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Biology

हेला कोशिकाओं में लाइव इमेजिंग का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड स्तरों का प्रतिदीप्ति-आधारित परिमाणीकरण

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65304
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

Summary

यह तकनीक प्रतिदीप्ति-आधारित लाइव इमेजिंग का उपयोग करके हेला कोशिकाओं के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड के स्तर को देखने और मात्रात्मक रूप से मापने के लिए एक प्रभावी वर्कफ़्लो का वर्णन करती है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रिया एटीपी संश्लेषण के माध्यम से ऊर्जा उत्पादन को नियंत्रित करके चयापचय होमियोस्टैसिस के लिए महत्वपूर्ण गतिशील अंग हैं। सेलुलर चयापचय का समर्थन करने के लिए, विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र एक स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को बनाए रखने के लिए सहयोग करते हैं। ऐसा ही एक मार्ग माइटोफैगी है, जहां पीटीईएन-प्रेरित काइनेज 1 (पिंक 1) और क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया के पार्किन फॉस्फो-सर्वव्यापी ऑटोफैगोसोम अनुक्रम ण और बाद में लाइसोसोम संलयन के माध्यम से सेल से हटाने की सुविधा प्रदान करते हैं। सेलुलर होमियोस्टैसिस के लिए माइटोफैगी महत्वपूर्ण है, और पार्किन में उत्परिवर्तन पार्किंसंस रोग (पीडी) से जुड़े हैं। इन निष्कर्षों के कारण, माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण के आणविक तंत्र और गतिशीलता को समझने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल क्षति और कारोबार की जांच पर महत्वपूर्ण जोर दिया गया है। यहां, लाइव-सेल इमेजिंग का उपयोग हेला कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की कल्पना करने के लिए किया गया था, ताकि कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफिनाइल हाइड्राज़ोन (सीसीसीपी), माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग एजेंट के साथ उपचार के बाद माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड के स्तर को निर्धारित किया जा सके। इसके अलावा, पार्किन (पार्किनटी 240 आर) का पीडी-लिंक्ड उत्परिवर्तन जो पार्किन-निर्भर माइटोफैगी को रोकता है, यह निर्धारित करने के लिए व्यक्त किया गया था कि जंगली प्रकार के पार्किन को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की तुलना में उत्परिवर्ती अभिव्यक्ति माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को कैसे प्रभावित करती है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड स्तरों को प्रभावी ढंग से निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके एक सरल वर्कफ़्लो का वर्णन करता है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क परस्पर जुड़े हुए जीवों की एक श्रृंखला है जो ऊर्जा उत्पादन1, जन्मजात प्रतिरक्षा 2,3 और सेल सिग्नलिंग 4,5 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसरेग्यूलेशन को पार्किंसंस रोग (पीडी) 6,7 जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जोड़ा गया है। पीडी एक प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है जो सब्सटेंशिया नाइग्रा के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स को प्रभावित करता हैजो दुनिया भर में लगभग 10 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है। पीडी को आनुवंशिक रूप से माइटोफैगी से जोड़ा गया है, जो सेलुलर होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए आवश्यक एक माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण मार्ग है जो चुनिंदा रूप से क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया 9,10 को हटा देता है। अध्ययनों ने कई स्वतंत्र माइटोफैगी मार्गों की पहचान की है, जिनमें FUN14 डोमेन जिसमें 1 (FUNDC1)-मध्यस्थता माइटोफैगी, बीसीएल -2 इंटरैक्टिंग प्रोटीन 3 (BNIP3) -सुविधाजनक माइटोफैगी, NIX-निर्भर माइटोफैगी, और अच्छी तरह से विशेषता वाले PTEN-प्रेरित काइनेज 1 (PINK1)/Parkin-विनियमित माइटोफैगी10,11 शामिल हैं। पिंक 1 (एक कथित काइनेज) और पार्किन (एक ई 3 यूबिकिटिन लिगेज) फॉस्फो-यूबिकिटेट क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया के साथ मिलकर काम करते हैं, जो ऑटोफैगोसोम के गठन को चलाता है जो क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल को घेरता है और लाइसोसोम के साथ मिलकर गिरावट शुरू करता है 12,13,14,15,16। पार्किन में उत्परिवर्तन पीडी-लिंक्ड फेनोटाइप्स से जुड़े हुए हैं जैसे कि डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स17,18 के नुकसान के माध्यम से न्यूरोडीजेनेरेशन।

यहां, एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जिसमें हेला कोशिकाएं, नियमित रूप से गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर से प्राप्त अमर कोशिकाओं का उपयोग करती हैं, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क स्वास्थ्य को बनाए रखने में पार्किन की भूमिका की जांच करने के लिए उपयोग की जाती हैं। हेला कोशिकाएं अंतर्जात पार्किन के नगण्य स्तर को व्यक्त करती हैं और इसलिए बहिर्जात पार्किन अभिव्यक्तिकी आवश्यकता होती है। माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क स्वास्थ्य में पार्किन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, हेला कोशिकाओं को या तो जंगली-प्रकार पार्किन (पार्किन डब्ल्यूटी), एक पार्किन उत्परिवर्ती (पार्किनटी 240 आर), या एक खाली नियंत्रण वेक्टर के साथ स्थानांतरित किया जाताहै। पार्किनटी 240 आर एक ऑटोसोमल रिसेसिव किशोर पार्किंसनिज़्म उत्परिवर्तन है जो पार्किन ई 3 लिगेज गतिविधि को प्रभावित करता है, जिससे माइटोफैगी मार्ग20 की दक्षता काफी कम हो जाती है। हेला कोशिकाएं कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफिनाइल हाइड्राज़ोन (सीसीसीपी), एक माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग एजेंट के हल्के (5 μM) या गंभीर (20 μM) सांद्रता के अधीन हैं। सीसीसीपी की गंभीर सांद्रता के साथ उपचार नियमित रूप से विभिन्न सेल लाइनों में पार्किन-मध्यस्थता माइटोफैगी को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे कि हेला और सीओएस -7 कोशिकाएं21,22,23।

उपचार के बाद, प्रोटोकॉल वर्तमान में उपलब्ध दो माइटोकॉन्ड्रियल-लक्षित फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की लाइव इमेजिंग को नियोजित करता है। टेट्रामिथाइलरोडामाइन, एथिल एस्टर, परक्लोरेट (टीएमआरई) एक धनिक डाई है जो माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता24 के आधार पर फ्लोरेस करता है, जबकि माइटोएसओएक्स एक माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड संकेतक है जहां प्रतिदीप्ति तीव्रता सुपरऑक्साइड एकाग्रता25 का एक कार्य है। अंत में, उल्लिखित प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह के लिए न्यूनतम गुंजाइश के साथ माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड स्तरों को प्रभावी ढंग से निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति-आधारित परिमाणीकरण और सरल वर्कफ़्लो का उपयोग करता है। यद्यपि इस प्रोटोकॉल को हेला कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, लेकिन इसे माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क स्वास्थ्य को मात्रात्मक रूप से चिह्नित करने के लिए अतिरिक्त सेल लाइनों और प्राथमिक सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

1. जैविक नमूने तैयार करना

नोट: जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ तकनीक का उपयोग करके निम्नलिखित चरणों का पालन करें। 70% इथेनॉल के साथ कैबिनेट और सभी सामग्रियों की सतह स्प्रे करें।

  1. हेला सेल संवर्धन और अभिकर्मक
    1. डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में 30,000 हेला कोशिकाओं को कल्चर करें जिसमें 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज होता है जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% एल-ग्लूटामाइन समाधान (हेला मीडिया; सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक होता है। कोशिकाओं को 35 मिमी ग्लास-बॉटम इमेजिंग व्यंजनों पर प्लेट करें (सामग्रीके टी सक्षम देखें) जिसमें 2 एमएल प्रीवार्म्ड हेला मीडिया होता है। 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस26,27 पर हेला संस्कृतियों को बनाए रखें।
    2. चढ़ाना के अगले दिन, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 35 मिमी इमेजिंग व्यंजनों का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोशिकाएं ~ 50% -60% कंफ्लुएंट हैं। एक बार कंफ्लुएंट होने के बाद, हेला कोशिकाओं को खाली पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) वेक्टर, वाईएफपी-पार्किनडब्ल्यूटी, या वाईएफपी-पार्किनटी 240 आर (चित्रा 1 ए) के साथ स्थानांतरित करें।
    3. प्रत्येक अभिकर्मक के लिए बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में दो अलग-अलग मिश्रण तैयार करें। ट्यूब को टैप करके या धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
      1. ट्यूब 1 में, प्लास्मिड डीएनए के 2 μg के साथ कम सीरम मीडिया ( सामग्री की तालिका देखें) के 200 μL मिलाएं।
      2. ट्यूब 2 में, 200 μL कम सीरम मीडिया को 6 μL अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)28.
    4. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। ट्यूब 1 में ट्यूब 2 जोड़ें, ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं, और आरटी पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. हेला सेल संस्कृतियों वाले मौजूदा इमेजिंग व्यंजनों में अभिकर्मक परिसरों को ड्रॉपवाइज जोड़ें, जिससे पूरे पकवान में समान वितरण सुनिश्चित हो। इमेजिंग व्यंजनों को रात भर 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: प्रत्येक डिश को उपयुक्त ट्रांसक्रिप्टेड प्लास्मिड के साथ लेबल करें। प्रत्येक प्रयोग के लिए, तीन वाईएफपी-पार्किनडब्ल्यूटी व्यंजन (डाइमिथाइल सल्फोक्साइड [डीएमएसओ; सामग्री की तालिका देखें], 5 μM CCCP, और 20 μM CCCP) लेबल करें। तीन वाईएफपी-पार्किनटी 240 आर व्यंजन और तीन खाली वाईएफपी वेक्टर व्यंजनों के साथ लेबलिंग दोहराएं।
  2. सीसीसीपी और फ्लोरोसेंट रंगों की तैयारी
    सावधानी: फ्लोरोसेंट रंजक अक्सर प्रकाश-संवेदनशील होते हैं। प्रकाश के संपर्क को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी या भूरे रंग के सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करके अंधेरे में रंगों को स्टोर करें।
    1. डीएमएसओ के 4.89 एमएल में 5 मिलीग्राम सीसीसीपी को घोलकर सीसीसीपी का 5 एमएम वर्किंग स्टॉक बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। डीएमएसओ के 1.22 एमएल में 5 मिलीग्राम सीसीसीपी को घोलकर सीसीसीपी का 20 एमएम वर्किंग स्टॉक बनाएं।
    2. 25 μM कार्यशील स्टॉक बनाने के लिए DMSO के 390 μL में 1 mM MitoTracker Deep Red ( सामग्री की तालिका देखें) स्टॉक समाधान के 10 μL को पतला करें।
    3. 5 एमएम वर्किंग स्टॉक बनाने के लिए डीएमएसओ के 13 μL में MitoSOX रेड25 ( सामग्री की तालिका देखें) के 50 μg को घोलें।
    4. 1 एमएम स्टॉक समाधान बनाने के लिए डीएमएसओ के 19.4 एमएल में 10 मिलीग्राम टीएमआरई24 ( सामग्री की तालिका देखें) को घोलें। 10 μM कार्यशील स्टॉक बनाने के लिए DMSO के 990 μL में 10 μL 1 mM TMRE जोड़कर TMRE को पतला करें।

2. हेला कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट जांच के साथ सीसीसीपी उपचार और माइटोकॉन्ड्रियल लेबलिंग

सावधानी: यह सुनिश्चित करने के लिए जल्दी से निम्नलिखित चरणों का पालन करें कि हेला कोशिकाएं विस्तारित अवधि के लिए इनक्यूबेटर से बाहर नहीं हैं।

  1. अभिकर्मक के अगले दिन, प्रत्येक प्रयोगात्मक प्लेट में 5 या 20 mM CCCP (अंतिम एकाग्रता: 5 μM और 20 μM, क्रमशः) के 2 μL जोड़ें। नियंत्रण प्लेटों के लिए, DMSO के 2 μL जोड़ें। प्लेटों को 1.5 घंटे के लिए 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस करें (चित्रा 1 ए)।
    नोट: सीसीसीपी उपचार कुल 2 घंटे के लिए है। हालांकि, सीसीसीपी उपचार के अंतिम 30 मिनट के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया को फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल किया जाता है।
  2. 1.5 घंटे के बाद, इनक्यूबेटर से प्लेटों को हटा दें और इमेजिंग व्यंजनों में फ्लोरोसेंट प्रोब जोड़ें। प्लेटों को 30 मिनट के लिए 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस करें (चित्रा 1 ए)।
    1. TMRE प्रयोग: 25 μM MitoTracker (अंतिम एकाग्रता: 25 nM) के 2 μL और 10 μM TMRE के 2 μL (अंतिम एकाग्रता: 10 nM) जोड़ें।
    2. MitoSOX प्रयोग: 25 μM MitoTracker (अंतिम एकाग्रता: 25 nM) के 2 μL और 5 mM MitoSOX (अंतिम एकाग्रता: 2.5 μM) का 1 μL जोड़ें।
  3. 2 एच सीसीसीपी उपचार के बाद, इमेजिंग के लिए हेला कोशिकाओं को तैयार करें (चित्रा 1 ए, बी)।
    1. टीएमआरई प्रयोग: हेला कोशिकाएं तुरंत छवि बनाने के लिए तैयार हैं; सुनिश्चित करें कि टीएमआरई हेला सेल कल्चर मीडिया में बना रहे।
    2. MitoSOX प्रयोग: मुक्त MitoSOX डाई को हटाने के लिए कोशिकाओं को 2 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड हेला मीडिया के साथ 3x धोएं। प्रीवार्म्ड मीडिया के 2 एमएल जोड़ें। हेला कोशिकाएं अब छवि बनाने के लिए तैयार हैं।
      नोट: हेला कोशिकाओं को ताजा, पहले से गर्म हेला मीडिया के साथ धोएं जिसमें प्रयोगात्मक स्थिति के समान डीएमएसओ या सीसीसीपी एकाग्रता होती है; MitoSOX या MitoTracker शामिल नहीं हैं।

3. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण सेटअप।

नोट: 63x/1.40 संख्यात्मक एपर्चर (NA) तेल विसर्जन उद्देश्य और एक पर्यावरण कक्ष (सामग्री की तालिका देखें) से लैस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके हेला कोशिकाओं की छवि बनाएं।

  1. इमेजिंग से 1 घंटे पहले, टैंक वाल्व खोलकर सीओ2 चालू करें। माइक्रोस्कोप के लिए पर्यावरण नियंत्रक चालू करने के लिए ऑन बटन दबाएं। तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस और सीओ2 से 5% तक समायोजित करने के लिए टचपैड पर अप और डाउन तीर का उपयोग करें। पूर्ण होने पर सेट दबाएँ.
    नोट: सुनिश्चित करें कि पर्यावरण कक्ष के दरवाजे बंद हैं और स्थितियों को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें।
  2. लेजर सेटिंग्स
    1. व्हाइट लाइट लेजर (डब्ल्यूएलएल) चालू करें और लेजर पावर को 85% और उत्तेजना नियंत्रण को अधिकतम शक्ति पर सेट करें। अधिग्रहण टैब क्लिक करें, लेजर जोड़ें का चयन करें, और दिखाई देने वाले संवाद बॉक्स में, WLL को चालू पर टॉगल करें। लेजर पावर बटन पर क्लिक करें और 85% दर्ज करें। उत्तेजना नियंत्रण बटन क्लिक करें और ड्रॉपडाउन मेनू (चित्रा 2 ए) से अधिकतम शक्ति का चयन करें।
    2. TMRE प्रयोग: YFP, MitoTracker और TMRE के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा सेट करें।
      1. वाईएफपी के लिए, उत्तेजना लेजर को 514 एनएम और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा विंडो को 524-545 एनएम पर सेट करें। अधिग्रहण टैब में, नई सेटिंग जोड़ें बटन क्लिक करें; फिर, लेजर जोड़ें पर क्लिक करें और इसे सेटिंग 1 में खींचें। उत्तेजना रेखा पर डबल-क्लिक करें और संवाद बॉक्स में तरंग दैर्ध्य के रूप में 514 दर्ज करें। संबंधित डिटेक्टर पर डबल-क्लिक करें और शुरुआत के लिए 524 और अंत तरंग दैर्ध्य के लिए 545 दर्ज करें।
      2. मिटोट्रैकर डीप रेड के लिए, उत्तेजना लेजर को 641 और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा विंडो को 650-750 एनएम पर सेट करें। अधिग्रहण टैब में, लेजर जोड़ें बटन क्लिक करें और इसे सेटिंग 1 में खींचें। उत्तेजना रेखा पर डबल-क्लिक करें और संवाद बॉक्स में तरंग दैर्ध्य के रूप में 641 दर्ज करें। संबंधित डिटेक्टर पर डबल-क्लिक करें और शुरुआत के लिए 650 और अंत तरंग दैर्ध्य के लिए 750 दर्ज करें।
      3. टीएमआरई के लिए, उत्तेजना लेजर को 555 एनएम और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा विंडो को 557-643 एनएम पर सेट करें। अधिग्रहण टैब में, नई सेटिंग जोड़ें बटन क्लिक करें; फिर, लेजर जोड़ें बटन पर क्लिक करें और इसे सेटिंग 2 में खींचें। उत्तेजना रेखा पर डबल-क्लिक करें और संवाद बॉक्स में तरंग दैर्ध्य के रूप में 555 दर्ज करें। संबंधित डिटेक्टर पर डबल-क्लिक करें और शुरुआत के लिए 557 और अंत तरंग दैर्ध्य के लिए 643 दर्ज करें।
    3. MitoSOX प्रयोग: YFP, MitoTracker और MitoSOX (चित्रा 2B) के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा सेट करें।
      1. वाईएफपी के लिए, उत्तेजना लेजर को 507 एनएम और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा विंडो को 517-540 एनएम पर सेट करें। अधिग्रहण टैब में, नई सेटिंग जोड़ें बटन क्लिक करें; फिर, लेजर जोड़ें बटन पर क्लिक करें और इसे सेटिंग 1 में खींचें। उत्तेजना रेखा पर डबल-क्लिक करें और संवाद बॉक्स में तरंग दैर्ध्य के रूप में 507 दर्ज करें। संबंधित डिटेक्टर पर डबल-क्लिक करें और शुरुआत के लिए 517 और अंत तरंग दैर्ध्य के लिए 540 दर्ज करें।
      2. MitoSOX के लिए, उत्तेजना लेजर को 547 एनएम और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा विंडो को 564-636 एनएम पर सेट करें। अधिग्रहण टैब में, नई सेटिंग जोड़ें बटन क्लिक करें; फिर, लेजर जोड़ें बटन पर क्लिक करें और इसे सेटिंग 2 में खींचें। उत्तेजना रेखा पर डबल-क्लिक करें और संवाद बॉक्स में तरंग दैर्ध्य के रूप में 547 दर्ज करें। संबंधित डिटेक्टर पर डबल-क्लिक करें और शुरुआत के लिए 564 और अंत तरंग दैर्ध्य के लिए 636 दर्ज करें।
      3. मिटोट्रैकर डीप रेड के लिए, उत्तेजना लेजर को 641 एनएम और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा विंडो को 652-742 एनएम पर सेट करें। अधिग्रहण टैब में, नई सेटिंग जोड़ें बटन क्लिक करें; लेजर जोड़ें बटन पर क्लिक करें और इसे सेटिंग 3 में खींचें। उत्तेजना रेखा पर डबल-क्लिक करें और संवाद बॉक्स में तरंग दैर्ध्य के रूप में 641 दर्ज करें। संबंधित डिटेक्टर पर डबल-क्लिक करें और शुरुआत के लिए 652 और अंत तरंग दैर्ध्य के लिए 742 दर्ज करें।
  3. छवि अधिग्रहण सेटिंग्स (चित्रा 2 सी)
    1. प्रारूप को 1,024 x 1,024 पर सेट करें, स्कैनिंग गति 600 हर्ट्ज और लाइन औसत 3 पर सेट करें।
      1. अधिग्रहण टैब का चयन करें और स्वरूप बटन क्लिक करें. ड्रॉपडाउन मेनू से, 1,024 x 1,024 का चयन करें। गति बटन पर क्लिक करें और ड्रॉपडाउन मेनू से 600 का चयन करें। फिर, लाइन औसत बटन क्लिक करें, और ड्रॉपडाउन मेनू से, 3 का चयन करें।
      2. द्विदिश स्कैनिंग चालू करें और चरण और ज़ूम फैक्टर को क्रमशः 22.61 और 1.50 पर सेट करें।
        1. अधिग्रहण टैब में, द्विदिश बटन को चालू पर टॉगल करें। चरण एक्स सेटिंग पर क्लिक करें और इसे 22.61 पर सेट करें। ज़ूम फैक्टर सेटिंग पर क्लिक करें और इसे 1.50 पर सेट करें।

4. छवि अधिग्रहण

चेतावनी: प्रयोगकर्ता को वाईएफपी प्रतिदीप्ति संकेत के आधार पर कोशिकाओं का चयन करने के लिए एक दृश्य निर्णय लेना चाहिए। ओवरसैचुरेटेड पिक्सेल से बचें, क्योंकि वे प्रतिदीप्ति तीव्रता परिमाणीकरण को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकते हैं। संतृप्त छवियों को प्राप्त करने से बचने के लिए पिक्सेल संतृप्ति को इंगित करने वाली ओवर/अंडर लुक-अप तालिका का उपयोग करें।

  1. रुचि की सेटिंग पर क्लिक करें और प्रतिदीप्ति छवि का लाइव पूर्वावलोकन प्रदान करने के लिए फास्ट लाइव दबाएं।
  2. संबंधित डिटेक्टर पर डबल-क्लिक करके लाभ और तीव्रता को समायोजित करें। प्रकट होने वाले संवाद बॉक्स में, स्लाइडर का उपयोग करके लाभ समायोजित करें. तीव्रता को बदलने के लिए, उत्तेजना रेखा पर डबल-क्लिक करें और तीव्रता को बदलने के लिए पॉपअप विंडो में अप और डाउन एरो का उपयोग करें। पूर्वावलोकन समाप्त करने के लिए रोकें क्लिक करें.
    1. TMRE प्रयोग: पहले DMSO नियंत्रण प्लेट की छवि बनाएं। टीएमआरई सिग्नल (सेटिंग 2) के लाभ और तीव्रता को समायोजित करें ताकि माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की तीव्रता संतृप्ति से ठीक नीचे हो; प्रयोग के लिए लाभ और तीव्रता को स्थिर रखें। मिटोट्रैकर और वाईएफपी (सेटिंग 1) के लाभ और तीव्रता को समायोजित करें ताकि माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क दिखाई दे लेकिन मंद हो।
    2. MitoSOX प्रयोग: पहले DMSO नियंत्रण प्लेट की छवि बनाएं। माइटोसॉक्स (सेटिंग 2) सिग्नल के लाभ और तीव्रता को समायोजित करें ताकि प्रतिदीप्ति दिखाई दे लेकिन मंद हो; प्रयोग के लिए लाभ और तीव्रता को स्थिर रखें। वाईएफपी (सेटिंग 1) और मिटोट्रैकर (सेटिंग 3) के लाभ और तीव्रता को समायोजित करें ताकि माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क दृश्यमान लेकिन मंद हो।
      नोट: TMRE और MitoSOX के लाभ और तीव्रता को रिकॉर्ड करें, क्योंकि ये मान पूरे प्रयोग में स्थिर रहना चाहिए। वाईएफपी और मिटोट्रैकर के प्रतिदीप्ति संकेतों को इस प्रोटोकॉल में निर्धारित नहीं किया गया है। इसलिए, लाभ और तीव्रता को प्रत्येक छवि के लिए समायोजित किया जा सकता है। यह लाभ और तीव्रता सेटिंग्स के लिए सबसे प्रभावी है जहां कोशिकाएं देखने में आसान हैं लेकिन फिर भी मंद हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं अत्यधिक लेजर तीव्रता के संपर्क में नहीं हैं जो सेल क्षति या फोटोब्लीचिंग का कारण बनती हैं।
  3. एक बार लाभ और तीव्रता सेटिंग्स पूरी हो जाने के बाद, छवि प्राप्त करने के लिए प्रारंभ पर क्लिक करें। प्रति प्रयोगात्मक स्थिति में 20 कोशिकाओं की छवियां प्राप्त करें (उदाहरण के लिए, प्रति छवि चार कोशिकाओं के साथ पांच छवियां; चित्रा 2 डी)।

5. इमेजजे का उपयोग करके प्रतिदीप्ति तीव्रता परिमाणीकरण।

नोट: इमेजिंग फ़ाइलें ".lif" के रूप में सहेजी जाती हैं और ImageJ29 के साथ संगत हैं। ImageJ के साथ संगत फ़ाइल प्रकार उनकी वेबसाइट पर निर्दिष्ट हैं। यदि यह असंगत है तो फ़ाइल प्रकार को कनवर्ट करना आवश्यक हो सकता है।

  1. रुचि का एक क्षेत्र (ROI) बनाएँ और सहेजें.
    1. ImageJ में, फ़ाइल क्लिक करें | नया | छवि. प्रकट होने वाले संवाद बॉक्स में, OK क्लिक करें.
    2. आयत उपकरण बटन पर क्लिक करें और 6 माइक्रोन x 6 माइक्रोन बॉक्स खींचें। विश्लेषण पर क्लिक करके ROI प्रबंधक खोलें | उपकरण | ROI प्रबंधक और ROI प्रबंधक के साथ एक संवाद बॉक्स के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें (चित्रा 3A)। प्रबंधक संवाद बॉक्स पर जोड़ें क्लिक करके प्रबंधक में आयताकार ROI जोड़ें. अधिक का चयन करके ROI सहेजें, फिर सहेजें बटन और OK पर क्लिक करें।
  2. प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें।
    1. छवि J में, फ़ाइल क्लिक करें और खोलें का चयन करें. संवाद बॉक्स में, प्रयोग के लिए इमेजिंग फ़ाइलों का चयन करें और खोलें क्लिक करें.
    2. जैव-प्रारूप आयात विकल्प विंडो के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें (चित्रा 3बी)। विभाजित चैनल का चयन करें और खोलें पर क्लिक करें।
      नोट: स्प्लिट चैनल सुविधा छवि में प्रत्येक चैनल को एक अलग विंडो के रूप में खोलने की अनुमति देती है। चैनल आदेश अधिग्रहण आदेश से मेल खाता है।
      1. TMRE प्रयोग: YFP (सेटिंग 1) पहला चैनल (c = 0) है; MitoTracker (सेटिंग 1) दूसरा चैनल (c = 1) है; और TMRE (सेटिंग 2) तीसरा चैनल (c = 2) है।
      2. MitoSOX प्रयोग: YFP (सेटिंग 1) पहला चैनल है (c = 0); MitoSOX (सेटिंग 2) दूसरा चैनल (c = 1) है; और MitoTracker (सेटिंग 3) तीसरा चैनल (c = 2) है।
    3. छवि का चयन करके चमक समायोजित करें | समायोजित करें | चमक (चित्रा 3 सी)।
      नोट: छवि चमक स्थायी रूप से परिवर्तित न हो यह सुनिश्चित करने के लिए सेट या लागू न करें। कभी-कभी, टीएमआरई या मिटोसॉक्स चैनलों में प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखाई नहीं देती है। आसान विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए चमक समायोजित करें। चमक को बदलने से कच्चे प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों पर असर नहीं पड़ता है।
    4. विश्लेषण क्लिक करें और माप सेट करें का चयन करें. क्षेत्र और औसत ग्रे मान बक्से की जाँच करें और ठीक (चित्रा 3 डी) क्लिक करें।
      नोट: औसत ग्रे मान प्रतिदीप्ति तीव्रता है।
    5. ROI प्रबंधक खोलें और विश्लेषण पर क्लिक करके चरण 5.1 में सहेजे गए ROI को लोड करें | उपकरण | आरओआई प्रबंधक। ROI प्रबंधक में, अधिक क्लिक करें, फिर प्रकट होने वाली सूची से खोलें, और सहेजे गए ROI का चयन करें।
    6. आरओआई प्रबंधक से सहेजे गए आरओआई का चयन करके एक एकल सेल में पांच यादृच्छिक क्षेत्रों की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें और आरओआई को एक सेल के भीतर यादृच्छिक स्थान पर ले जाएं (चित्रा 3 ई)। एम दबाकर प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें। इस चरण को चार अतिरिक्त गैर-अतिव्यापी क्षेत्रों के साथ दोहराएं। जब क्षेत्र और औसत ग्रे मानों के साथ एक संवाद बॉक्स दिखाई देता है (चित्रा 3 एफ), विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट में मानों की प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ।
      1. TMRE प्रयोग: छवि का चयन करें (c = 2)।
      2. MitoSOX प्रयोग: छवि का चयन करें (c = 2)।
    7. औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता मान प्राप्त करें। स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें), पांच औसत ग्रे मानों का औसत करें। प्रत्येक सेल के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    8. एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके प्रयोगात्मक स्थितियों में TMRE या MitoSOX मतलब ग्रे मानों का विश्लेषण और तुलना करें ( सामग्री की तालिका देखें; चित्र 4 और चित्र 5)। डेटा को बार ग्राफ या वायलिन प्लॉट के रूप में प्रस्तुत करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, सीसीसीपी उपचार (चित्रा 1) के बाद माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड स्तर को मापने के लिए प्रतिदीप्ति-आधारित परिमाणीकरण का उपयोग किया गया था। इस वर्कफ़्लो में हेला कोशिकाओं का उपयोग किया गया, जो गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर से प्राप्त एक अमर सेल लाइन है। हेला कोशिकाओं का उपयोग नियमित रूप से माइटोकॉन्ड्रियल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जाता है और अपेक्षाकृत सपाट होते हैं, जिससे माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की कल्पना करना आसान हो जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क स्वास्थ्य को बनाए रखने में पार्किन की भूमिका की जांच करने के लिए, हेला कोशिकाओं को एक खाली नियंत्रण वेक्टर, पार्किनडब्ल्यूटी, या पार्किनटी 240 आर (एक उत्परिवर्ती जो माइटोफैगी को बाधित करता है) 21 के साथ क्षणिक रूप से स्थानांतरित किया गया था। हेला कोशिकाओं को 35 मिमी ग्लास-बॉटम इमेजिंग व्यंजनों में चढ़ाया गया था और ~ 50% -60% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने के बाद स्थानांतरित किया गया था (चित्रा 1 ए)। चूंकि हेला कोशिकाएं तेजी से विभाजित होती हैं, इसलिए यह आमतौर पर इमेजिंग व्यंजनों में कोशिकाओं को चढ़ाने के बाद का दिन होता है। अभिकर्मक दक्षता का आकलन करने के लिए अगले दिन वाईएफपी प्रतिदीप्ति संकेत का निरीक्षण करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था। प्रयोग केवल एक सफल अभिकर्मक के बाद किए गए थे।

निरीक्षण के बाद, हेला कोशिकाओं को माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को विध्रुवित करने के लिए सीसीसीपी के हल्के (5 μM) या गंभीर (20 μM) सांद्रता के साथ इलाज किया गया था (चरण 1.2 सीसीसीपी और फ्लोरोसेंट जांच तैयार करने के लिए विस्तृत निर्देश दिखाता है)। सीसीसीपी उपचार कुल 2 घंटे के लिए किया गया था। सीसीसीपी उपचार के अंतिम 30 मिनट के दौरान, माइटोकॉन्ड्रिया को माइटोट्रैकर और टीएमआरई / माइटोसॉक्स (चित्रा 1 ए) के साथ लेबल किया गया था। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि टीएमआरई और माइटोसॉक्स में अतिव्यापी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा है और इसका उपयोग एक साथ नहीं किया जा सकता है। इसके बजाय, हमने टीएमआरई और माइटोसॉक्स प्रयोगों के लिए अलग-अलग इमेजिंग व्यंजनों का उपयोग किया। टीएमआरई प्रयोगों के लिए, हेला कोशिकाएं तुरंत 2 एच सीसीसीपी उपचार के अंत में छवि बनाने के लिए तैयार थीं। टीएमआरई एकाग्रता स्थिर रहनी चाहिए; इसलिए, टीएमआरई हेला मीडिया में बना रहा। हालांकि, इमेजिंग से पहले मुफ्त MitoSOX को हटा दिया जाना चाहिए। माइटोसॉक्स प्रयोगों के लिए, कोशिकाओं को मुक्त डाई को हटाने के लिए हेला मीडिया के साथ तीन बार धोया गया था। इस चरण के लिए, प्रयोगात्मक स्थितियों के समान डीएमएसओ या सीसीसीपी एकाग्रता वाले हेला मीडिया का उपयोग करना आवश्यक है। होचस्ट 33342, एक नाभिक मार्कर, शुरू में क्षणिक अभिकर्मक और सीसीसीपी उपचार (चित्रा 1 बी) के बाद हेला कोशिकाओं का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया था।

इसके बाद, क्रमशः माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड के स्तर को मापने के लिए, टीएमआरई और माइटोसॉक्स फ्लोरेसेंस तीव्रता की कल्पना करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया गया था। छवियों को द्विदिश स्कैनिंग के मापदंडों के साथ 63x (1.4 NA) तेल विसर्जन उद्देश्य, 1,024 x 1,024 पिक्सेल का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन, 600 हर्ट्ज की स्कैनिंग गति, 3 की लाइन औसत, 22.61 का चरण और 1.5 का ज़ूम फैक्टर (चित्रा 2 सी) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। डीएमएसओ नियंत्रण प्लेट को टीएमआरई और मिटोसॉक्स के लिए लाभ और तीव्रता मूल्यों को सेट करने के लिए सभी प्रयोगों के लिए पहले चित्रित किया गया था। स्थितियों में मात्रात्मक तुलना करने के लिए, इन मानों को डीएमएसओ स्थिति में सेट किया जाना चाहिए और पूरे प्रयोग के दौरान स्थिर रहना चाहिए। सीसीसीपी माइटोकॉन्ड्रियल विध्रुवण और झिल्ली क्षमता के नुकसान को प्रेरित करता है, जिसके परिणामस्वरूप टीएमआरई प्रतिदीप्ति तीव्रता कम हो जाती है। इसलिए, नियंत्रण प्रयोगों में उच्चतम टीएमआरई तीव्रता थी, और लाभ और तीव्रता मान संतृप्ति के करीब निर्धारित किए गए थे। इसके विपरीत, उच्च सुपरऑक्साइड का स्तर माइटोसॉक्स तीव्रता को बढ़ाता है। इसलिए, नियंत्रण में सबसे कम माइटोसॉक्स प्रतिदीप्ति तीव्रता थी, और लाभ और तीव्रता मान कम सेट किए गए थे जहां एक मंद संकेत मौजूद था। चूंकि MitoTracker, TMRE और MitoSOX महत्वपूर्ण रंजक हैं और सभी कोशिकाओं को लेबल करते हैं, इसलिए छवि बनाने के लिए कोशिकाओं का चयन करते समय उनका उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। इसके बजाय, कोशिकाओं को वाईएफपी सिग्नल के आधार पर चुना गया था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे स्थानांतरित हो गए थे। एकल-विमान छवियों का अधिग्रहण किया गया था, जो हेला सेल के तल पर केंद्रित था, जहां माइटोकॉन्ड्रिया की एक बड़ी आबादी स्थित थी।

टीएमआरई और माइटोसॉक्स प्रतिदीप्ति तीव्रता का परिमाणीकरण।
इमेजजे (चित्रा 3) का उपयोग करके टीएमआरई और माइटोएसओएक्स फ्लोरेसेंस तीव्रता का परिमाणीकरण का विश्लेषण किया गया था। एक 6 माइक्रोन x 6 माइक्रोन आरओआई बनाया गया था और आरओआई प्रबंधक में संग्रहीत किया गया था। टीएमआरई या मिटोसॉक्स तीव्रता को मापने के लिए आरओआई को प्रत्येक सेल के पांच यादृच्छिक गैर-अतिव्यापी क्षेत्रों में रखा गया था। प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजजे में औसत ग्रे मान से मेल खाती है। प्रति सेल औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करने के लिए प्रत्येक सेल के लिए पांच तीव्रता मूल्यों का औसत निकाला गया था। इन मूल्यों को उपचार स्थितियों में सांख्यिकीय महत्व के लिए प्लॉट और विश्लेषण किया गया था।

टीएमआरई और मिटोसॉक्स फ्लोरेसेंस तीव्रता के परिणाम क्रमशः चित्रा 4 और चित्रा 5 में दिखाए गए हैं। जैसा कि अपेक्षित था, ज्ञात अनकपलिंग एजेंट सीसीसीपी के साथ उपचार ने नियंत्रण स्थितियों (चित्रा 4 ए, बी) की तुलना में टीएमआरई प्रतिदीप्ति तीव्रता को कम कर दिया। इसके अलावा, गंभीर (20 μM) CCCP उपचार ने सुपरऑक्साइड उत्पादन को प्रेरित किया और MitoSOX प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 5 ए, बी) में वृद्धि की। हल्के (5 μM) CCCP तनाव स्थितियों में, पार्किनWT और ParkinT240R की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप खाली YFP नियंत्रण वेक्टर की तुलना में उच्च TMRE तीव्रता हुई। इसी तरह, वाईएफपी नियंत्रण वेक्टर (चित्रा 5 ए, बी) को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की तुलना में पार्किनडब्ल्यूटी और पार्किनटी 240 आर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में माइटोएसओएक्स तीव्रता कम थी। इन परिणामों से पता चलता है कि पार्किन अभिव्यक्ति उच्च माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और कम सुपरऑक्साइड स्तरों को संरक्षित करके माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क स्वास्थ्य को बनाए रखने में मदद करती है। इस प्रकार, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड गठन को नियंत्रित करने में पार्किन की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता की सटीक तुलना करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक वर्कफ़्लो. (ए) सीसीसीपी के साथ ट्रांसक्रिप्ट, इलाज और माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क को लेबल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध, और हेला कोशिकाओं में टीएमआरई और माइटोसॉक्स फ्लोरेसेंस तीव्रता की छवि। (बी) एक खाली वाईएफपी वेक्टर (ऊपर), वाईएफपी-पार्किनडब्ल्यूटी (मध्य), और वाईएफपी-पार्किनटी 240 आर (नीचे; मैजेंटा) व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। डीएनए को लेबल करने के लिए होचस्ट 33342 (सफेद) का उपयोग किया जाता है। स्केल बार = 10 μm। संक्षेप: सीसीसीपी = कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफिनाइल हाइड्राज़ोन; टीएमआरई = टेट्रामिथाइलरोडामाइन-एथिल एस्टर-परक्लोरेट; वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कॉन्फोकल अधिग्रहण सेटिंग्स सेट करने के लिए उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस । (ए) लेजर सेटिंग्स संवाद बॉक्स। लाल आयत सफेद प्रकाश लेजर, शक्ति स्थिति, लेजर शक्ति और तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश डालता है। (बी) एक मिटोसॉक्स प्रयोग के लिए स्थापित प्रायोगिक चैनल। सेटिंग्स, उत्तेजना लाइनें और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा विंडो वाईएफपी, मिटोसॉक्स और मिटोट्रैकर के लिए दिखाए गए हैं। (सी) अधिग्रहण सेटिंग्स प्रारूप, गति, द्विदिशता, चरण एक्स, ज़ूम फैक्टर और लाइन औसत दिखाती हैं। (डी) एक प्रतिनिधि ने छवि हासिल की। हेला कोशिकाएं वाईएफपी (मैजेंटा) व्यक्त कर रही हैं, और माइटोकॉन्ड्रिया को माइटोसॉक्स (हरा) और मिटोट्रैकर (सियान) के साथ लेबल किया गया है। स्केल बार = 10 μm। संक्षेप: डब्ल्यूएलएल = सफेद प्रकाश लेजर; वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: टीएमआरई और माइटोसॉक्स फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने के लिए इमेजजे वर्कफ़्लो । (ए) इमेजजे में एक उदाहरण आरओआई के साथ आरओआई प्रबंधक पैनल। (बी) जैव-प्रारूप आयात विकल्प पैनल। लाल आयत स्प्लिट चैनल विकल्प पर प्रकाश डालता है जिसे चुना जाना चाहिए। (सी) चमक और कंट्रास्ट सेटिंग्स पैरामीटर। (डी) माप पैरामीटर सेट करें। लाल आयताकार क्षेत्र और माध्य ग्रे मान विकल्पों को उजागर करते हैं जिन्हें चुना जाना चाहिए। (ई) माइटोसॉक्स के साथ लेबल किए गए हेला सेल की प्रतिनिधि छवि। लाल वर्ग पैनल ए से आरओआई को दर्शाता है। स्केल बार = 10 μm. (F) परिणाम पैनल प्रयोगात्मक क्षेत्र और ROI से औसत ग्रे मान दिखाता है। औसत ग्रे मान (नारंगी) प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षेप: टीएमआरई = टेट्रामेथिलरोडामाइन-एथिल एस्टर-परक्लोरेट; ROI = रुचि का क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: माइटोकॉन्ड्रियल क्षति के बाद टीएमआरई प्रतिदीप्ति तीव्रता। (ए) माइटोकॉन्ड्रियल क्षति को प्रेरित करने के लिए डीएमएसओ, 5 μM CCCP, या 20 μM CCCP के साथ 2 घंटे के उपचार के बाद हेला कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। कोशिकाएं बहिर्जात रूप से एक खाली वाईएफपी वेक्टर, वाईएफपी-पार्किनडब्ल्यूटी, या वाईएफपी-पार्किनटी 240 आर (मैजेंटा) को व्यक्त कर रही हैं, और मिटोट्रैकर (सियान) और टीएमआरई (हरे) के साथ लेबल की गई हैं। स्केल बार = 30 μm. (B) डीएमएसओ- और सीसीसीपी-उपचारित स्थितियों में खाली वाईएफपी वेक्टर (नीला), वाईएफपी-पार्किनडब्ल्यूटी (नारंगी), और वाईएफपी-पार्किनटी 240 आर (बैंगनी) व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए टीएमआरई प्रतिदीप्ति तीव्रता का परिमाणीकरण। पी < 0.0001 एक एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ दो-तरफा एनोवा द्वारा। (C-E) पैनल बी से टीएमआरई प्रतिदीप्ति तीव्रता का परिमाणीकरण डीएमएसओ (सी), 5 μM CCCP (D), और 20 μM CCCP (E) में अंतर को उजागर करने के लिए अलग किया गया है। * पी < 0.05; पी < 0.001; डन के कई तुलना परीक्षण के साथ क्रुस्कल-वालिस एनोवा द्वारा पी < 0.0001। एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है। एसईएम ± मतलब; एन = तीन स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों से 79-104। संक्षेप: सीसीसीपी = कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफिनाइल हाइड्राज़ोन; टीएमआरई = टेट्रामिथाइलरोडामाइन-एथिल एस्टर-परक्लोरेट; वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को नुकसान के बाद माइटोसॉक्स प्रतिदीप्ति तीव्रता। (ए) माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली क्षमता को पूर्ववत करने के लिए डीएमएसओ, 5 μM CCCP, या 20 μM CCCP के साथ 2 घंटे के लिए इलाज किए गए हेला कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। कोशिकाओं को खाली वाईएफपी वेक्टर, वाईएफपी-पार्किनडब्ल्यूटी, या वाईएफपी-पार्किनटी 240 आर (मैजेंटा) के साथ स्थानांतरित किया गया था, और मिटोट्रैकर (सियान) और मिटोसॉक्स (हरा) के साथ लेबल किया गया था। स्केल बार = 30 μm. (B) नियंत्रण और उपचारित स्थितियों के लिए खाली YFP वेक्टर (नीला), YFP-ParkinWT (नारंगी), और YFP-ParkinT240R (बैंगनी) व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए माइटोसॉक्स प्रतिदीप्ति तीव्रता का परिमाणीकरण। डन के एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ दो-तरफा एनोवा द्वारा 0.0001 < किया गया। (C-E) पैनल बी से माइटोसॉक्स प्रतिदीप्ति तीव्रता का परिमाणीकरण डीएमएसओ (सी), 5 μM CCCP (D), और 20 μM CCCP (E) में अंतर को उजागर करने के लिए अलग किया गया है। * पी < 0.05; डन के कई तुलना परीक्षण के साथ क्रुस्कल-वालिस एनोवा द्वारा पी < 0.0001। एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है। एसईएम ± मतलब; एन = तीन स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों से 87-107। संक्षेप: सीसीसीपी = कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफिनाइल हाइड्राज़ोन; टीएमआरई = टेट्रामिथाइलरोडामाइन-एथिल एस्टर-परक्लोरेट; वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां उल्लिखित वर्कफ़्लो का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड के स्तर को प्रतिदीप्ति-आधारित इमेजिंग30 का उपयोग करके मजबूत और पुन: निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इन प्रयोगों को डिजाइन करते समय विचार करने के लिए महत्वपूर्ण तकनीकी सीमाएं हैं। हेला कोशिकाओं को एक खाली वाईएफपी वेक्टर, वाईएफपी-पार्किनडब्ल्यूटी, या वाईएफपी-पार्किनटी 240 आर के साथ स्थानांतरित किया गया था। खाली वाईएफपी वेक्टर का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में किया गया था कि प्रयोगात्मक निष्कर्ष पार्किन के लिए विशिष्ट थे। क्षणिक अभिकर्मक के लिए, डीएनए से अभिकर्मक अभिकर्मक के लिए 1: 3 का द्रव्यमान अनुपात प्रयोगात्मक रूप से उच्चतम अभिकर्मक दर प्राप्त करने के लिए निर्धारित किया गया था, जहां प्रत्येक निर्माण28 के लिए प्लास्मिड डीएनए के 2 μg का उपयोग किया गया था। सभी निर्माणों के लिए वाईएफपी-टैग को सुसंगत रखना महत्वपूर्ण था, क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन जन्मजात चमक31,32 में भिन्न होते हैं। यदि कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग का उपयोग किया जाना चाहिए, तो समान चमक और फोटोस्टेबिलिटी वाले फ्लोरोसेंटप्रोटीन का चयन किया जाना चाहिए।

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड के स्तर को मापने के लिए, दो अच्छी तरह से प्रलेखित रंगों का चयन किया गया था। टीएमआरई का प्रतिदीप्ति संकेत माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता पर आधारित है, जबकि माइटोसॉक्स प्रतिदीप्ति तीव्रता सुपरऑक्साइड स्तरों का एक कार्य है। प्रतिदीप्ति-आधारित इमेजिंग के लिए, फ्लोरोसेंट जांच के बीच कोई वर्णक्रमीय ओवरलैप नहीं होना चाहिए। हालांकि, प्रारंभिक प्रोटोकॉल एमचेरी-पार्किनडब्ल्यूटी और एमचेरी-पार्किनटी 240 आर का उपयोग करके किया गया था, जो टीएमआरई और मिटोएसओएक्स के लाल-स्थानांतरित स्पेक्ट्रा के साथ अतिव्यापी था। वर्णक्रमीय ओवरलैप से बचने और संभावित क्रॉसस्टॉक को कम करने के लिए, वाईएफपी-टैग किए गए पार्किन संरचनाओं का चयन किया गया था। इस समायोजन ने मिटोट्रैकर डाई को हरे से दूर-लाल रंग में बदलना आवश्यक कर दिया। इसके अलावा, हेला सेल प्लेटिंग घनत्व को अनुकूलित किया गया था; प्रारंभ में, हेला कोशिकाओं को प्रति इमेजिंग डिश 45,000 कोशिकाओं पर चढ़ाया गया था, लेकिन इसके परिणामस्वरूप ओवर-कॉन्फ्लुएंट व्यंजन बने। उच्च सेल कंफ्लुएंसी अभिकर्मक दक्षता को कम कर सकती है, कोशिका मृत्यु को बढ़ावा दे सकती है, और सेलुलर चयापचय को बदल सकती है34,35,36. इन संभावित प्रभावों से बचने के लिए, कोशिकाओं को प्रति इमेजिंग डिश 30,000 कोशिकाओं के घनत्व पर चढ़ाया गया था।

इस प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह की क्षमता है, खासकर जब कोशिकाओं और आरओआई स्थानों का चयन करते हैं। प्रोटोकॉल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड स्तरों के लिए एक कार्यात्मक रीडआउट के रूप में टीएमआरई और माइटोसॉक्स फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन का उपयोग करता है। इसलिए, इन जांचों का उपयोग करके सेल चयन संभावित रूप से प्रयोगात्मक परिणामों को पूर्वाग्रह कर सकता है। इस पूर्वाग्रह का मुकाबला करने के लिए, हमने पूरी तरह से वाईएफपी अभिव्यक्ति के आधार पर कोशिकाओं को चुना। सेल के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क में नॉनओवरलैपिंग आरओआई को यादृच्छिक रूप से चुना गया था। हालांकि इस विधि का उपयोग पहले प्रतिदीप्ति तीव्रता27 को मापने के लिए किया गया था, अतिरिक्त पूर्वाग्रह को कम करने वाले उपाय किए जा सकते हैं। सबसे पहले, अपेक्षित परिणामों का समर्थन करने वाले आरओआई चयन को रोकने के लिए इमेजजे में ब्लाइंड एनालिसिस टूल्स का उपयोग करके अध्ययन को अंधा किया जा सकता है। दूसरा, प्रतिदीप्ति तीव्रता को उन्नत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा जा सकता है जो आरओआई की आवश्यकता को समाप्त करता है।

जबकि यह प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति-आधारित परिमाणीकरण के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है, अतिरिक्त तरीकों, जैसे कि फ्लो साइटोमेट्री, का उपयोग टीएमआरई और मिटोसॉक्स37 में प्रतिदीप्ति परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हमने माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क आकृति विज्ञान की कल्पना करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री के बजाय कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया। उल्लिखित प्रोटोकॉल को आसानी से प्रवाह साइटोमेट्री के साथ टीएमआरई और माइटोसॉक्स फ्लोरेसेंस को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो समान प्रयोगात्मक परिणाम देता है। इसके अलावा, ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) परख का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के कार्य में परिवर्तन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। जबकि ओसीआर माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का एक संवेदनशील उपाय प्रदान करता है, यह झिल्ली क्षमता या सुपरऑक्साइड एकाग्रता के लिए विशिष्ट नहीं है, बल्कि इसके बजाय माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन38 का एक वैश्विक उपाय प्रदान करता है। माइटोकॉन्ड्रियलस्वास्थ्य का आकलन करने के लिए टीएमआरई और मिटोसॉक्स प्रयोगों के साथ संयोजन के रूप में इन परखों का प्रदर्शन किया जा सकता है।

हालांकि यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर सीसीसीपी40 के प्रभाव पर केंद्रित है, वैकल्पिक तंत्र के साथ हानिकारक अभिकर्मकों का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एंटीमाइसिन ए और ऑलिगोमाइसिन ए इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला अवरोधक हैं जो आमतौर पर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन38 के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल क्षति को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। जबकि हमने विशेष रूप से माइटोएसओएक्स का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड के स्तर को मापा, इंट्रासेल्युलर आरओएस को सेलरॉक्स का उपयोग करके मापा जा सकता है। हेला कोशिकाओं में, कम अंतर्जात अभिव्यक्ति के कारण पार्किन को ओवरएक्सप्रेस करना आवश्यक था। भविष्य के अध्ययन सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क स्वास्थ्य पर पार्किन अभिव्यक्ति के प्रभावों का निरीक्षण कर सकते हैं जो अंतर्जात पार्किन41 को व्यक्त करते हैं। चूंकि माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा चयापचय और सेलुलर होमियोस्टैसिस के महत्वपूर्ण नियामक हैं, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन कई बीमारियों से जुड़ा हुआ है, जिसमें मधुमेह 42, अल्जाइमर रोग 43,44,45, कैंसर 46 और यकृत रोग 47 शामिल हैं। इसलिए, इस वर्कफ़्लो को प्रासंगिक सेल लाइनों और प्राथमिक संस्कृतियों में माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य और डिसरेग्यूलेशन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि पर उनकी विचारशील प्रतिक्रिया के लिए इवांस प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। यह काम ड्यूक व्हाइटहेड स्कॉलर्स, ड्यूक साइंस एंड टेक्नोलॉजी स्कॉलर्स और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (एचएचएमआई) हैना ग्रे फैलोशिप द्वारा समर्थित है। चित्र 1 ए BioRender.com का उपयोग करके बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A

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References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).

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जीव विज्ञान अंक 195 माइटोकॉन्ड्रिया माइटोफैगी न्यूरोडीजेनेरेशन पार्किन माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां सुपरऑक्साइड हेला कोशिकाएं कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी।
हेला कोशिकाओं में लाइव इमेजिंग का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और सुपरऑक्साइड स्तरों का प्रतिदीप्ति-आधारित परिमाणीकरण
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Fazli, M., Evans, C. S.… More

Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).

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