase 1 (PINK1) og Parkin-fosfo-ubiquitinering av skadede mitokondrier letter autofagosomsekvestrasjon og påfølgende fjerning fra cellen via lysosomfusjon. Mitofagi er viktig for cellulær homeostase, og mutasjoner i Parkin er knyttet til Parkinsons sykdom (PD). På grunn av disse funnene har det vært betydelig vekt på å undersøke mitokondriell skade og omsetning for å forstå molekylære mekanismer og dynamikk i mitokondriell kvalitetskontroll. Her ble levende celleavbildning brukt til å visualisere det mitokondrielle nettverket av HeLa-celler, for å kvantifisere mitokondriemembranpotensialet og superoksidnivåene etter behandling med karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), et mitokondrielt frakoblingsmiddel. I tillegg ble en PD-bundet mutasjon av Parkin (ParkinT240R) som hemmer Parkin-avhengig mitofagi uttrykt for å bestemme hvordan mutant uttrykk påvirker mitokondrienettverket sammenlignet med celler som uttrykker villtype Parkin. Protokollen som er skissert her, beskriver en enkel arbeidsflyt ved hjelp av fluorescensbaserte tilnærminger for å kvantifisere mitokondriemembranpotensial og superoksidnivåer effektivt.

Introduction

Mitokondrienettverket er en serie sammenkoblede organeller som spiller en avgjørende rolle i energiproduksjon1, medfødt immunitet2,3 og cellesignalering 4,5. Mitokondriell dysregulering har vært assosiert med nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons sykdom (PD)6,7. PD er en progressiv nevrodegenerativ lidelse som påvirker dopaminerge nevroner av substantia nigra som påvirker nesten 10 millioner mennesker over hele verden8. PD har vært genetisk knyttet til mitofagi, en mitokondriell kvalitetskontrollvei som er nødvendig for å opprettholde cellulær homeostase som selektivt fjerner skadede mitokondrier 9,10. Studier har identifisert flere uavhengige mitofagiveier, inkludert FUN14-domene som inneholder 1 (FUNDC1)-mediert mitofagi, Bcl-2 interagerende protein 3 (BNIP3)-tilrettelagt mitofagi, NIX-avhengig mitofagi og den velkarakteriserte PTEN-induserte kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulerte mitofagi10,11. PINK1 (en antatt kinase) og Parkin (en E3 ubiquitin ligase) arbeider sammen med fosfo-ubiquitinat skadede mitokondrier, som driver dannelsen av autofagosomer som sluker den skadede organellen og smelter sammen med lysosomer for å initiere nedbrytning 12,13,14,15,16. Mutasjoner i Parkin har vært assosiert med PD-koblede fenotyper som nevrodegenerasjon via tap av dopaminerge nevroner17,18.

Her beskrives en protokoll der HeLa-celler, rutinemessig brukte udødeliggjorte celler avledet fra livmorhalskreft, brukes til å undersøke Parkins rolle i å opprettholde mitokondriell nettverkshelse. HeLa-celler uttrykker ubetydelige nivåer av endogent Parkin og krever derfor eksogent Parkin-uttrykk19. For å studere rollen til Parkin i mitokondriell nettverkshelse, blir HeLa-celler transfektert med enten villtype Parkin (ParkinWT), en Parkin-mutant (ParkinT240R) eller en tom kontrollvektor. ParkinT240R er en autosomal recessiv juvenil parkinsonismemutasjon som påvirker Parkin E3-ligaseaktiviteten, noe som reduserer effektiviteten til mitofagibanen20 betydelig. HeLa-celler utsettes for milde (5 μM) eller alvorlige (20 μM) konsentrasjoner av karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), et mitokondrielt frakoblingsmiddel. Behandling med alvorlige konsentrasjoner av CCCP brukes rutinemessig til å indusere Parkin-mediert mitofagi i forskjellige cellelinjer, slik som HeLa og COS-7 celler21,22,23.

Etter behandling benytter protokollen levende avbildning av mitokondrienettverket ved bruk av to tilgjengelige mitokondriemålrettede fluorescerende fargestoffer. Tetrametylrhodamin, etylester, perklorat (TMRE) er et kationisk fargestoff som fluorescerer basert på mitokondriemembranpotensial24, mens MitoSOX er en mitokondriell superoksidindikator hvor fluorescensintensiteten er en funksjon av superoksydkonsentrasjon25. Til slutt bruker den skisserte protokollen en fluorescensbasert kvantifisering og enkel arbeidsflyt for effektivt å kvantifisere mitokondriemembranpotensialet og superoksidnivåene med minimalt rom for brukerskjevhet. Selv om denne protokollen ble designet for å studere mitokondriell funksjon i HeLa-celler, kan den tilpasses for flere cellelinjer og primære celletyper for kvantitativt å karakterisere mitokondriell nettverkshelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av biologiske prøver

MERK: Utfør følgende trinn ved hjelp av steril teknikk i et biosikkerhetsskap. Spray overflaten på skapet og alle materialer med 70% etanol.

  1. HeLa celledyrking og transfeksjon
    1. Dyrkning 30 000 HeLa-celler i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) inneholdende 4,5 g/l glukose tilsatt 10 % føtal bovint serum og 1 % L-glutaminoppløsning (HeLa media; se materialfortegnelse). Plate cellene på 35 mm glassbunn bildefat (se Table of Materials) som inneholder 2 ml forvarmede HeLa-medier. Opprettholde HeLa-kulturene ved 5% CO2 og 37 ° C26,27.
    2. Dagen etter plating, inspiser 35 mm bilderetter ved hjelp av et lysmikroskop for å sikre at cellene er ~ 50% -60% sammenflytende. Når de er konfluerende, transfekter HeLa-cellene med tom gult fluorescerende protein (YFP) vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R (figur 1A).
    3. Forbered to separate blandinger i sterile mikrosentrifugerør for hver transfeksjon. Bland ved å banke på røret eller pipettere forsiktig opp og ned.
      1. I rør 1 blandes 200 mikrol redusert serummedium (se materialfortegnelse) med 2 μg av plasmid-DNA.
      2. I tube 2, bland 200 mikrol redusert serummedium med 6 μL transfeksjonsreagens (se materialtabell)28.
    4. Inkuber rørene i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Tilsett rør 2 til rør 1, bland ved å pipettere opp og ned, og rug i 20 minutter ved RT.
    5. Legg transfeksjonskompleksene dråpevis til de eksisterende bildefatene som inneholder HeLa-cellekulturene, og sørg for lik fordeling over hele retten. Legg bildefatene i 5% CO2 og 37 ° C inkubatoren over natten.
      MERK: Merk hver tallerken med riktig transfektet plasmid. For hvert eksperiment, merk de tre YFP-ParkinWT-rettene (dimetylsulfoksid [DMSO; se materialtabell], 5 μM CCCP og 20 μM CCCP). Gjenta merkingen med de tre YFP-ParkinT240R-rettene og de tre tomme YFP-vektorfatene.
  2. Fremstilling av CCCP og fluorescerende fargestoffer
    FORSIKTIG: Fluorescerende fargestoffer er ofte lysfølsomme. Oppbevar fargestoffene i mørket ved hjelp av aluminiumsfolie eller brune sentrifugerør for å redusere eksponering for lys.
    1. Lag en 5 mM fungerende lager av CCCP (se materialfortegnelse) ved å oppløse 5 mg CCCP i 4,89 ml DMSO. Lag en 20 mM fungerende lager av CCCP ved å oppløse 5 mg CCCP i 1,22 ml DMSO.
    2. Fortynn 10 μL av en 1 mM MitoTracker Deep Red (se materialfortegnelse) stamløsning i 390 μL DMSO for å lage en 25 μM arbeidsmasse.
    3. Løs opp 50 μg MitoSOX Red25 (se materialfortegnelse) i 13 μL DMSO for å lage en 5 mM arbeidsstokk.
    4. Løs opp 10 mg TMRE24 (se materialfortegnelse) i 19,4 ml DMSO for å lage en 1 ml stamløsning. Fortynn TMRE ved å tilsette 10 μL 1 mM TMRE i 990 μL DMSO for å lage en 10 μM lager.

2. CCCP-behandling og mitokondriell merking med fluorescerende prober i HeLa-celler

FORSIKTIG: Utfør følgende trinn raskt for å sikre at HeLa-cellene ikke er ute av inkubatoren i en lengre periode.

  1. Dagen etter transfeksjon, tilsett 2 μL av enten 5 eller 20 mM CCCP (endelig konsentrasjon: henholdsvis 5 μM og 20 μM) til hver eksperimentell plate. For kontrollplater, tilsett 2 μL DMSO. Sett platene tilbake til 5 % CO2 og 37 °C inkubatoren i 1,5 timer (figur 1A).
    MERK: CCCP-behandlingen er i totalt 2 timer. Mitokondriene er imidlertid merket med fluorescerende sonder i løpet av de siste 30 minuttene av CCCP-behandlingen.
  2. Etter 1,5 timer, fjern platene fra inkubatoren og legg til fluorescerende sonder til bildeoppvasken. Sett platene tilbake til 5 % CO2 og 37 °C inkubatoren i 30 minutter (figur 1A).
    1. TMRE-eksperiment: Legg til 2 μL av 25 μM MitoTracker (endelig konsentrasjon: 25 nM) og 2 μL av 10 μM TMRE (endelig konsentrasjon: 10 nM).
    2. MitoSOX-eksperiment: Legg til 2 μL av 25 μM MitoTracker (endelig konsentrasjon: 25 nM) og 1 μL av 5 mM MitoSOX (endelig konsentrasjon: 2,5 μM).
  3. Etter 2 timers CCCP-behandling, klargjør HeLa-cellene for avbildning (figur 1A,B).
    1. TMRE-eksperiment: HeLa-celler er umiddelbart klare til å avbildes; sikre at TMRE forblir i HeLa-cellekulturmediet.
    2. MitoSOX-eksperiment: Vask cellene 3x med 2 ml forvarmet HeLa media for å fjerne gratis MitoSOX-fargestoff. Tilsett 2 ml forvarmede medier. HeLa-cellene er nå klare til å avbildes.
      MERK: Vask HeLa-cellene med friske, forvarmede HeLa-medier som inneholder samme DMSO- eller CCCP-konsentrasjon som den eksperimentelle tilstanden; inkluderer ikke MitoSOX eller MitoTracker.

3. Konfokal mikroskop bildeoppkjøp oppsett

MERK: Avbilde HeLa-cellene ved hjelp av et konfokalmikroskop (se materialfortegnelse) utstyrt med et 63x/1.40 numerisk blenderåpning (NA) oljenedsenkingsmål og et miljøkammer (se materialfortegnelse).

  1. Ved 1 time før avbildning, slå på CO2 ved å åpne tankventilen. Trykk på På-knappen for å slå på miljøkontrolleren for mikroskopet. Bruk pil opp og pil ned på styreplaten for å justere temperaturen til 37 °C og CO2 til 5 %. Trykk på Sett når du er ferdig.
    MERK: Sørg for at dørene til miljøkammeret er lukket og vent til forholdene stabiliserer seg.
  2. Laser-innstillinger
    1. Slå på White Light Laser (WLL) og sett lasereffekten til 85% og eksitasjonskontrollen til maksimal effekt. Klikk kategorien Hent , velg Legg til laser, og i dialogboksen som vises, bytt WLL til På. Klikk på Laser Power-knappen og skriv inn 85%. Klikk på Excitasjonskontroll-knappen og velg Maksimal effekt fra rullegardinmenyen (figur 2A).
    2. TMRE-eksperimentet: Still inn eksitasjons- og utslippsspektra for YFP, MitoTracker og TMRE.
      1. For YFP, sett eksitasjonslaseren til 514 nm og emisjonsspektravinduet til 524-545 nm. I kategorien Oppkjøp klikker du på Legg til ny innstilling knapp; klikk deretter på Legg til laser og dra den til innstilling 1. Dobbeltklikk på eksitasjonslinjen og skriv inn 514 som bølgelengde i dialogboksen. Dobbeltklikk på den tilsvarende detektoren og skriv inn 524 for begynnelsen og 545 for sluttbølgelengden.
      2. For MitoTracker Deep Red setter du eksitasjonslaseren til 641 og emisjonsspektravinduet til 650-750 nm. I kategorien Oppkjøp klikker du på Legg til laser-knappen og drar den til innstilling 1. Dobbeltklikk på eksitasjonslinjen og skriv inn 641 som bølgelengde i dialogboksen. Dobbeltklikk på den tilsvarende detektoren og skriv inn 650 for begynnelsen og 750 for sluttbølgelengden.
      3. For TMRE, sett eksitasjonslaseren til 555 nm og emisjonsspektravinduet til 557-643 nm. I kategorien Oppkjøp klikker du på Legg til ny innstilling knapp; klikk deretter på Legg til laser-knappen og dra den til innstilling 2. Dobbeltklikk på eksitasjonslinjen og skriv inn 555 som bølgelengde i dialogboksen. Dobbeltklikk på den tilsvarende detektoren og skriv inn 557 for begynnelsen og 643 for sluttbølgelengden.
    3. MitoSOX-eksperimentet: Angi eksitasjons- og utslippsspektra for YFP, MitoTracker og MitoSOX (figur 2B).
      1. For YFP, sett eksitasjonslaseren til 507 nm og utslippsspektravinduet til 517-540 nm. I kategorien Oppkjøp klikker du på Legg til ny innstilling knapp; klikk deretter på Legg til laser-knappen og dra den til innstilling 1. Dobbeltklikk på eksitasjonslinjen og skriv inn 507 som bølgelengde i dialogboksen. Dobbeltklikk på den tilsvarende detektoren og skriv inn 517 for begynnelsen og 540 for sluttbølgelengden.
      2. For MitoSOX, sett eksitasjonslaseren til 547 nm og emisjonsspektravinduet til 564-636 nm. I kategorien Oppkjøp klikker du på Legg til ny innstilling knapp; klikk deretter på Legg til laser-knappen og dra den til innstilling 2. Dobbeltklikk på eksitasjonslinjen og skriv inn 547 som bølgelengde i dialogboksen. Dobbeltklikk på den tilsvarende detektoren og skriv inn 564 for begynnelsen og 636 for sluttbølgelengden.
      3. For MitoTracker Deep Red setter du eksitasjonslaseren til 641 nm og emisjonsspektravinduet til 652-742 nm. I kategorien Oppkjøp klikker du på Legg til ny innstilling knapp; klikk på Legg til laser-knappen og dra den til innstilling 3. Dobbeltklikk på eksitasjonslinjen og skriv inn 641 som bølgelengde i dialogboksen. Dobbeltklikk på den tilsvarende detektoren og skriv inn 652 for begynnelsen og 742 for sluttbølgelengden.
  3. Innstillinger for bildeopptak (figur 2C)
    1. Sett formatet til 1,024 x 1,024, skannehastigheten til 600 Hz og linjegjennomsnittet til 3.
      1. Velg kategorien Brukeranskaffelse, og klikk på Format-knappen . Fra rullegardinmenyen velger du 1,024 x 1,024. Klikk på Hastighet-knappen og velg 600 fra rullegardinmenyen. Klikk deretter på Linjegjennomsnitt knappen, og velg 3 fra rullegardinmenyen.
      2. Slå på toveisskanning og sett fase- og zoomfaktoren til henholdsvis 22,61 og 1,50.
        1. I kategorien Brukeranskaffelse setter du knappen Toveis til På. Klikk på Fase X-innstillingen og sett den til 22.61. Klikk på Zoom Factor-innstillingen og sett den til 1.50.

4. Oppkjøp av bilder

FORSIKTIG: Eksperimentøren må gjøre en visuell vurdering for å velge cellene basert på YFP-fluorescenssignalet. Unngå overmettede piksler, da de kan påvirke kvantifiseringen av fluorescensintensiteten betydelig. Bruk en over/under-oppslagstabell som angir bildepunktmetning for å unngå at mettede bilder hentes.

  1. Klikk på innstillingen av interesse og trykk Fast Live for å gi en live forhåndsvisning av fluorescensbildet.
  2. Juster forsterkningen og intensiteten ved å dobbeltklikke på den tilsvarende detektoren. I dialogboksen som vises, justerer du Forsterkning ved hjelp av glidebryteren. For å endre intensiteten, dobbeltklikk på eksitasjonslinjen og bruk opp - og nedpilene i popup-vinduet for å endre intensiteten. Klikk Stopp for å avslutte forhåndsvisningen.
    1. TMRE-eksperiment : Avbilde DMSO-kontrollplaten først. Juster forsterkningen og intensiteten til TMRE-signalet (innstilling 2) slik at mitokondrienettverksintensiteten er like under metning; Hold forsterkningen og intensiteten konstant for eksperimentet. Juster forsterkningen og intensiteten til MitoTracker og YFP (innstilling 1) slik at mitokondrienettverket er synlig, men svakt.
    2. MitoSOX-eksperiment: Avbilde DMSO-kontrollplaten først. Juster forsterkningen og intensiteten til MitoSOX-signalet ( innstilling 2) slik at fluorescensen er synlig, men svak; Hold forsterkningen og intensiteten konstant for eksperimentet. Juster forsterkningen og intensiteten til YFP (innstilling 1) og MitoTracker (innstilling 3) slik at mitokondrienettverket er synlig, men svakt.
      MERK: Registrer gevinsten og intensiteten til TMRE og MitoSOX, da disse verdiene må forbli konstante gjennom hele eksperimentet. Fluorescenssignalene til YFP og MitoTracker er ikke kvantifisert i denne protokollen. Derfor kan forsterkningen og intensiteten justeres for hvert bilde. Det er mest effektivt å ha forsterknings- og intensitetsinnstillingene der cellene er enkle å se, men fortsatt svake, for å sikre at cellene ikke blir utsatt for overdreven laserintensiteter som forårsaker celleskader eller fotobleking.
  3. Når innstillingene for forsterkning og intensitet er fullført, klikker du Start for å få et bilde. Skaff bilder av 20 celler per eksperimentell tilstand (f.eks. fem bilder med fire celler per bilde; Figur 2D).

5. Kvantifisering av fluorescensintensitet ved bruk av ImageJ

MERK: Bildefiler lagres som ".lif" og er kompatible med ImageJ29. Kompatible filtyper med ImageJ er spesifisert på deres hjemmeside. Det kan være nødvendig å konvertere filtypen hvis den ikke er kompatibel.

  1. Opprett og lagre et interesseområde (ROI).
    1. I ImageJ klikker du på Fil | Nytt | Bilde. I dialogboksen som vises, klikker du OK.
    2. Klikk på Rektangelverktøy-knappen og tegn en boks på 6 mikron x 6 mikron. Åpne ROI-behandling ved å klikke Analyser | Verktøy | ROI Manager og vent til en dialogboks med ROI-behandling vises (figur 3A). Legg til den rektangulære avkastningen for lederen ved å klikke Legg til i dialogboksen overordnet. Lagre avkastningen ved å velge Mer, og klikk deretter på Lagre-knappen og OK.
  2. Mål fluorescensintensiteten.
    1. I Bilde J klikker du på Fil og velger Åpne. Velg bildefilene for eksperimentet i dialogboksen, og klikk Åpne.
    2. Vent til vinduet Importvalg for bioformater vises (figur 3B). Velg Split Channels og klikk Åpne.
      MERK: Funksjonen for delte kanaler gjør at hver kanal i bildet kan åpnes som et separat vindu. Kanalordren tilsvarer innkjøpsordren.
      1. TMRE-eksperimenter : YFP (innstilling 1) er den første kanalen (c = 0); MitoTracker (innstilling 1) er den andre kanalen (c = 1); og TMRE (innstilling 2) er den tredje kanalen (c = 2).
      2. MitoSOX-eksperimenter : YFP (innstilling 1) er den første kanalen (c = 0); MitoSOX (innstilling 2) er den andre kanalen (c = 1); og MitoTracker (innstilling 3) er den tredje kanalen (c = 2).
    3. Juster lysstyrken ved å velge Bilde | Justere | Lysstyrke (figur 3C).
      MERK: Ikke trykk på Angi eller Bruk for å sikre at bildets lysstyrke ikke endres permanent. Av og til er fluorescensintensiteten ikke synlig i TMRE- eller MitoSOX-kanalene. Juster lysstyrken for å gjøre visualiseringen enklere. Endring av lysstyrken påvirker ikke verdiene for rå fluorescensintensitet.
    4. Klikk på Analyser , og velg Angi målinger. Merk av for Område og Middelgrå verdi , og klikk på OK (figur 3D).
      MERK: Den gjennomsnittlige grå verdien er fluorescensintensiteten.
    5. Åpne ROI Manager og last inn avkastningen som ble lagret i trinn 5.1 ved å klikke Analyser | Verktøy | ROI Manager. Klikk Mer i ROI-behandling, deretter Åpne fra listen som vises, og velg den lagrede avkastningen.
    6. Mål fluorescensintensiteten til fem tilfeldige regioner i en enkelt celle ved å velge den lagrede avkastningen fra ROI-behandleren og flytt avkastningen til et tilfeldig sted i en celle (figur 3E). Mål fluorescensintensiteten ved å trykke på M. Gjenta dette trinnet med fire ekstra ikke-overlappende områder. Når det vises en dialogboks med området og middelgrå verdier (figur 3F), kopierer og limer du inn verdiene i et regneark for analyse.
      1. TMRE-eksperiment : Velg bilde (c = 2).
      2. MitoSOX-eksperiment : Velg bilde (c = 2).
    7. Oppnå de gjennomsnittlige fluorescensintensitetsverdiene. Ved hjelp av regnearkprogramvare (se Materialfortegnelse) finner du gjennomsnittet av de fem gjennomsnittlige grå verdiene. Gjenta denne prosessen for hver celle.
    8. Analysere og sammenligne TMRE eller MitoSOX gjennomsnittlige gråverdier på tvers av eksperimentelle forhold ved hjelp av et statistisk program (se Materialfortegnelse; Figur 4 og figur 5). Presenter data som stolpediagrammer eller fiolinplott.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne protokollen ble fluorescensbasert kvantifisering brukt til å måle membranpotensialet og superoksidnivåene i mitokondrienettverket etter CCCP-behandling (figur 1). Denne arbeidsflyten brukte HeLa-celler, en udødeliggjort cellelinje avledet fra livmorhalskreft. HeLa-celler brukes rutinemessig til å studere mitokondriebiologi og er relativt flate, noe som gjør det enkelt å visualisere mitokondrienettverket ved hjelp av mikroskopi. For å undersøke Parkins rolle i å opprettholde mitokondriell nettverkshelse, ble HeLa-celler transfektert forbigående med en tom kontrollvektor, ParkinWT, eller ParkinT240R (en mutant som forstyrrer mitofagi)21. HeLa-celler ble belagt med 35 mm glassbunnsantenner og ble transfektert når ~50%-60% sammenløp var nådd (figur 1A). Siden HeLa-celler raskt deler seg, er dette vanligvis dagen etter plating av cellene i bildeskålene. Et lysmikroskop ble brukt til å observere YFP-fluorescenssignalet dagen etter for å vurdere transfeksjonseffektiviteten. Eksperimenter ble bare utført etter en vellykket transfeksjon.

Etter inspeksjon ble HeLa-cellene behandlet med milde (5 μM) eller alvorlige (20 μM) konsentrasjoner av CCCP for å depolarisere mitokondrienettverket (trinn 1.2 viser detaljerte instruksjoner for fremstilling av CCCP og fluorescerende prober). CCCP-behandlingen ble utført i totalt 2 timer. I løpet av de siste 30 minuttene av CCCP-behandlingen ble mitokondriene merket med MitoTracker og TMRE/MitoSOX (figur 1A). Det bør bemerkes at TMRE og MitoSOX har overlappende fluorescensspektra og ikke kan brukes samtidig. I stedet brukte vi separate bilderetter for TMRE- og MitoSOX-eksperimentene. For TMRE-eksperimenter var HeLa-cellene umiddelbart klare til å avbildes ved slutten av 2-timers CCCP-behandlingen. TMRE-konsentrasjonen må forbli konstant; derfor forble TMRE i HeLa-mediene. Fritt MitoSOX må imidlertid fjernes før avbildning. For MitoSOX-eksperimentene ble cellene vasket tre ganger med HeLa media for å fjerne det frie fargestoffet. For dette trinnet er det viktig å bruke HeLa-medier som inneholder samme DMSO- eller CCCP-konsentrasjon som de eksperimentelle forholdene. Hoechst 33342, en kjernemarkør, ble opprinnelig brukt til å vurdere HeLa-cellene etter forbigående transfeksjon og CCCP-behandling (figur 1B).

Deretter ble konfokalmikroskopi utført for å visualisere TMRE og MitoSOX fluorescensintensiteter, for å måle henholdsvis mitokondriemembranpotensialet og superoksidnivået. Bildene ble tatt ved hjelp av et 63x (1,4 NA) oljefordypningsmål med parametere for toveisskanning, en romlig oppløsning på 1,024 x 1,024 piksler, en skannehastighet på 600 Hz, linjegjennomsnitt på 3, en fase på 22,61 og en zoomfaktor på 1,5 (figur 2C). DMSO-kontrollplaten ble avbildet først for alle eksperimenter for å angi forsterknings- og intensitetsverdier for TMRE og MitoSOX. For å gjøre kvantitative sammenligninger på tvers av betingelser, må disse verdiene settes i DMSO-tilstanden og forbli konstante gjennom hele eksperimentet. CCCP induserer mitokondriell depolarisering og tap av membranpotensial, noe som resulterer i redusert TMRE-fluorescensintensitet. Derfor hadde kontrollforsøkene den høyeste TMRE-intensiteten, og forsterknings- og intensitetsverdiene ble satt nær metning. I motsetning til dette øker høyere superoksidnivåer MitoSOX-intensiteten. Derfor hadde kontrollen den laveste MitoSOX-fluorescensintensiteten, og forsterknings- og intensitetsverdiene ble satt lavt der et svaktsignal var tilstede. Siden MitoTracker, TMRE og MitoSOX er vitale fargestoffer og merker alle celler, bør de ikke brukes når du velger celler som skal avbildes. I stedet ble cellene valgt basert på YFP-signalet for å sikre at de ble transfektet. Enkeltflybilder ble anskaffet, med fokus på bunnen av HeLa-cellen, hvor en stor populasjon av mitokondrier befant seg.

Kvantifisering av TMRE og MitoSOX fluorescensintensitet
Kvantifisering av fluorescensintensitetene TMRE og MitoSOX ble analysert med ImageJ (figur 3). En avkastning på 6 mikron x 6 mikron ble opprettet og lagret i ROI-behandleren. ROI ble plassert i fem tilfeldige ikke-overlappende regioner i hver celle for å måle TMRE- eller MitoSOX-intensiteten. Fluorescensintensiteten tilsvarer den gjennomsnittlige gråverdien i ImageJ. De fem intensitetsverdiene ble gjennomsnittet for hver celle for å beregne gjennomsnittlig fluorescensintensitet per celle. Disse verdiene ble plottet og analysert for statistisk signifikans på tvers av behandlingsbetingelser.

Resultatene for fluorescensintensitetene TMRE og MitoSOX er vist i henholdsvis figur 4 og figur 5. Som forventet reduserte behandling med det kjente frakoblingsmiddelet CCCP TMRE-fluorescensintensiteten sammenlignet med kontrollbetingelsene (figur 4A,B). I tillegg induserte alvorlig (20 μM) CCCP-behandling superoksidproduksjon og økte MitoSOX-fluorescensintensiteten (figur 5A,B). Under milde (5 μM) CCCP-spenningsforhold resulterte uttrykket av ParkinWT og ParkinT240R i høyere TMRE-intensitet sammenlignet med den tomme YFP-kontrollvektoren. Tilsvarende var MitoSOX-intensiteten lavere i celler som uttrykker ParkinWT og ParkinT240R sammenlignet med celler som uttrykker YFP-kontrollvektoren (figur 5A, B). Disse resultatene tyder på at Parkin-uttrykk bidrar til å opprettholde mitokondrienettverkshelsen ved å bevare høyere mitokondriemembranpotensialer og lave superoksidnivåer. Dermed kan protokollen som er skissert her brukes til å nøyaktig sammenligne fluorescensintensitet for å analysere Parkins rolle i å kontrollere mitokondriemembranpotensial og superoksiddannelse.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentell arbeidsflyt . (A) Skjematisk fremstilling av den eksperimentelle arbeidsflyten som brukes til å transfektere, behandle med CCCP og merke mitokondrienettverket, og avbilde TMRE og MitoSOX fluorescensintensitet i HeLa-celler. (B) Representative bilder av celler som uttrykker en tom YFP-vektor (øverst), YFP-ParkinWT (midten) og YFP-ParkinT240R (nederst; magenta). Hoechst 33342 (hvit) brukes til å merke DNA. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: CCCP = karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon; TMRE = tetrametylrhodamin-etylester-perklorat; YFP = gult fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Brukergrensesnittet for konfokalanskaffelsesinnstillinger . (A) Dialogboks for laserinnstillinger. Det røde rektangelet fremhever den hvite lyslaseren, strømtilstanden, laserkraften og bølgelengdene. (B) Eksperimentell kanal satt opp for et MitoSOX-eksperiment. Innstillingene, eksitasjonslinjene og emisjonsspektravinduene vises for YFP, MitoSOX, og MitoTracker. (C) Anskaffelsesinnstillinger viser format, hastighet, toveis, fase X, zoomfaktor og linjegjennomsnitt. (D) Et representativt ervervet bilde. HeLa-celler uttrykker YFP (magenta), og mitokondriene er merket med MitoSOX (grønn) og MitoTracker (cyan). Skala bar = 10 μm. Forkortelser: WLL = hvitt lys laser; YFP = gult fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: ImageJ-arbeidsflyt for å kvantifisere TMRE- og MitoSOX-fluorescensintensiteter . (A) ROI-administrasjonspanelet med et eksempel på avkastning i ImageJ. (B) Panelet for importvalg for bioformater. Det røde rektangelet uthever alternativet Delte kanaler som skal velges. (C) Innstillinger for lysstyrke og kontrast. (D) Angi måleparameter. De røde rektanglene uthever alternativene Areal og Middelgrå verdi som skal velges. (E) Representativt bilde av en HeLa-celle merket med MitoSOX. Den røde firkanten illustrerer avkastningen fra panel A. Skalalinje = 10 μm. (F) Resultatpanel som viser eksperimentområdet og gjennomsnittlige gråverdier fra avkastningen. Den gjennomsnittlige grå verdien (oransje) representerer fluorescensintensitetsverdiene. Forkortelser: TMRE = tetrametylrhodamin-etylester-perklorat; ROI = interesseområde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: TMRE fluorescensintensitet etter mitokondrieskade. (A) Representative bilder av HeLa-celler etter en 2 timers behandling med DMSO, 5 μM CCCP eller 20 μM CCCP for å indusere mitokondriell skade. Celler uttrykker eksogent en tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R (magenta), og merket med MitoTracker (cyan) og TMRE (grønn). Skala bar = 30 μm. (B) Kvantifisering av TMRE fluorescensintensitet for celler som uttrykker tom YFP-vektor (blå), YFP-ParkinWT (oransje) og YFP-ParkinT240R (lilla) i DMSO- og CCCP-behandlede forhold. p < 0,0001 med toveis ANOVA med multippel sammenligningstest. (VG Nett) Kvantifiseringen av TMRE-fluorescensintensitetene fra panel B er separert for å markere forskjeller i DMSO (C), 5 μM CCCP (D) og 20 μM CCCP (E). * p < 0,05; p < 0,001; p < 0.0001 av Kruskal-Wallis ANOVA med Dunns flere sammenligningstest. Ns = ikke signifikant. Gjennomsnittlig ± SEM; n = 79-104 fra tre uavhengige biologiske replikater. Forkortelser: CCCP = karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon; TMRE = tetrametylrhodamin-etylester-perklorat; YFP = gult fluorescerende protein; DMSO = dimetylsulfoksid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: MitoSOX-fluorescensintensitet etter skade på mitokondrienettverket. (A) Representative bilder av HeLa-celler behandlet i 2 timer med DMSO, 5 μM CCCP eller 20 μM CCCP for å koble fra mitokondriemembranpotensialet. Celler ble transfektert med tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R (magenta), og merket med MitoTracker (cyan) og MitoSOX (grønn). Skalastang = 30 μm. (B) Kvantifisering av MitoSOX-fluorescensintensitet for celler som uttrykker tom YFP-vektor (blå), YFP-ParkinWT (oransje) og YFP-ParkinT240R (lilla) for kontroll- og behandlede tilstander. p < 0,0001 med toveis ANOVA med Dunns multippel sammenligningstest. (VG Nett) Kvantifiseringen av MitoSOX-fluorescensintensitetene fra panel B er separert for å markere forskjeller i DMSO (C), 5 μM CCCP (D) og 20 μM CCCP (E). *p < 0,05; p < 0.0001 av Kruskal-Wallis ANOVA med Dunns flere sammenligningstest. Ns = ikke signifikant. Gjennomsnittlig ± SEM; n = 87-107 fra tre uavhengige biologiske replikater. Forkortelser: CCCP = karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon; TMRE = tetrametylrhodamin-etylester-perklorat; YFP = gult fluorescerende protein; DMSO = dimetylsulfoksid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Arbeidsflyten som er skissert her, kan brukes til å kvantifisere mitokondriemembranpotensial og superoksidnivåer robust og reproduserbart ved hjelp av fluorescensbasert avbildning30. Det er viktige tekniske begrensninger å vurdere når du designer disse eksperimentene. HeLa-celler ble transfektert med en tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT, eller YFP-ParkinT240R. Den tomme YFP-vektoren ble brukt som en kontroll for å bekrefte at de eksperimentelle funnene var spesifikke for Parkin. For den forbigående transfeksjonen ble et masseforhold på 1: 3 for DNA til transfeksjonsreagens eksperimentelt bestemt for å gi den høyeste transfeksjonshastigheten, hvor 2 μg plasmid-DNA ble brukt for hver konstruksjon28. Å holde YFP-taggen konsistent for alle konstruksjoner var viktig, da fluorescerende proteiner varierer i medfødt lysstyrke31,32. Hvis flere fluorescerende proteinkoder må brukes, bør fluorescerende proteiner med tilsvarende lysstyrke og fotostabilitet velges33.

For å måle mitokondriemembranpotensial og superoksidnivåer ble to veldokumenterte fargestoffer valgt. Fluorescenssignalet til TMRE er basert på mitokondriemembranpotensialet, mens MitoSOX-fluorescensintensitet er en funksjon av superoksidnivåer. For fluorescensbasert avbildning bør det ikke være spektral overlapping mellom fluorescerende prober. Den første protokollen ble imidlertid utført ved hjelp av mCherry-ParkinWT og mCherry-ParkinT240R, som overlappet med de rødforskjøvede spektrene til TMRE og MitoSOX. For å unngå spektral overlapping og minimere potensiell crosstalk, ble YFP-merkede Parkin-konstruksjoner valgt. Denne justeringen gjorde det nødvendig å endre MitoTracker-fargestoffet fra grønt til langt rødt. I tillegg ble HeLa-cellebeleggets tetthet optimalisert; I utgangspunktet ble HeLa-celler belagt med 45 000 celler per avbildningsfat, men dette resulterte i overkonfluerende retter. Høy cellekonfluens kan redusere transfeksjonseffektivitet, fremme celledød og endre cellulær metabolisme34,35,36. For å unngå disse potensielle virkningene ble cellene belagt med en tetthet på 30.000 celler per bildebehandling.

Hovedbegrensningen til denne protokollen er potensialet for brukerskjevhet, spesielt når du velger celler og avkastningssteder. Protokollen bruker endringer i TMRE og MitoSOX fluorescensintensiteter som en funksjonell avlesning for membranpotensial og superoksidnivåer. Derfor kan cellevalg ved hjelp av disse probene potensielt forstyrre de eksperimentelle resultatene. For å bekjempe denne skjevheten valgte vi celler basert utelukkende på YFP-uttrykk. Ikke-overlappende avkastning ble tilfeldig valgt over mitokondrienettverket i cellen. Selv om denne metoden tidligere ble brukt til å måle fluorescensintensitet27, kunne ytterligere skjevhetsreduserende tiltak tas. For det første kan studien blindes ved hjelp av blindanalyseverktøyene i ImageJ for å forhindre ROI-valg som støtter forventede resultater. For det andre kan fluorescensintensiteter måles ved hjelp av avansert bildeanalyseprogramvare som eliminerer behovet for avkastning.

Mens denne protokollen bruker konfokalmikroskopi for fluorescensbasert kvantifisering, kan ytterligere metoder, for eksempel flowcytometri, brukes til å kvantifisere fluorescensendringer i TMRE og MitoSOX37. Her brukte vi konfokalmikroskopi i stedet for flowcytometri for å visualisere mitokondrienettverksmorfologien. Den skisserte protokollen kan enkelt tilpasses for å måle TMRE og MitoSOX fluorescens med flowcytometri som gir lignende eksperimentelle resultater. I tillegg kan analyser av oksygenforbruk (OCR) brukes til å oppdage endringer i funksjonen til mitokondriell elektrontransportkjede uten kationiske fargestoffer. Mens OCR gir et sensitivt mål for mitokondriell dysfunksjon, er det ikke spesifikt for membranpotensial eller superoksidkonsentrasjon, men gir i stedet et globalt mål på mitokondriell funksjon38. Disse analysene kan utføres i forbindelse med TMRE- og MitoSOX-eksperimenter for å vurdere mitokondriell helse39.

Selv om denne protokollen spesifikt fokuserer på effekten av den mitokondrielle frakoblingen CCCP40, kan skadelige reagenser med alternative mekanismer benyttes. For eksempel er antimycin A og oligomycin A elektrontransportkjedehemmere som vanligvis brukes til å indusere mitokondriell skade via reaktive oksygenarter (ROS) produksjon38. Mens vi spesifikt målte mitokondrielle superoksidnivåer ved hjelp av MitoSOX, kunne intracellulær ROS måles ved hjelp av CellROX. I HeLa-celler var det nødvendig å overuttrykke Parkin på grunn av det lave endogene uttrykket. Fremtidige studier kan observere effekten av Parkin-uttrykk på mitokondriell nettverkshelse ved bruk av cellekultursystemer som uttrykker endogen Parkin41. Siden mitokondrier er kritiske regulatorer av energimetabolisme og cellulær homeostase, er mitokondriell dysfunksjon forbundet med mange sykdommer, inkludert diabetes42, Alzheimers sykdom 43,44,45, kreft 46 og leversykdom 47. Derfor kan denne arbeidsflyten tilpasses for å studere mitokondriell helse og dysregulering i relevante cellelinjer og primærkulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å oppgi.

Acknowledgments

Vi takker medlemmene av Evans-laboratoriet for gjennomtenkte tilbakemeldinger på dette manuskriptet. Dette arbeidet støttes av Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars, og Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Figur 1A ble laget med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).

Tags

Biologi utgave 195 mitokondrier mitofagi nevrodegenerasjon Parkin mitokondriemembranpotensial reaktive oksygenarter superoksid HeLa-celler konfokalmikroskopi
Fluorescensbasert kvantifisering av mitokondriemembranpotensial og superoksidnivåer ved bruk av levende avbildning i HeLa-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fazli, M., Evans, C. S.… More

Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter