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Biology

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65304
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

Summary

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Abstract

As mitocôndrias são organelas dinâmicas críticas para a homeostase metabólica, controlando a produção de energia via síntese de ATP. Para apoiar o metabolismo celular, vários mecanismos de controle de qualidade mitocondrial cooperam para manter uma rede mitocondrial saudável. Uma dessas vias é a mitofagia, onde a quinase 1 induzida por PTEN (PINK1) e a fosfoubiquitinação de Parkin das mitocôndrias danificadas facilitam o sequestro do autofagossomo e a subsequente remoção da célula via fusão lisossômica. A mitofagia é importante para a homeostase celular, e mutações em Parkin estão ligadas à doença de Parkinson (DP). Devido a esses achados, tem havido uma ênfase significativa na investigação do dano e turnover mitocondrial para entender os mecanismos moleculares e a dinâmica do controle de qualidade mitocondrial. Aqui, imagens de células vivas foram usadas para visualizar a rede mitocondrial de células HeLa, para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido após o tratamento com cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), um agente desacoplador mitocondrial. Além disso, uma mutação PD-ligada de Parkin (ParkinT240R) que inibe a mitofagia Parkin-dependente foi expressa para determinar como a expressão mutante impacta a rede mitocondrial em comparação com as pilhas que expressam Parkin selvagem-tipo. O protocolo descrito aqui descreve um fluxo de trabalho simples usando abordagens baseadas em fluorescência para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma eficaz.

Introduction

A rede mitocondrial é uma série de organelas interconectadas que desempenham um papel crucial na produção de energia1, imunidade inata 2,3 e sinalização celular 4,5. A desregulação mitocondrial tem sido associada a doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (DP)6,7. A DP é uma doença neurodegenerativa progressiva que afeta neurônios dopaminérgicos da substância negra e afeta cerca de 10 milhões de pessoas em todo omundo8. A DP tem sido geneticamente ligada à mitofagia, uma via de controle de qualidade mitocondrial necessária para a manutenção da homeostase celular que remove seletivamente as mitocôndrias danificadas 9,10. Estudos identificaram múltiplas vias de mitofagia independentes, incluindo o domínio FUN14 contendo 1 mitofagia mediada por FUNDC1, mitofagia facilitada pela proteína de interação Bcl-2 3 (BNIP3), mitofagia dependente de NIX e a bem caracterizada quinase 1 induzida por PTEN (PINK1)/mitofagia regulada por Parkin10,11. PINK1 (uma suposta quinase) e Parkin (uma ubiquitina ligase E3) trabalham em conjunto com mitocôndrias danificadas por fosfo-ubiquitinato, o que impulsiona a formação de autofagossomos que engolem a organela danificada e se fundem com lisossomos para iniciar a degradação 12,13,14,15,16. Mutações em Parkin têm sido associadas a fenótipos ligados à DP, como a neurodegeneração via perda de neurônios dopaminérgicos17,18.

Aqui, é descrito um protocolo no qual células HeLa, rotineiramente usadas como células imortalizadas derivadas do câncer cervical, são usadas para investigar o papel de Parkin na manutenção da saúde da rede mitocondrial. As células HeLa expressam níveis desprezíveis de Parkin endógeno e, portanto, requerem expressão exógena de Parkin19. Para estudar o papel de Parkin na saúde da rede mitocondrial, as células HeLa são transfectadas com Parkin selvagem (ParkinWT), um mutante Parkin (ParkinT240R) ou um vetor de controle vazio. ParkinT240R é uma mutação autossômica recessiva do parkinsonismo juvenil que afeta a atividade da ligase Parkin E3, reduzindo significativamente a eficiência da via mitofágica20. As células HeLa estão sujeitas a concentrações leves (5 μM) ou severas (20 μM) de cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), um agente desacoplador mitocondrial. O tratamento com concentrações severas de CCCP é rotineiramente utilizado para induzir mitofagia mediada por Parkin em várias linhagens celulares, como células HeLa e COS-721,22,23.

Após o tratamento, o protocolo emprega imagens ao vivo da rede mitocondrial usando dois corantes fluorescentes direcionados para mitocôndrias atualmente disponíveis. A tetrametilrodamina, éster etílico, perclorato (TMRE) é um corante catiônico que fluoresce com base no potencial de membrana mitocondrial24, enquanto a MitoSOX é um indicador de superóxido mitocondrial onde a intensidade da fluorescência é função da concentração de superóxido25. Finalmente, o protocolo delineado usa uma quantificação baseada em fluorescência e fluxo de trabalho simples para quantificar efetivamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido com escopo mínimo para viés do usuário. Embora este protocolo tenha sido desenhado para estudar a função mitocondrial em células HeLa, ele pode ser adaptado para linhagens celulares adicionais e tipos celulares primários para caracterizar quantitativamente a saúde da rede mitocondrial.

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Protocol

1. Preparação de amostras biológicas

NOTA: Execute as seguintes etapas usando técnica estéril em um gabinete de biossegurança. Borrife a superfície do gabinete e todos os materiais com etanol 70%.

  1. Cultura e transfecção de células HeLa
    1. Cultura de 30.000 células HeLa em meio águia modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g/L de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino e solução de L-glutamina a 1% (HeLa media; ver Tabela de Materiais). Plaquear as células em placas de imagem com fundo de vidro de 35 mm (verT capaz de Materiais) contendo 2 mL de mídia HeLa pré-aquecida. Manter as culturas HeLa a 5% CO2 e 37 °C26,27.
    2. No dia seguinte ao plaqueamento, inspecione as placas de imagem de 35 mm usando um microscópio de luz para garantir que as células sejam ~50%-60% confluentes. Uma vez confluentes, transfectar as células HeLa com vetor vazio de proteína fluorescente amarela (YFP), YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R (Figura 1A).
    3. Preparar duas misturas separadas em tubos de microcentrífuga estéreis para cada transfecção. Misture batendo no tubo ou pipetando suavemente para cima e para baixo.
      1. No tubo 1, misturar 200 μL de meio sérico reduzido (ver Tabela de Materiais) com 2 μg de DNA plasmidial.
      2. No tubo 2, misturar 200 μL de meio sérico reduzido com 6 μL de reagente de transfecção (ver Tabela de Materiais)28.
    4. Incubar os tubos por 5 min à temperatura ambiente (TR). Adicione o tubo 2 ao tubo 1, misture pipetando para cima e para baixo e incube por 20 min no TR.
    5. Adicione os complexos de transfecção aos pratos de imagem existentes contendo as culturas de células HeLa, garantindo uma distribuição igual em todo o prato. Coloque as placas de imagem na incubadora de 5% CO2 e 37 °C durante a noite.
      NOTA: Rotule cada prato com o plasmídeo transfectado apropriado. Para cada experimento, rotule as três placas YFP-ParkinWT (dimetil sulfóxido [DMSO; ver Tabela de Materiais], 5 μM CCCP e 20 μM CCCP). Repita a rotulagem com os três pratos YFP-ParkinT240R e os três pratos vetoriais YFP vazios.
  2. Preparação de CCCP e corantes fluorescentes
    CUIDADO: Corantes fluorescentes são frequentemente sensíveis à luz. Guarde os corantes no escuro usando papel alumínio ou tubos de centrífuga marrom para reduzir a exposição à luz.
    1. Faça um estoque de trabalho de 5 mM de CCCP (ver Tabela de Materiais) dissolvendo 5 mg de CCCP em 4,89 mL de DMSO. Fazer um estoque de trabalho de 20 mM de CCCP dissolvendo 5 mg de CCCP em 1,22 mL de DMSO.
    2. Diluir 10 μL de uma solução-mãe MitoTracker Deep Red de 1 mM (ver Tabela de Materiais) em 390 μL de DMSO para formar um material de trabalho de 25 μM.
    3. Dissolva 50 μg de MitoSOX Red25 (ver Tabela de Materiais) em 13 μL de DMSO para criar um parque de trabalho de 5 mM.
    4. Dissolver 10 mg de TMRE24 (ver Tabela de Materiais) em 19,4 ml de DMSO para formar uma solução-mãe de 1 mM. Diluir o TMRE adicionando 10 μL de 1 mM TMRE em 990 μL de DMSO para fazer um estoque de trabalho de 10 μM.

2. Tratamento CCCP e marcação mitocondrial com sondas fluorescentes em células HeLa

CUIDADO: Execute as seguintes etapas rapidamente para garantir que as células HeLa não fiquem fora da incubadora por um período prolongado.

  1. No dia seguinte à transfecção, adicionar 2 μL de CCCP 5 ou 20 mM (concentração final: 5 μM e 20 μM, respectivamente) a cada placa experimental. Para placas de controle, adicionar 2 μL de DMSO. Retorne as placas para a incubadora de 5% CO2 e 37 °C por 1,5 h (Figura 1A).
    NOTA: O tratamento CCCP é para um total de 2 h. No entanto, as mitocôndrias são marcadas com sondas fluorescentes durante os 30 minutos finais do tratamento com CCCP.
  2. Após 1,5 h, remova as placas da incubadora e adicione sondas fluorescentes às placas de imagem. Retorne as placas para a incubadora de 5% CO2 e 37 °C por 30 min (Figura 1A).
    1. Experimento TMRE: Adicionar 2 μL de 25 μM MitoTracker (concentração final: 25 nM) e 2 μL de 10 μM TMRE (concentração final: 10 nM).
    2. Experiência MitoSOX: Adicionar 2 μL de 25 μM MitoTracker (concentração final: 25 nM) e 1 μL de 5 mM MitoSOX (concentração final: 2,5 μM).
  3. Após o tratamento com CCCP de 2 h, preparar as células HeLa para aquisição de imagens (Figura 1A,B).
    1. Experimento TMRE: as células HeLa estão imediatamente prontas para obter imagens; garantir que o TMRE permaneça no meio de cultura de células HeLa.
    2. Experimento MitoSOX: Lave as células 3x com 2 mL de meio HeLa pré-aquecido para remover o corante livre MitoSOX. Adicionar 2 mL de meio pré-aquecido. As células HeLa estão agora prontas para serem fotografadas.
      NOTA: Lavar as células HeLa com meios HeLa frescos e pré-aquecidos que contenham a mesma concentração de DMSO ou CCCP que a condição experimental; não incluem MitoSOX ou MitoTracker.

3. Configuração de aquisição de imagens em microscópio confocal

NOTA: Obtenha imagens das células HeLa usando um microscópio confocal (ver Tabela de Materiais) equipado com uma objetiva de imersão em óleo de abertura numérica (NA) de 63x/1,40 e uma câmara ambiental (consulte Tabela de Materiais).

  1. Em 1 h antes da aquisição de imagens, ligue o CO2 abrindo a válvula do tanque. Pressione o botão On para ligar o controlador ambiental do microscópio. Use as setas para cima e para baixo no touchpad para ajustar a temperatura para 37 °C e o CO2 para 5%. Pressione Definir quando concluir.
    OBS: Certifique-se de que as portas da câmara ambiental estejam fechadas e aguarde a estabilização das condições.
  2. Configurações do laser
    1. Ligue o Laser de Luz Branca (WLL) e ajuste a potência do laser para 85% e o controle de excitação para a potência máxima. Clique na guia Adquirir , selecione Adicionar Laser e, na caixa de diálogo exibida, alterne a WLL para Ativada. Clique no botão Laser Power e digite 85%. Clique no botão Excitation Control e selecione Maximum Power no menu suspenso (Figura 2A).
    2. Experiência TMRE: Defina os espectros de excitação e emissão para YFP, MitoTracker e TMRE.
      1. Para YFP, ajuste o laser de excitação para 514 nm e a janela de espectros de emissão para 524-545 nm. Na guia Adquirir , clique no botão Adicionar Nova Configuração ; em seguida, clique em Adicionar laser e arraste-o para a configuração 1. Clique duas vezes na Linha de excitação e digite 514 como o comprimento de onda na caixa de diálogo. Clique duas vezes no detector correspondente e digite 524 para o comprimento de onda inicial e 545 para o final.
      2. Para o MitoTracker Deep Red, ajuste o laser de excitação para 641 e a janela de espectros de emissão para 650-750 nm. Na guia Adquirir, clique no botão Adicionar Laser e arraste-o para a Configuração 1. Clique duas vezes na linha de excitação e digite 641 como o comprimento de onda na caixa de diálogo. Clique duas vezes no detector correspondente e digite 650 para o comprimento de onda inicial e 750 para o final.
      3. Para TMRE, ajuste o laser de excitação para 555 nm e a janela de espectros de emissão para 557-643 nm. Na guia Adquirir , clique no botão Adicionar Nova Configuração ; em seguida, clique no botão Adicionar laser e arraste-o para a configuração 2. Clique duas vezes na linha de excitação e digite 555 como o comprimento de onda na caixa de diálogo. Clique duas vezes no detector correspondente e digite 557 para o início e 643 para o comprimento de onda final.
    3. Experiência MitoSOX: Defina os espectros de excitação e emissão para YFP, MitoTracker e MitoSOX (Figura 2B).
      1. Para YFP, ajuste o laser de excitação para 507 nm e a janela de espectros de emissão para 517-540 nm. Na guia Adquirir , clique no botão Adicionar Nova Configuração ; em seguida, clique no botão Adicionar laser e arraste-o para a configuração 1. Clique duas vezes na Linha de excitação e digite 507 como o comprimento de onda na caixa de diálogo. Clique duas vezes no detector correspondente e digite 517 para o início e 540 para o comprimento de onda final.
      2. Para MitoSOX, ajuste o laser de excitação para 547 nm e a janela de espectros de emissão para 564-636 nm. Na guia Adquirir , clique no botão Adicionar Nova Configuração ; em seguida, clique no botão Adicionar laser e arraste-o para a configuração 2. Clique duas vezes na Linha de excitação e digite 547 como o comprimento de onda na caixa de diálogo. Clique duas vezes no detector correspondente e digite 564 para o comprimento de onda inicial e 636 para o final.
      3. Para o MitoTracker Deep Red, ajuste o laser de excitação para 641 nm e a janela de espectros de emissão para 652-742 nm. Na guia Adquirir , clique no botão Adicionar Nova Configuração ; clique no botão Adicionar laser e arraste-o para a configuração 3. Clique duas vezes na linha de excitação e digite 641 como o comprimento de onda na caixa de diálogo. Clique duas vezes no detector correspondente e digite 652 para o início e 742 para o comprimento de onda final.
  3. Configurações de aquisição de imagens (Figura 2C)
    1. Defina o formato para 1.024 x 1.024, a velocidade de digitalização para 600 Hz e a média de linha para 3.
      1. Selecione a guia Aquisição e clique no botão Formatar . No menu suspenso, selecione 1.024 x 1.024. Clique no botão Velocidade e selecione 600 no menu suspenso. Em seguida, clique no botão Média de linhas e, no menu suspenso, selecione 3.
      2. Ative a varredura bidirecional e defina o fator de fase e zoom para 22,61 e 1,50, respectivamente.
        1. Na guia Aquisição, alterne o botão Bidirecional para Ativado. Clique na configuração Fase X e defina-a como 22.61. Clique na configuração Fator de zoom e defina-a como 1,50.

4. Aquisição de imagens

CUIDADO: O experimentador deve fazer um julgamento visual para selecionar as células com base no sinal de fluorescência YFP. Evite pixels supersaturados, pois eles podem afetar significativamente a quantificação da intensidade da fluorescência. Use uma tabela de pesquisa sobre/abaixo que indique a saturação de pixels para evitar a aquisição de imagens saturadas.

  1. Clique na Configuração de interesse e pressione Fast Live para fornecer uma visualização ao vivo da imagem de fluorescência.
  2. Ajuste o ganho e a intensidade clicando duas vezes no detector correspondente. Na caixa de diálogo exibida, ajuste o Ganho usando o controle deslizante. Para alterar a intensidade, clique duas vezes na Linha de excitação e use as setas para cima e para baixo na janela pop-up para alterar a intensidade. Clique em Parar para encerrar a visualização.
    1. Experimento TMRE: Imageie a placa de controle DMSO primeiro. Ajustar o ganho e a intensidade do sinal TMRE (Ajuste 2) para que a intensidade da rede mitocondrial fique um pouco abaixo da saturação; manter o ganho e a intensidade constantes para o experimento. Ajuste o ganho e a intensidade do MitoTracker e do YFP (Configuração 1) para que a rede mitocondrial seja visível, mas fraca.
    2. Experimento MitoSOX: Obtenha imagens da placa de controle DMSO primeiro. Ajuste o ganho e a intensidade do sinal MitoSOX (Setting 2) para que a fluorescência seja visível, mas fraca; manter o ganho e a intensidade constantes para o experimento. Ajuste o ganho e a intensidade do YFP (Setting 1) e do MitoTracker (Setting 3) para que a rede mitocondrial fique visível, mas fraca.
      OBS: Registre o ganho e a intensidade de TMRE e MitoSOX, pois esses valores devem permanecer constantes durante todo o experimento. Os sinais de fluorescência do YFP e do MitoTracker não são quantificados neste protocolo. Portanto, o ganho e a intensidade podem ser ajustados para cada imagem. É mais eficaz ter as configurações de ganho e intensidade onde as células são fáceis de ver, mas ainda fracas, para garantir que as células não sejam expostas a intensidades excessivas de laser que causam danos celulares ou fotoclareamento.
  3. Quando as configurações de ganho e intensidade estiverem concluídas, clique em Iniciar para adquirir uma imagem. Adquirir imagens de 20 células por condição experimental (por exemplo, cinco imagens com quatro células por imagem; Figura 2D).

5. Quantificação da intensidade de fluorescência usando ImageJ

NOTA: Os arquivos de imagem são salvos como ".lif" e são compatíveis com o ImageJ29. Os tipos de arquivos compatíveis com o ImageJ são especificados em seu site. Pode ser necessário converter o tipo de arquivo se ele for incompatível.

  1. Crie e salve uma região de interesse (ROI).
    1. No ImageJ, clique em Arquivo | Novo | Imagem. Na caixa de diálogo exibida, clique em OK.
    2. Clique no botão Rectangle Tool e desenhe uma caixa de 6 mícrons x 6 mícrons. Abra o gerenciador de ROI clicando em Analisar | Ferramentas | ROI Manager e aguarde até que uma caixa de diálogo com o gerenciador de ROI apareça (Figura 3A). Adicione o ROI retangular ao gerenciador clicando em Adicionar na caixa de diálogo do gerente. Salve o ROI selecionando Mais e, em seguida, clique no botão Salvar e OK.
  2. Meça a intensidade da fluorescência.
    1. Na Imagem J, clique em Arquivo e selecione Abrir. Na caixa de diálogo, selecione os arquivos de imagem para o experimento e clique em Abrir.
    2. Aguarde até que a janela Bio-formats Import Options (Opções de importação de bioformatos ) seja exibida (Figura 3B). Selecione Canais divididos e clique em Abrir.
      NOTA: O recurso de canais divididos permite que cada canal na imagem seja aberto como uma janela separada. A ordem do canal corresponde à ordem de aquisição.
      1. Experimentos TMRE : YFP (Setting 1) é o primeiro canal (c = 0); MitoTracker (Configuração 1) é o segundo canal (c = 1); e TMRE (Setting 2) é o terceiro canal (c = 2).
      2. Experimentos MitoSOX : YFP (Setting 1) é o primeiro canal (c = 0); MitoSOX (Setting 2) é o segundo canal (c = 1); e MitoTracker (Configuração 3) é o terceiro canal (c = 2).
    3. Ajuste o brilho selecionando Imagem | Ajustar | Brilho (Figura 3C).
      Observação : não pressione Definir ou aplicar para garantir que o brilho da imagem não é alterado permanentemente. Ocasionalmente, a intensidade da fluorescência não é visível nos canais TMRE ou MitoSOX. Ajuste o brilho para permitir uma visualização mais fácil. Alterar o brilho não afeta os valores brutos de intensidade de fluorescência.
    4. Clique em Analisar e selecione Definir medidas. Marque as caixas Area e Mean gray value e clique em OK (Figura 3D).
      Observação : o valor médio de cinza é a intensidade de fluorescência.
    5. Abra o ROI Manager e carregue o ROI salvo na etapa 5.1 clicando em Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI. No Gerenciador de ROI, clique em Mais, em Abrir na lista exibida e selecione o ROI salvo.
    6. Meça a intensidade da fluorescência de cinco regiões aleatórias em uma única célula selecionando a ROI salva do gerenciador de ROI e mova a ROI para um local aleatório dentro de uma célula (Figura 3E). Meça a intensidade da fluorescência pressionando M. Repita esta etapa com quatro regiões adicionais não sobrepostas. Quando uma caixa de diálogo com os valores de área e cinza médio for exibida (Figura 3F), copie e cole os valores em uma planilha para análise.
      1. Experimento TMRE : Selecione a imagem (c = 2).
      2. Experimento MitoSOX : Selecione a imagem (c = 2).
    7. Obter os valores médios de intensidade de fluorescência. Usando um software de planilha eletrônica (consulte Tabela de Materiais), faça a média dos cinco valores médios de cinza. Repita esse processo para cada célula.
    8. Analisar e comparar os valores médios de cinza TMRE ou MitoSOX em condições experimentais usando um programa de software estatístico (ver Tabela de Materiais; Figura 4 e Figura 5). Apresente os dados como gráficos de barras ou gráficos de violino.

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Representative Results

Neste protocolo, a quantificação baseada em fluorescência foi utilizada para medir o potencial de membrana e os níveis de superóxido da rede mitocondrial após o tratamento com CCCP (Figura 1). Esse fluxo de trabalho usou células HeLa, uma linhagem celular imortalizada derivada do câncer cervical. As células HeLa são rotineiramente usadas para estudar a biologia mitocondrial e são relativamente planas, facilitando a visualização da rede mitocondrial usando microscopia. Para investigar o papel de Parkin na manutenção da saúde da rede mitocondrial, as células HeLa foram transfectadas transitoriamente com um vetor controle vazio, ParkinWT, ou ParkinT240R (um mutante que interrompe a mitofagia)21. As células HeLa foram plaqueadas em placas de imagem com fundo de vidro de 35 mm e transfectadas uma vez atingida ~50%-60% de confluência (Figura 1A). Uma vez que as células HeLa se dividem rapidamente, isso é tipicamente o dia após o plaqueamento das células nos pratos de imagem. Um microscópio de luz foi usado para observar o sinal de fluorescência do YFP no dia seguinte para avaliar a eficiência da transfecção. Os experimentos só foram realizados após uma transfecção bem-sucedida.

Após a inspeção, as células HeLa foram tratadas com concentrações leves (5 μM) ou severas (20 μM) de CCCP para despolarizar a rede mitocondrial (o passo 1.2 mostra instruções detalhadas para a preparação de CCCP e sondas fluorescentes). O tratamento com CCCP foi realizado por um total de 2 h. Durante os 30 min finais do tratamento com CCCP, as mitocôndrias foram marcadas com MitoTracker e TMRE/MitoSOX (Figura 1A). Deve-se notar que TMRE e MitoSOX têm espectros de fluorescência sobrepostos e não podem ser usados simultaneamente. Em vez disso, usamos placas de imagem separadas para os experimentos TMRE e MitoSOX. Para os experimentos com TMRE, as células HeLa estavam imediatamente prontas para obter imagens ao final do tratamento com CCCP de 2 h. A concentração de TMRE deve permanecer constante; portanto, TMRE permaneceu na mídia HeLa. No entanto, MitoSOX livre deve ser removido antes da aquisição de imagens. Para os experimentos com MitoSOX, as células foram lavadas três vezes com meio HeLa para remover o corante livre. Para esta etapa, é essencial utilizar meios HeLa contendo a mesma concentração de DMSO ou CCCP das condições experimentais. Hoechst 33342, um marcador de núcleos, foi inicialmente usado para avaliar as células HeLa após a transfecção transitória e o tratamento com CCCP (Figura 1B).

Posteriormente, microscopia confocal foi realizada para visualizar as intensidades de fluorescência de TMRE e MitoSOX, para medir o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido, respectivamente. As imagens foram adquiridas com objetiva de imersão em óleo de 63x (1,4 NA) com parâmetros de varredura bidirecional, resolução espacial de 1.024 x 1.024 pixels, velocidade de varredura de 600 Hz, média de linhas de 3, fase de 22,61 e fator de zoom de 1,5 (Figura 2C). A placa de controle DMSO foi fotografada primeiro para todos os experimentos para definir os valores de ganho e intensidade para TMRE e MitoSOX. Para fazer comparações quantitativas entre condições, esses valores devem ser definidos na condição DMSO e permanecer constantes durante todo o experimento. O CCCP induz despolarização mitocondrial e perda do potencial de membrana, resultando em uma intensidade reduzida de fluorescência TMRE. Portanto, os experimentos de controle apresentaram a maior intensidade de TMRE, e os valores de ganho e intensidade foram ajustados próximos à saturação. Em contraste, níveis mais elevados de superóxido aumentam a intensidade da MitoSOX. Portanto, o controle apresentou a menor intensidade de fluorescência da MitoSOX, e os valores de ganho e intensidade foram reduzidos quando um sinal fraco estava presente. Como MitoTracker, TMRE e MitoSOX são corantes vitais e rotulam todas as células, eles não devem ser usados ao selecionar células para imageamento. Em vez disso, as células foram selecionadas com base no sinal YFP para garantir que fossem transfectadas. Imagens em plano único foram adquiridas, focalizando o fundo da célula HeLa, onde uma grande população de mitocôndrias estava localizada.

Quantificação da intensidade de fluorescência TMRE e MitoSOX
A quantificação das intensidades de fluorescência TMRE e MitoSOX foi analisada usando o ImageJ (Figura 3). Um ROI de 6 mícrons x 6 mícrons foi criado e armazenado no gerenciador de ROI. A ROI foi colocada em cinco regiões aleatórias não sobrepostas de cada célula para medir a intensidade de TMRE ou MitoSOX. A intensidade da fluorescência corresponde ao valor médio de cinza no ImageJ. Os cinco valores de intensidade foram calculados em média para cada célula para calcular a intensidade média de fluorescência por célula. Esses valores foram plotados e analisados quanto à significância estatística entre as condições de tratamento.

Os resultados para as intensidades de fluorescência TMRE e MitoSOX são mostrados na Figura 4 e Figura 5, respectivamente. Como esperado, o tratamento com o conhecido agente desacoplador CCCP diminuiu a intensidade da fluorescência TMRE em comparação com as condições de controle (Figura 4A,B). Além disso, o tratamento CCCP severo (20 μM) induziu a produção de superóxido e aumentou a intensidade de fluorescência da MitoSOX (Figura 5A,B). Em condições leves (5 μM) de estresse CCCP, a expressão de ParkinWT e ParkinT240R resultou em maior intensidade de TMRE em comparação com o vetor de controle YFP vazio. Da mesma forma, a intensidade da MitoSOX foi menor nas células que expressam ParkinWT e ParkinT240R em comparação com as células que expressam o vetor controle YFP (Figura 5A,B). Estes resultados sugerem que a expressão de Parkin ajuda a manter a saúde da rede mitocondrial, preservando maiores potenciais de membrana mitocondrial e baixos níveis de superóxido. Assim, o protocolo aqui descrito pode ser usado para comparar com precisão a intensidade da fluorescência para analisar o papel de Parkin no controle do potencial de membrana mitocondrial e na formação de superóxido.

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho experimental . (A) Esquema do fluxo de trabalho experimental usado para transfectar, tratar com CCCP e marcar a rede mitocondrial, e imagem TMRE e intensidade de fluorescência MitoSOX em células HeLa. (B) Imagens representativas de células expressando um vetor YFP vazio (acima), YFP-ParkinWT (meio) e YFP-ParkinT240R (abaixo; magenta). Hoechst 33342 (branco) é usado para rotular o DNA. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: CCCP = cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona; TMRE = tetrametilrodamina-éster-perclorato de etila; YFP = proteína fluorescente amarela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: A interface do usuário para configurar as configurações de aquisição confocal . (A) Caixa de diálogo Configurações do laser. O retângulo vermelho destaca o laser de luz branca, o estado de potência, a potência do laser e os comprimentos de onda. (B) Canal experimental configurado para um experimento MitoSOX. As configurações, linhas de excitação e janelas de espectros de emissão são mostradas para YFP, MitoSOX e MitoTracker. (C) As configurações de aquisição mostram o formato, a velocidade, a bidirecionalidade, a fase X, o fator de zoom e a média das linhas. (D) Imagem adquirida representativa. As células HeLa estão expressando YFP (magenta), e as mitocôndrias são marcadas com MitoSOX (verde) e MitoTracker (ciano). Barra de escala = 10 μm. Abreviações: WLL = laser de luz branca; YFP = proteína fluorescente amarela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Fluxo de trabalho do ImageJ para quantificar as intensidades de fluorescência TMRE e MitoSOX. (A) O painel gerenciador de ROI com um exemplo de ROI no ImageJ. (B) Painel de opções de importação de bioformatos. O retângulo vermelho realça a opção Dividir canais que deve ser selecionada. (C) Parâmetros de configurações de brilho e contraste. (D) Definir parâmetro de medição. Os retângulos vermelhos realçam as opções de valor de área e Média de valores cinza que devem ser selecionadas. (E) Imagem representativa de uma célula HeLa marcada com MitoSOX. O quadrado vermelho ilustra a ROI do painel A. Barra de escala = 10 μm. (F) Painel de resultados mostrando a área experimental e os valores médios de cinza das ROIs. O valor médio de cinza (laranja) representa os valores de intensidade de fluorescência. Abreviaturas: TMRE = tetrametilrodamina-éster-perclorato de etila; ROI = região de interesse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Intensidade da fluorescência TMRE após dano mitocondrial. (A) Imagens representativas de células HeLa após um tratamento de 2 h com DMSO, CCCP 5 μM ou CCCP 20 μM para induzir dano mitocondrial. As células expressam exogenamente um vetor YFP vazio, YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R (magenta), e marcadas com MitoTracker (ciano) e TMRE (verde). Barra de escala = 30 μm. (B) Quantificação da intensidade de fluorescência TMRE para células que expressam vetor YFP vazio (azul), YFP-ParkinWT (laranja) e YFP-ParkinT240R (roxo) em condições tratadas com DMSO e CCCP. p < 0,0001 por ANOVA two-way com teste de comparações múltiplas. (C-E) A quantificação das intensidades de fluorescência TMRE do painel B é separada para destacar diferenças em DMSO (C), 5 μM CCCP (D) e 20 μM CCCP (E). * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001 pela ANOVA de Kruskal-Wallis com teste de comparações múltiplas de Dunn. Ns = não significativo. Média ± EPM; n= 79-104 de três réplicas biológicas independentes. Abreviaturas: CCCP = cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona; TMRE = tetrametilrodamina-éster-perclorato de etila; YFP = proteína fluorescente amarela; DMSO = dimetil sulfóxido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Intensidade da fluorescência da mitoSOX após dano à rede mitocondrial. (A) Imagens representativas de células HeLa tratadas por 2 h com DMSO, 5 μM CCCP ou 20 μM CCCP para desacoplar o potencial de membrana mitocondrial. As células foram transfectadas com vetor YFP vazio, YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R (magenta) e marcadas com MitoTracker (ciano) e MitoSOX (verde). Barra de escala = 30 μm. (B) Quantificação da intensidade de fluorescência da MitoSOX para células expressando vetor YFP vazio (azul), YFP-ParkinWT (laranja) e YFP-ParkinT240R (roxo) para condições controle e tratadas. p < 0,0001 por ANOVA two-way com teste de comparações múltiplas de Dunn. (C-E) A quantificação das intensidades de fluorescência da MitoSOX do painel B é separada para destacar diferenças em DMSO (C), 5 μM CCCP (D) e 20 μM CCCP (E). *p < 0,05; p < 0,0001 pela ANOVA de Kruskal-Wallis com teste de comparações múltiplas de Dunn. Ns = não significativo. Média ± EPM; n = 87-107 de três réplicas biológicas independentes. Abreviaturas: CCCP = cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona; TMRE = tetrametilrodamina-éster-perclorato de etila; YFP = proteína fluorescente amarela; DMSO = dimetil sulfóxido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O fluxo de trabalho aqui descrito pode ser usado para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma robusta e reprodutível usando imagens baseadas em fluorescência30. Há limitações técnicas importantes a serem consideradas ao projetar esses experimentos. As células HeLa foram transfectadas com um vetor YFP vazio, YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R. O vetor YFP vazio foi usado como controle para confirmar que os achados experimentais eram específicos para Parkin. Para a transfecção transitória, uma razão de massa de 1:3 para DNA para reagente de transfecção foi determinada experimentalmente para produzir a maior taxa de transfecção, onde 2 μg de DNA plasmidial foram usados para cada construto28. Manter o YFP-tag consistente para todos os construtos foi importante, pois as proteínas fluorescentes diferem em brilho inato31,32. Se várias etiquetas de proteínas fluorescentes devem ser usadas, então proteínas fluorescentes com brilho e fotoestabilidade semelhantes devem ser selecionadas33.

Para medir o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido, dois corantes bem documentados foram selecionados. O sinal de fluorescência da TMRE é baseado no potencial de membrana mitocondrial, enquanto a intensidade de fluorescência da MitoSOX é função dos níveis de superóxido. Para imagens baseadas em fluorescência, não deve haver sobreposição espectral entre sondas fluorescentes. No entanto, o protocolo inicial foi realizado usando mCherry-ParkinWT e mCherry-ParkinT240R, que se sobrepuseram aos espectros de desvio para o vermelho de TMRE e MitoSOX. Para evitar sobreposição espectral e minimizar possíveis crosstalks, construtos Parkin marcados com YFP foram selecionados. Esse ajuste exigiu a alteração do corante MitoTracker de verde para vermelho. Além disso, a densidade de plaqueamento celular HeLa foi otimizada; inicialmente, as células HeLa foram plaqueadas a 45.000 células por prato de imagem, mas isso resultou em placas superconfluentes. A alta confluência celular pode reduzir a eficiência da transfecção, promover a morte celular e alterar o metabolismo celular34,35,36. Para evitar esses impactos potenciais, as células foram plaqueadas a uma densidade de 30.000 células por placa de imagem.

A principal limitação desse protocolo é o potencial de viés do usuário, especificamente na seleção de células e locais de ROI. O protocolo utiliza mudanças nas intensidades de fluorescência TMRE e MitoSOX como leitura funcional para os níveis de potencial de membrana e superóxido. Portanto, a seleção celular usando essas sondas poderia potencialmente enviesar os resultados experimentais. Para combater esse viés, escolhemos células baseadas apenas na expressão de YFP. ROIs não sobrepostas foram selecionadas aleatoriamente através da rede mitocondrial dentro da célula. Embora esse método tenha sido usado anteriormente para medir a intensidade da fluorescência27, medidas adicionais de redução de viés poderiam ser tomadas. Primeiro, o estudo poderia ser cegado usando as ferramentas de análise cega no ImageJ para evitar a seleção de ROI que suporta os resultados esperados. Em segundo lugar, as intensidades de fluorescência podem ser medidas usando um software avançado de análise de imagens que elimina a necessidade de ROIs.

Embora este protocolo use microscopia confocal para quantificação baseada em fluorescência, métodos adicionais, como citometria de fluxo, poderiam ser usados para quantificar alterações de fluorescência em TMRE e MitoSOX37. Aqui, usamos microscopia confocal em vez de citometria de fluxo para visualizar a morfologia da rede mitocondrial. O protocolo delineado poderia ser facilmente adaptado para medir a fluorescência de TMRE e MitoSOX com citometria de fluxo produzindo resultados experimentais semelhantes. Além disso, ensaios de taxa de consumo de oxigênio (OCR) podem ser usados para detectar mudanças na função da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial sem corantes catiônicos. Embora o OCR forneça uma medida sensível da disfunção mitocondrial, ele não é específico para o potencial de membrana ou concentração de superóxido, mas fornece uma medida global da função mitocondrial38. Esses ensaios podem ser realizados em conjunto com os experimentos TMRE e MitoSOX para avaliar a saúde mitocondrial39.

Embora este protocolo enfoque especificamente o efeito do desacoplador mitocondrial CCCP40, reagentes prejudiciais com mecanismos alternativos poderiam ser utilizados. Por exemplo, a antimicina A e a oligomicina A são inibidores da cadeia de transporte de elétrons comumente usados para induzir danos mitocondriais via produção de espécies reativas de oxigênio (EROs)38. Enquanto medimos especificamente os níveis de superóxido mitocondrial usando MitoSOX, as ROS intracelulares puderam ser medidas usando CellROX. Em células HeLa, foi necessário superexpressar Parkin devido à baixa expressão endógena. Estudos futuros poderão observar os efeitos da expressão de Parkin na saúde da rede mitocondrial utilizando sistemas de cultura celular que expressam Parkin endógeno41. Como as mitocôndrias são reguladores críticos do metabolismo energético e da homeostase celular, a disfunção mitocondrial está associada a inúmeras doenças, incluindo diabetes42, doença de Alzheimer 43,44,45, câncer 46 e doença hepática 47. Portanto, esse fluxo de trabalho poderia ser adaptado para estudar a saúde mitocondrial e a desregulação em linhagens celulares relevantes e culturas primárias.

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Disclosures

Os autores não têm interesses concorrentes a declarar.

Acknowledgments

Agradecemos aos membros do laboratório Evans por seu feedback atencioso sobre este manuscrito. Este trabalho é apoiado por Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars, e Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. A Figura 1A foi confeccionada com BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia mitocôndrias mitofagia neurodegeneração Parkin potencial de membrana mitocondrial espécies reativas de oxigênio superóxido células HeLa microscopia confocal
Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa
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Fazli, M., Evans, C. S.… More

Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).

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