Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Количественная оценка потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида на основе флуоресценции с использованием визуализации в реальном времени в клетках HeLa

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65304
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

Summary

Этот метод описывает эффективный рабочий процесс для визуализации и количественного измерения потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида в клетках HeLa с использованием флуоресцентной визуализации в реальном времени.

Abstract

Митохондрии являются динамическими органеллами, критически важными для метаболического гомеостаза, контролируя выработку энергии посредством синтеза АТФ. Для поддержки клеточного метаболизма различные механизмы контроля качества митохондрий взаимодействуют для поддержания здоровой митохондриальной сети. Одним из таких путей является митофагия, при которой PTEN-индуцированная киназа 1 (PINK1) и фосфо-убиквитинирование Паркина поврежденных митохондрий способствуют секвестрации аутофагосом и последующему удалению из клетки посредством слияния лизосом. Митофагия важна для клеточного гомеостаза, а мутации в Паркине связаны с болезнью Паркинсона (БП). В связи с этими выводами значительное внимание уделялось исследованию повреждений и оборота митохондрий, чтобы понять молекулярные механизмы и динамику контроля качества митохондрий. Здесь визуализация живых клеток использовалась для визуализации митохондриальной сети клеток HeLa, для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида после обработки карбонильным цианидом м-хлорфенилгидразоном (CCCP), митохондриальным разъединяющим агентом. Кроме того, была экспрессирована мутация паркина, связанная с болезнью Паркина (ParkinT240R), которая ингибирует паркин-зависимую митофагию, чтобы определить, как экспрессия мутантов влияет на митохондриальную сеть по сравнению с клетками, экспрессирующими паркин дикого типа. Протокол, описанный здесь, описывает простой рабочий процесс с использованием подходов, основанных на флуоресценции, для эффективной количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида.

Introduction

Митохондриальная сеть представляет собой ряд взаимосвязанных органелл, которые играют решающую роль в производстве энергии1, врожденном иммунитете2,3 и клеточной сигнализации 4,5. Митохондриальная дисрегуляция была связана с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона (БП)6,7. БП — это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, поражающее дофаминергические нейроны черной субстанции, которое поражает почти 10 миллионов человек во всем мире8. БП генетически связана с митофагией, митохондриальным путем контроля качества, необходимым для поддержания клеточного гомеостаза, который избирательно удаляет поврежденные митохондрии 9,10. Исследования выявили несколько независимых путей митофагии, включая домен FUN14, содержащий 1 (FUNDC1)-опосредованную митофагию, Bcl-2-взаимодействующий белок 3 (BNIP3)-облегченную митофагию, NIX-зависимую митофагию и хорошо охарактеризованную PTEN-индуцированную киназу 1 (PINK1)/паркин-регулируемую митофагию10,11. PINK1 (предполагаемая киназа) и Parkin (убиквитинлигаза E3) работают в тандеме с фосфо-убиквитинатом поврежденных митохондрий, что приводит к образованию аутофагосом, которые поглощают поврежденную органеллу и сливаются с лизосомами, чтобы инициировать деградацию 12,13,14,15,16. Мутации в Паркине были связаны с фенотипами, связанными с болезнью Паркина, такими как нейродегенерация из-за потери дофаминергических нейронов17,18.

Здесь описан протокол, в котором клетки HeLa, обычно используемые иммортализированные клетки, полученные из рака шейки матки, используются для исследования роли паркина в поддержании здоровья митохондриальной сети. Клетки HeLa экспрессируют незначительные уровни эндогенного паркина и, следовательно, требуют экзогенной экспрессии паркина19. Чтобы изучить роль паркина в здоровье митохондриальной сети, клетки HeLa трансфицируют либо паркином дикого типа (ParkinWT), либо мутантом паркина (ParkinT240R), либо пустым контрольным вектором. Parkin T240R представляет собой аутосомно-рецессивную мутацию ювенильного паркинсонизма, которая влияет на активность лигазы Parkin E3, значительно снижая эффективность пути митофагии20. Клетки HeLa подвергаются воздействию мягких (5 мкМ) или тяжелых (20 мкМ) концентраций карбонильного цианида м-хлорфенилгидразона (CCCP), митохондриального развязывающего агента. Лечение тяжелыми концентрациями CCCP обычно используется для индукции митофагии, опосредованной Паркином, в различных клеточных линиях, таких как клетки HeLa и COS-721,22,23.

После лечения протокол использует живую визуализацию митохондриальной сети с использованием двух доступных в настоящее время флуоресцентных красителей, нацеленных на митохондрии. Тетраметилродамин, этиловый эфир, перхлорат (TMRE) представляет собой катионный краситель, который флуоресцирует на основе потенциала митохондриальной мембраны24, в то время как MitoSOX представляет собой митохондриальный супероксидный индикатор, где интенсивность флуоресценции зависит от концентрациисупероксида 25. Наконец, описанный протокол использует количественную оценку на основе флуоресценции и простой рабочий процесс для эффективной количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида с минимальными возможностями для смещения пользователя. Хотя этот протокол был разработан для изучения функции митохондрий в клетках HeLa, он может быть адаптирован для дополнительных клеточных линий и первичных типов клеток для количественной характеристики здоровья митохондриальной сети.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка биологических образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги, используя стерильную технику в шкафу биобезопасности. Сбрызните поверхность шкафа и всех материалов 70% этанолом.

  1. Культивирование и трансфекция клеток HeLa
    1. Культивирование 30 000 клеток HeLa в модифицированной среде орла (DMEM) Дульбекко, содержащей 4,5 г/л глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% раствора L-глютамина (HeLa media; см. Таблицу материалов). Поместите ячейки на 35-миллиметровые чашки для визуализации состеклянным дном (см. Таблицу материалов), содержащую 2 мл предварительно разогретой среды HeLa. Поддерживайте культуры HeLa при 5% CO2 и 37 ° C26,27.
    2. На следующий день после нанесения покрытия осмотрите 35-миллиметровые чашки для визуализации с помощью светового микроскопа, чтобы убедиться, что клетки сливаются на ~ 50-60%. После слияния трансфицируйте клетки HeLa пустым желтым флуоресцентным белым вектором (YFP), YFP-ParkinWT или YFP-ParkinT240R (рис. 1A).
    3. Приготовьте две отдельные смеси в стерильных микроцентрифужных пробирках для каждой трансфекции. Перемешайте, постукивая по трубке или аккуратно пипетируя вверх и вниз.
      1. В пробирке 1 смешайте 200 мкл восстановленных сывороточных сред (см. Таблицу материалов) с 2 мкг плазмидной ДНК.
      2. В пробирке 2 смешайте 200 мкл восстановленной сывороточной среды с 6 мкл реагента для трансфекции (см. Таблицу материалов)28.
    4. Инкубируйте пробирки в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Добавьте пробирку 2 в пробирку 1, перемешайте пипеткой вверх и вниз и инкубируйте в течение 20 минут при RT.
    5. Добавьте комплексы трансфекции по каплям в существующие чашки для визуализации, содержащие клеточные культуры HeLa, обеспечивая равномерное распределение по всей чашке. Поместите чашки для визуализации в инкубатор с 5% CO2 и 37 °C на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пометьте каждое блюдо соответствующей трансфицированной плазмидой. Для каждого эксперимента пометьте три чашки YFP-ParkinWT (диметилсульфоксид [ДМСО; см. Таблицу материалов], 5 мкМ CCCP и 20 мкМ CCCP). Повторите маркировку с тремя тарелками YFP-ParkinT240R и тремя пустыми векторными тарелками YFP.
  2. Приготовление CCCP и флуоресцентных красителей
    ВНИМАНИЕ: Флуоресцентные красители часто чувствительны к свету. Храните красители в темноте, используя алюминиевую фольгу или коричневые центрифужные пробирки, чтобы уменьшить воздействие света.
    1. Сделайте рабочее сырье CCCP 5 мМ (см. Таблицу материалов), растворив 5 мг CCCP в 4,89 мл ДМСО. Сделайте 20 мМ рабочего материала CCCP, растворив 5 мг CCCP в 1,22 мл DMSO.
    2. Разбавьте 10 мкл исходного раствора MitoTracker Deep Red (см. Таблицу материалов) 1 мМ в 390 мкл ДМСО, чтобы получить рабочее сырье 25 мкМ.
    3. Растворите 50 мкг MitoSOX Red25 (см. Таблицу материалов) в 13 мкл ДМСО, чтобы получить рабочее тело размером 5 мМ.
    4. Растворите 10 мг TMRE24 (см. Таблицу материалов) в 19,4 мл ДМСО, чтобы получить исходный раствор 1 мМ. Разбавьте TMRE, добавив 10 мкл 1 мМ TMRE в 990 мкл ДМСО, чтобы получить рабочее тело 10 мкМ.

2. Лечение CCCP и метечка митохондрий флуоресцентными зондами в клетках HeLa

ВНИМАНИЕ: Быстро выполните следующие шаги, чтобы убедиться, что клетки HeLa не находятся вне инкубатора в течение длительного периода времени.

  1. На следующий день после трансфекции добавьте 2 мкл 5 или 20 мМ CCCP (конечная концентрация: 5 мкМ и 20 мкМ соответственно) к каждой экспериментальной пластине. Для контрольных пластин добавьте 2 мкл ДМСО. Верните планшеты в инкубатор с 5% CO2 и 37 °C в течение 1,5 ч (рис. 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение CCCP длится в общей сложности 2 часа. Тем не менее, митохондрии помечаются флуоресцентными зондами в течение последних 30 минут лечения CCCP.
  2. Через 1,5 часа выньте пластины из инкубатора и добавьте флуоресцентные зонды в чашки для визуализации. Верните планшеты в инкубатор с 5% CO2 и 37 °C на 30 мин (рис. 1A).
    1. Эксперимент TMRE: добавьте 2 мкл 25 мкМ MitoTracker (конечная концентрация: 25 нМ) и 2 мкл 10 мкМ TMRE (конечная концентрация: 10 нМ).
    2. Эксперимент MitoSOX: добавьте 2 мкл 25 мкМ MitoTracker (конечная концентрация: 25 нМ) и 1 мкл 5 мМ MitoSOX (конечная концентрация: 2,5 мкМ).
  3. После 2-часового лечения CCCP подготовьте клетки HeLa к визуализации (рис. 1A, B).
    1. Эксперимент TMRE: клетки HeLa сразу готовы к визуализации; убедитесь, что TMRE остается в среде для культивирования клеток HeLa.
    2. Эксперимент MitoSOX: Промойте клетки 3 раза 2 мл предварительно разогретого носителя HeLa, чтобы удалить свободный краситель MitoSOX. Добавьте 2 мл предварительно разогретой среды. Теперь клетки HeLa готовы к съемке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промойте клетки HeLa свежим, предварительно подогретым носителем HeLa, который содержит ту же концентрацию DMSO или CCCP, что и в экспериментальных условиях; не включайте MitoSOX или MitoTracker.

3. Настройка получения изображений конфокального микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение клеток HeLa с помощью конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов), оснащенного масляным иммерсионным объективом с 63x/1,40 числовой апертурой (NA) и камерой для окружающей среды (см. Таблицу материалов).

  1. За 1 ч до визуализации включите CO2, открыв клапан резервуара. Нажмите кнопку «Вкл.», чтобы включить контроллер окружающей среды для микроскопа. Используйте стрелки вверх и вниз на сенсорной панели, чтобы отрегулировать температуру до 37 °C и CO2 до 5%. Нажмите «Установить», когда закончите.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что двери в экологическую камеру закрыты, и дождитесь стабилизации условий.
  2. Настройки лазера
    1. Включите лазер белого света (WLL) и установите мощность лазера на 85% и регулятор возбуждения на максимальную мощность. Перейдите на вкладку « Приобрести », выберите « Добавить лазер» и в появившемся диалоговом окне переключите WLL в положение «Вкл.». Нажмите кнопку « Мощность лазера » и введите 85%. Нажмите кнопку «Управление возбуждением » и выберите « Максимальная мощность » в раскрывающемся меню (рис. 2A).
    2. Эксперимент TMRE: Установите спектры возбуждения и излучения для YFP, MitoTracker и TMRE.
      1. Для YFP установите лазер возбуждения на 514 нм и окно спектров излучения на 524-545 нм. На вкладке «Получить» нажмите кнопку «Добавить новую настройку»; затем нажмите «Добавить лазер» и перетащите его в «Настройка 1». Дважды щелкните линию возбуждения и введите 514 в качестве длины волны в диалоговом окне. Дважды кликните по соответствующему детектору и введите 524 для начала и 545 для конечной длины волны.
      2. Для MitoTracker Deep Red установите лазер возбуждения на 641 и окно спектров излучения на 650-750 нм. На вкладке «Приобретение» нажмите кнопку «Добавить лазер» и перетащите ее в параметр 1. Дважды щелкните линию возбуждения и введите 641 в качестве длины волны в диалоговом окне. Дважды кликните по соответствующему детектору и введите 650 для начала и 750 для конечной длины волны.
      3. Для TMRE установите лазер возбуждения на 555 нм и окно спектров излучения на 557-643 нм. На вкладке «Получить» нажмите кнопку «Добавить новую настройку»; затем нажмите кнопку «Добавить лазер» и перетащите его в Настройка 2. Дважды щелкните линию возбуждения и введите 555 в качестве длины волны в диалоговом окне. Дважды щелкните по соответствующему детектору и введите 557 для начала и 643 для конечной длины волны.
    3. Эксперимент MitoSOX: Установите спектры возбуждения и излучения для YFP, MitoTracker и MitoSOX (рис. 2B).
      1. Для YFP установите лазер возбуждения на 507 нм и окно спектров излучения на 517-540 нм. На вкладке «Получить» нажмите кнопку «Добавить новую настройку»; затем нажмите кнопку «Добавить лазер» и перетащите ее в Настройка 1. Дважды щелкните линию возбуждения и введите 507 в качестве длины волны в диалоговом окне. Дважды кликните по соответствующему детектору и введите 517 для начала и 540 для конечной длины волны.
      2. Для MitoSOX установите лазер возбуждения на 547 нм и окно спектров излучения на 564-636 нм. На вкладке «Получить » нажмите кнопку « Добавить новую настройку »; затем нажмите кнопку «Добавить лазер » и перетащите его в Настройка 2. Дважды щелкните линию возбуждения и введите 547 в качестве длины волны в диалоговом окне. Дважды щелкните по соответствующему детектору и введите 564 для начала и 636 для конечной длины волны.
      3. Для MitoTracker Deep Red установите лазер возбуждения на 641 нм и окно спектров излучения на 652-742 нм. На вкладке «Получить» нажмите кнопку «Добавить новую настройку»; нажмите кнопку «Добавить лазер» и перетащите его в настройку 3. Дважды щелкните линию возбуждения и введите 641 в качестве длины волны в диалоговом окне. Дважды щелкните по соответствующему детектору и введите 652 для начала и 742 для конечной длины волны.
  3. Настройки получения изображения (рис. 2C)
    1. Установите формат 1,024 x 1,024, скорость сканирования 600 Гц и среднее значение строки 3.
      1. Выберите вкладку «Приобретение» и нажмите кнопку «Формат ». В раскрывающемся меню выберите 1,024 x 1,024. Нажмите кнопку «Скорость » и выберите 600 в раскрывающемся меню. Затем нажмите кнопку «Среднее по линии » и в раскрывающемся меню выберите 3.
      2. Включите двунаправленное сканирование и установите фазу и коэффициент масштабирования на 22,61 и 1,50 соответственно.
        1. На вкладке «Приобретение» переключите двунаправленную кнопку в положение «Вкл.». Нажмите на настройку фазы X и установите ее на 22.61. Нажмите на настройку Zoom Factor и установите ее на 1.50.

4. Получение изображения

ВНИМАНИЕ: Экспериментатор должен сделать визуальное суждение, чтобы выбрать клетки на основе сигнала флуоресценции YFP. Избегайте перенасыщенных пикселей, так как они могут существенно повлиять на количественную оценку интенсивности флуоресценции. Используйте таблицу подстановки «больше/меньше», указывающую насыщенность пикселей, чтобы избежать получения насыщенных изображений.

  1. Нажмите на интересующую настройку и нажмите Fast Live, чтобы обеспечить предварительный просмотр флуоресцентного изображения в реальном времени.
  2. Отрегулируйте усиление и интенсивность, дважды щелкнув по соответствующему детектору. В появившемся диалоговом окне отрегулируйте усиление с помощью ползунка. Чтобы изменить интенсивность, дважды щелкните линию возбуждения и используйте стрелки вверх и вниз во всплывающем окне, чтобы изменить интенсивность. Нажмите кнопку Остановить, чтобы завершить предварительный просмотр.
    1. Эксперимент TMRE: сначала сфотографируйте контрольную пластину DMSO. Отрегулируйте усиление и интенсивность сигнала TMRE (настройка 2) так, чтобы интенсивность митохондриальной сети была чуть ниже насыщения; Сохраняйте усиление и интенсивность постоянными для эксперимента. Отрегулируйте усиление и интенсивность MitoTracker и YFP (настройка 1) так, чтобы митохондриальная сеть была видимой, но тусклой.
    2. Эксперимент MitoSOX: сначала сфотографируйте контрольную пластину DMSO. Отрегулируйте усиление и интенсивность сигнала MitoSOX (настройка 2) так, чтобы флуоресценция была видимой, но тусклой; Сохраняйте усиление и интенсивность постоянными для эксперимента. Отрегулируйте усиление и интенсивность YFP (настройка 1) и MitoTracker (настройка 3) так, чтобы митохондриальная сеть была видимой, но тусклой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите усиление и интенсивность TMRE и MitoSOX, так как эти значения должны оставаться постоянными на протяжении всего эксперимента. Флуоресцентные сигналы YFP и MitoTracker не количественно оцениваются в этом протоколе. Таким образом, усиление и интенсивность можно регулировать для каждого изображения. Наиболее эффективно иметь настройки усиления и интенсивности, при которых клетки хорошо видны, но все еще тусклые, чтобы гарантировать, что клетки не подвергаются чрезмерной интенсивности лазера, которая вызывает повреждение клеток или фотообесцвечивание.
  3. После завершения настройки усиления и интенсивности нажмите « Пуск », чтобы получить изображение. Получение изображений 20 ячеек в каждом экспериментальном условии (например, пять изображений с четырьмя ячейками на изображение; Рисунок 2D).

5. Количественная оценка интенсивности флуоресценции с использованием ImageJ

ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы изображений сохраняются в формате «.lif» и совместимы с ImageJ29. Типы файлов, совместимые с ImageJ, указаны на их веб-сайте. Может потребоваться преобразовать тип файла, если он несовместим.

  1. Создайте и сохраните интересующий регион (ROI).
    1. В ImageJ выберите Файл | Новинки | Рис. В появившемся диалоговом окне нажмите кнопку ОК.
    2. Нажмите кнопку «Прямоугольник» и нарисуйте рамку размером 6 микрон x 6 микрон. Откройте менеджер ROI, нажав «Анализировать» | Инструменты | ROI Manager и дождитесь появления диалогового окна с ROI manager (рисунок 3A). Добавьте прямоугольную рентабельность инвестиций для менеджера, нажав кнопку Добавить в диалоговом окне менеджера. Сохраните рентабельность инвестиций, выбрав «Еще», затем нажмите кнопку «Сохранить» и «ОК».
  2. Измерьте интенсивность флуоресценции.
    1. На изображении J нажмите « Файл» и выберите « Открыть». В диалоговом окне выберите файлы изображений для эксперимента и нажмите кнопку Открыть.
    2. Дождитесь появления окна Bio-formats Import Options (рисунок 3B). Выберите «Разделить каналы » и нажмите «Открыть».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функция разделения каналов позволяет открывать каждый канал на изображении как отдельное окно. Канальный ордер соответствует ордеру на приобретение.
      1. Эксперименты TMRE : YFP (настройка 1) - первый канал (c = 0); MitoTracker (Настройка 1) - второй канал (c = 1); и TMRE (настройка 2) - третий канал (c = 2).
      2. Эксперименты MitoSOX : YFP (настройка 1) - первый канал (c = 0); MitoSOX (настройка 2) - второй канал (c = 1); и MitoTracker (настройка 3) - третий канал (c = 2).
    3. Отрегулируйте яркость, выбрав «Изображение» | Отрегулируйте | Яркость (рис. 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не нажимайте «Установить» или «Применить», чтобы яркость изображения не изменилась навсегда. Иногда интенсивность флуоресценции не видна в каналах TMRE или MitoSOX. Отрегулируйте яркость, чтобы упростить визуализацию. Изменение яркости не влияет на исходные значения интенсивности флуоресценции.
    4. Нажмите «Анализировать» и выберите «Установить измерения». Установите флажки Area (Площадь) и Среднее значение серого (Mean gray) и нажмите OK (рисунок 3D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее значение серого - это интенсивность флуоресценции.
    5. Откройте ROI Manager и загрузите ROI , сохраненный на шаге 5.1, нажав «Анализировать» | Инструменты | Менеджер по рентабельности инвестиций. В диспетчере рентабельности инвестиций нажмите «Еще», затем « Открыть» в появившемся списке и выберите сохраненную рентабельность инвестиций.
    6. Измерьте интенсивность флуоресценции пяти случайных областей в одной ячейке, выбрав сохраненную рентабельность инвестиций в диспетчере рентабельности инвестиций, и переместите рентабельность инвестиций в случайное место в ячейке (рис. 3E). Измерьте интенсивность флуоресценции, нажав клавишу M. Повторите этот шаг с четырьмя дополнительными неперекрывающимися областями. Когда появится диалоговое окно со значениями площади и среднего значения серого (рис. 3F), скопируйте и вставьте значения в электронную таблицу для анализа.
      1. Эксперимент TMRE : выберите изображение (c = 2).
      2. Эксперимент MitoSOX : выберите изображение (c = 2).
    7. Получите средние значения интенсивности флуоресценции. Используя программное обеспечение для работы с электронными таблицами (см. Таблицу материалов), усредните пять средних значений серого. Повторите этот процесс для каждой ячейки.
    8. Проанализируйте и сравните средние значения серого TMRE или MitoSOX в экспериментальных условиях с помощью статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалов; Рисунок 4 и рисунок 5). Представляйте данные в виде гистограмм или скрипичных графиков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом протоколе количественное определение на основе флуоресценции использовалось для измерения мембранного потенциала и уровней супероксида митохондриальной сети после обработки CCCP (рис. 1). В этом рабочем процессе использовались клетки HeLa, иммортализированная клеточная линия, полученная из рака шейки матки. Клетки HeLa обычно используются для изучения митохондриальной биологии и являются относительно плоскими, что позволяет легко визуализировать митохондриальную сеть с помощью микроскопии. Чтобы исследовать роль паркина в поддержании здоровья митохондриальной сети, клетки HeLa были временно трансфицированы пустым контрольным вектором,Parkin WT или ParkinT240R (мутантом, нарушающим митофагию)21. Клетки HeLa были помещены в 35-миллиметровые чашки со стеклянным дном и трансфицированы после достижения ~ 50% -60% слияния (рис. 1A). Поскольку клетки HeLa быстро делятся, обычно это происходит на следующий день после того, как клетки помещаются в чашки для визуализации. На следующий день для наблюдения за сигналом флуоресценции YFP использовался световой микроскоп для оценки эффективности трансфекции. Эксперименты проводились только после успешной трансфекции.

После осмотра клетки HeLa обрабатывали слабыми (5 мкМ) или тяжелыми (20 мкМ) концентрациями CCCP для деполяризации митохондриальной сети (на шаге 1.2 показаны подробные инструкции по приготовлению CCCP и флуоресцентных зондов). Лечение CCCP проводилось в общей сложности 2 часа. В течение последних 30 минут лечения CCCP митохондрии были помечены MitoTracker и TMRE / MitoSOX (рис. 1A). Следует отметить, что TMRE и MitoSOX имеют перекрывающиеся спектры флуоресценции и не могут использоваться одновременно. Вместо этого мы использовали отдельные антенны для визуализации для экспериментов TMRE и MitoSOX. Для экспериментов TMRE клетки HeLa были немедленно готовы к визуализации в конце 2-часового лечения CCCP. Концентрация TMRE должна оставаться постоянной; поэтому TMRE остался в средствах массовой информации HeLa. Тем не менее, свободный MitoSOX должен быть удален перед визуализацией. Для экспериментов MitoSOX клетки трижды промывали средой HeLa, чтобы удалить свободный краситель. Для этого этапа важно использовать среду HeLa, содержащую ту же концентрацию DMSO или CCCP, что и в экспериментальных условиях. Hoechst 33342, маркер ядер, первоначально использовался для оценки клеток HeLa после транзиторной трансфекции и лечения CCCP (рис. 1B).

Впоследствии была проведена конфокальная микроскопия для визуализации интенсивности флуоресценции TMRE и MitoSOX, для измерения потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида соответственно. Изображения были получены с помощью 63-кратного (1,4 NA) масляного иммерсионного объектива с параметрами двунаправленного сканирования, пространственным разрешением 1,024 x 1,024 пикселей, скоростью сканирования 600 Гц, усреднением линий 3, фазой 22.61 и коэффициентом увеличения 1.5 (рис. 2C). Контрольная пластина DMSO была изображена первой для всех экспериментов, чтобы установить значения усиления и интенсивности для TMRE и MitoSOX. Чтобы провести количественные сравнения в разных условиях, эти значения должны быть установлены в условии ДМСО и оставаться постоянными на протяжении всего эксперимента. CCCP индуцирует митохондриальную деполяризацию и потерю мембранного потенциала, что приводит к снижению интенсивности флуоресценции TMRE. Поэтому контрольные эксперименты имели самую высокую интенсивность TMRE, а значения усиления и интенсивности были установлены близко к насыщению. Напротив, более высокие уровни супероксида увеличивают интенсивность MitoSOX. Следовательно, контроль имел самую низкую интенсивность флуоресценции MitoSOX, а значения усиления и интенсивности были установлены низкими там, где присутствовал тусклый сигнал. Поскольку MitoTracker, TMRE и MitoSOX являются жизненно важными красителями и маркируют все клетки, их не следует использовать при выборе клеток для изображения. Вместо этого клетки были выбраны на основе сигнала YFP, чтобы убедиться, что они были трансфицированы. Были получены одноплоскостные изображения, сосредоточенные на дне клетки HeLa, где находилась большая популяция митохондрий.

Количественная оценка интенсивности флуоресценции TMRE и MitoSOX
Количественная оценка интенсивности флуоресценции TMRE и MitoSOX была проанализирована с помощью ImageJ (рис. 3). Окупаемость инвестиций 6 микрон x 6 микрон была создана и сохранена в менеджере ROI. ROI был помещен в пять случайных неперекрывающихся областей каждой ячейки для измерения интенсивности TMRE или MitoSOX. Интенсивность флуоресценции соответствует среднему значению серого в ImageJ. Пять значений интенсивности были усреднены для каждой ячейки, чтобы рассчитать среднюю интенсивность флуоресценции на клетку. Эти значения были построены на графике и проанализированы на предмет статистической значимости в зависимости от условий лечения.

Результаты для интенсивности флуоресценции TMRE и MitoSOX показаны на рисунках 4 и 5 соответственно. Как и ожидалось, обработка известным развязывающим агентом CCCP снижала интенсивность флуоресценции TMRE по сравнению с контрольными условиями (рис. 4A, B). Кроме того, тяжелая (20 мкМ) обработка CCCP индуцировала образование супероксида и увеличивала интенсивность флуоресценции MitoSOX (рис. 5A, B). В легких (5 мкМ) стрессовых условиях CCCP экспрессия ParkinWT и ParkinT240R приводила к более высокой интенсивности TMRE по сравнению с пустым контрольным вектором YFP. Точно так же интенсивность MitoSOX была ниже в клетках, экспрессирующих ParkinWT иParkin T240R , по сравнению с клетками, экспрессирующими контрольный вектор YFP (рис. 5A, B). Эти результаты свидетельствуют о том, что экспрессия паркина помогает поддерживать здоровье митохондриальной сети, сохраняя более высокие мембранные потенциалы митохондрий и низкие уровни супероксида. Таким образом, протокол, изложенный здесь, может быть использован для точного сравнения интенсивности флуоресценции для анализа роли паркина в контроле потенциала митохондриальной мембраны и образовании супероксида.

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальный рабочий процесс . (A) Схема экспериментального рабочего процесса, используемого для трансфекции, обработки CCCP и маркировки митохондриальной сети, а также изображения интенсивности флуоресценции TMRE и MitoSOX в клетках HeLa. (B) Репрезентативные изображения клеток, экспрессирующих пустой вектор YFP (вверху), YFP-ParkinWT (посередине) и YFP-ParkinT240R (внизу; пурпурный). Hoechst 33342 (белый) используется для маркировки ДНК. Масштабная линейка = 10 мкм. Сокращения: CCCP = карбонильный цианид м-хлорфенилгидразон; TMRE = тетраметилродамин-этиловый эфир-перхлорат; YFP = желтый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Пользовательский интерфейс для настройки параметров конфокального сбора данных. (A) Диалоговое окно "Настройки лазера". Красный прямоугольник выделяет лазер белого света, состояние питания, мощность лазера и длины волн. (B) Экспериментальный канал, созданный для эксперимента MitoSOX. Настройки, линии возбуждения и окна спектров излучения показаны для YFP, MitoSOX и MitoTracker. (C) Настройки сбора данных показывают формат, скорость, двунаправленность, фазу X, коэффициент масштабирования и среднее значение линии. (D) Представитель получил изображение. Клетки HeLa экспрессируют YFP (пурпурный), а митохондрии помечены MitoSOX (зеленый) и MitoTracker (голубой). Масштабная линейка = 10 мкм. Сокращения: WLL = лазер белого света; YFP = желтый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Рабочий процесс ImageJ для количественной оценки интенсивности флуоресценции TMRE и MitoSOX . (A) Панель менеджера ROI с примером ROI в ImageJ. (B) Панель параметров импорта биоформатов. Красный прямоугольник выделяет параметр «Разделить каналы », который следует выбрать. (C) Параметры настройки яркости и контрастности. (D) Установите параметр измерений. Красными прямоугольниками выделены параметры «Область » и « Среднее серое значение », которые следует выбрать. (E) Репрезентативное изображение клетки HeLa, меченной MitoSOX. Красный квадрат иллюстрирует ROI с панели A. Масштабная линейка = 10 мкм. (F) Панель результатов, показывающая экспериментальную область и средние значения серого цвета из ROI. Среднее значение серого (оранжевый) представляет собой значения интенсивности флуоресценции. Сокращения: TMRE = тетраметилродамин-этиловый эфир-перхлорат; ROI = регион интереса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Интенсивность флуоресценции TMRE после повреждения митохондрий. (A) Репрезентативные изображения клеток HeLa после 2-часовой обработки ДМСО, 5 мкМ CCCP или 20 мкМ CCCP для индуцирования повреждения митохондрий. Клетки экзогенно экспрессируют пустой вектор YFP, YFP-ParkinWT или YFP-ParkinT240R (пурпурный) и помечены MitoTracker (голубой) и TMRE (зеленый). Масштабная линейка = 30 мкм. (B) Количественная оценка интенсивности флуоресценции TMRE для клеток, экспрессирующих пустой вектор YFP (синий), YFP-ParkinWT (оранжевый) и YFP-ParkinT240R (фиолетовый) в условиях, обработанных DMSO и CCCP. p < 0,0001 с помощью двустороннего ANOVA с многократным сравнительным тестом. (С-Е) Количественная оценка интенсивности флуоресценции TMRE с панели B отделяется, чтобы подчеркнуть различия в ДМСО (C), 5 мкМ CCCP (D) и 20 мкМ CCCP (E). * p < 0,05; р < 0,001; p < 0,0001 по Крускалу-Уоллису ANOVA с тестом множественного сравнения Данна. Ns = незначительно. Среднее ± SEM; n = 79-104 из трех независимых биологических реплик. Сокращения: CCCP = карбонильный цианид м-хлорфенилгидразон; TMRE = тетраметилродамин-этиловый эфир-перхлорат; YFP = желтый флуоресцентный белок; ДМСО = диметилсульфоксид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Интенсивность флуоресценции MitoSOX после повреждения митохондриальной сети. (A) Репрезентативные изображения клеток HeLa, обработанных в течение 2 часов ДМСО, 5 мкМ CCCP или 20 мкМ CCCP для разъединения мембранного потенциала митохондрий. Клетки трансфицировали пустым вектором YFP, YFP-ParkinWT или YFP-ParkinT240R (пурпурный) и помечали MitoTracker (голубой) и MitoSOX (зеленый). Масштабная линейка = 30 мкм. (B) Количественная оценка интенсивности флуоресценции MitoSOX для клеток, экспрессирующих пустой вектор YFP (синий), YFP-ParkinWT (оранжевый) и YFP-ParkinT240R (фиолетовый) для контрольных и обработанных условий. p < 0,0001 с помощью двустороннего ANOVA с множественным сравнительным тестом Данна. (С-Е) Количественная оценка интенсивности флуоресценции MitoSOX с панели B отделяется, чтобы подчеркнуть различия в ДМСО (C), 5 мкМ CCCP (D) и 20 мкМ CCCP (E). *p < 0,05; p < 0,0001 по Крускалу-Уоллису ANOVA с множественным сравнительным тестом Данна. Ns = незначительно. Среднее ± SEM; n = 87-107 из трех независимых биологических реплик. Сокращения: CCCP = карбонильный цианид м-хлорфенилгидразон; TMRE = тетраметилродамин-этиловый эфир-перхлорат; YFP = желтый флуоресцентный белок; ДМСО = диметилсульфоксид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Рабочий процесс, описанный здесь, может быть использован для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида надежно и воспроизводимо с использованием флуоресцентной визуализации30. Существуют важные технические ограничения, которые следует учитывать при разработке этих экспериментов. Клетки HeLa трансфицировали пустым вектором YFP, YFP-ParkinWT или YFP-ParkinT240R. Пустой вектор YFP был использован в качестве контроля, чтобы подтвердить, что экспериментальные результаты были специфичны для Паркина. Для переходной трансфекции экспериментально было определено отношение масс 1:3 для ДНК к реагенту трансфекции, чтобы получить самую высокую скорость трансфекции, где для каждой конструкции28 использовали 2 мкг плазмидной ДНК. Важно было сохранить согласованность YFP-метки для всех конструкций, поскольку флуоресцентные белки различаются по врожденной яркости31,32. Если необходимо использовать несколько флуоресцентных белковых меток, то следует выбирать флуоресцентные белки с аналогичной яркостью и фотостабильностью33.

Для измерения потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида были выбраны два хорошо документированных красителя. Сигнал флуоресценции TMRE основан на потенциале митохондриальной мембраны, в то время как интенсивность флуоресценции MitoSOX зависит от уровней супероксида. Для флуоресцентной визуализации не должно быть спектрального перекрытия между флуоресцентными зондами. Однако первоначальный протокол был выполнен с использованием mCherry-ParkinWT и mCherry-ParkinT240R, которые перекрывались со спектрами TMRE и MitoSOX с красным смещением. Чтобы избежать спектрального перекрытия и свести к минимуму потенциальные перекрестные помехи, были выбраны конструкции Паркина, помеченные YFP. Эта корректировка потребовала изменения цвета MitoTracker с зеленого на ярко-красный. Кроме того, была оптимизирована плотность покрытия клеток HeLa; Первоначально клетки HeLa были покрыты 45 000 клеток на чашку визуализации, но это привело к чрезмерному сливу блюд. Высокое слияние клеток может снижать эффективность трансфекции, способствовать гибели клеток и изменять клеточный метаболизм34,35,36. Чтобы избежать этих потенциальных воздействий, клетки были покрыты плотностью 30 000 клеток на чашку визуализации.

Основным ограничением этого протокола является возможность предвзятости пользователя, особенно при выборе ячеек и мест окупаемости инвестиций. Протокол использует изменения интенсивности флуоресценции TMRE и MitoSOX в качестве функционального считывания мембранного потенциала и уровней супероксида. Таким образом, отбор клеток с использованием этих зондов потенциально может повлиять на результаты эксперимента. Чтобы бороться с этой предвзятостью, мы выбрали клетки, основанные исключительно на экспрессии YFP. Неперекрывающиеся ROI были случайным образом выбраны в митохондриальной сети в клетке. Хотя этот метод ранее использовался для измерения интенсивности флуоресценции27, могут быть приняты дополнительные меры по снижению смещения. Во-первых, исследование может быть ослеплено с помощью инструментов слепого анализа в ImageJ, чтобы предотвратить выбор ROI, который поддерживает ожидаемые результаты. Во-вторых, интенсивность флуоресценции может быть измерена с помощью передового программного обеспечения для анализа изображений, которое устраняет необходимость в окупаемости инвестиций.

Хотя в этом протоколе используется конфокальная микроскопия для количественного определения на основе флуоресценции, дополнительные методы, такие как проточная цитометрия, могут быть использованы для количественной оценки изменений флуоресценции в TMRE и MitoSOX37. Здесь мы использовали конфокальную микроскопию, а не проточную цитометрию, чтобы визуализировать морфологию митохондриальной сети. Изложенный протокол может быть легко адаптирован для измерения флуоресценции TMRE и MitoSOX с помощью проточной цитометрии, дающей аналогичные экспериментальные результаты. Кроме того, анализы скорости потребления кислорода (OCR) могут быть использованы для обнаружения изменений функции митохондриальной цепи переноса электронов без катионных красителей. В то время как OCR обеспечивает чувствительную меру митохондриальной дисфункции, он не является специфическим для мембранного потенциала или концентрации супероксида, а вместо этого обеспечивает глобальную меру митохондриальной функции38. Эти анализы могут быть выполнены в сочетании с экспериментами TMRE и MitoSOX для оценки здоровья митохондрий39.

Хотя в этом протоколе особое внимание уделяется влиянию митохондриального разъединителя CCCP40, можно использовать повреждающие реагенты с альтернативными механизмами. Например, антимицин А и олигомицин А являются ингибиторами цепи переноса электронов, обычно используемыми для индукции повреждения митохондрий посредством производства активных форм кислорода (АФК)38. В то время как мы специально измеряли уровни митохондриального супероксида с помощью MitoSOX, внутриклеточные АФК можно было измерить с помощью CellROX. В клетках HeLa необходимо было сверхэкспрессировать паркин из-за низкой эндогенной экспрессии. В будущих исследованиях можно было бы наблюдать влияние экспрессии паркина на здоровье митохондриальной сети с использованием систем клеточных культур, которые экспрессируют эндогенный паркин41. Поскольку митохондрии являются важнейшими регуляторами энергетического обмена и клеточного гомеостаза, митохондриальная дисфункция связана с многочисленными заболеваниями, включая диабет 42, болезнь Альцгеймера 43,44,45, рак46 и заболевание печени 47. Таким образом, этот рабочий процесс может быть адаптирован для изучения здоровья митохондрий и нарушения регуляции в соответствующих клеточных линиях и первичных культурах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конкурирующих интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

Мы благодарим сотрудников лаборатории Эванса за их вдумчивые отзывы об этой рукописи. Эта работа поддерживается стипендиатами Дьюка Уайтхеда, учеными в области науки и техники Дьюка и стипендией Ханны Грей Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI). Рисунок 1А был сделан с использованием BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).

Tags

Биология выпуск 195 митохондрии митофагия нейродегенерация Паркин мембранный потенциал митохондрий активные формы кислорода супероксид клетки HeLa конфокальная микроскопия
Количественная оценка потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида на основе флуоресценции с использованием визуализации в реальном времени в клетках HeLa
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fazli, M., Evans, C. S.… More

Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter