Summary
Ce protocole présente un système optimisé d’essais biologiques sur feuilles détachées pour évaluer l’efficacité des champignons entomopathogènes (FPE) contre le puceron de la moutarde (Lipaphis erysimi (Kalt.)), un insecte parthénogénétique. La méthode décrit le processus de collecte de données au cours des expériences sur les boîtes de Pétri, ce qui permet aux chercheurs de mesurer de manière cohérente la virulence de l’EPF contre les pucerons de la moutarde et d’autres insectes parthénogénétiques.
Abstract
Le puceron de la moutarde (L. erysimi) est un ravageur qui infeste diverses cultures crucifères et transmet des virus végétaux. Pour parvenir à une lutte antiparasitaire respectueuse de l’environnement, les champignons entomopathogènes (FPE) sont des agents de lutte microbienne potentiels pour lutter contre ce ravageur. Par conséquent, il est nécessaire de procéder à un dépistage de la virulence des isolats d’EPF dans des conditions de boîte de Pétri avant l’application au champ. Cependant, le puceron de la moutarde est un insecte parthénogénétique, ce qui rend difficile l’enregistrement des données lors des expériences sur les boîtes de Pétri. Un système modifié d’essais biologiques sur feuilles détachées a été mis au point pour résoudre ce problème, en utilisant un micro-pulvérisateur pour inoculer les conidies aux pucerons et prévenir la noyade en facilitant le séchage à l’air après la suspension des spores. Le système a maintenu une humidité relative élevée tout au long de la période d’observation, et le disque foliaire est resté frais pendant plus de dix jours, ce qui a permis la reproduction parthénogénétique des pucerons. Pour éviter l’accumulation de progéniture, un processus d’élimination quotidienne à l’aide d’un pinceau a été mis en place. Ce protocole démontre un système stable d’évaluation de la virulence des isolats d’EPF contre les pucerons de la moutarde ou d’autres pucerons, permettant la sélection d’isolats potentiels pour la lutte contre les pucerons.
Introduction
Le puceron de la moutarde (L. erysimi) est un ravageur notoire qui infeste une variété de cultures crucifères, causant des pertes économiques importantes1. Bien que plusieurs insecticides systématiques aient été recommandés pour lutter contre les infestations de pucerons, l’utilisation fréquente de ces insecticides soulève des inquiétudes quant à la résistance aux pesticides 2,3. Par conséquent, en termes de lutte antiparasitaire respectueuse de l’environnement, les champignons entomopathogènes (FPE) pourraient constituer une stratégie de lutte alternative appropriée. L’EPF est un insecte pathogène capable d’infecter les hôtes en pénétrant dans leurs cuticules, ce qui en fait un agent puissant pour lutter contre les pucerons et autres insectes suceurs de plantes4. De plus, l’EPF s’est avérée être une technique de lutte antiparasitaire réalisable et durable, offrant des avantages tels que l’antagonisme des agents pathogènes des plantes et la promotion de la croissance des plantes5.
L’EPF peut être obtenu par appâtage d’insectes dans le sol ou isolé à partir de cadavres d’insectes sur le terrain 6,7. Cependant, avant de poursuivre l’utilisation d’isolats fongiques, un dépistage de la pathogénicité est nécessaire. Plusieurs études ont été menées sur l’efficacité de l’EPF contre les pucerons, qui sont des ravageurs importants des cultures qui peuvent causer de graves dommages 8,9. Les pucerons de la moutarde, parmi diverses espèces de pucerons, ont été testés pour leur sensibilité à plusieurs souches de Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., et même Alternaria, qui est principalement connu comme un champignon saprophyte et phytopathogène, mais qui a montré des effets mortels contre les pucerons de la moutarde10,11,12.
Pour évaluer l’efficacité de l’EPF contre les pucerons dans des conditions de laboratoire, les essais biologiques peuvent être divisés en deux parties principales : la chambre d’inoculation et l’inoculation fongique. Le protocole actuel décrit la construction d’une chambre d’inoculation, où les pucerons peuvent être maintenus à l’aide de diverses méthodes telles qu’une feuille excisée avec un pétiole enveloppé dans du coton humide, un disque foliaire excisé avec une boîte de Pétri tapissée de papier filtre humide, un entretien direct sur les plantes en pot, ou un disque foliaire excisé incrusté dans une gélose à l’eau dans une boîte de Pétri ou un récipient10, Dé 11 et 13. Les méthodes courantes d’inoculation fongique comprennent la pulvérisation des conidies, l’immersion des pucerons dans une suspension de conidies, le trempage des feuilles dans une suspension de conidies et l’inoculation d’endophytes végétaux11,14,15,16. Bien qu’il existe diverses méthodes d’inoculation, les essais biologiques doivent simuler les conditions d’application sur le terrain. Par exemple, dans le cas de la méthode des feuilles trempées12,17, l’efficacité de l’EPF peut être évaluée, mais comme les pucerons infestent les feuilles chargées de champignons, la face dorsale du puceron, qui est un site de pénétration préférentiel, n’est généralement pas exposée au champignon.
Pour évaluer l’effet aphidicide de l’EPF dans des conditions de laboratoire, ce protocole propose d’utiliser la méthode des feuilles détachées décrite par Yokomi et Gottwald18 avec quelques modifications, suivie d’une inoculation des conidies à l’aide d’un micro-pulvérisateur. Cette méthode permet de maintenir environ 100 % d’humidité dans la chambre d’essai biologique pendant au moins sept jours sans nécessiter de réapprovisionnement supplémentaire en eau18,19. De plus, le confinement des pucerons sur une seule surface assure leur exposition à la pulvérisation des conidies et facilite les observations20. Cependant, les pucerons peuvent rester coincés dans la surface exposée de la gélose lorsqu’ils se déplacent dans la chambre d’inoculation. De plus, l’enregistrement des données dans l’expérience de la boîte de Pétri avec les pucerons de la moutarde, qui sont des insectes parthénogénétiques, peut être difficile en raison de leur développement et de leur reproduction rapides. Il est difficile de faire la distinction entre les adultes inoculés et leur progéniture sans prélèvement. Les détails de la façon de procéder à cette étape sont rarement mentionnés, et certains facteurs incohérents, tels que la zone de consommation des feuilles, doivent être optimisés.
Ce protocole démontre un système stable pour le criblage de la virulence des isolats d’EPF contre les pucerons de la moutarde, permettant la sélection d’isolats potentiels contre diverses espèces de pucerons à partir d’une vaste bibliothèque d’EPF. Les pucerons récoltés sur le terrain peuvent être identifiés et une population suffisante de pucerons de la moutarde en laboratoire peut être établie pour évaluer l’effet aphidicide de divers isolats fongiques à l’aide d’une méthodologie simple et réalisable avec des résultats cohérents. Les pucerons ont développé de multiples mécanismes évolutifs en réponse à des pressions anthropiques intenses et répétées dans les agroécosystèmes, ce qui pose des défis à la sécurité alimentaire9. Par conséquent, cette méthode décrite pourrait être étendue à l’évaluation des isolats potentiels d’EPF contre diverses espèces de pucerons.
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Protocol
REMARQUE : L’organigramme complet est illustré à la figure 1.
1. Collecte et entretien du puceron de la moutarde
- Collecte de pucerons de la moutarde
- Retournez les feuilles et vérifiez visuellement s’il y a une infestation de pucerons de la moutarde sur les crucifères au champ.
- Consigner l’information sur le site d’échantillonnage (c.-à-d. GPS) et la ou les plantes hôtes, et confirmer l’historique des applications d’insecticides auprès des agriculteurs.
- À l’aide d’un aspirateur à insectes ou d’un pinceau fin (voir le tableau des matériaux), prélever environ 50 pucerons de la moutarde dans un tube à centrifuger de 50 mL provenant de crucifères cultivées au champ et apporter l’échantillon au laboratoire dans les 3 heures.
- Préparez une boîte de Pétri d’entretien temporaire avec des feuilles crucifères excisées et du papier filtre infiltré d’eau au fond.
- Placez les cinq pucerons sur la boîte de Pétri d’entretien temporaire à température ambiante (25 ± 2 °C) avec une humidité relative de 70 % et une photopériode de 12 h 12 (clair : foncé) pendant 14 jours pour confirmer que le puceron est exempt d’ennemis naturels avant de poursuivre l’élevage.
REMARQUE : Pour s’assurer que les pucerons récoltés au champ sont exempts d’ennemis naturels tels que les guêpes parasitoïdes ou les champignons entomopathogènes, il est essentiel de confirmer l’absence de ces organismes avant de poursuivre l’élevage.
- Maintien des pucerons de la moutarde
REMARQUE : Pour maintenir les pucerons de la moutarde, utilisez des feuilles de crucifères sans pesticides (y compris les biopesticides).- Prévoir un approvisionnement stable et suffisant en feuilles crucifères (environ 25 cm2).
REMARQUE : Procurez-vous les feuilles de crucifères au marché ou cultivez les plantes. Avant l’élevage massif à long terme de pucerons de la moutarde, plusieurs types de crucifères différents pourraient être testés pour trouver un crucifère approprié. Une fois que l’espèce de la feuille de crucifère est fixée, ne la changez pas. Dans cette étude, on a utilisé le Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) au stade 6-7 feuilles (voir le tableau des matériaux). De plus, jetez les 2-3 feuilles les plus anciennes. - Ajoutez de l’eau avant que le papier filtre au fond ne soit complètement sec.
- Observez quotidiennement la densité de population des pucerons de la moutarde. La population devrait être multipliée par 2 à 3 après 7 jours.
- Lorsque le nombre de pucerons augmente, coupez les feuilles excisées à l’origine avec des pucerons de la moutarde en 4 à 6 petits morceaux et mettez chaque petit morceau de feuille avec des pucerons de la moutarde dans une boîte de Pétri avec des feuilles fraîchement excisées et du papier filtre infiltré d’eau.
- Placez la boîte de Pétri dans un incubateur à 25 °C avec une photopériode de 12 :12 h (clair :foncé) et observez quotidiennement la densité de population de pucerons de la moutarde.
- Retirez les feuilles excisées d’origine après que la plupart des pucerons aient migré vers des feuilles excisées fraîches avant que les feuilles d’origine ne pourrissent.
- Prévoir un approvisionnement stable et suffisant en feuilles crucifères (environ 25 cm2).
2. Identification moléculaire du puceron de la moutarde
NOTA : Pour confirmer l’espèce de puceron de la moutarde récoltée au champ, l’identification moléculaire a été effectuée à l’aide de deux marqueurs moléculaires : la région amplifiée caractérisée par séquence (SCAR) A05Le conçue par Lu et al.21, et la région de la cytochrome oxydase (COI) du puceron de la moutarde du puceron de la moutarde.
- Extraction de l’ADN génomique du puceron de la moutarde
- Prélever environ 50 pucerons dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.
REMARQUE : Les pucerons utilisés pour l’identification moléculaire doivent être les descendants d’un seul puceron, et différents stades peuvent également être regroupés dans le même tube pour l’extraction de l’ADN. - Homogénéisez les pucerons à l’aide d’un pilon à granulés et extrayez l’ADN à l’aide du kit d’isolement d’ADN génomique Gene-Spin en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Éluer l’ADN génomique avec 50 μL d’eau préchauffée sans nucléase.
- Prélever environ 50 pucerons dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.
- Amplification par PCR et séquençage de l’ADN
- Amplifier les séquences d’ADN cible à partir de l’ADN génomique des pucerons à l’aide de PCR Master Mix (2x) avec les paires d’amorces A05LeF/A05LeR et LeCO1F/LeCO1R (Tableau 1) avec différents programmes de PCR21.
REMARQUE : La réaction PCR d’un volume total de 20 μL est composée de 2 μL de matrice d’ADN génomique de pucerons, de 1 μL d’amorces directes et de 1 μL d’amorces inversées, de 10 μL de mélange principal de PCR (voir le tableau des matériaux) et de 6 μL de ddH2O. - Réaliser la PCR dans un thermocycleur (voir tableau des matériaux) avec le programme suivant : 94 °C pendant 5 min, 25 cycles de 94 °C pendant 45 s, 61 °C (pour A05LeF/A05LeR) et 58 °C (pour LeCO1F/LeCO1R) pendant 45 s, 72 °C pendant 1 min, suivi d’une extension finale de 72 °C pendant 5 min.
- Analyser le produit PCR par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % pour confirmer l’identité du puceron de la moutarde (figure 2).
NOTA : Si la paire d’amorces A05LeF/A05LeR réussit à amplifier la taille correcte du fragment d’ADN, elle a permis d’identifier de manière convaincante le puceron prélevé sur le terrain comme étant le puceron21 de la moutarde. Les paires d’amorces sont répertoriées dans le tableau 2. - Purifier le produit PCR de l’amplicon COI du puceron de la moutarde à l’aide d’un gel/kit PCR disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux) et séquencer le produit PCR à l’aide d’un service de séquençage commercial.
- Amplifier les séquences d’ADN cible à partir de l’ADN génomique des pucerons à l’aide de PCR Master Mix (2x) avec les paires d’amorces A05LeF/A05LeR et LeCO1F/LeCO1R (Tableau 1) avec différents programmes de PCR21.
- Analyse de séquence
NOTE : Selon Lu et al.21, la courbure de l’ADN de A05Le est un fragment d’ADN spécifique du puceron de la moutarde ; par conséquent, le produit PCR A05Le n’a pas besoin d’être séquencé davantage.- Vérifier la qualité de lecture par le logiciel Chromas (voir Tableau des matériaux) après l’obtention de la séquence LeCO1.
- Coupez les lectures de mauvaise qualité en amont et en aval en ouvrant un fichier fasta (ou txt) et en supprimant directement les lectures de mauvaise qualité.
- Soumettez la séquence découpée à NCBI Web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) à l’aide des paramètres par défaut.
REMARQUE : Si les tailles d’amplicon des ensembles d’amorces A05Le et LeCO1 sont correctes, théoriquement, la recherche de séquences par explosion dans les bases de données standard du NCBI doit correspondre au puceron de la moutarde.
3. Préparation de champignons entomopathogènes
NOTA : Le FPE utilisé dans cette étude est indiqué dans le tableau 1.
- Récupération d’EPF à partir d’une bibliothèque fongique
- Décongeler le bouillon de champignons conservé (conidies en suspension dans 30 % de glycérine) du congélateur à -80 °C.
- Transférez une petite quantité (environ 10 μL) de la suspension de conidies dans une plaque de gélose au dextrose (SDA) de 6 cm 1/4 (0,75 g de bouillon de dextrose Sabouraud avec 1,5 g de gélose par 100 mL jjH2O) et étalez-la uniformément à l’aide d’un épandeur de cellules dans une hotte à flux laminaire.
- Scellez la boîte de Pétri avec un film de paraffine et incubez-la dans l’obscurité à 25 °C pendant 10 à 14 jours.
- Re-culture des isolats fongiques en striant la masse fongique sur une plaque de 1/4 de SDA et en incubant les champignons dans l’obscurité à 25 °C pendant 10 à 14 jours avant de récolter les conidies22.
REMARQUE : La culture fongique doit être utilisée environ 10 jours avant d’inoculer les pucerons. Il n’est pas recommandé d’utiliser une culture EPF de plus de 14 jours pour le test de virulence.
- Préparation de la suspension des conidies
- Gratter les conidies de la culture fongique vieille de 10 à 14 jours sur 1/4 de plaque SDA en inoculant l’anse après avoir ajouté 2 à 3 mL 0,03 % Tween 80 (voir le tableau des matériaux).
- Récupérez la suspension fongique dans un tube à centrifuger.
- Vortex la solution à la vitesse la plus élevée, compter le nombre de conidies à l’aide d’un hémocytomètre sous un microscope optique et ajuster la concentration de la suspension de conidies à 108 conidies/mL.
- Transférez la suspension de conidies dans un micro-pulvérisateur stérilisé aux UV.
REMARQUE : Faites tourbillonner à nouveau la suspension des conidies avant de la transférer, car les conidies sont sujettes aux précipitations. Le micro-pulvérisateur doit être exposé aux rayons ultraviolets dans une hotte à flux laminaire pendant 30 minutes avant utilisation.
4. Dépistage de la virulence contre le puceron de la moutarde
- Préparation des adultes nouvellement émergés
- Déplacer les adultes aptères (sans ailes) et alates (ailés) de la boîte de Pétri d’élevage vers les feuilles fraîchement excisées pour reproduire de nouvelles descendances du même âge. Retirer les adultes après 24 h pour éviter le surpeuplement et minimiser la production de descendances alées23,24. Seuls les adultes aptères seront utilisés dans d’autres expériences.
- Élever les descendants jusqu’au stade adulte et retirer les descendants qui ne se développent pas jusqu’au stade adulte après 48 h (figure 3) afin d’éviter la variation d’âge entre les pucerons pour l’expérience. De plus, retirez les adultes alés.
- Préparation de la chambre d’inoculation
REMARQUE : Il est recommandé de préparer d’abord des feuilles crucifères de 9 cm de diamètre, afin que le disque foliaire puisse être incorporé dans la gélose à l’eau avant la solidification.- Nettoyez les feuilles crucifères avec de l’eau du robinet, enlevez la saleté et les résidus, et tout autre arthropode s’il y en a.
- Essuyez tout excès d’eau avec une serviette en papier et vérifiez la présence d’autres arthropodes à la surface des feuilles crucifères à l’aide d’un stéréomicroscope. Retirez tous les arthropodes s’ils sont présents.
- Coupez un disque de feuille de 9 cm de diamètre soit en appuyant directement sur la boîte de Pétri inférieure sur la feuille comme moule, soit à l’aide de ciseaux.
REMARQUE : Si les feuilles ont un diamètre inférieur à 9 cm, combinez quelques feuilles excisées. - Préparer une gélose à 1,5 % d’eau pour chaque boîte de Pétri en chauffant et en dissolvant 450 mg de gélose (voir le tableau des matériaux) dans 30 mL ddH2O au micro-ondes.
REMARQUE : La quantité de gélose à 1,5% d’eau peut être ajustée en fonction de l’échelle de l’expérience. - Versez 30 mL de gélose à 1,5 % d’eau dans la boîte de Pétri de 9 cm avant la solidification dans la hotte à flux laminaire, puis attendez que la gélose refroidisse à ~40 °C jusqu’à ce que la surface de la gélose soit semi-solidifiée.
REMARQUE : Vérifiez si la surface est semi-solidifiée en secouant doucement horizontalement la boîte de Pétri. - Placez le disque foliaire, surface abaxiale vers le haut, au-dessus de la gélose à l’eau, en incorporant le disque foliaire dans la gélose.
REMARQUE : Minimiser l’exposition de la surface de la gélose. - Une fois que la gélose à l’eau s’est complètement solidifiée, fermez le couvercle de la boîte de Pétri.
REMARQUE : Ouvrez immédiatement le couvercle pour la vaporisation de l’eau si beaucoup de gouttelettes se condensent sur le couvercle. - Placez 20 adultes aptères sur le disque foliaire.
REMARQUE : Il est recommandé d’opérer sous un stéréomicroscope pour éviter d’endommager leurs pièces buccales.
- Inoculation et observation de l’EPF
- Ouvrez le couvercle de la chambre d’inoculation et vaporisez 0,3 mL de suspension de conidies (à partir de l’étape 3.2) directement sur les pucerons et le disque foliaire à partir d’environ 15 cm au-dessus du disque foliaire.
REMARQUE : Tourbillonnez à nouveau la suspension de conidies avant de pulvériser. Les zones de pulvérisation doivent être testées avant l’expérience, car elles peuvent varier d’un pulvérisateur à l’autre. Dans ce cas, il est recommandé d’appliquer 0,3 ml avec une distance de 15 cm. La zone de pulvérisation doit couvrir tout le disque foliaire et une fine couche de suspension de conidies doit recouvrir le disque foliaire. Si les gouttelettes convergent vers l’eau stagnante sur la feuille, le volume d’inoculation doit être diminué. Nettoyez la table avec de l’éthanol à 70 % avant l’inoculation et entre l’utilisation de différents isolats. - Attendez que la suspension des conidies sèche, puis fermez le couvercle pour éviter que les pucerons de la moutarde ne se noient.
REMARQUE : Les pucerons se déplacent rarement pendant l’expérience ; Cependant, il est toujours nécessaire de s’assurer que les pucerons ne s’échappent pas. - Sceller la chambre d’inoculation avec un film de paraffine pour maintenir une humidité relative élevée et placer la chambre d’inoculation dans un incubateur à 25 °C avec une photopériode de 12 :12 h (lumière :obscurité).
- Ouvrez le couvercle de la chambre d’inoculation pour compter la mortalité au stéréomicroscope toutes les 12 h pendant 5 jours.
- Essuyez le miellat adhérant à la couverture avec une serviette en papier et retirez les pucerons nouvellement apparus avec un pinceau fin. Nettoyez le couvercle à l’eau du robinet toutes les 24 h.
REMARQUE : La période d’observation peut varier pour différentes espèces de pucerons en fonction de la longévité des adultes. - Conservez le cadavre sur le disque foliaire pour détecter la mycose afin de confirmer la réussite de l’inoculation.
- Ouvrez le couvercle de la chambre d’inoculation et vaporisez 0,3 mL de suspension de conidies (à partir de l’étape 3.2) directement sur les pucerons et le disque foliaire à partir d’environ 15 cm au-dessus du disque foliaire.
- Confirmation du taux de germination des conidies
REMARQUE : Cette étape est facultative. Confirmer le taux de germination des conidies par paires lors de l’exécution du criblage de virulence pour s’assurer de l’activité des conidies.- Déposez une gouttelette de suspension de conidies de 5 μL sur 1/4 de SDA pour trois répétitions.
- Après 18 h, calculer le taux de germination avec le microscope optique. Comptez au moins 100 spores au hasard dans une seule gouttelette pour confirmer le taux de germination fongique.
REMARQUE : Normalement, le taux de germination des isolats utilisés dans l’expérience devrait être supérieur à 90 %.
5. Essai biologique d’isolats EPF sélectionnés
NOTA : Les isolats d’EPF qui présentaient une virulence élevée, qui a été sélectionnée à l’étape 4, ont été soumis à un essai biologique contre les pucerons de la moutarde à l’aide de quatre concentrations de suspensions de conidies (allant de 104 à 107 conidies/mL).
- Préparation de la suspension des conidies
- Répétez l’étape 3.1 pour récupérer les isolats EPF sélectionnés.
- Répétez l’étape 3.2 pour préparer quatre concentrations de suspension de conidies, y compris 104, 10,5,10,6 et 107 conidies/mL.
- Préparation des adultes nouvellement émergés
- Répétez l’étape 4.1 pour préparer les adultes nouvellement émergés.
- Préparation de la chambre d’inoculation
- Répétez l’étape 4.1. pour préparer la chambre d’inoculation.
- Inoculation et observation de l’EPF
- Répétez l’étape 4.3. pour effectuer l’inoculation et l’observation de l’EPF avec les quatre concentrations de suspension de conidies, respectivement.
6. Analyse statistique
- Calcul de la mortalité corrigée
- Calculez la mortalité corrigée à l’aide de la formule25 d’Abbott, comme indiqué ci-dessous :
Mortalité corrigée (%) = [(MT− M C) × 100 %] / (100− MC)
MT représente la mortalité du groupe de traitement et MC représente la mortalité du groupe témoin.
REMARQUE : La mortalité du groupe témoin ne doit pas être supérieure à 20 %. - Ouvrez la plate-forme logicielle SPSS (voir le tableau des matériaux), créez des variables telles que « traitement » et « cor_mor » (représentant la mortalité corrigée) et entrez les résultats calculés pour l’inoculation de différents isolats au même point de temps avec la même concentration inoculée.
- Sélectionnez Analyser, Comparer les moyennes et les proportions, Test T d’échantillons indépendants dans SPSS pour une analyse de test t indépendante.
- Dans SPSS, entrez le traitement dans la case « Variable de regroupement » et cor_mor dans la zone « Variable(s) de test ». Définissez des groupes par différents isolats fongiques. Appuyez sur OK pour analyser.
- Calculez la mortalité corrigée à l’aide de la formule25 d’Abbott, comme indiqué ci-dessous :
- Calcul du temps létal médian (LT 50) et de la concentration létale médiane (LC50)
- Ouvrez le SPSS, créez les variables « total », « réponse » et « durée"/"concentration », et saisissez le résultat enregistré dans la feuille de calcul.
- Sélectionnez Analyser, Régression, Probit dans SPSS pour calculer LT 50 et/ou LC50.
NOTA : Si la mortalité cumulée ne dépasse pas 50 % à terme, il n’est pas possible d’estimer la LT 50 et/ou la LC50. - Entrez le total dans la case « Total observé », la réponse dans la case « Fréquence de réponse », la durée/concentration dans la case « Covariable(s) ». Appuyez sur OK pour analyser.
REMARQUE : En règle générale, appuyez sur Options et définissez le « Niveau de signification pour l’utilisation du facteur d’hétérogénéité » sur 0,05.
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Representative Results
L’organigramme présenté illustre l’état stable des pucerons de la moutarde depuis la collecte au champ jusqu’au criblage de la virulence. Le maintien des pucerons à partir de la collecte au champ a assuré une augmentation stable des colonies de pucerons avec un approvisionnement alimentaire adéquat. Les pucerons prélevés sur le terrain ont été confirmés comme étant des pucerons de la moutarde grâce à l’utilisation de marqueurs moléculaires, y compris la taille de l’amplicon par PCR et le séquençage de LeCO1. Le dépistage de la virulence, effectué à l’aide de la méthode des feuilles détachées, a révélé un taux de survie constant pour les pucerons de la moutarde, le groupe témoin affichant un taux de survie de 85 % (figure 4).
Au cours du criblage de la virulence, le Cc-NCHU-213 a démontré la capacité de destruction des pucerons la plus rapide, entraînant des mortalités de 50 % et 90 % à 3 jours et 4,5 jours après l’inoculation (d.p.i.), respectivement (figure 4). Cependant, des capacités variables de destruction des pucerons ont été observées parmi les cinq isolats de B. bassiana. Bb-NCHU-141, -143 et -153 ont montré des capacités lentes de destruction des pucerons, avec seulement 5 % de mortalité à 3 d.p.i., même en excluant les effets de la pulvérisation de 0,03 % entre les 80 et d’autres facteurs mortels (figure 4). Par conséquent, la formule de mortalité corrigée a été utilisée pour normaliser la mortalité témoin. La plupart des isolats d’EPF contre le puceron de la moutarde présentaient des taux de mortalité corrigés supérieurs à 70 % dans un délai de 5 d.p.i., à l’exception du Pl-NCHU-152 (tableau 3). Parmi ces isolats d’EPF, Bb-NCHU-286 a montré le taux de mortalité le plus élevé, soit 100 % (tableau 3). De plus, une mycose EPF a été observée sur des cadavres de pucerons de la moutarde infectés par Metarhizium spp., Beauveria spp., Purpureocillium lilacinum et Cordyceps cateniannulata lors du dépistage de la virulence, ce qui indique l’efficacité de ce système (Figure 5).
Sur la base des résultats du criblage de virulence, deux isolats de l’EPF, à savoir Mb-NCHU-197 et Cc-NCHU-213, présentant une activité rapide de destruction des insectes (40 % et 50 % de mortalité à 3 d.p.i., respectivement), ont été sélectionnés pour des essais biologiques contre les pucerons de la moutarde. Les résultats ont démontré des mortalités corrigées significativement différentes pour Mb-NCHU-197 et Cc-NCHU-213 à 3 et 4 d.p.i. avec une inoculation de 107 conidies/mL (Figure 6). Dans l’essai LT50, le traitement avec 107 conidies/mL de Cc-NCHU-213 a montré une durée significativement plus courte que les autres traitements (tableau 4). De plus, la CL50 de Cc-NCHU-213 (9,32 × 104) était inférieure à celle de Mb-NCHU-213 (2,30 × 10 5), ce qui indique que le Cc-NCHU-213 possède une plus grande virulence contre les pucerons de la moutarde (tableau 5).
Figure 1 : Organigramme expérimental pour le dépistage de la virulence de l’EPF contre les pucerons de la moutarde. (A) Mise en place d’un système d’élevage de pucerons de la moutarde. b) Préparation de l’EPF. (C) Inoculation fongique. (D) Analyse statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Électrophorèse de l’ADN génomique du puceron de la moutarde amplifié avec des ensembles d’amorces A05Le et Le CO1. L’électrophorèse a été réalisée sur un gel d’agarose à 1 %. M = échelle d’ADN de 100 pb ; BP = paires de bases. L’astérisque rouge indique la courbure cible de l’amplification PCR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Différences entre la nymphe aptère du quatrième stade et le puceron adulte de la moutarde. (A) Nymphe du quatrième stade. (B) Adulte. Les tibias des pattes postérieures de la nymphe du quatrième stade larvaire sont blanchâtres (marqués d’une flèche rouge). Les pucerons nouvellement apparus ont été éliminés à l’aide d’une fine brosse de chameau lors d’essais de virulence. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Carte thermique de mortalité de 13 isolats d’EPF contre le puceron de la moutarde par la méthode des feuilles détachées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Observation de la mycose fongique de 13 isolats d’EPF. Mepe-NCHU-2 = Metarhizium pemphigi ; Mp-NCHU-11 = Metarhizium pinghaense ; Mb = Metarhizium baoshanense ; Cc = Cordyceps cateniannulata ; Ba = Beauveria australis ; Bb = Beauveriabassiana ; Pl = Purpureocillium lilacinum. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Mortalité corrigée des isolats fongiques Mb-NCHU-197 et Cc-NCHU-213 contre le puceron de la moutarde. Les barres d’erreur représentent l’écart-type (ET). Les mortalités de Mb-NCHU-197 et de Cc-NCHU-213 au même moment avec la même concentration inoculée ont été comparées à l’aide d’un test t indépendant, et les mortalités marquées d’un astérisque se sont avérées significativement différentes (p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Isoler | Espèce | Hôte ou source* | Emplacement |
| Mp-NCHU-2 | Metarhizium pemphigi | terre | Yilan |
| ML-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | terre | Yilan |
| MP-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | terre | Yilan |
| BA-NCHU-113 | Beauveria australis | terre | Taichung |
| Bb-NCHU-141 | Beauveria bassiana | Hypothenemus hampei | Chiayi |
| Bb-NCHU-143 | Beauveria bassiana | Hypothenemus hampei | Chiayi |
| Pl-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | Tessaratoma papillosa | Chiayi |
| Bb-NCHU-153 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus | Le Chunghua |
| Bb-NCHU-157 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus | Le Chunghua |
| MB-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | terre | Taichung |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | terre | Taichung |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | terre | Taichung |
| Bb-NCHU-286 | Beauveria bassiana | Cerambycidae | Taichung |
Tableau 1 : Isolats d’EPF utilisés dans cette étude.
| Nom de l’amorce | Séquence (5' - 3') | Taille du produit (bp) | Référence | |
| A05Le | F-GGGTCTTGGATGGTGTGTGTG | 953 | Lu et al. [21] | |
| R-AGGGGTCTTGTCGCCATTTT | ||||
| LeCO1 | F-CTTTTCCCATGATCAATTTT | 593 | Cette étude | |
| R-ACGTAGTGGAAAATGAGCAAC | ||||
Tableau 2 : Paires d’amorces utilisées pour l’identification moléculaire des pucerons de la moutarde.
| Isoler | Espèce | Mortalité corrigée (%) |
| Mp-NCHU-2 | Metarhizium pemphigi | 76.47 |
| ML-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | 82.35 |
| MP-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | 76.47 |
| BA-NCHU-113 | Beauveria australis | 82.35 |
| Bb-NCHU-141 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| Bb-NCHU-143 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| Pl-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | 35.29 |
| Bb-NCHU-153 | Beauveria bassiana | 82.35 |
| Bb-NCHU-157 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| MB-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | 76.47 |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 88.24 |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 94.12 |
| Bb-NCHU-286 | Beauveria bassiana | 100.00 |
Tableau 3 : Taux de mortalité corrigés de 13 isolats d’EPF contre le puceron de la moutarde 5 jours après l’inoculation (d.p.i.).
| Isoler | Espèce | Conc. (conidies/mL) | N* | LT50 (jours)† | Limites de confiance de 95 % | Pente (SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 104 | 60 | 3.816 un | 3.61–4.05 | 0.60 (0.05) | 15.64 (28) |
| 105 | 60 | 3.112 bd | 2.95–3.28 | 0.72 (0.05) | 14.61 (28) | ||
| 106 | 60 | 2,908 milliards | 2.76–3.06 | 0.85 (0.06) | 15.04 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.549 c | 2.40–2.69 | 0.90 (0.06) | 24.31 (28) | ||
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 104 | 60 | 3.948 un | 3.71–4.23 | 0.53 (0.05) | 8.81 (28) |
| 105 | 60 | 3.237 d | 3.07–3.41 | 0.72 (0.05) | 22.86 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.414 c | 2.28–2.54 | 1.08 (0.07) | 28.30 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.132 e | 2.02–2.25 | 1.41 (0.10) | 28.96 (28) | ||
| *Nombre d’insectes observés. | |||||||
| †Les valeurs LT50 marquées de lettres différentes ont été considérées comme significativement différentes, car leurs limites de confiance à 95 % ne se chevauchaient pas. | |||||||
| ‡X2, valeur du Khi-deux dans le test de qualité de l’ajustement de Pearson ; df, degrés de liberté | |||||||
Tableau 4 : Valeurs LT50 des isolats fongiques Mb-NCHU-197 et Cc-NCHU-213 contre les pucerons de la moutarde à différentes concentrations de conidies. *Nombre d’insectes observés. Les valeurs †LT50 marquées de lettres différentes ont été considérées comme significativement différentes, car leurs limites de confiance à 95 % ne se chevauchaient pas. ‡X2, valeur du Khi-deux dans le test de qualité de l’ajustement de Pearson ; df, degrés de liberté.
| Isoler | Espèce | N* | CL50 (conidies/mL)† | Limites de confiance de 95 % | Slpoe (SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 240 | 2,30 × 105 A | 8,63 × 104 à 5,70 × 105 | 0.43 (0.08) | 10.14 (10) |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 240 | 9,32 × 104 A | 4,97 × 104 à 1,62 × 105 | 0.76 (0.09) | 4.33 (10) |
| *Nombre d’insectes observés. | ||||||
| †Les valeurs de CL50 marquées de lettres différentes ont été considérées comme significativement différentes, car leurs limites de confiance à 95 % ne se chevauchaient pas. | ||||||
| ‡X2, valeur du Khi-deux dans le test de qualité de l’ajustement de Pearson ; df, degrés de liberté | ||||||
Tableau 5 : Valeurs de la CL50 des isolats fongiques Mb-NCHU-197 et Cc-NCHU-213 contre les pucerons de la moutarde. *Nombre d’insectes observés. Les valeurs †LC50 marquées de lettres différentes ont été considérées comme significativement différentes, car leurs limites de confiance à 95 % ne se chevauchaient pas. ‡X2, valeur du Khi-deux dans le test de qualité de l’ajustement de Pearson ; df, degrés de liberté.
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Discussion
Les crucifères, un groupe de légumes, sont fréquemment infestés par de multiples espèces de pucerons, dont le puceron de la moutarde (L. erysimi) et le puceron du chou (Brevicoryne brassicae)26. Les deux espèces ont été signalées à Taïwan27, et il est possible qu’elles coexistent sur le site de collecte. Pour distinguer les espèces de pucerons étroitement apparentées, cette étude a utilisé une technique d’identification moléculaire à l’aide d’un ensemble d’amorces multiplex21. En concevant un marqueur moléculaire à partir du fragment du gène COI du puceron de la moutarde, nous avons réussi à identifier le puceron de la moutarde, confirmant ainsi la fiabilité du marqueur moléculaire A05Le à cet effet21.
Les observations ont révélé qu’il est difficile de faire la distinction entre les nymphes aptères du quatrième stade et les pucerons adultes de la moutarde en se basant uniquement sur leur taille ou leur morphologie sans expérience. Cependant, un trait distinctif crucial est le tibia des pattes postérieures, qui apparaît blanc chez les nymphes du quatrième stade, mais pas chez les adultes (figure 3). Des études antérieures sur L. attenuatum, B. bassiana contre les pucerons du cotonnier et M. brunneum contre les pucerons verts du pêcher ont démontré que la mue peut être une stratégie pour éviter l’infection28,29,30. Par conséquent, une mauvaise identification des stades de pucerons peut entraîner des erreurs dans l’évaluation de la virulence, car la mue peut affecter l’efficacité de l’EPF28,29,31. Pour remédier à ce problème et assurer une plus grande exactitude et précision dans l’évaluation de la virulence, exclure les pucerons dont la partie blanchâtre du tibia de la patte arrière n’a pas atteint le stade adulte, à moins d’utiliser intentionnellement des nymphes de pucerons. Ces pucerons ne sont pas complètement matures et peuvent subir une mue, ce qui pourrait leur permettre d’échapper au processus d’infection de l’EPF. De plus, il est recommandé d’observer et d’enregistrer les données toutes les 12 h. L’intervalle de 12 h est préférable pour démontrer les différences entre plusieurs isolats prometteurs ayant des capacités similaires de destruction des pucerons et facilite le calcul précis de LT50. Cependant, l’intervalle de temps peut être ajusté en fonction des différents cycles de vie d’autres espèces d’insectes ou déterminé par un prétest à petite échelle.
Bien que la méthode de la feuille détachée puisse laisser un minimum de miellat sur le disque foliaire, la majeure partie du miellat adhère au couvercle de la boîte de Pétri puisque le disque foliaire est à proximité. Il peut être essuyé ou lavé pendant la période d’observation. Cependant, le miellat est sans aucun doute présent dans l’environnement pratique de la culture lorsque les pucerons envahissent32. Le miellat présent dans la chambre d’inoculation peut simuler quelque peu la situation dans laquelle l’EPF est inoculé aux pucerons dans le champ. Les cuticules des pucerons contiennent principalement du miellat, qui sert de source de nutriments pour le champignon et peut stimuler la germination de l’EPF16. Ainsi, la combinaison de l’application d’EPF et de la production de miellat par les pucerons peut être avantageuse.
Pour confirmer que la mort des pucerons est due à une infection, les cadavres sont généralement transférés de la chambre d’inoculation de l’EPF vers du papier filtre humide ou un milieu de culture pour observer l’excroissance fongique 11,14,33,34. Cependant, dans cette étude, une gélose à l’eau a été utilisée dans la chambre d’inoculation pour maintenir une humidité élevée, ce qui permet aux cadavres de pucerons de rester sur les feuilles sans avoir besoin d’être déplacés pour l’observation de l’excroissance fongique. Bien que la méthode des feuilles détachées fournisse des informations sur l’effet aphidicide des isolats d’EPF, elle présente encore des limites. La gélose à l’eau utilisée pour maintenir l’état du disque foliaire peut provoquer le blocage des pucerons lorsqu’ils se déplacent dans la chambre d’inoculation. Pour remédier à ce problème, le pourcentage de gélose à l’eau a été porté à 3 %, ce qui permet d’obtenir une surface suffisamment ferme pour que les pucerons russes du blé (Diuraphis noxia) puissent marcher sur20. Dans cette expérience, les pucerons de la moutarde ont pu se déplacer confortablement sur des surfaces de gélose à l’eau avec des concentrations allant de 1,5 % à 3 %. Cependant, au fur et à mesure que la période d’observation avançait, quelques pucerons se sont retrouvés coincés la tête en bas, les pattes vers le haut, et ont dû être secourus jusqu’au disque foliaire. Cela peut être dû aux différences de taille ou de mobilité des pucerons, ce qui indique que l’augmentation de la concentration de gélose seule peut ne pas résoudre le problème. Par conséquent, assurez-vous que le disque foliaire recouvre entièrement la surface de la gélose en utilisant une feuille qui s’adapte mieux à la taille de la boîte de Pétri, ce qui peut aider à atténuer ce problème. Par rapport à la méthode des feuilles détachées décrite par Yokomi et Gottwald18, cette étude a amélioré un aspect en utilisant une taille de feuille qui convient approximativement à la boîte de Pétri. Cela permet de quantifier relativement la consommation alimentaire et de minimiser la surface de gélose exposée. De plus, la feuille doit être « encastrée » dans la gélose à l’eau semi-solidifiée, alors que dans la référence originale, elle était décrite comme « placée » sur la gélose à l’eau18. L’intégration du disque foliaire dans la gélose à l’eau réduit la probabilité que les pucerons restent collés à la surface de la gélose et facilite l’observation, car les pucerons sont confinés d’un côté.
Ce protocole fournit des instructions détaillées sur la façon de procéder avec la méthode des feuilles détachées et l’inoculation de l’EPF, ainsi que certaines modifications qui ont facilité les opérations, les observations et les résultats cohérents. Il établit également une méthode normalisée pour la sélection des isolats d’EPF contre les ravageurs suceurs de plantes dans des conditions de laboratoire. De plus, il est possible d’effectuer un contrôle standard avec des produits dont l’efficacité est connue ou qui sont disponibles dans le commerce pour la commercialisation future des isolats d’EPF.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts dans ce travail.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le 109-2313-B-005 -048 -MY3 du ministère de la Science et de la Technologie (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. Jr Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , Texas A&M AgriLife Extension Service. 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , 23 North Dakota State University Extension Publication: North Dakota, USA. (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
